Universitatea ’’Ștefan cel Mare’’ din Suceava

Facultatea de Educație Fizică și Sport

Departamentul de Sănătate și Dezvoltare Umană

Specializare Nutriție și Dietetică

Referat COLORAȚIA IMUNOHISTOCHIMICĂ

BURLACU ADELINA
AN I , gr 1411c

2020
Cuprins
1. Introducere
…………………………………………………………………………………………………………
…….2
1.2 Clasificarea coloerațiilor..................................................................................................2
2. Analiza Imunohistochimică...................................................................................................2
2.1 Colorația Imunohistochimică...........................................................................................2
2.2 Tehnica IHC...................................................................................................................2
3. Metoda de colorare ...............................................................................................................3
3.1 Metoda fluorescentă directă...........................................................................................3
3.2 Metoda fluorescentă indirectă........................................................................................4
4. Marcarea enzimatică.............................................................................................................5
4.1 Peroxidaza.........................................................................................................................5
5. Pașii unei analize
IHC............................................................................................................5
6. Interpretarea Rezultatelor....................................................................................................6
6.1 De ce putem obține rezultate nespecificate?..................................................................6
7. Analiza țesutorilor la microscop ........................................................................................6-
8
8. Concluzii....................................................................................................................................9
9. Bibliografie......................................................................................................................................9

1
 1.Introducere
Colorația este o metodă de laborator folosită în microscopie, etapa ,în care crește contrastul
dintre diferite componente tisulare ,prin modificarea indicilor de refracție ai substratului morfologic
cu ajutorul coloranților. Metoda de colorare depinde de fixatorul utilizat și de țesutul pe care dorim
să-l examinăm . Acesta este necesare în domenii precum: citologie, histologie, biologie celulară;
Colorantul este o substanța chimică folosită pentru colorare. Acesta poate intra în celulă
,atașându-se la nivelul componentelor celulare și permițând defirențierea lor optică.

1.2 Clasificarea colaratiilor:

-Morfologice
-Histochimice
-Imunohistochimice
-Citologice

2. Analiza Imunohistochimică
Analiza IHC reprezintă combinația între două știinte: imunologia și histochimia.. Acesta se
utilizează pentru determinarea diferitor patologii folosind anticorpi specifici, care au capacitatea de
a identifica anumite antigene (proteine) prezente în ţesutul analizat. Folosind markeri specifici se
poate determina modelul de expresie al acestor proteine, tipul de afecțiune, prognosticul bolii şi
orientarea către opţiuni terapeutice eficiente.

2.1. Colorația Imunohistochimică

Colorația imunohistohimică este metoda uzuală de laborator folosită în microscopie
bazându-se pe reacția imunologică dintre Ag și Ac, prin care se urmărește neutralizarea toxicității
sau patogenității antigenului. Datorită acestei metode putem localiza antigene specifice diverselor
țesuturi (fibre musculare sau țesuturi conjunctive), celule (în frotiuri de sânge pentru a observa
celulele sanguine) sau organite celulare, însă acestea fiind mai greu colorate.

2.2 Tehnica imunohistochimică

Acesta poate furniza detalii asupra localizării tisulare și celulare a proteinelor. Întrucât
localizarea celulară a proteinelor poate da informații asupra rolurilor lor fiziologice. Acestă tehnică
este dedicată identificării antigenilor proteice de la nivelul celular sau tisular. Principiul tehnicii se
bazează pe abilitatea anticorpilor de a interacționa specific cu epitopi sau atigene. Țesuturile
destinate investigării prin acestă metodă sunt fixate și apoi incluse la parafină.

2
 Anticoprii utilizați sunt cei monoclonali și policlonali. Datorită înaltei omogenități și
specifități folosirea antcorpilor monoclonali în imunnohistochimie reprezintă avantaje mari.

Anticoprii mai pot fi clasificați în :

primari - destinați cuplării cu antigenele de interes,neconjugați;
secundari-au ca specifitate etiopi de la nivelul anticorpilor primari și sunt conjugați fie cu
biotina, fie cu diferite enzyme, fie cu agenți fluorescenți.

