Determinarea aminoacizilor liberi totali din piele

Generalităţi: Aminoacizii liberi sunt aminoacizii din celule şi din fluidele extracelulare din care se
sintetizează proteine şi peptide. Acestea la rândul lor sunt hidrolizate mereu, iar unele proteine îmbătrânite
sunt recunoscute ca „non-self” şi degradate rezultând peptide, care sunt apoi hidrolizate de către endo- şi
exo-peptidaze la aminoacizii corespunzători. De aceea, este important să se determine conţinutul de
aminoacizi liberi totali, precum şi raportul acestora cu proteinele, deoarece în anumite stări patologige, sau
sub acţiunea frigului, căldurii excesive, diete conţinutul lor poate creşte.

Presiunea osmotică: In condiţii normale, adică la o presiune de o atmosferă şi la 0°C, o soluţie cu

concentraţia 1 M va exercita o presiune de 22,4 atm. Dacă soluţia se află într-o pungă dintr-o membrană
semipermeabilă (de exemplu celofan) care se introduce în apă distilată, atunci apa distilată va pătrunde
prin membrana de celofan pentru a dilua soluţia 1 M şi a reduce astfel presiunea.

Principiu: 2 ml de soluţie de NaCl 22,5%, se introduc în vase cilindrice care se aşează cu gura pe pielea
mâinii, după ce aceasta a fost spălată şi uscată. Datorită presiunii osmotice mari, aminoacizii din piele sunt
eliberaţi şi acumulaţi în soluţia de NaCl. Din soluţia de NaCl aminoacizii extraşi pot fi determinaţi cu un
reactiv pe bază de ninhidrină, iar etalonarea se realizează cu un aminoacid oarecare cum ar fi alanina sau
acidul aspartic.

Modul de lucru: In vase cilindrice se introduc câte 2 ml de NaCl 22,5% care reprezintă soluția cu o
presiune osmotică mare capabilă să extragă aminoacizii liberi din piele.
Vasele se țin lipide de piele, cu gura în jos, fără a se pierde lichid, timp de 10 min, cu agitare
uşoară. După 10 min, se iau câte 0,5 mL extract salin ce conține aminoacizi liberi totali care se introduc
într-o eprubetă. Se adaugă 1 mL reactiv cu ninhidrină, se agită energic conținutul eprubetei care se
introduce apoi într-o baie de apă în fierbere timp de 15 min.
Se realizează o soluție standard ce conține 20 g acid aspartic/mL. Se iau 0,5 mL din această
soluție, în două repetiții şi se procedează la fel ca şi în cazul probelor reale. Se introduce şi o probă de
referință (proba oarbă) realizată numai cu reactivii. Pentru aceasta, 0,5 mL soluție de NaCl 22,5% se
amestecă cu 1 mL reactiv cu ninhidrină.
Spectrele de absorbție se trasează în domeniul 350 – 650 nm.
Subiecții testați: studenţi şi voluntari.
Reactivul cu ninhidrină. Se dizolvă 0,4 g ninhidrină şi 0,4 g Cd(NO 3)2·4H2O în 25 ml soluţie
tampon cu pH 5,5 şi se completează la semn, la 100 ml, cu glicerină sau cu etilenglicol. Soluţia se prepară
extemporaneu (adică înainte de determinare, deşi soluţia este stabilă în vase brune închise timp de câteva
săptămâni).
Soluţia tampon. Se dizolvă 54,4 g acetat de sodiu cristalizat în aproximativ 50 ml apă distilată, cu
încălzire şi, după răcire, se adaugă 10 ml acid acetic glacial şi în continuare, apă distilată până la 100 ml.
Se corectează valoarea pH-ului, dacă este cazul, la 5,5 cu acid acetic glacial, respectiv, cu hidroxid de
sodiu.