MECANISMELE GENETICE CARE STAU LA BAZA GENERARIL DIVERSITATI IMUNOGLOBULINELOR Receptorul pentru antigen al limfocitului B este molecula de imunoglobulina (Ig). Studiile enzimatice efectuate in ani 60 au condus la elucidarea structurii sale, formati din dowd lanuri grele (H — de la Heavy) identice si doua lanfuri usoare identice (L~ de la Light). inca de pe atunci devenise evident c& cele doud capete ale acestei glicoproteine posed functii diferite. Recunoasterea antigenului este efectuati cu ajutorul capitului amino-terminal, in timp ce capatul carboxi-terminal este implicat in ceea ce denumim funcfii “biologice”. Lanturile au fost imparjite ca atare intr-o porfiune variabild (N-terminalA) si 0 portiune constania (C-terminala). Fiecare molecula de imunoglobulina poseda doui situsuri identice de legare a antigenului, iar la formarea fiecdruia participa atat partea variabild a lanului L cat si partea variabila a lantului H. Astazi stim cd portiunea din imunoglobulina dedicata legarii antigenului, numita paratop, este extrem de redusa ca dimensiuni, fiind alcatuita din doar cativa aminoacizi, localizati in asa numitele regiuni hipervariabile. Nici antigenul nu participa la legare in intregul su, ci cu o porfiune corespunzitoare din punet de vedere dimensional, numita epitop. Adancirea studiilor de structuri a relevat organizarea moleculei in domenii “globulare”, formate din cate doua straturi opuse, unite prin intermediul unci legaturi disulfidice intra-lant si a unei legaturi hidrofobe. Fiecare dintre straturi este format dintr-un numar de foi f pliate, antiparalele, unite prin bucle de conexiune. Totodata, analiza comparativa a unui numar mare de lanyuri a evidenfiat c& diferentele dintre acestea nu se regisesc dispuse aleator in structura primar a proteinei ci sunt restranse la nivelul cétorva portiuni inguste, numite regiuni hipervariabile. La nivelul domeniului globular, regiunile hipervariabile se regasesc in regiunea buclelor de conexiune dintre foile B pliate’. Fiecare limfocit B poseda pe suprafafa sa imunoglobuline cu o specificitate unica, astfel c@ fiecare limfocit B este capabil si raspundi unui epitop unic. Acest aspect a fost infeles si acceptat odati cu teoria selectiei clonale, Antigenele patrunse in organism vor selecta acele clone de limfocite care au specificitajile potrivite, le vor activa si vor induce proliferarea lor. O parte din aceste limfocite se vor diferentia in plasmocite, celule care nu mai exprima imunoglobuline pe suprafata deoarece sintetizeaz lanturi grele mai scurte si sunt astfel incapabile de a mai insera aceste molecule in membrana. in schimb, plasmocitele vor secreta imunoglobulinele, iar aceasta variant& solubilé a receptorului pentru antigen al limfocitului B capati numele de anticorp. Anticorpii sunt si ei capabili si recunoasca antigenele in mod specific, conducdnd la formarea de complexe antigen-anticorp (complexe imune). Imunoglobulinele reprezinti componentul central al receptorului pentru antigen al limfocitului B (BCR ~ B cell receptor), ciruia i se alituri moleculele constante Igo. si IgB, cu rol in transmiterea intracelulara a semnalului interceptat de receptor. Se estimeaza ci sistemul imun al mamiferelor este capabil sd sintetizeze mai mult de 10!” imunoglobuline (anticorpi) diferite’, un numir imens de molecule, care depaseste cu mult numarul de gene pe care genomul uman il poate pune la dispozitie. Se pune firesc intrebarea: cum este posibila sinteza numdrului imens de imunoglobuline. O prima teorie (germ-line theory ~ teoria liniei germinale) estima ci doar aproximativ 15% dintre genele unui genom haploid sunt alocate codificdrii imunoglobulinelor, fara s4 poata oferi insi nici o explicatie pentru modalitatea de a forma, cu un numér limitat de gene, un numar att de mare de " Exitemarepunilorhipervarable a fst pus th evident de cre Wu si Kabat in diagramele care le poaitnumele. Analizareguailor ‘ariabile a reeva cl, dn pune de vedere al stuctriprimare, difeenee dine Ianur se repisese la nivel unorporiufngust,denumite (CDR (complementarity determining region), in tim ce, n afra acestora(egiuni cad), dfeenfele dine lanai nu sunt nici pe depart la {el demarcate, *Totaltateaspesiftilar dferite pe care le poate podvcesistemul imun este cunoscuh sub numele de Repertory Imuneogtestructuri diferite. Alte teorii ulterioare (somatic variation theories — teoriile variatici somatice) sustineau c&, intr-adevar, din totalul genelor din genom, doar un numér limitat erau dedicate imunoglobulinelor, dar c&, prin recombindri si mutagii, acestea erau capabile si duca la diversitate. Din pacate ins’, nici aceste teorii nu au reusit sA raspunda la intrebarea ridicatd de studiile structurale, care au evidentiat, ci moleculele de anticorpi manifesti nu numai diversitate la capatul N-terminal dar si constanfé cAtre capitul C-terminal, Astfel, a apirut pentru prima oard (Dreyer si Benett, 1965) ideea c& exist gene separate pentru regiunea variabild si respectiv regiunea constantd, iar aceste gene reusesc sa se uneascd la nivelul ADN-ului pentru a forma o secvenfa continua. Mai mult decat atat, intuijia celor doi se apropie foarte mult de realitatea cunoscuta astizi si anume c& pentru partea variabild exist disponibile sute de gene, in timp ce pentru partea constanta e necesara doar una, Au trebuit s treacd ins mai bine de 10 ani pentru ca progresul tehnologic si poatd evidentia (Susumu Tonegawa, 1976) existenja unor gene separate pentru regiunea variabild si constant, ca si rearanjarea genelor in cursul diferentierii limfocitelor B. Pe masura ce a devenit posibila clonarea si secventierea genelor, s-a dovedit c4 procesul este si mai complex. 