NORMA CHILENA OFICIAL NCh1764.

Of98

Leche - Determinación de penicilina y antibióticos

lactámicos - Método A - Método del disco filtro

Preámbulo

El Instituto Nacional de Normalización, INN, es el organismo que tiene a su cargo el

estudio y preparación de las normas técnicas a nivel nacional. Es miembro de la
INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION (ISO) y de la COMISION
PANAMERICANA DE NORMAS TECNICAS (COPANT), representando a Chile ante esos
organismos.

La norma NCh1764 ha sido preparada por la División de Normas del Instituto Nacional de
Normalización y en su estudio participaron los organismos y personas naturales
siguientes:

APROLECHE Norberto Butendieck B.

Cooperativa Agrícola Lechera Frutillar Ltda.,
CAFRA Andrea Gómez
Fernando Urra
Cooperativa Agrícola Lechera Santiago Ltda.,
CALS Carlos Varas L.
Cooperativa Agrícola y Lechera de La Unión
Ltda., COLUN Gustavo Berlien G.
Federación Nacional Cooperativas Lecheras,
FENALECHE Eduardo Anrique M.
Industrial y Comercial LOS FUNDOS Ltda. Marco A. Leiva A.
Instituto de Ciencia y Tecnología de los
Alimentos, ICYTAL, UACh Manuel Pinto C.
Renate Schoebitz T.
Instituto de Desarrollo Agropecuario, INDAP Juan Burrows G.
Instituto de Investigaciones Agropecuarias
INIA, CARILLANCA Norberto Butendieck B.

I
NCh1764

Instituto de Investigaciones Agropecuarias

INIA, La Platina Carlos Pedraza G.
Instituto Nacional de Normalización, INN Manuel Pinto C.
LONCOLECHE S.A. Francisco J. Deck
Ministerio de Agricultura, ODEPA Víctor Esnaola
NESTLE CHILE S.A. Luis Agüero A.
Miguel Sáez T.
SEREMI de Agricultura , Los Lagos Enrique Villalobos A.
Servicio Agrícola y Ganadero, SAG Claudio Poblete A.

En la elaboración de esta norma se han tomado en consideración las siguientes normas de

la Federación Internacional de Lecherías:

a) FIL-IDF 57:1970 Detection of penicillin in milk by a disc assay technique;

b) FIL-IDF 1991 Bulletin Nº 258 Detection and confirmation of inhibitors in milk and
milk products. 99pp.

Esta norma anula y reemplaza a la NCh1764.Of80 Leche – Determinación de penicilina y

otras sustancias inhibidoras – Método del disco de filtro, declarada Norma Chilena Oficial
de la República por Decreto Nº 23, de fecha 24 de Enero de 1980, del Ministerio de
Agricultura, publicado en el Diario Oficial Nº 30.598 del 23 de Febrero de 1980.

Esta norma ha sido aprobada por el Consejo del Instituto Nacional de Normalización, en
sesión efectuada el 24 de Julio de 1998.

Esta norma ha sido declarada Norma Chilena Oficial de la República por Decreto N° 158,
de fecha 26 de Octubre de 1998, del Ministerio de Agricultura, publicado en el Diario
Oficial N° 36.218, del 19 de Noviembre de 1998.

II
 NORMA CHILENA OFICIAL NCh1764.Of98

Leche - Determinación de penicilina y antibióticos

lactámicos - Método A - Método del disco filtro

1 Alcance

Esta norma establece un método para determinar la presencia de sustancias inhibidoras

en la leche.

Esta norma establece el método del disco filtro para detectar principalmente la
presencia de penicilina, cuando se encuentra en concentración superior a 0,0015 µg/ml.

Esta norma se aplica a la leche cruda, leche fluida procesada, leche en polvo, ya sea
entera, parcialmente descremada o descremada.

2 Referencias

NCh1011/1 Leche y productos lácteos - Muestreo - Parte 1: Leche cruda.

