Univ Blida I. FSNV.

Département BPC Master 1 Microbiologie (2020)

Séquençage (2ème Partie)

Les nouvelles technologies de séquençage à trés haut débit ("next-

generation high-throughput DNA sequencing technologies" - NGST ou NGS)

Introduction :
Le séquençage de nouvelle génération (NGS) est le terme utilisé pour décrire différentes
méthodes qui permettent de séquencer des milliers ou des millions de fragments d'ADN en
parallèle, en une seule expérience. Les méthodes NGS permettent donc d'obtenir beaucoup plus
rapidement de vastes quantités de données nécessaires pour assembler une séquence entière du
génome, alors que cela n’est pas possible dans les techniques classiques de séquençage par
terminaison de chaîne (techniques de Sanger).

I. Préparation des échantillons pour le séquençage :

Cette étape de la technique est commune aux différentes méthodes utilisées pour réaliser
le NGS. Elle consiste en la préparation d’une banque de fragments d'ADN qui ont été
immobilisés sur un support solide de telle manière que plusieurs réactions de séquençage
peuvent être effectuées côte à côte, en parallèle, dans un réseau. Les fragments ont généralement
une longueur de 100 à 500 pb, les tailles précises dépendant des longueurs des séquences
individuelles qui peuvent être obtenues par la méthode de nouvelle génération utilisée. La façon
la plus utilisée pour décomposer l'ADN génomique en fragments est la sonication, une
technique qui utilise des ondes sonores à haute fréquence pour effectuer des coupes aléatoires
dans les molécules d'ADN.
Deux méthodes d'immobilisation différentes sont couramment utilisées dans le séquençage de
nouvelle génération. Dans la première méthode, le support solide est une lame de verre
recouverte de nombreuses copies d'un oligonucléotide qui serviront à attacher les fragments
d’ADN à la lame de verre (le support).

Fragments d’ADN

Adaptateur
Oligonucléotides
Oligonucléotides

Lame de verre
Figure 1. Immobilisation de fragments d'ADN par appariement de bases à des
oligonucléotides sur une lame de verre.
L'appariement des bases entre les oligonucléotides immobilisés et les adaptateurs ligaturés
aux extrémités des fragments d'ADN entraîne la fixation des fragments à la lame

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Des adaptateurs, de courts morceaux d'ADN double brins dont les séquences
correspondent à celles de l'oligonucléotide, sont ligaturés aux extrémités des fragments d'ADN,
qui sont ensuite dénaturés. Les molécules monocaténaires résultantes se fixent à la lame de
verre par appariement de bases entre leurs séquences adaptatrices et les oligonucléotides
immobilisés (Figure 1).
Dans la deuxième méthode d'immobilisation, le support solide est constitué par de
petites billes métalliques recouvertes de la protéine streptavidine. Les fragments d'ADN sont
ligaturés à des adaptateurs, dans ce cas des adaptateurs qui portent un marqueur de biotine
attaché à leurs extrémités 5ʹ. La biotine est une petite molécule organique qui se lie fortement
à la streptavidine, de sorte que les fragments se fixent aux billes métalliques par la liaison
biotine – streptavidine.
Les billes sont ensuite secouées dans un mélange huile-eau afin de générer une émulsion, de
sorte qu'il n'y aura qu'une seule bille dans chaque gouttelette aqueuse au sein de l'émulsion
(figure 2). Chaque gouttelette d’eau est ensuite transférée dans un puit différent sur un réseau
formé sur une bande en plastique.

a) bille

Liaision Streptavidine-biotine

b)
Goutte d’eau Fragment d’ADN lié à la bille

Emulsion

Figure 2. Immobilisation de fragments d'ADN par appariement de bases à des billes

métalliques.
(a) Chaque fragment d'ADN est attaché à une seule bille par une liaison streptavidine-
biotine. (b) Les billes, avec leurs fragments d'ADN attachés, sont secouées dans un
mélange huile-eau de telle sorte que, dans l'émulsion résultante, chaque gouttelette d'eau
ne contient qu’une seule bille

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L'étape finale de préparation de la banque est l'amplification des fragments d'ADN immobilisés
par PCR, pour produire un nombre suffisant de copies identiques à séquencer. Les adaptateurs
jouent maintenant un deuxième rôle car ils fournissent les sites pour les amorces pour cette
PCR. La même paire d'amorces peut donc être utilisée pour amplifier tous les fragments, même
si les fragments eux-mêmes ont des séquences différentes. Avec la méthode sur lame de verre,
les produits de PCR se fixent aux oligonucléotides adjacents, de sorte que chaque fragment de
départ est amplifié en un groupe immobilisé de fragments identiques (figure 4.10A). Si des
billes métalliques sont utilisées, la PCR est effectuée dans l'émulsion d'huile, de sorte que les
produits de chaque PCR sont conservés dans leur propre gouttelette d'eau, avant le dépôt des
gouttelettes dans les puits sur la bande en plastique (Figure 3).

Produits de PCR

PCR

PCR

Produits de PCR

Figure 3. Amplification des banques immobilisées.

(a) Sur les lames de verre, les copies de fragments obtenues par PCR se fixent aux
oligonucléotides adjacents, formant un groupe de fragments immobilisés identiques.
(b) Avec les billes métalliques, la PCR est effectuée dans l'émulsion huile-eau et les copies des
fragments sont conservées dans leurs gouttelettes d'eau.

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Séquençage (2ème Partie)

II. Diverses méthodes de séquençage de nouvelle génération ont été conçues :

1- Méthode ILLUMINA :
Actuellement, la méthode la plus populaire est basée sur le séquençage avec terminateur
réversible qui, comme dans la méthode de Sanger, utilise des nucléotides modifiés qui bloquent
la synthèse des brins lorsqu'ils sont incorporés à la fin d'un polynucléotide qui est synthétisé par
une ADN polymérase. La différence est que l'étape de terminaison est réversible, car le groupe
chimique attaché au carbone 3ʹ du nucléotide modifié peut être supprimé une fois que l'identité
du nucléotide incorporé dans la chaine a été confirmée (Figure 4).
Le premier cycle de séquençage commence en ajoutant les 4 terminateurs réversibles marqués,
les amorces et l’ADN polymérase.
a) • Après excitation par un laser, la fluorescence émise est récupérée et la première base est
lue.
b) • Le cycle suivant continue en ajoutant les 4 terminateurs réversibles marqués.
c) • Les cycles de séquences sont répétés pour lire chaque base les unes après les autres.

c
La lecture est effectuée à
chaque position sur toutes les
séquences en parallèle.
Le signal est détecté sur
l’ordinateur pour chaque
nucléotide incorporé et la
séquence est reconstituée

Figure 4. Méthode Illumina

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2- Technologie ROCHE 454 :

• Purification et chargement des fragments sur plaque. Le diamètre des puits ne permet
qu’une seule bille à la fois.

• Ajout des enzymes de séquençage et envoi des nucléotides individuels les uns après les
autres.

• Les bases complémentaires du brin matrice s’ajoutent une ou plusieurs à la fois.

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Séquençage (2ème Partie)

• Le signal chimie luminescent est enregistré par une caméra CCD.

• Séquençage par synthèse avec émission de lumière, on parle de pyroséquençage.
• La lecture est effectuée en simultanée sur plusieurs bases incorporées. Le « flowgram » est
alors lu pour obtenir la séquence.