1, FORMAREA LANTURILOR USOARE, Imunoglobulinele pot utiliza doua tipuri de lanfuri L, denumite kappa (k) si respectiv lambda (2) in functie de partea constant. Partea constanta si partea variabila a lanturilor usoare sunt aproximativ egale din punct de vedere al dimensiunii. 0 molecula de imunoglobulina poate folosi fie lanquri k, fie languri 2. (dar nu ambele simultan), fara ca aceasta sa afecteze in vreun fel functionalitatea receptorului sau a anticorpului, Fiecare dintre cele dowd lanquri usoare este codificat de gene distincte, situate pe cromosomi diferiti: setul de gene care codificd lanqul k se gaseste situat pe cromosomul 2 iar genele lanfului usor 2 se gasesc situate pe eromosomul 22 Prima optiune a limfocitului B este reprezentata intotdeauna de lanful usor k. Partea variabila a lanfului k (incepand de la capatul N-terminal) are o lungime de 108 aminoacizi si este codificata de doua segmente genice distincte: segmentul genic V (variabila) codifica primii 95 de aminoacizi si segmentul genic J (joining — unire) codifica aminoacizii 96-108. + Analiza genica a relevat ca in genomul celulelor germinale umane exist aproximativ 75 de segmente genice Vz diferite, fiecare dintre ele putand codifica pentru un segment initial distinet al domeniului variabil k. Aceste gene variabile sunt aranjate in mod liniar, separate prin introni si precedate (in plus fa, de promotori) de o seevenfi exonicé denumiti Leader (conducatoare), situata in aval fata de promotor si care va codifica un scurt peptid care are rolul de a introduce si ghida lanful ce se sintetizeaza in reticulul endoplasmatic. Acest peptid leader va fi insa clivat de la nivelul langului sintetizat, inainte s8 aiba loc asamblarea Janqurilor usoare gi grele. + Lao oarecare distanfa de grupul genelor V, spre capatul telomeric al ADN-ului, se giseste grupul celor 6 segmente genice Jy dup care, separati printr-un intron foarte lung, se giseste singura gend pentru regiunea constanté Cy, care codificd intreaga portiune constanta a lantului k. Formarea lanfului k incepe prin aducerea unui segment genic Ve si a unui segment genic Jy in imediata vecinatate unul fafa de celalalt, fenomen numit rearanjare genie. Genele sunt rearanjate si unite datorita existenfei la cele doud capete a unor secvente intronice denumite RSS (Recombination Signal Sequences — secvente semnal de recombinare). Procesul este mediat de enzimele codificate de genele RAG-1 si RAG-2 (recombination activation genes ~ gene de activare a recombinarii). Aceste enzime actioneaz exclusiv la nivelul limfocitelor, iar prezenja lor simultana este indispensabila pentru buna funcfionare a procesului(@) Nucleotide sequence of RSSs CACAGTG~(23 bpEACAAAAACC GGTTTTTGT12 bpPCACTGTG 23 by GTGTCAG TGTTTTTGG CCAAAAACA12 bpPGTGACAC Heptamer Nonamer Nonamer Heptamer ‘Two-urn RSS ‘One-turn RSS ‘In cursul procesului de rearanjare, cele dou segmente genice V si J, alese in mod complet aleatoriu, vor fi unite, dand nastere unei secvente genice continue; totodaté, intregul material genetic care se gisea intre cele doua gene va fi excizat si indepirtat. Astfel, ADN-ul limfocitului B care a suferit o rearanjare a genelor lanfului k va contine urmatoarele regiuni, incepind dinspre centromer citre telomer: toate segmentele genice Vx de dinaintea celei selectate, promotor-ul si exonul Leader (L) al segmentului genic Vy, ales, un intron, segmentul genic continuu ViJ, urmat de segmentele genice J, neselectate, un intron si gena pentru regiunea constant, Seeventa rearanjatd a lanfului usor este apoi transcrisi de cdtre 0 ARN-polimeraza, incepand de la segmentul L pana la semnalul stop de dup gena pentru regiunea constant, generind astfel un transcript ARN primar. Urmeaza apoi un proces de taiere (matisare) a ARNm precursor, prin care sunt indepartate secventele necodante si un proces de poliadenilare a genei constante. Rezulta astfel ARNm matur care va parasi nucleul gi se va lega ulterior la nivelul ribosomilor. Aici are loc translatia si proteina ce se sintetizeaza va fi dirijati, de catre segmentul Leader de la nivelul capatului N-terminal, in interiorul Iumenului reticulului endoplasmatic rugos (RER). in RER, seeventa Leader este indepartat’ iar lanful usor va putea, abia acum, s se asocieze cu un lant greu. Vos Rearranged DNA ML V2 Vis tne is deb oy a) — a —— | ansoroon Primary ANA Transcript, ee ee Cry i Solcing cae: mRNA,Genele lanfului usor 2 se gisesc situate