3 Definición

Se considera que la leche contiene sustancias inhibidoras cuando al utilizar esta

metodología, se obtiene una zona clara de inhibición en el lugar de la muestra. La
sustancia inhibidora corresponde a una penicilina, si al agregar penicilinasa (ß lactamasa)
a una muestra equivalente, no se obtiene una zona clara de inhibición o se observa una
zona clara de diámetro inferior al de la leche sin penicilinasa.

1
NCh1764
4 Principios

Un disco de papel filtro impregnado con la muestra de leche se coloca sobre la superficie
de un medio de cultivo sólido, inoculado con Bacillus stearothermophilus var. calidolactis,
el cual es sensible a la penicilina. El desarrollo de este microorganismo produce, después
de la incubación, opacidad del medio de cultivo. La presencia de sustancias inhibidoras
en la leche da origen a una zona clara en el medio, alrededor de cada disco impregnado
con la muestra. La extensión de la zona clara depende de la concentración y del tipo de
sustancia inhibidora presente en la leche.

5 Medios de cultivo y reactivos

5.1 Bacillus stearothermophilus var. calidolactis, cepa C 953*) idéntica a la cepa

ATCC**) 10149.

5.2 Agar inclinado

Extracto de levadura 2g
Peptona 5g
Extracto de carne 1g
Cloruro de sodio 5g
Agar agar 15 g
Agua destilada 1 000 ml

Preparar y distribuir el medio de cultivo en tubos de tapa rosca en volúmenes de

10 ml. Esterilizar en autoclave a 121 ºC ± 1 ºC durante 15 min. El pH final debe
ser 7,4 ± 0,1.

5.3 Caldo triptona

Extracto de levadura 1g
Triptona 2g
Glucosa 0,05 g
Agua destilada 100 ml

Preparar y esterilizar en autoclave a 121 ºC ± 1 ºC durante 15 min. El pH final debe

ser 8,0 ± 0,1.

*)
Instituto Netherlands para la Investigación Lechera.

**)
ATCC, American Type Culture Collection, Rockville, M.D. USA.
2
 NCh1764
5.4 Agar triptona

Extracto de levadura 2,5 g

Triptona 5g
Glucosa 1g
Agar agar 15 g
Agua destilada 1 000 ml

Distribuir en volúmenes no superiores a 200 ml y esterilizar en autoclave a

121 ºC ± 1 ºC durante 15 min. El pH final debe ser 8,0 ± 0,1.

5.5 Penicilina, solución patrón

Preparar en un frasco estéril, una solución patrón que contenga 100 U.I./ml
(60 µg/ml) de benzil penicilina sódica o potásica, en agua destilada estéril.

Mantener en refrigeración a 4°C ± 2°C y utilizar en el día de su preparación.

5.6 Penicilinasa

Preparar en agua destilada estéril, una solución que contenga 1000 U.I./ml (600 µg/ml) de
penicilinasa. Mantener en refrigeración a 4 ºC ± 2 ºC durante cuatro semanas como
máximo.

5.7 Leche en polvo descremada libre de inhibidores

Reconstituir la leche en polvo al 10% de sólidos totales en agua destilada estéril.

Verificar previamente que esté exenta de inhibidores.

5.8 Penicilina, soluciones de control

Diluir 1,25 ml de la solución patrón de penicilina en 1 000 ml de agua destilada estéril.

Esta solución contiene 0,125 U.I./ml.

5.8.1 Agregar 1 ml de la solución obtenida en 5.8, a 49 ml de leche reconstituida (5.7) y

agitar. Esta solución testigo contiene 0, 0025 U.I./ml .

5.8.2 Agregar 2 ml de la solución obtenida en 5.8, a 48 ml de leche reconstituida (5.7)

y agitar. Esta solución testigo contiene 0, 005 U.I./ml .

5.9 Solución testigo de penicilinasa

Mezclar cuidadosamente la muestra de leche y transferir 10 ml a un frasco estéril de

boca ancha. Adicionar 0,4 ml de la solución patrón de penicilinasa (5.6) y mezclar.

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NCh1764
6 Aparatos y materiales

6.1 Frascos, para muestras, estériles, con cierre hermético.

NOTA 1) Algunos tapones de goma pueden transmitir sustancias inhibidoras a la pared interior del cuello.

