BIOLOGIE CELULARĂ ȘI

MOLECULARĂ

Lucrări practice

Page 1 of 90
LP.1 MIJLOACE TEHNICE DE STUDIU ÎN BIOLOGIA
CELULARĂ ŞI MOLECULARĂ. NOŢIUNI
ELEMENTARE DE TEHNICĂ MICROSCOPICĂ;
TIPURI DE MICROSCOAPE. DESCRIEREA MODULUI
DE UTILIZARE A MICROSCOPULUI - APLICAŢII
PRACTICE (EXERCIŢII DE OBŢINERE ŞI REGLARE
A IMAGINII MICROSCOPICE FOLOSIND
PREPARATE PERMANENTE)

Biologia celulara este o ştiinţă modernă care s-a dezvoltat

datorită descoperirii tehnicilor moderne de observaţie a
celulelor, acestea fiind, în principal, de microscopie. Primul
microscop optic a fost inventat de către savantul englez Robert
Hooke cu care a studiat o felie subţire dintr-o rădăcină de plută
descoperind nişte cavităţi mici, dispuse ca într-un fagure pe
care le-a denumit celule. Ulterior, microscopul lui Hooke a fost
perfecţionat de către succesorii săi, crescându-i puterea de
mărire, astfel încât la ora actuală celulele putând fi studiate atât
din punct de vedere morfologic, funcţional, cât şi molecular.
Prima etapa în studiul celular este reprezentată de analiza
morfologică care implică mijloace ce au la baza microscopia
fotonică.

Alcatuirea şi funcţionarea microscopului optic:

Microscopul fotonic este un aparat optic de mărit care
utilizează ca sursă de radiaţie fotonul (element din spectrul
undelor electromagnetice). Puterea de mărire (PM) reprezintă
produsul dintre puterea de marire a obiectivului şi cea a
ocularului. Puterea maxima este de x1500 ori. Puterea de
rezoluţie (PZ) a unui microscop este cea mai importantă funcţie

Page 2 of 90
a sa şi reprezintă distanţa cea mai mică la care două puncte pot
fi vizualizate distinct, de aceasta depinzând claritatea şi
calitatea imaginii.
Microscopului optic obişnuit permite studiul celulei la
nivel micrometric, µm=0,001mm şi este compus din partea
mecanică şi partea optică. Partea mecanică este constituită din:
talpa sau piciorul microscopului de care se ataşează coloana
sau braţul microscopului.
Partea mecanică reprezintă suportul pentru partea optică.
Talpa microscopului asigură stabilitatea aparatului şi are
încorporate: sursa de lumina, diafragma, oglinda proiectoare.
De coloana microscopului se găsesc ataşate: platina sau masa
microscopului, condensator, revolverul, tubul microscopului şi
dispozitivul de punere la punct al imaginii (sistemul de vize).
Platina microscopului reprezintă suportul pe care se
fixează preparatul de examinat şi este dispusă perpendicular pe
axa optică a microscopului, prezentând un orificiu prin care
trec razele de lumină spre preparat. Prin intermediul celor
două vize laterale, platina poate fi deplasată în plan orizontal
astfel încât preparatul să poată fi examinat pe întreaga
suprafaţă. Preparatul se fixează pe platina microscopului printr-
un sistem de prindere constituit din "valeţi", platina prezentând
şi o riglă gradată astfel încât sa poată fi identificate anumite
zone de pe suprafaţa preparatului. Condensatorul este localizat
sub platina microscopului şi facilitează focalizarea luminii pe
preparatul microscopic. Tubul microscopului are ataşat în plan
inferior revolverul, de partea mobilă a acestuia se ataşează
obiectivele, iar în plan superior, ocularele. Cu ajutorul
sistemului de vize, tubul se deplasează sus-jos în vederea
obţinerii unei imagini clare a preparatului. Prin sistemul de vize
macroviză-microviză se obţine o imagine clară. Macroviza
realizează mişcări grosiere, este utilizată pentru lupă sau