Noțiuni de enzimologie
Metoda de colorare imunoenzimatică se bazează pe reacția dintre enzime și subtraturile lor
cromogeni incolori, care se va colora în produsi finali detectabili .Cele mai utilizate enzime
sunt : peroxidaza(HRP), fosfotaza alcalină(AP), glucozoxidaza, și beta-galactozidaza .

Factori în alegere enzimelor :

-enzima trebuie să fie într-o formă înalt purificată și relativ ieftină ;
-ezima legată trebuie să fie stabilă în soluții,;
-produșii reacțiior să fie ușor detectabili și stabili .

Colorarea țesutului
Colorarea ţesutului depinde de manipularea şi de procesarea ţesutului înainte de colorare urmărind
fiixare, congelare, decongelare, spălara, uscare, încălzire. Complexele antigen-anticorp pot fi vizualizate
numai prin marcarea anticorpului specific cu fluorocromi sau cu enzyme.

3.Metoda de colorare
Acesta se clasifică în metoda directă și indirectă.
3.1. Marcarea fluorescentă directă
Anticorpul primar este marcat de enzimă, iar aplicare ulterioară a acestei reacții, a substratului
cromogen evidențiază formarea complexelor specifice Ag-Ac, printr-o reacție de culoare. Metoda
directă constă în punerea în contact a antigenului cu anticorpul specific, marcat fluorescent. Cei mai
frecvenţi reactivi utilizaţi pentru marcarea anticorpilor sunt izotiocianatul fluoresceina (FITC) şi
izotiocianatul tetrametilrodamina (TRITC). Aceste substanţe, în soluţie alcalină (pH 9-10) se
combină covalent cu proteinele, reacţionând în principal cu grupul amino al lizinei. Materialul care
urmează a fi marcat este un antiser primar. Fluorocromul se va conjuga cu toate tipurile de proteine
prezente în ser, nu numai cu anticorpul sau anticorpii interesaţi. Materialul fluorescent nelegat va fi
de asemenea prezent din cauza unor hidrolize ale agenţilor de marcaj care survin în mediu alcalin
necesar dezvoltării reacţiei cu aminele.Materialul fluorescent neconjugat trebuie să fie eliminat din
cauză că ar colora nespecific ţesuturile. Serul marcat este dializat pentru a îndepărta moleculele
mici (gm < 5000 daltoni) şi pentru a înlocui solventul alcalin cu o soluţie salină ce are un pH
fiziologic. Apoi serul imun este trecut printr-o coloană filtru de gel, care reţine moleculele mici sau
poate fi tratat cu cărbune activat. Rezultatul final duce la obţinerea unui ser ce conţine în cea mai
mare parte anticorpul specific marcat cu un fluorocrom. Acest ser este pus în contact cu ţesutul care
conţine antigenul într-o atmosferă umedă, timp de aproximativ o oră. Apoi se înlătură excesul cu o
soluţie salină şi se montează între lamă şi lamelă utilizând un amestec de glicerol şi tampon alcalin.

Procedura de imunocolorare.
Materialul biologic care conţine antigene pe care vrem să le studiem sunt secţionate la
3
microtom şi montate pe lame histologice. Secţiunile sunt clătite cu soluţie de ser fiziologic după
care se adaugă o picătură de antiser marcat, pe fiecare lamă, acoperind toată secţiunea. Pentru o
reacţie bună se vor efectua mai multe diluţii ale serului în soluţie salină. (Diluţii mai slabe de 1:8 ale
anticorprului primar nu sunt utilizate pentru metodele directe cu anticorpi fluorescenţi). Serul este
lăsat în contact cu secţiunile, în atmosferă umedă, aproximativ o oră. Apoi este îndepărtat surplusul
de ser primar cu soluţie salină după care se aplică o lamelă (se realizează montarea preparatului
histologic).
Preparatele imunofluorescente sunt de obicei montate în amestec de glicerol şi un oarecare tampon
alcalin, deoarece mediul de montare permanent scade intensitatea fluorescenţei. Secţiunile colorate
şi montate sunt examinate la microscopul cu fluorescenţă, cu excitaţie şi filtrare adecvate pentru
marcaj.