la om pe cromosomul 22. Locusul uman confine aproximativ 75 de segmente genice Vj si 4 segmente genice J;, despre care se stie c& sunt functionale (pe langa altele nefunctionale, numite pseudogene). Organizarea locusului 2. este diferita de cea pentru k, fiecare segment genic J}, fiind asociat cu eéte un segment genic C; distinct. Sinteza lanfului 2 este similara in principiu cu cea a langului k: printr-o rearanjare aleatorie, mediati de RAGI si RAG2, un segment genic Vj, (care codificd primi 97 de aminoacizi) este unit cu o un segment genic J, (care codifica urmatorii 13 aminoacizi ai regiunii variabile), dar ADN-ul rearanjat va utiliza mai departe acea geni C, asociati segmentului genic J ales. {gf Germtine DNA Primary RNA Transript vit as oat _ \ \/ secing | mRNA VACA | tani 2. FORMAREA LANTURILOR GRELE, Genele lantului greu (H) sunt situate la om situate pe cromosomul 14. Organizarea acestor gene este mai complexa decit cea a genelor ce codificd lanturile usoare (L) deoarece exista un segment genic suplimentar D, care codifica o portiune a regiunii variabile. Astfel, segmental genic Vi (cu o lungime de aprox. 300 baze azotate) codificd primi 94 de aminoacizi iar segmentul genic Jy (cu o lungime de aprox. 30-40 de baze azotate) secventa curprinsa intre aminoacizii 98-113; secventa intermediara, extrem de scurti (95-97), este codificata de un segment genic denumit Dj (Diversitate) (cu 0 lungime de aprox. 9-23 de baze azotate). Prin secvenfializarea directa a genelor de pe cromosomul 14, astazi stim c& exist, incepand de la telomer spre centromer, un grup de 130 de segmente genice Vx, urmate de un grup de 27 de segmente genice Dy, apoi, la o oarecare distanfa, 6 segmente genice Jy functionale,‘rtm be nin pee el ee © alta caracteristica ce particularizeaza genele lanqurilor grele este prezenta in genomul celulelor germinale a unor gene multiple ce codified regiunea constanta. Partea constant a Jantului greu este responsabilé pentru conferirea asa numitelor functii “biologice” ale anticorpilor, iar conservarea acestor importante functii efectorii este realizata prin mentinerea ‘unui numar limitat de gene pentru regiunea constant’, Human ign Locus 10 fan wwe wan Dat De OW2T Wt he SS kB ‘Hume tok Locus age wwe ee ee ee ‘Oo a ‘Human igrLocus wt ve =o ee Ti vers =e Prewconne Landa soponeoty I aed Desgrens SN Cvegments oonn tee Spre deosebire de partea constanti a lanfurilor usoare, regiunea situat& spre capatul C-terminal a lanfurilor gree este cea care hotirasteincadrarea intregii imunoglobuline intr-una din cele 5 clase (isotip)°. Grupul genelor Cx (fiecare dintre ele flancate de introni) este separat de genele Jy printr-un intron lung. in plus, fiecare gen Cy este format din mai mulfi exoni si introni. Fiecare dintre exoni codified cfte un domeniu distinct al regiunii constante. Genele regiunii * Panea constant laulu grou, coiicst de o stam gend constants, pemiteinadrarainregi imunoglobulnent-una din cele S clase (Gsotpur) A.D, F, G, M-De fap, exst 9 tpun distnete de lan grele ceea ce permite dstine|a unoe case i sudelas: IgG, IgG, 18G>, Ge pA IgA, IRM, gD, IgE.constante sunt aranjate intr-o anumita ordine, iar acest aranjament secvential nu este intimplator, fiind in directa legaturd cu ordinea exprimarii claselor de imunoglobuline in cursul diferenfierii limfocitului B sia rAspunsului initial in IgM la contactul cu un antigen. Pentru a genera o gend transcriptibild pentru lantul greu sunt necesare rearanjari distincte. in aceeasi maniera intamplatoare descrisi anterior, un segment genic Dy oarecare este adus in imediata proximitate a unui segment genic Jy. Langa segmentul DyJy care rezulta astfel este adus’ unul din segmentele genice Vi. Rearanjarile de la nivelul ADN-ului cromosomului 14 vor conduce la urmatoarea succesiune, dinspre telomer citre centromer: segmentele genice Vi neselectate, promotor-ul segmentului genic Vy selectat, exonul Leader, un scurt intron, segmentul continu VDJ, un alt intron, segmentele genice Jy neselectate, un intron lung si intreaga serie de gene constante, Odata rearanjarrile terminate, o ARN polimeraza se va lega la promotor si va transcrie intreaga secventa (inclusiv intronii). in acest proces de transcriptie sunt antrenate si primele doud gene constante, care sunt C, si Cs. Rezult& astfel un transcript ARN primar care va urma un proces de matisare si poliadenilare diferentiata. Matisarea ARN- ului va conduce in acest caz nu numai la eliminarea intronilor ci si la separarea genelor C, si Cs, Daca intr-o prima etapa, segmental VDJ va fuziona cu Cy, si astfel primul lant greu sintetizat de limfocitul B va fi un lant greu yt (iar prima imunoglobulina produsa va fi IgM), in etapa imediat urmatoare, segmentul VDJ se va asocia, intr-o maniera cvasialternativa, atat cu gena C,, cat si cu gena Cs. Consecina acestui proces particular va fi exprimarea simultan’, pe suprafaja aceleiasi celule B, att de IgM, cat si de IgD, avind ins aceeasi specificitate, determinata de aceeasi combinatie distineta VDI. 3. MECANISMUL REARANJARILOR GENELOR