Page 3 of 90
obiectivul de 10x, iar microviza, prin mişcările de fineţe,
asigură claritatea imaginii.
Partea optică este constituită din sistemul ocular-obiectiv.
Ocularele sunt constituite din două lentile dispuse într-un tub
metalic, cu putere de mărire de 5x,7x,10x,15x. Obiectivele sunt
formate dintr-o asociaţie de lentile, cu puteri de mărire de 6x,
10x, 20x, 40x sau 60x şi 90x sau 100x. Obiectivul de 100x este
utilizat pentru imersie, folosind ulei de cedru, şi prezintă o
lentilă frontală, mobilă, dispusă spre preparat.
Tehnica de observaţie microscopică a preparatului de
examinat debutează cu rotirea revolverului în axul optic al
microscopului la obiectivul de 10x sau lupă. Se analizează, prin
oculare, lumina şi se coboară condensorul până când aceasta
devine uniformă. Se fixează preparatul pe platina microscopuui
cu ajutorul valeţilor, se reglează imaginea în câmpul
microscopului, pentru început, folosind macroviza. Ulterior, în
vederea obţinerii unei imagini clare se roteşte microviza în
ambele sensuri. Se analizează preparatul pe toată suprafaţa sa
cu ajutorul celor două vize montate pe platina microscopului,
menţinând contactul cu microviza ataşată coloanei. După
analiza preparatului se revine la obiectivul de 10x şi apoi se
manevrează preparatul.
Montarea unor dispozitive speciale la microscopul fotoni
permite analiza microscopică în: lumină fluorescentă, contrast
de fază, câmp întunecat, lumină polarizată.
Microscopia prin fluorescenţă evidenţiază anumite
fenomene luminoase prezente în structuri biologice naturale,
primare (autofluorescenţă) sau în cele provocate prin
intermediul fluorocromilor, cel mai utilizat fluorocrom fiind
acridin-orange (fluorescenţă provocată sau secundară). Prin
fluorescenţă se emit radiaţii luminoase de către o substanţă sub
acţiunea razelor ultraviolete. Prin intermediul fluorescenţei
primare se pot identifica: pigmenţii, acizii aminaţi, virusurile,

Page 4 of 90
dintele natural etc. Prin intermediul fluorescenţei secundare se
pot identifica: acizii nucleici, fibrele de colagen etc. Tehnica de
imunofluorescenţă este foarte utilizată şi se realizează prin
cuplarea unui acid cu un fluorocrom.
Microscopia optică prin contrast de fază este utilizată
pentru obţinerea de imagini cu contrast înalt ale unor probe
transparente, nefixate, necolorate, nemarcate (celule în stare
vie, de regulă în culturi), microorganisme, particule subcelulare
etc folosind un tip special de microscop a căror obiective sunt
dispuse sub platina microscopului. Microscopia în contrast de
fază se desfăşoară după un mecanism care “transformă
variaţiile de fază ale undei luminoase după ce a trecut prin
probă, în variaţii ale amplitudinii acesteia". Variaţiile de
amplitudine pot fi vizualizate ca diferenţe ale contrastului
imaginii putând fi observate procesele biologice în desfăşurare
la o maximă claritate şi contrast.
Microscopia în lumină polarizată determină
îmbunătăţirea contrastului şi a calităţii imaginiilor obţinute prin
materiale birefringente. Microscopul are două dispozitive
speciale numite polarizor şi analizor. Polarizorul se găseşte sub
condensator, iar analizorul se află deasupra obiectivului. Acest
tip de microscopie este utilizată pentru studii calitative şi
cantitative, pentru diferite tipuri de probe. La plasarea între
polarizori, a materialului birefringent, lumina incidentă pe
material este împărţită în două componente ale căror
amplitudine şi intensitate sunt variabile în funcţie de orientarea
unghiului format de polarizor cu direcţiile de vibraţie permise
de materialul utilizat. Birefringenţa pozitivă - indicele de
refracţie este mai ridicat în lungime decât în plan
perpendicular, iar negativă în caz contrar.
Microscopia electronică este folosită în diferite domenii
de cercetare, mai ales în domeniul cercetărilor medicale si
biologice pentru studiul structurilor submicroscopice celulare,

Page 5 of 90
al unor constituienţi chimici celulari sau macromolecule
purificate, pentru urmări structura în relief a moleculelor etc.
Microscopul are o rezoluţie superioară în comparaţie cu
microscoapele optice deoarece foloseşte electronii care au o
lungime de undă de aproximativ 100.000 mai scurtă decât
lumina vizibilă şi poate obţine o imagine mărită de până la
2.000.000. Electronii pe toată traiectoria lor – de la sursă până
la imaginea finală - se deplasează în vid.

