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Dr MECHAI Abdelbasset
Chromosomes artificiels
Les chromosomes artificiels (ou minichromosomes) sont des structures qui copient les
chromosomes de la cellule hôte eucaryote et se répartissent régulièrement lors des divisions,
comme les chromosomes naturels.
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Chaque partie du pYAC porte un marqueur de
sélection utilisable dans la levure
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Chromosomes artificiels
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NB
Le YAC est un vecteur navette puisqu'il peut se répliquer aussi bien dans une cellule
de levure que dans une cellule bactérienne. A l'état natif c'est un plasmide circulaire qui
comporte de l'ADN de deux origines
h+
Ces fragments étant de taille différente on peut les séparer par électrophorèse sur gel
d'agarose et récupérer les deux premiers que l'on mélange avec des gros fragments à
intégrer ayant des extrémités cohésives compatibles
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Le minichromosome recombinant
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Sélection des cellules recombinantes
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Les vecteurs d'eucaryotes supérieurs
Les vecteurs de transfert de l'ADN dans les cellules d'eucaryotes supérieurs sont les virus. Les
principaux sont les virus de la vaccine, le virus SV40, les adénovirus, les baculovirus et les
rétrovirus.
Les retrovirus sont des virus à ARN qui pénètrent à l'intérieur de la cellule eucaryote,
convertissent leurs génomes en ADN par la transcriptase inverse.
L'ADN est ensuite intégré dans le génome hôte grâce à l'intégrase virale.
I- Récepteurs bactériens
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Escherichia coli
Les avantages
Les inconvénients
Les avantages
Les inconvénients
02 la présence d'une activité proléolytique qui peut être gênante pour les
produits formés.
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3. Récepteurs eucaryotes
04
Son caractère eucaryote la rend en principe parfaitement apte à une
transformation par de l'ADN eucaryote.
Les études ont d'abord concerné des fragments d'ADN puis des gènes entiers et
enfin l'intégralité d'un chromosome.
Le premier acide nucléique qui fut séquencé est l'ARNtAIa de levure en 1964.
L'obtention des fragments d'ADN s'est effectuée par l'emploi d'enzymes qui
coupent l'ADN en des sites spécifiques, les endonucléases de restriction.
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la méthode de Sanger
La methode met en œuvre une étape de dénaturation des deux brins
une hybridation avec une amorce marquée radioactivement et une élongation par
une ADN polymérase en présence de didésoxyribonucléosides triphosphate
(ddNTP).
Lorsqu'une faible quantité d'un ddNTP est présente (ddATP par exemple) en plus
des quatre dNTP nécessaire pour la polymérisation (dATP, dCTP, dGTP et dTTP),
plusieurs fragments marqués sont générés
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2. Réaction de polymérisation en chaîne (PCR)
Cette technique permet d'amplifier en nombre très élevé de copies une séquence
particulière d'ADN (ou parfois d'ARN), ce qui facilite grandement son étude et son
exploitation.
La PCR est basée sur le même principe de réplication que celui qui est
naturellement utilisé par les cellules pour dupliquer l'ADN. Les brins d'ADN
matrice sont obtenus par chauffage (dénaturation)
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La PCR nécessite :
l'ADN polymérase ;
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La technique PCR
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Réalisation pratique de la PCR
Une hybridation des amorces sur les brins matrice est effectuée a une température
bien précise.
Cette étape est très importante car, selon la température choisie, la spécificité
d'hybridation basée sur l'appartement A/T, G/C sera plus ou moins bonne
Cette polymérase est extraite de la souche Thermus aquaticus, une bactérie qui vit dans
des sources chaudes. Elle reste stable à 94 °C, température de déna-turation de l'ADN,
ce qui autorise plusieurs cycles PCR sur le même échantillon .
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3.Techniques d'hybridation des acides nucléiques
L'une des techniques majeures dans l'analyse d'un gène est la technique de
transfert selon Southern du nom de son inventeur, E.M. Southern.
Une sonde d'ADN connu (ADN marqué radioactivement par exemple) est mise
au contact de la réplique et hybridée par complémentarité aux fragments
d'ADN étudiés.
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- Stabilité
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Réplication
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Transcription
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Traduction
La traduction doit également être très efficace, ce qui
dépend de la fixation au ribosome et d'une bonne séquence
de lecture
Il peut arriver que la protéine fabriquée se révèle toxique pour l'hôte
: il faut alors trouver un biotype résistant (par mutagénèse) ou, en cas
de résultat négatif, changer de souche réceptrice.
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Excrétion
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Figure 25 : Expression par formation de protéines mixtes
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CHAPITRE IV:
Les protéines
recombinantes
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1. Biosynthèse de l'insuline
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méthode d'Itakura
fait intervenir les étapes suivantes:
culture des deux souches obtenues avec production des 2 protéines mixtes
β-gal-A et β-gal-B (ou selon le cas. trp-A et trp-B) ;
Cette insuline est commercialisée depuis 1982. Il faut signaler qu'il existe de
nombreuses autres méthodes de fabrication.
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Technique d'Itakura
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2. la somatostatine (SRIF)
la chaîne d'ADN est précédée par la séquence reconnue par l'enzyme
de restriction Eco RI et le codon méthionine et suivie par des codons
d'arrêt et la séquence reconnue par l'enzyme de restriction Bam HI
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2. la somatostatine (SRIF)
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2. la somatostatine (SRIF)
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