CARE CODIFICA PENTRU REGIUNEA VARIABILA Rearanjarile genelor decurg aga cum au fost descrise mai sus, dar se pot pune firese doud {ntrebari: cum se face oare c& genele sunt asamblate in mod corect, intotdeauna 0 gen Vi este asociatd cu o gend Dy si nu direct cu gena Jy? Cum se face cd asocierea genelor se produce prin unirea segmentelor genice in ordinea corecti 5'-3° si de ce nu e posibili Tearanjarea a doua gene din acelasi grup (V, D sau J)? fnfelegerea mecanismului a aparut odati cu identificarea a doud secvente conservate la nivelul ADN-ului din genomul celulelor germinale, fiecare dintre ele constand dintr-un heptamer palindromic si un nonamer bogat in Asi T, separate de catre 0 secventi neconservati, formata fie din 12, fie din 23 de perechi de baze azotate. Lungimea acestor “distantieri” corespunde fie unei spire, fie a dowd spire complete a helix-ului ADN. Aceste secvente sunt intronice si se gisesc dupa fiecare segment genic V, inaintea fiecdrui segment genic J si la ambele capete ale segmentelor genice D. Intronii descrisi functioneaza ca jinte de recunoastere — secvenfe semnal ~ pentru enzimele responsabile pentru rearanjarea genelor si sunt denumite RSS (Recombination Signal Sequence). Rearanjarea genelor este rezultatul acjiunii mai multor enzime, denumite generic “recombinaze”. Primele astfel de recombinaze responsabile pentru procesele care au loc in limfocite au fost descrise in 1990: genele RAG1 si RAG2 (Recombination Activating Gene) codificd proteine care, doar daca actioneaz& impreuna, sunt capabile si inducd rearanjarea VDJ sau VI". Rearanjarile genelor V(D)J — destinate partilor variabile a imunoglobulinelor — pot fi “productive” sau “non-productive”. O rearanjare productiva este aceea care va conduce la 0 secvenfi VJ sau VDJ care si poati fi transcrisi gi apoi translati in intregime. O rearanjare neproductiva decaleaz& cadrul de lecturd generind codoni stop care vor bloca translajia iar * Recombinazee codifcae de cre RAG! gi RAG2, alituri de encima TET (Terminal deoxinucleotiil Transferaa) sunt singurele caze se esse doar in limitecelulele vor fi eliminate prin apoptoza. Desi se considera cd tdierea ADN-ului se face in mod precis la joncfiunea dintre exon si intronul RSS, procesul ulterior de fuziune a segmentelor genice este adesea imperfect. Aceasta imprecizie reprezinta o sabie cu doud taiguri. Pe de o parte, confer’ un imens avantaj limfocitelor, conducand la generarea unui surplus de diversitate, dar, pe de alta parte, poate conduce la rearanjiri neproductive. Limfocitele sunt celule somatice diploide si conjin deci atat cromosomi materi cat si paterni Toate genele implicate in codificarea lanjurilor pentru imunoglobuline (ca si cele pentru TCR ~T cell receptor, receptorul pentru antigen al limfocitului T) sunt gene dominante. Cu toate acestea, limfocitelor nu li se permite decat utilizarea alelelor de pe un singur cromosom. Fenomenul (unic limfocitelor), a fost denumit “excluzie alelicd”. Singura rearanjare care are Joc simultan pe ambii cromosomi este cea dintre genele Dy si Jy, toate celelalte desfagurdndu- se fie pe un cromosom, fie pe cel pereche. in acest fel, fiecare limfocit va retine doar cate 0 rearanjare productiva VDJ si respectiv VJ, astfel incat vor fi produse lanturi usoare si grele avand o parte variabild identica. Asamblarea lor va conduce in final la obfinerea de receptori pentru antigen cu o specificitate unica. 4. FACTORI CARE CONTRIBUIE LA GENERAREA DIVERSITATIL IMUNOGLOBULINELOR Privind retrospectiv cdtre primele doud teorii emise cu privire la diversitatea receptorilor pentru antigen, teoria liniei germinale si teoria somaticd, constatim cA fiecare dintre ele confine elemente validate ulterior experimental. Prezentim in continuare 0 sintez’ a mecanismelor care determina, in ultima instant, obfinerea acestui numar remarcabil de receptori pentru antigene: (1) In primul rand trebuie remareat c&, spre deosebire de oricare alte proteine sintetizate in organism, codificarea lanfurilor imunoglobulinelor este asiguratd de mai multe gene, care, ulterior, vor fi asamblate intr-o secvent contigua. (2) Fiecare dintre aceste gene este aleasa dintr-un rezervor genic alcatuit din mai multe gene, perfect individualizate. Cel mai bine reprezentat, din acest punet de vedere, este grupul segmentelor genice V, atit cel destinat lanturilor grele cat si usoare. (3) Mecanismul cel mai important, care creeazi el insusi diversitate si oferd in plus posibilitatea interventici unor mecanisme suplimentare ulterioare, este reprezentat de rearanjarile aleatorii, guvernate de recombinaze. Faptul c& aceste reasortari genice se produc intr-o 0 manieri intdmplatoare, fra sa existe reguli care si impun’ combinatii particulare, las practic posibilitatea formarii oricdrei combinafii de gene*. (4) Paratopul imunoglobulinelor este format din combinatia partii variabile a unui lant grew sia parti variabile a unui lant usor. Asocierea dintre un lant greu si unul usor este de asemenea aleatorie; intr-o celula B oarecare, intimplarea poate conduce