Tipuri de microscoape electronice:

 Microscoape electronice cu transmisie (TEM)
 Microscoape electronice cu baleiaj
 Microscoape electronice cu scanare
 Microscoape electronice cu reflexie
 Microscoape electronice cu scanare şi transmisie

Microscop optic

Page 6 of 90
 Microscop optic cu cameră foto încorporată şi soft characteristic

Microscop cu fluorescenţă

Microscop în contrast de fază

Întrebări recapitulative
1. Când și cine a inventat microscopul optic?

Page 7 of 90
2. Care este dizpozitivul de punere la punct al
imaginii?
3. Care este tehnica de observație microscopică?
4. Ce reprezintă microscopia prin fluorescență?
5. La ce folosește microscopia electronică? Enumerați
căteva tipuri de microscoape electronice.

Page 8 of 90
 LP2. A. TEHNICA REALIZĂRII UNUI PREPARAT
MICROSCOPIC EXTEMPORANEU (PROASPĂT SAU
TEMPORAR) DIN RACLAT DE MUCOASĂ LINGUALĂ

B. CICLUL CELULAR ȘI DIVIZIUNEA CELULARĂ

Celulele sunt studiate, cel mai adesea, prin tehnicile de

observaţie pe preparatele microscopice, deci prin metoda “in
vitro”. Această metodă asigură observarea celulelor vii sau
moarte în afara organismului fiind o metodă foarte des întâlnită
în practica medicală. Preparatele realizate în acest sens se
clasifică în:

a) Preparate microscopice proaspete, temporare sau

extemporanee
b) Preparate microscopice fixate, durabile, definitive
sau permanente.

O altă metodă permite observarea celulelor vii la locul

lor de origine “in vivo” şi “in situ”-prin care poate fi analizată
motilitatea celulară (deplasări celulare determinate de curenţii
sanguine şi limfatic, mişcări ale plasmalemei capabile să
execute deplasări celulare prin emiterea unor formaţiuni
celulare particulare: pseudopode, cili, flageli, văluri ondulante.
Această metodă are dezavantajul că este limitată şi necesită
aparatură complexă şi laborioasă.
Preparatul “extemporaneu” prezintă o serie de
avantaje, precum:
- oferă medicului stabilirea rapidă a diagnosticului (în câteva
minute) deoarece tehnica de prelucrare a preparatului se
realizează într-un timp foarte scurt;

Page 9 of 90
- tehnica este necostisitoare, nelaborioasă, nu necesită
aparatură complexă;
- nu este necesară angajarea de personal medical
supracalificat.

Printre dezavantajele acestei tehnici se numără:

- preparatul se degradează rapid în timp (minute, ore);
- uneori rezultatul poate fi neconcludent ceea ce determină
medicul să recomande efectuarea altor tipuri de preparate,
cum ar fi preparatul permanent realizat prin metoda
efectuării secţiunilor fine.

Principiul metodei
Raclarea uşoară, cu ajutorul unei lame efector, a
mucoasei linguale, de la bază spre suprafaţa mucoasei în
vederea analizei morfologice a celulelor epiteliale.
Cavitatea bucală este constituită din celule aparţinând
ţesutului epitelial pluristratificat care se regăsesc într-o
permanentă reînnoire: celulele tinere sunt dispuse pe
membrana bazală, iar cele senescente şi apoptotice la nivelul
suprafeţei mucoasei bucale.
Celulele raclate vor fi analizate la microscopul optic,
din punct de vedere a caracterelor morfologice, la obiective cu
diferite puteri de mărime.