6.2 Placas Petri, de fondo plano y de espesor uniforme, con un diámetro interior
de 90 mm.

6.3 Pinza, de punta fina y curva.

6.4 Estufa de cultivo, con termostato, regulada a 55 ºC ± 1 ºC.

6.5 Discos de papel filtro, de 12 mm a 15 mm de diámetro.

NOTA 2) Para controlar la ausencia de inhibidores en los discos de filtro, realizar un ensayo en blanco de
cada lote. Impregnar un disco con agua destilada estéril y verificar la ausencia de inhibición al incubar la
placa a 55 ºC ± 1 ºC durante 5 h.

6.6 Matraz de Erlenmeyer, de 150 ml, estéril.

6.7 Tubos de ensayo, de tapa rosca (16 mm ∙ 160 mm).

6.8 Asa, para inoculación.

6.9 Baño de agua, con termostato regulado entre 45°C y 60°C ± 1°C.

7 Toma de muestras

La toma de muestras se realizará según NCh1011/1.

8 Procedimiento

8.1 Preparación de la muestra

En caso de leche en polvo, reconstituir al 10% de sólidos totales en agua destilada y

esterilizar antes de proceder al ensayo.

En el caso de productos líquidos, analizar dentro de las 10 h siguientes al muestreo.

Mantener las muestras a una temperatura inferior a 5 ºC. Si no es posible analizarlas
dentro de 10 h, éstas deberán ser congeladas a una temperatura de -30 ºC a -15 ºC,
para reducir el efecto de inactivación de la penicilina, pero en todo caso efectuar el
ensayo antes de 24 h. Para su análisis las muestras deben ser descongeladas en un baño
de agua a 45 ºC ± 1 ºC, agitándolas hasta su completa homogeneización.

4
 NCh1764
8.2 Conservación del cultivo

Inocular el cultivo (5.1), en estrías sobre la superficie de un tubo con agar inclinado
(5.2) e incubar a 55 ºC ± 1 ºC durante 48 h.

Los tubos cerrados con el cultivo, pueden ser mantenidos en refrigeración a 4ºC ± 2ºC
durante un mes.

8.3 Preparación del cultivo

8.3.1 Transferir asépticamente 10 ml del caldo triptona (5.3) a un matraz

Erlenmeyer (6.6).

8.3.2 Con un asa (6.8) inocular el medio (8.3.1) con el cultivo procedente del tubo
de agar inclinado (8.2) e incubar a 55 ºC ± 1 ºC durante 16 a 18 h. Después de 18
h, como máximo, inocular 0,1 ml del cultivo líquido en 10 ml de caldo triptona fresco
(5.3) e incubar nuevamente a 55 ºC ± 1 ºC durante 16 a 18 h.

8.3.3 Alternativamente, se puede inocular 0,1 ml de un cultivo líquido anterior

(8.3.2), en el medio (8.3.1), siempre que no tenga un tiempo superior a 36 h y haya
sido mantenido en refrigeración a 4 ºC ± 2 ºC.

NOTA 3) El cultivo líquido (8.3.2) debería tener un recuento de bacterias viables entre 5 ∙ 107 ufc/ml y
10 ∙ 10 7 ufc/ml después de una incubación a 55 ºC ± 1 ºC durante 48 h.

8.4 Preparación de las placas Petri

8.4.1 Fundir el agar triptona (5.4), a 55 ºC en un baño de agua y mezclar

cuidadosamente con el cultivo fresco (8.3 2) en una proporción de 5:1
respectivamente.

8.4.2 Colocar las placas Petri estériles sobre una superficie horizontal nivelada y transferir
una cantidad suficiente del medio de cultivo (8.4.1) para formar una capa uniforme
de 0,8 mm a 1 mm de espesor. Una vez solidificado el agar, invertir las placas de
inmediato con el objeto de evitar al máximo la condensación sobre la superficie del medio.