la sinteza unor lanturi H_ si L oarecare, iar acestea, odata asamblate, vor conduce la 0 combinatie particulara‘ (5) Imprecizia unirii genelor conduce la ceea ce a fost denumit& adiversitate jonctionala” sau “flexibilitate joncyionala”. Aga cum menjionam anterior, tdierea dintre RSS si secventa codanta pare s& fie precisa, in schimb, unirea secventelor codante este, cel mai adesea, 5 Un caleutsimplu ne ara cin cau! lang rele, dac orice gena D se poate combina cy ericegena Js apol eu orice gen, nual 4 combina posibile pe cae Hl patem objine este de $1(VH) x 27(DH) x 6H) = 8262. in cazullanulorusoare de tip k,ealeutul ne ‘onduce Ia 40(Vk) x (Ik) = 200 de combina, respect 3A) x 402) = 120 de combinay pnt anurl soar. 6 Aslan calcul simp ne art et putem objne, in cul asoieri unui lant gre cu un an gor kun numa de 8262 x 200 = 1 652 400 de ‘Yatane, Aceattsumd, des impresiongnt, este totus depute de numirl de speifcai exstente in orpansm, care aletuieserepertrial imunolopic cae este estimat ine 10” s 10". Supluul de diversitate ete oft inst de mecanisme supimentar, eae ni a6 put nl ‘manifesta tn absena acest; sistem cu total deosebit rin care gene, situate la distanl Saree, sunt aleve Iatimplitor, allturate $3 unite ent a foema 0 ged hited %imprecisa. Joncfiunea genelor va deveni in acest fel un loc major de generare a diversitaqi, dat flind faptul c& acest proces este unul practic necontrolabil. 5.1 Regiunea P de adijie apare dupa tierea ADN-ului. Daca prima clivare apare la jonctiunea RSS-exon, in etapa urmitoare, nucleotidele de la acest capt vor face in aga fel incét, in momentul tZierii complete a ambelor catene, acestea s@ fie unite intre ele printr-o bucld, asa numitul “ac de pat”, Fenomenul se produce la capetele ambelor gene care urmeazi si fie fuzionate si, pentru ca unirea acestor gene si poati avea loc, “acele de par” trebuie ulterior gi ele tdiate. Aceasta a doua tdiere de cdtre 0 endonucleaza se face, cel mai adesea, asimetric, astfel incat una dintre catene va deveni mai lunga decat cealalalta. Este necesara interventia unor enzime de reparare care si adauge nucleotide complementare celor prezente la nivelul catenei mai lungi. Se creazii astfel o seeven{a palindromica la nivelul joncjiunii, motiv pentru care aceasta regiune a fost denumita “regiune P de aditie”. 6 Pee on van no atk => i= clea fain generates sites for the addition of Panucleotides SS ee E Repair enzymes add ‘complementary nucleotides BEAT Recta ees 5.2 In ultimele stadii ale rearanjarii VDJ, odata taiat acul de par, cele doua catene ale ADN- ului sunt taiate de catre exonucleaze inainte de a fi reparate de catre ligaze, Se intimpla frecvent ca exonucleazele sa taie chiar din secventele codante. Dupa ce ADN-ul a fost reparat, secvenfa genelor rearanjate difera de cea din ,germline”. 5.3 Regiunea N de aditie este creat’ cu ajutorul uni e numite TdT (terminal deoxinucleotidil transferaze). Rolul TAT este acela de a adauga nucleotide la capetele genei D in cursul unirii acesteia la gena J sau la gena V. Numarul maxim de baze azotate pe care enzima le poate alipi genei D este de 15, dar numarul de nucleotide transferat este aleator gi astfel se formeaz secvenje complet diferite. iNest aie ss La =§> aie i oe generates sites for the addition of Prnuceotides SS re DE ‘ar adds Nocteonies | Rerirenames add complemen mutes FTCGAAGT TATA Senna nero)Ceca ce este important de subliniat in acest moment este cd diversitatea jonetionald, adiia in regiunea P si in regiunea N si deletiile conduc la aparitia unor secvenfe genice complet noi, care nu existau initial in genomul celulelor germinale. Aceste mecanisme sunt cele care reusesc sa ridice diversitatea Ig-nelor pana la cifra avansata anterior, de aproximativ 10'° specificitayi diferite. (6) Unalt mecanism implicat in generarea diversititii este constituit de mutagiile somatice ce se produc intimplator, printr-un mecanism inc neelucidat, 1a nivelul genelor rearanjate (VJ sau VDJ). Un element deosebit este reprezentat de frecventa crescuta (hipermutajii) cu care aceste mutafii apar, de cel pusin o sutd de mii de ori mai inalta decat frecventa cu care apar mutafiile spontane la nivelul oric&ror alte gene’. Acest fenomen este caracteristic limfocitelor B mature care raspund fafa de un antigen si are potentialul de a genera maturatie de afinitate. 