Materiale necesare
- material biologic – celule obţinute prin raclaj de mucoasă
- lame efector şi lame port-obiect sterile
- lamele
- mănuşi
- comprese sterile
- pipete

Page 10 of 90
- hârtie de filtru
- cuvă colorare
- lichid conservant artificial: ser fiziologic (NaCl 9%0)
- colorant vital: albastru de metilen
- microscop optic

Materialul biologic pentru preparatele extemporanee poate

fi constituit din:
- organe mici întregi
- fragmente de ţesuturi
- celule disociate
- raclate de pe mucoase
- culturi celulare
- biopuncţii din organe parenchimatoase sau
biopuncţii cavitare
- aspirate lichidiene.
Lamele şi lamelele trebuie să fie sterile, se achiziţionează
de la firme specializate. Lamele sunt realizate din sticlă neutră,
au formă dreptunghiulară, laturi paralele, margini şlefuite, cu
dimensiuni în general de 76/26 mm şi grosime de 1,5-2 mm.
Lamelele cele mai des utilizate sunt de formă pătrată, darv sau
dreptunghiulară cu grosime de 0,15-0,18 mm şi dimensiuni de
18/18, 22/22 sau 22/23 mm.
Lichidul conservant utilizat pentru acest tip de preparat
este serul fiziologic (NaCl 9%0), artificial. Celulele prelevate,
în stare vie, sunt depuse pe lama port-obiect peste care s-a pus
în prealabil o picătură de lichid conservat – ser fiziologic.
Acesta are rolul de a crea celulelor prelevate, prin compoziţia
chimică, un mediu identic sau apropiat cu cel în care se găsesc
în organism.

Page 11 of 90
 Coloranţii vitali utilizaţi în Biologia celulară sunt subsatnţe
netoxice pentru celule sau foarte puţin toxice, sunt utilizaţi
pentru o mai bună evidenţiere a structurilor celulare, deoarece
acestea necolorate sunt mai greu de identificat, fiind
refringente, translucide în microscopia optică.
Coloranţii vitali se clasifică în:
- electronegativi sau acizi: Albastru de trypan - utilizat în
culturi celulare în vederea determinării viabilităţii celulare;
Tuşul de China – specific studiului morfologiei şi
viabilităţii spermatozoizilor.
 electropozitivi sau bazici: Albastrul de metilen - utilizat
foarte frecvent în preparatele extemporanee, Verde Janus -
utilizat pentru evidenţierea mitocondriilor
 indiferenţi: Substanţe din grupa Sudan-ului care pun în
evidenţă anumite tipuri de incluziuni lipidice.

Coloranţii vitali pot fi administraţi:

1. intravital – pe cale intravenoasă, se injectează colorantul
în vena cozii la şoarecele de laborator sau subcutanată,
după care se procedează la sacrificarea acestuia, recoltarea
materialului, efectuarea preparatului şi analiza la
microscopul optic.
2. postvital – se sacrifică şoarecele de laborator, se recoltează
materialul, se etalează pe lama port-obiect, după care se
colorează şi se analizează la microscop.

Descrierea metodei de lucru

1. pacientul se prezintă la medic dimineaţa, pe nemâncate şi
fără să fi efectuat toaleta cavităţii bucale;
2. se clăteşte cavitatea bucală cu apă de robinet de 2-3 ori;

Page 12 of 90
3. utilizând mănuşi se aşează o lamă porto-biect în cuva de
colorare pe care se pune, central, o picătură de ser
fiziologic;
4. cu ajutorul lamei efector se recoltează celulele prin raclajul
uşor al mucoasei linguale pornind disnpre bază, în timp ce
cu degetul arătător, bandajat cu comprese sterile, de la
mâna stângă se ţine apăsată partea externă a mucoasei
linguale; raclarea se efectuează într-un singur sens, printr-o
singură mişcare;
5. celulele prelevate se depun pe lama port-obiect care conţine
deja lichidul conservant şi se emulsionează prin mişcări de
du-te-vino ale lamei;
6. după emulsionare se depune, cu ajutorul unei pipete, o
picătură de albastru de metilen;
7. cu ajutorul lamelei acoperim preparatul realizat, pentru a se
evita crearea bulelor de aer lamela trebuie aşezată peste
materialul biologic prin cadere liberă;
8. în cazul excesului de colorant acesta poatefi eliminat
folosind hârtia de filtru. Un colţ al hârtiei de filtru se
apropie de marginea lamelei şi se aşteaptă absorbţia
excesului de colorant. Sugativarea colorantului trebuie
făcută cu mare atenţie pentru a nu absoarbe şi materialul
biologic;
9. preparatul se examinează imediat la microscopul optic.