8.4.3 Las placas Petri preparadas (8.4.2) deben ser utilizadas preferentemente en el
mismo día, sin embargo pueden conservarse refrigeradas a 4ºC ± 2 ºC por un
período máximo de tres días, colocándolas en una bolsa de polietileno cerrada
inmediatamente después de su preparación.

8.4.4 Marcar en el fondo de la placa cuadrados de 25 mm de lado y numerarlos para

identificar las muestras.

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8. 5 Determinación

8.5.1 Mezclar cuidadosamente la muestra de leche. Tomar con una pinza limpia (6.3) y
seca un disco de papel filtro (6. 5) y sumergirlo en la muestra de leche; eliminar el
exceso de leche presionando el disco contra la pared del frasco o tubo. Colocar el disco
sobre la superficie de agar en la placa Petri, en el centro de un cuadrado (8.4.4),
seleccionado al azar y presionar levemente con la pinza.

8.5.2 Repetir la operación con otro disco para el duplicado.

8.5.3 Efectuar la operación descrita en 8.5.1, con la solución testigo de penicilina de

0, 0025 U.I./ ml ( 5.8.1), en lugar de la muestra de leche, en triplicado.

8.5.4 Efectuar la operación descrita en 8.5.1, usando la solución testigo de penicilina

de 0, 005 U.I./ ml (5.8.2), en lugar de la muestra de leche, en duplicado.

8.5.5 Efectuar la operación descrita en 8.5.1, usando la solución testigo de penicilinasa

(5.6), en lugar de la muestra de leche, en duplicado.

8.5.6 Una vez ubicados al azar todos los discos sobre la placa Petri, incubar con la tapa
hacia abajo, a 55 ºC ± 1 ºC durante 2,5 a 5 h; si a las 2,5 h no aparecen zonas de
inhibición claramente definidas alrededor del disco testigo de penicilina (8.5.3), continuar
la incubación hasta completar 5 h.

8.5.7 Examinar las placas Petri, frente a una luz adecuada, para determinar las zonas
claras de inhibición alrededor de los discos de papel filtro.

8.5.8 Determinar los diámetros medios de las zonas claras de inhibición correspondientes
a la muestra de leche y a las soluciones testigo de penicilina y penicilinasa.

9 Interpretación de los resultados

9.1 La presencia de inhibidores se caracteriza por zonas claras alrededor de los discos
de papel filtro.

9.2 En el disco tratado con la solución testigo de penicilina de 0,0025 U.I./ml, la

zona clara debería ser apenas perceptible, en cambio con la solución de 0,005
U.I./ml la zona de inhibición debería ser de un diámetro mayor.

9.3 Si alrededor de los discos con la muestra de leche aparece una zona clara mayor
que 1 mm, y en los discos con la solución testigo de penicilinasa no aparece ninguna
zona clara, la muestra de leche contiene sustancias inhibidoras en una concentración
mayor que 0,0025 U.I./ml de leche.

9.4 Si el diámetro medio de las zonas claras alrededor de los discos con la muestra de
leche es igual al diámetro medio de las zonas claras de los discos con la solución
testigo de penicilinasa, significa que la muestra no contiene penicilina.

6
 NCh1764
9.5 Si el diámetro medio de las zonas claras alrededor de los discos impregnados con la
solución testigo de penicilinasa es menor que el diámetro medio de los discos
impregnados con la muestra de leche, significa que dicha leche contiene penicilina
además de otros inhibidores.

9.6 Si se observan zonas claras alrededor de los discos con penicilinasa, éstas se deben a
otras sustancias inhibidoras además de la penicilina. Si también se observan zonas claras
alrededor de los discos con la muestra de leche, se atribuyen a una mezcla de penicilina
con otras sustancias inhibidoras.

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INSTITUTO NACIONAL DE NORMALIZACION ! INN-CHILE

Leche – Determinación de penicilina y antibióticos

lactámicos – Método A – Método del disco filtro

Milk – Determination of penicillin and lactam antibiotics – Method A – Method of filter

disk

Primera edición : 1998

Reimpresión : 1999

Descriptores: leche, análisis químico, determinación de contenido, penicilina, antibióticos

CIN 67.100.10

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