5. ASOCIEREA GENEI CONSTANTE $I COMUTAREA DE CLASA Organizarea genelor ce codified partea constanta a lanturilor este diferita de cea responsabila pentru partea variabila. in cazul lanturilor usoare, exist o singur& gena Cx si mai multe gene Cj, dar partea constanta a lanfurilor ugoare nu influenteaz& nici paratopul si nici clasa imunoglobulinei respective. De mult mai mare importanfi este ins partea constant a lanturilor grele, responsabila pentru determinarea isotipului si a functiilor numite “biologice” ale anticorpilor. Genele pentru regiunile constante sunt mult mai Iungi decat cele pentru regiunile variabile, fiind aleatuite dintr-o serie de exoni distincyi ce codificd fiecare in parte domeniile extracelulare, regiunea “balama” (acolo unde este cazul), domeniul ‘transmembranar gi coada intracitoplasmatica O caracteristic’ a genelor Cy este prezenfa unor gene multiple in genomul celulelor germinale, corespunzatoare fiecdrei clase si subclase de imunoglobuline. Ultima gend Jy este separata de prima gena Cy printr-un intron foarte lung. in plus, fiecare gen Cy este precedata ‘nu numai de promotor, dar si de un amplificator al transcriptiei (enhancer) precum si de cate 0 secventa intronicd denumita “switch” (comutare), caracteristicd fiecdrei gene in parte; o exceptie notabili este reprezentata de gena Cs, lipsité de seevenfa de comutare. Secventele de comutare sunt destul de lungi, fiind alc&tuite din mai multe motive repetitive. Rolul acestor introni este acela de a permite asocierea la acest nivel a unor recombinaze care sunt diferite pentru fiecare clas in parte. In timpul diferengierii limfocitului B, genele C,, si Cs, cele mai apropiate de genele J, sunt primele transcrise, Ca un element particular, ambele gene sunt transcrise simultan, probabil tocmai datorita absentei seoventei de comutare din fafa genei Cs, precum si a distanfei de numai 5 kb dintre cele doug gene. Astfel, transcriptul primar, cu o lungime de aproximativ 15 kb, contine genele VDJC,Cs, Dintre cele patru situsuri de poliadenilare, primele doud sunt asociate genei C,, iar celelalte doud genei Cs. Dac& transcriptul primar este clivat si poliadenilarea are loc la nivelul situsului 2, atunci ARN-ul mesager va contine intreaga seeventa a genei C, gi va rezulta astfel forma membranard a lantului, Daca insd poliadenilarea se face la nivelul situsului 4, atunci, prin tdierea ARN-ului, secventa C,, va fi inldturata gi se va ajunge la ARNm care codific& pentru forma membranara a lanfului Cs. Acest proces se produce simultan, astfel c& secventa VDJ are posibilitatea si se uneascd, de o manieri altemativa si cu gena C, si cu gena Cs. in consecinga, limfocitele B mature dar naive vor 7 Se pure eX anumite motive de nucleotide i seevente palindromic de ia nivel geelorrearanjate (VS sau VDI) suot in mo pate! susceptible tn fata acestas mecaism nlimfocitele B mature find afectateprefereapal acl secvente care ced reguniehipervariabile (CDR). In med normal, hipermutaile somatice au loc i central geminal (dei in organele limfoidesecundare), co consecnflsexpuneti Inantigen: acele imfocite 1 care au receptrulcu cea mai are afinitate pentru snigenulrexpectiv vor fi selectate in mod preferential, vor suprviu io dine acest se vor diferent i celle cu memore.Procesul fst denust “mature de afinleexprima simultan pe suprafata atat IgM cit si IgD, dar cu aceeasi specificitate, determinati de catre aceeasi combinatie VDJ. Dupa stimularea antigenic ins, expresia IgD este pierdutd, iar IgM tinde s@ fie inlocuitd, in cele mai multe cazuri, cu un alt isotip, fenomen denumit “comutare de clasa”. Astfel, gena C,. va fi inlocuiti cu o alta, situat’ spre capatul 3° al ADN-ului. Trebuie subliniat ins cé acest proces are loc in timpul viejii adulte a limfocitului B si noi rearanjari genice nu mai sunt posibile; odata ce limfocitul a ajuns la o anumita reasortare productiva, aceasta va deveni permanent pentru celula in cauz. Astfel, comutarea de clas nu influeneaza specificitatea imunoglobulinei respectiv: De asemenea, trebuie precizat c& procesul de comutare de clasi are loc in contextul unui raspuns imun fai de un antigen T-dependent, cu alte cuvinte, un rspuns imun in care sunt implicate si limfocitele T helper, prin intermediul anumitor seturi de citokine si molecule de suprafata®. vou * Réspunsu fai de ancigencl T independent, n absenia icervenilimfoctelorT helper, nu conduce nic la merorie imunoogis sini a comutare decash. 106. SECRETIA ANTICORPILOR in cazul cAnd limfocitul B s-a diferentiat in plasmocit, sinteza imunoglobulinelor de suprafata este inlocuita de cea de anticorpi. Diferenja nu se regiseste la partea variabila (in mod esenfial, specificitatea anticorpilor este aceeasi cu a imunoglobulinelor de pe suprafata limfocitelor B stimulate initial) ci la nivelul secvengei situatd spre capatul C-terminal al partii constante. Posibilitatea sintezei unei forme sau a alteia se datoreaz existenjei unor exoni suplimentari, denumiti M1 si M2, localizafi in aval de exonul responsabil pentru ultimul domeniu extracelular constant. Exonul MI codified portiunea transmembranard, iar M2 portiunea intracitoplasmatic’. Dac& poliadenilarea se produce la nivelul situsului 1 de la nivelul transcriptului primar, atunci exonii M1 si M2 sunt pierdui gi se va ajunge la forma secretata a lanfului greu respectiv. DNA Cut Cu2 Cus Ouse MME, Polyadenylation Polyadenylation ‘3' of M2 SofSe Pomermn Cut Oye Gus QW4Se MI M2 Pana’ | Fa sire Primary wae mime out ee a pmo TmRNA for Membrane-bound IgM Seg RIO SAMA MAINA for. ea | Secreted lM {in concluzie, formarea imunoglobulinelor este consecinfa unui proces genetic absolut distinct, unic receptorilor pentru antigene, cu o mulfime de excepfii de la regula. Astfel, un singur peptid va trebui codificat