Page 13 of 90
 Raclarea mucoasei (stud. An I MD)

Etalarea materialului prelevat (stud. An I MD)

Realizarea preparatelor colorare cu albsatru de metilen

Page 14 of 90
 Definitivarea preparatului (stud. An I MD)

Analiza microscopică a preparatului

Preparatul astfel obţinut se aşează pe platina microscopului
şi se începe observaţia pornind de la obiectivul de 10x.
Preparatul trebuie analizat pe toată suprafaţa acestuia. Analiza
microscopică poate fi efectuată:

1. Pe preparate necolorate:
 celule epiteliale, de formă geometrică poligonală
 nucleul este dispus central, de dimensiuni mici,
având formă rotund-ovalară
 raportul nucleo/citoplasmatic este în favoarea
citoplasmei
 celulele sunt delimitate de plasmalemă refringentă.

Page 15 of 90
 Analiza microscopică a celulelor prelevate (stud. An I MD)

2. Pe preparate colorate:
 celulele sunt delimitate de o membrană plasmatică
bine evidenţiată, colorată ăn albastru-bleu
 nucleul este intens bazofil, colorat în albastru,
conţinând unul sau mai mulţi nucleoli rotunzi-
ovalari
 citoplasma este colorată în bleu şi conţine
numeroase granulaţii (corespund organitelor
citoplasmatice) localizate cu predilecţie în zona
perinucleară.
După observarea preparatului la microscop, materialele
folosite (biologice sau consumabile) sunt colectate în recipiente
speciale pentru a fi predate firmei de deşeuri biologice.

Page 16 of 90
 CICLUL CELULAR ŞI DIVIZIUNEA
CELULARĂ
Ciclul celular defineşte seria de evenimente de natură
biochimică şi morfologică care se desfăşoară în viaţa unei
celule din momentul formării şi până la finele diviziunii sale.
Ciclul celular cuprinde două etape: interfaza şi diviziunea.
1. Interfaza – este perioada cuprinsă între două diviziuni
succesive în care se desfăşoară toate acticităţile specifice
celulei. Interfaza este împărţită în 3 faze: faza G1 (presintetică),
faza S (de sinteză) şi faza G2 (premitotică sau postsintetică). În
interfază are loc acumularea de substanţe nutritive vitale care
vor fi folosite în diviziune.
2. Diviziunea celulară sau faza M (mitotică) reprezintă
procesul prin care materialul genetic replicat în interfază se
distribuie în mod egal şi total, rezultând 2 nuclei distincţi
(cariokineză), iar celula mamă se împarte în două celule fiice
(citokineză).
Durata unui ciclu celular poate varia între diferite
ţesuturi datorită duratei fazei G1. În cazul celulelor eucariote
superioare durata medie a unui ciclu celular pe parcursul a 24
de ore viaţă este următoarea: faza G1 durează 10 ore, faza S= 9
ore, faza G2= 4 ore , iar faza M= 1 oră.

o Faza G1 (engl. Gap - interval) mai este numită şi faza

de creştere în care se sintetizează intens ARN şi proteine,
diverse enzime, în special cele necesare pentru replicarea
AND-ului. De asemenea se sintetizează organite celulare noi şi
creşte volumul citoplasmei. În această fază fiecare cromosom
este monocromatidian, cantitatea de material genetic fiind de
2C molecule de ADN sub forma a 2n (46 cromosomi

Page 17 of 90
despiralizaţi). Celulele acumulează în G1 ARN şi proteine până
la o concentraţie prag, numită punct de restricţie (R). În
anumite condiţii nefavorabile (lipsa factorilor de creştere etc)
unele celule trec într-o fază de activitate metabolică redusă,
numită faza G0 sau punct de repaus (linişte, latenţă sau odihnă).
În faza G0 celulele rămân viabile şi pot supravieţui timp
îndelungat. Această fază este caracteristică şi celulelor inactive
sau îmbătrânite. De asemenea, celulele neproliferative trec din
faza G1 în faza G0 unde pot rămâne perioade lungi de timp sau
chiar nedefinit, aşa cum este cazul neuronilor.

faza G1 (presintetică), R (punct de restricţie), G0 (punct

de repaus sau latenţă), faza S (de sinteză), faza G2 (premitotică
sau postsintetică).