Deficițele metodei directe

Dacă concentraţia antigenului este scăzută, densitatea moleculei fluorocrom nu poate fi
suficient de mare pentru a permite detectarea lor la microscop. În plus, procesul de marcare al
anticorpului primar poate fi deficitar, reducând capacitatea acestuia de a pune în evidenţă complexul
Ag-Ac.Un ser ideal marcat are aproximativ 10 molecule fluorocromice ataşate la fiecare moleculă
de IgG. O altă deficienţă a acestei tehnici este faptul că antiserurile primare sunt greu de preparat
sau scumpe şi adesea sunt disponibile în cantităţi mici.

3.2 Metoda fluorescentă indirectă

Presupune folosirea unui Ac primar neconjugat pentru reacția Ag-specifică. Un al doilea Ac
secundar conjugat cu enzima, recunoaște și interacționează cu Ac primar, iar substratul cromogen
vizualizează reacția. Această metodă este mult mai sensibilă decât cea directă, astfel mai mulți Ac
secundari se vor lega de epitopi diferiți de la nivelul celui primar, atașânndu-se mai multe molecule
de enzimă la situsul Ag ceea ce crește intensitatea semnalului de colorare.

Procedure de imunocolorare
O secţiune, conţinând antigen este mai întâi incubată pentru 30-60 minute cu o concentraţie
adecvată (de obicei 1:20 sau 1:50) anticorpului primar. Moleculele de anticorpi care se ataşează la
situsurile antigenice (se leagă de epitopi) din ţesut( imunoglobuline). Ele se cuplează cu antigenele
prin intermediul fragmentelor Fab. Segmentele Fc ale moleculelor de imunoglobuline din anticorpul
primar. În stadiul următor al metodei de colorare, secţiunea este tratată cu antiserul secundar marcat
fluorescent. Moleculele anti-IgG (anticorpul secundar) se vor lega de fragmentele Fc ale
moleculelor de imunoglobuline deja ataşate derivate din antiserul primar. Prin urmare, cum am
precizat mai sus,această este o metodă de amplificare a cantităţii de fluorocrom si deci, de
amplificare a semnalului luminos emis de acesta.

Această metodă este superioară metodei directe pentru 2 motive:

- nu este necesară marcarea anticorpului primar. Obţinerea antiserurilor secundare şi marcarea
lor este mai ieftină;
- mai mult de o moleculă de anticorp fluorescent din antiserul secundar va putea să se ataşeze
de fiecare moleculă a anticorpului primar. Fiecare moleculă de antigen a legat de două ori mai
multe molecule fluorescente decât ar fi legat dacă s-ar fi folosit metoda directă de

4
imunofluorescenţă. În realitate factorul de amplificare poate fi mult mai mare (nu numai de 2 ori).
Pin urmare, tehnicile IHC indirecte sunt întotdeauna mai rapide și mai eficiente decât cele directe.

4.Marcare enzimatică
Enzimele sunt cei mai folosiţi markeri în imunocitochimie-(variantă a metodei de colorare
bazată pe folosirea reacției de Ag-Ac.)
Prin aceste tehnici anticorpii sunt marcaţi prin conjugare cu enzime. Incubaţia complexului
antigen-anticorp-enzimă cu un cromogen folosind o metodă histochimică standard generează un
produs final de reacţie, colorat, stabil, uşor de examinat la microscopul optic obişnuit. În plus,
varietatea enzimelor şi cromogenilor disponibili, permit utilizatorului alegerea culorii produsului
final de reacţie.

4.1 Peroxidaza
Peroxidaza din hrean este cea mai folosită enzimă, şi în combinaţie cu un cromogen favorabil
diaminobenzidina (3,3’diaminobenyidi tetraclorid)(DAB), conduce la formarea unui produs de
reacţie maro închis, stabil, insolubil şi permanent. Cu toate că DAB a fost considerat potenţial
carcinogen, actual riscul demonstrat a fi mic. În afară de DAB, peroxidaza poate fi combinată şi cu
alţi cromogeni: 4 clor-1-naftol (rezultând o coloraţie albastră), alfa naftol pironina (rezultând o
coloraţie roșie purpurie), etc. Amplificarea semnalului constă în faptul că la o singură moleculă de
imunoglobulină pot fi ataşate mai multe molecule de enzimă marcate cu un cromogen.

