FOSFATAZA ALCALINA SERICA / SALIVARA

Consideratii generale

Fosfatazele sunt un grup de enzime de tip monoesteraze care catalizeaza

hidroliza esterilor fosforici: glicerofosfati, fenilfosfatdisodic, para-
nitrofenilfosfat, etc. In urma reactiei rezulta acid fosforic, fenolul sau alcoolul
respectiv. Un exemplu este glucozo – 6 – fosfataza care catalizeaza hidroliza
glucozo – 6 – fosfatului la glucoza si acid fosforic.

Fosfatazele au rol important in absorbtia si metabolismul glucidelor,

nucleotidelor si fosfolipidelor. De asemenea joaca un rol important in depunerea
calciului in oase.

Termenul de fosfataza alcalina se refera la un grup de izoenzime din care face

parte fosfataza alcalina osoasa, fosfataza alcalina hepatobiliara si fosfataza
alcalina intestinala. Fosfataza alcalina se gaseste in cantitate mare in ficat si la
nivelul tesutului osos. Enzima mai poate fi intalnita tranzitoriu la nivelul
placentei.

Fosfataza alcalina osoasa este secretata de osteoblaste iar cea hepatobiliara de

hepatocite si catalizeaza hidroliza unor esteri organici ai acidului fosforic.

Un substrat foarte potrivit pentru detrminarea activitatii enzimatice a fosfatazei

alcaline totale este sarea disodica a para – nitrofenilfosfatului.

Termenii de fosfataza alcalina sau acida se refera la pH – ul pentru care enzima

prezinta maximum de actiune (pH optim de actiune). pH – ul optim de actiune al
fosfatazelor difera in functie de natura substratului:

 fosfataza alcalina are pH optim de actiune in jur de 10,4;

 fosfataza acida are pH optim de actiune in jur de 4,9.

Activitatea enzimatica a fosfatazei alcaline de origine osoasa creste in ser si

saliva ori de cate ori are loc o reactie osteoblastica asociata cu formarea si
repararea tesutului osos. Fiziologic, fosfataza alcalina osoasa are activitati
enzimatice distincte in functie de grupele de varsta. La varsta copilariei si in
general in perioada de crestere si dezvoltare a organismului, activitatea
catalitica la nivel seric si salivar a fosfatazei alcaline osoase poate avea valori
duble sau triple comparativ cu valorile normale intalnite la adulti: 480 U/L fata
de 180 U/L.

Fosfataza alcalina totala este folosita pentru diagnosticul afectiunilor osoase si

hepatice ea fiind singura enzima care are o importanta practica in depistarea
metastazelor osoase sau hepatice, avand valoare de marker tumoral.

Determinarea activitratii enzimatice a fosfatazei alcaline prin metoda

enzimatica(cinetica)

Principiul metodei

Fosfataza alcalina totala serica sau salivara catalizeaza reaztia de hidroliza a

para – nitrofenilfosfatului disodic cu obtinere de acid fosforic si para –
nitrofenol.

In mediu alcalin para – nitrofenolul este intens colorat in galben si prezinta un

maximum de absorbtie la λ = 405 nm. Activitatea enzimei este direct
proportionala cu concentratia para – nitrofenolului (intensitatea coloratiei)
eliberat in urma reactiei dintre enzima si substrat.

Testul cinetic de determinare a activitatii enzimatice a fosfatazei alcaline totale

serice sau salivare se realizeaza prin evaluarea cineticii de aparitie a para –
nitrofenolului intr-un interval de timp prestabilit ( 3 minute ).

Reactivi

R1 : solutie de dietanolamina cu pH = 9,8 1,2 mM;

solutie de clorura de magneziu 0,6 mM;

R2 : solutie de para – nitrofenilfosfat 50 mM.

Reactivul de lucru se prepara prin amestecarea a 4 volume R1 cu un volum R2.

Modul de lucru

Se pregatesc 2 eprubete pentru proba si pentru martor. Procedura de determinare

a activitatii enzimatice a fosfatazei alcaline totale serice sau salivare se
desfasoara conform procedurii prezentate in tabel.

Reactivi Proba Martor

Ser/saliva 0,02 mL -
Apa distilata - 0,02 mL
Reactiv de lucru 1,0 mL 1,0 mL

Se lucreaza probele la 25o C. Se citeste imediat la spectrofotometru absorbanta

probei fata de martor la λ = 405 nm si se noteaza valoarea cu A 1. Dupa exact 3
minute se citeste din nou absorbanta probei si se noteaza valoarea cu A2.

Calcul:

ΔAbs / minut = (A2 – A1) / 3

U/L fosfataza alcalina = ΔAbs /18 530 x Vfinal /Vproba x 106 = ΔAbs x 2752

F (factor) = 1/18530 x Vfinal /Vproba x 106 = 2752

18 530 reprezinta coeficentul molar de absorbtie al para – nitrofenolului in

mediu alcalin la λ = 405 nm;

volumul probei de analizat este de 0,02 mL;

volumul final este de 1,02 mL.

Valorile normale determinate la 25oC sunt:

- adulti < 180 U/L;

- copii < 480 U/L.
Variatii patologice

Valori scazute ale activitatii enzimatice: hipo sau afosfatazemie familiala,

deficit de vitamina C, magneziu, zinc.

Valori crescute ale activitatii enzimatice:

- cresteri moderate apar in hepatita virala, ciroza;

- cresteri de 5 – 20 ori apar in tumori hepatice, metastaze osoase;
- valori crescute apar in hiperparatiroidism care se manifesta prin
mobilizarea calciului si fosforului din oase;
- valori crecute se intalnesc in procesul de refacere al fracturilor osoase.