de mai multe gene, iar elementul principal al intregului proces este reprezentat de rearanjarea la intémplare a mai multor gene destinate regiunii variabile. in plus, genele care codificd pentru regiunile constante sunt fuzionate doar la nivel de ARN, ceea ce va crea premizele asocierii alternative ale genelor Cut si Cd, intr-o prima instanga gi apoi ale comutarii de clasa. in ciuda faptului ca genele implicate in formarea imunoglobulinelor sunt dominante, datorita excluziei alelice vor putea fi exprimate doar alele de pe un cromosom sau altul.MECANISMELE GENETICE CARE STAU LA BAZA GENERARII DIVERSITATI TCR intre imunoglobuline si receptorul pentru antigen al celulei T (TCR) exist multe asemandri din punct de vedere structural. Domeniile extracelulare care alcdtuiesc cele doud lanuri sunt, ca si la Ig, constante si variabile, intreaga portiune extracelular’ a TCR seamani cu fragmentul Fab al anticorpilor’,iar componenta dedicat recunoasterii este asociata cu molecula constant’ CD3 (analogi Iga si IgB, cu rol in transmiterea intracelular’i a semnalului). Mecanismul de formare a receptorului pentru antigen al limfocitelor T prezinta foarte multe aspecte extrem de aseméndtoare cu cel al formarii imunoglobulinelor, implicand, in esenta, rearanjari genice V(D)J si diversitate jonofionala. Analiza lanturilor TCR demonstreaza de asemenea existenta regiunilor hipervariabile, responsabile pentru formarea efectiva a situsului de interactiune al receptorului. Din aceste motive, am ales si ne concentrim in special asupra diferenfelor de formare a celor doud categorii de receptori. O prima deosebire notabild este reprezentati de existenta a doud tipuri de TCR: TCR 1 (y6) si TCR 2 (af). Indiferent de tipul de TCR, acesta este asociat la nivel transmembranar, prin legaturi electrostatice, cu aceeasi molecula CD3. Exist 4 familii de gene la nivelul ADN-ului din genomul celulelor germinale, dedicate céte unui anumit tip de lant. Genele care codified lanturile a. si 6 sunt grupate pe cromosomul 14 (in alta regiune decat genele pentru lanful greu al imunoglobulinelor), iar genele lanturilor B si pe cromosomul 7. Localizarea particulara a genelor 6 nu este intimplatoare. Atunci cand celula reuseste s& ajunga la o rearanjare productiva a genelor pentru lantul a, genele lanqului 8 sunt deletate; astfel, la nivelul unui anumit limfocit T, nu poate exista o expresie simultana de TCR af si TCR ¥6. ‘A, Human TORA Locus i u A. Human TCRB Locus BI vpe vpn-48 Dpt vBta-s) Cpt Dp2 Jp2N-7) CBZ EB y. ey Lamy * Domenial Cy nu este onganiat ca un domenie globular. Conformayia TCR pare sa ie ma rigid decdt «1g dato interactuniler diate _domenile Feces lang, posi dato dfeonei dnt sisterulderocuastere a Ag propria al Fiedrui ecepoe. ALwe wo wit Wize diay cr Sena) oe ror EY y A. Human TCRD Locus Vo. Je s s Vet V62_—««V63_—=«(HTB EHS «EB CSV (ESHA p= 3 u 2 1B 6 L540 Reasortarea genelor se face sub influenta enzimelor codificate de aceleasi RAGI si RAG2, sistemul de recunoastere a genelor este reprezentat de aceeasi_secven{fi heptamer/distangier/nonamer, fuziunea secvenjelor genice conduce la imprecizie jonctionala, la care se adauga imprecizia inserjionald. Existenfa mai multor gene D sau J, grupate distinct, poate conduce la unele diferente de rearanjare’”. A. TORA = z Sistemul distinct de repartizare al RSS-urilor in cazul genelor TCR permite ca segmente genice V sa fuzioneze direct cu segmente genice J. Spre deosebire insa de segmentele genice D utilizate de limfocitele B (flancate de RSS-uri formate din cate 12 nucleotide si care astfel nu pot fuziona unele cu altele), pana la 3 segmentele genice D ale TCR-ului uman pot fuziona, inainte de unirea cu segmentul genic J. Ca urmare, desi numarul de gene din grupul V este mai mic decat cel de la Ig, repertoriul TCR este mai mare decat al imunogloblinelor, tocmai datorit’ unei enorme variabil jjonctionale si inserfionale (regiune N de aditie, regiune P de adifie). Aceleasi mecanisme reprezinta, in acelasi timp, si un factor de rise, putdnd conduce la rearanjari neproductive care fie fac produsul nefuncjional, fie fac ca secvenfa de ADN si nu mai poati fi citita (introducerea unor codoni stop). diferengi importantd intre procesele de formare ale celor doi receptori este aceea cA, in urma activarii antigenice, genele TCR nu sufera hipermutajii somatice. Absen{a mutatiilor intamplatoare reprezinta 0 masura de siguran}a impotriva aparitiei limfocitelor autoreactive, cu atét mai important cu cat limfocitele T au un sistem de recunoastere particular, care vizeazd nu doar antigenul - non-self - ci si molecula de MHC (Major Histocompatibility ‘Complex — Complex Major de Histocompatibilitate) self - care prezinta acest antigen. " Aste, dacd in cazl genelor lanl B este aleasdgena Ds aceasta se va putea asoca doar eu genJ din al dolla grup. Dac este least ‘ns gen Dy, earanjarea va putea asoca, intro manierd aleaorie, feo pend J din primal grup, fe din al dole. 1dFormarea TCR incepe in corticala timusului, intr-o etapa de dezvoltare a timocitelor'' cand acestea