5. Pașii unei analize Imunohistochimice

1. Selectarea blocului de parafină ce conține țesutul relevant pentru analiză. Această etapă este
efectuată de laborant care vizualizează microscopic lamele colorate clasic cu HE
(hematoxilină-eozină), notează blocul de parafină corespunzător și indică tipul de anticorpi necesari
testării.
2. Secționarea blocurilor de parafină în felii subţiri (3-4 µm), ce vor fi montate pe lame de sticlă
speciale.
3. Procesarea feliilor de țesut împreună cu anticorpul specific pentru antigenul cercetat, care va fi
colorat cu o substanță cromogen, etapă ce necesită 2-3 zile, conform protocolului din laborator.
4. Identificarea microscopică a reacției pozitive induse de formarea complexelor antigen-anticorp în
celulele examinate. În cazul unei reacții neconcludente sau a datelor insuficiente în primă fază, se
poate solicita repetarea unei testări sau suplimentarea cu alți anticorpi.

În toate metodele IHC de lucru există o regulă bine stabilită a succesiunii etapelor (a aplicării
reactivilor pe lamă, a efectuării tehnicilor de blocare, a reacțiilor nedorite de fond, a demascării
situsurilor Ag).Acestea nu se pot fi inversate sau efectuate într-o altă succesiune,nerespectarea
acestor reguli poate duce la compromiterea finalității reacției .

6.Interpretarea rezultatelor
5
 Pentru reuşita reacţiilor imunohistochimice este esențială fixarea corectă a fragmentului
bioptic, astfel încât epitopii (situsurile antigenice) să nu fie inactivaţi ori denaturați. Rezultatul se
exprimă în procente sau cu simboluri matematice urmând următoarele criterii : +++
supraexprimare, difuz pozitivă, + pozitiv, +/- slab pozitiv. Produsul final de reacţie se vizualizează
cu diaminobenzidină (DAB) şi este colorat în brun.

6.1 De ce putem obține rezultate nespecifice?

Rezultatele inconsecvente pot fi cauzate de variaţiile metodelor de fixare sau de
neregularităţile din interiorul ţesutului. Interpretarea clinică a oricărei coloraţii pozitive sau a
absenţei acesteia trebuie să se evalueze în contextul prezentării clinice, al morfologiei şi al altor
criterii histopatologice.

Rezultatele fals negative presupun secţionarea necorespunzătoare şi contaminarea cu alte ţesuturi

ce pot produce artefacte, captarea anticorpilor .
Rezultatele fals positive – la nivelul țesutului testat pot exista proteine diferite de Ag de interes ce
au abilitatea de a se cupla cu Ac primari ceea ce va determina legări nespecifice .

7.Analiza țesuturilor la microscop (vezi de la fig.1-fig.5)

fig .1 - Citokeratina: exprimată de celulele epiteliale

6
Fig.2 - Actina: exprimată de celulele musculare şi Mioepiteliale

Fig.3- Cromogranina A: exprimată de celulele sistemului neuroendocrin difuz

7
Fig.4- Colagenul IV: membranele bazale

Fig.5- Antigenul specific prostatic: exprimat de celulele glandulare prostatice

8.Concluzii
Analiza Imunohistochimică reprezintă o etapă avansată în diagnosticare. Este o analiză

8
care oferă un diagnostic de certitudine. Acesta joacă un rol important în identificare tumorilor
precum cancerul de sân, cancerul de piele, carcinomul de rinichi, cancerul de prostată, cancerul
pulmonar, cancerul gastric, leziunile osoase dar şi în cazul bolilor neurodegenerative. Întregul
scop al procedurii IHC este de a oferi informaţii importante privind existenţa unei boli, cât de
avansată este, sau chiar în monitorizarea unui tratament.

9.Bibliografie
IMUNOHISTOCHIMIE,curs II -
https://ro.scribd.com/presentation/146497250/Imunohistochimie
Lucrări practice,Histologie partea I de Marius Raica, Cristian Suciu,Cezar Gyenes
https://personalgenetics.ro/afectiune/diagnostic-imunohistochimic/
http://www.scumc.ro/examenul-histopatologic-si-testele-de-imunohistochimie/
https://www.coursehero.com/file/38165559/Coloratii-imunohistochimicepptx/