si-au cAstigat expresia moleculei CD3, enzima TAT este de asemenea prezenta, dar nici una dintre moleculele co-receptor (CD4 si CD8) nu au aparut inca — motiv pentru care celulele sunt denumite dublu negative (DN). Primele gene care incep si se rearanjeze, mai mult sau mai pufin simultan, sunt cele pentru lanfurile B si 7. Dacd genele y suferd o reasortare productiva, incepe si rearanjarea genelor 6. Daca atat genele pentru lanturile cat si cele pentru lanturile 5 sunt rearanjate productiv, cu alte cuvinte transcripfia poate avea loc si poate incepe sinteza lanturilor, alte rearanjari nu vor mai avea loc gi acele timocite vor rimane 76 si se vor dezvolta, pe o cale diferita, in celule DN, CD3+ 76. Acestea vor reprezenta aproximativ 5% din totalul timocitelor la adult. Majoritatea timocitelor dublu negative aleg ins o altd cale de dezvoltare. Daci rearanjirile y si/sau 8 nu sunt functionale, vor continua rearanjarile f. Odati ce celula a ajuns la o rearanjare TCR productiva sunt suprimate alte rearanjari ale lanfurilor B-TCR (componenta a fenomenului de excluzie alelica). Astfel sunt selectate acele timocite care exprima lanqul B pentru o expansiune si maturare ulterioard. Din acest moment, pot fi declansate rearanjarile pentru lanful o, iar acele timocite care vor ajunge la rearanjari productive vor fi capabile s exprime pe suprafafi un TCR af complet format, chiar daca la nivele scdzute. Timocitele sunt in continuare dublu pozitive gi se gasesc la nivelul corticalei profunde a timusului. De aici incolo, aceste celule vor suferi o serie de procese complexe, cunoscute sub numele de selecfie pozitiva si negativa Selecfia pozitiva are loc la nivelul corticalei profunde, sub influenfa celulelor epiteliale corticale. Acele timocite care sunt capabile si recunoasc’ prin intermediul TCR-ului moleculele MHC (cu 0 afinitate medie) sunt selectate pozitiv, vor supravieui $i vor primi semnale care le vor determina s& prolifereze. Consecinja acestui fenomen este cea ce se numeste “restrictie MHC”, sau, cu alte cuvinte, capacitatea limfocitelor T de a recunoaste antigenul doar in contextul moleculelor MHC proprii organismului respectiv. Celulele care nu corespund acestui criteriu sunt eliminate prin apoptoza. Excluzia alelicd functioneazd cu maxima strictete in cazul formarii imunoglobulinelor. in cazul TCR-ului ins, dacd pentru lantul f excluzia alelica pare sa reprezinte regula, in cazul lanfurilor o. este mai putin stricta. in cazul in care se produc rearanjari productive pe ambi cromosomi, cele dou lanfuri a diferite vor conduce la existenga simultand a doud TCR-uri cu specificitayi antigenice diferite. Desi mu exist un consens asupra numarului de astfel de limfocite T mature circulante, se pare cd in astfel de situatii doar unul dintre cei doi receptori reuseste si treacd de procesele de selectie (in special de selectia pozitiva si ca urmare si fie MHC-limitat) Numarul celulelor care poseda un receptor corespunzator din acest punct de vedere este mic si, ca urmare, o serie din celulele care nu au fost selectate pozitiv au posibilitatea sa isi reia rearanjarile pentru lantul o.. Dac noua rearanjare va fi productiva, exist potentialul de a conduce la © noua specificitate. Acest fenomen este denumit “editare” iar timocitul cdruia i se oferd aceast sansi va trebui si treaci din nou prin procesul de selectie pozitiva La nivelul jonctiunii cortico-medulare, unde se gisesc celule cu origine hematogent (macrofage gi celule dendritice) si mai departe in corticala medulara, sub influenta celulelor epiteliale de la acest nivel, are loc procesul de selecfie negativa'”. Eliminarea prin procesul de selectie negativa a timocitelor care poartd receptori de mare afinitate pentru molecule MHC self singure sau pentru antigenul self prezentate de MHC, conduce la tolerant fafa de self. ° Limfocitele di mus, aia in pin proces de dfeenire, sunt demure imocite © Selecta povtv a lmfoeitali Bare alts semiicfe(exprimaea unu receporiteredia) selectia negative reer ns de asemenea 1s eliminrealmfcialor B autoreactiveDeoarece procesul are loc in timus, este denumit toleranfi central. Sunt astfel practic eliminate fizic un numar important de limfocite autoreactive’. Recunoasterea unui tip de MHC sau altul are 0 consecin{a suplimentara: acele timocite care au recunoscut un MHC I se vor diferentia in continuare in limfocite T citotoxice (CD8+ CD4,), iar cele care au recunoscut MHC Il se vor diferentia in limfoeite T helper (CD4+ CD8-). TABLE 9-1 TCR MULTIGENE FAMILIES HUMANS No. of gene segments Chromosome Gene location HIDE pte) Chain 4 50 7m 1 & Chain” 4 Sus 3.1 B Chain 7 Sr eeets ee y Chaint 7 4 \emee) ‘The B-chain gene segments are located between the V, and, segments. “There are two repeats, each containing 1 Dy 6 or 7 jy and 1 C,, There are nwo repeats, each containing 2 or 8), and 1 C. SOURCE: Data from PAH Moss et al, 1992, Anne Rev. fmmnenol. 10:71, " acest proces nu este perfect; va continua tn periferie, dar aici vo f implicate mai degaba alte mecanisme decdt inducers apoptozei cellelor. 40.