o Faza S (engl. Synthesis – sinteză) începe prin sinteza

de proteine histonice, are loc replicarea AND-ului, are loc
dublarea materialului genetic (4C), numărul d cromosomi
rămâne 46, dar fiecare dintre aceştia va fi bicromatidian.
o Faza G2 durează până la începutul mitozei şi se
caracterizează prin producerea de cantităţi mari de tubuline,

Page 18 of 90
actina şi miozina, se continuă sinteza ARN-ului şi a
proteinelor, dar şi a unor cantităţi mici de AND. Fiecare
cromosom în această fază este monocromatidian, dar
despiralizat. Spre finalul fazei se activează "factorul de
declanşare al mitozei" (MPF) care determină condensarea
filamentelor de cromatină în cromosomi şi formarea fusului de
diviziune. În absenţa MPF celulele se opresc în faza G2,
întrerup ciclul celuar formând celule tetraploide, unele dintre
acestea, devin prin amitoză, celule binucleate (cardiomiocitele
adulte).
o Faza M sau faza mitotică, este cea mai scurtă dintre
faze, debutează cu diviziunea nucleului şi se finalizează cu
diviziunea citoplasmei. În această fază materialul genetic
dublat în interfază "segregă", adică se distribuie în mod egal şi
total celor două celule fiice care sunt identice cu celula mamă.
Celulele care rezultă în urma diviziunii celulare
evoluează în trei direcţii diferite: unele continuă să prolifereze,
altele se diferenţiază, iar altele trec în stadiul de repaus.
Celulele proliferatoare parcurg un nou ciclu celular, se divid
repetat, ciclic, aceste tipuri celulare se regăsesc în ţesuturile
embrionare, stratul bazal al epidermului, măduva hematogenă
etc). Celulele care părăsesc definitiv ciclul celular se transfomă
în celule specializate, cu anumite structuri şi funcţii, ele nu se
mai divid şi mor după un timp îndelungat (neuronii,
granulocitele, hematiile adulte etc). Unele celule trec din faza
presintetică şi rămân în faza de repaus (limfocitele, celulele
stem etc) având o activitate metabolică redusă, dar păstrându-şi
capacitatea de diviziune. Sub influenţa unor stimuli, precum
factorii de creştere, celulele se reactivează şi reintră în ciclul de
diviziune.
Celulele eucariote se reproduc pe două că:
- prin diviziune directă sau amitoză
- prin diviziune directă (cariokineză şi citokineză).

Page 19 of 90
 Amitoza presupune o simplă scindare a nucleului şi a
citoplasmei, iar diviziunea indirectă se realizează în urma unor
schimbări ale substanţei nucleare. Aceasta se clasifică în:
- tipică sau ecvaţională (mitoza)
- alotipică sau reducţională (meioza).

Prin diviziunea celulară materialul genetic este transmis:

- de la o celulă somatică la celule fiice, rezultând celule noi,
diplode, identice cu celula din care provin – diviziune
mitotică.
- de la un organism adult la descendenţi, prin intermediul
gameţilor haploizi, rezultaţi în urma meiozei.

MITOZA

Reprezintă un proces complex care se desfăşoară

secvenţial şi care are loc numai la nivelul celulelor somatice.
Durata acestu proces este de circa 10% din ciclul celular.
Mitoza a fost descoperită pentru prima dată de W. Fleming în
1879, acest proces asigură creşterea organismului, dar şi
reînnoirea celulară, prin generarea a două celule fiice identice,
cu celula mamă.
Mitoza se desfăşoară în 5 etape succesive:
1. Profaza
2. Prometafaza
3. Metafaza
4. Anafaza
5. Telofaza

1. Profaza se caracterizează prin condensarea fibrelor de

cromatină ("cromoneme") sub forma unor fiamente fine care se
îngroaşă, se scurtează, devin intens colorate şi vor forma

Page 20 of 90
cromosomii. Fiecare cromosom este alcătuit din două
cromatide surori, iar fiecare cromatidă conţine în regiunea
centromerului o secvenţă specifică de ADN repetitiv, unde
cromatidele sunt unite prin intermediul unor proteine unde se
asamblează complexe proteice specializate numite kinetocori
cu care cromosomul se va fixa pe filamentele fusului de
diviziune. La nivelul citoplasmei, centrosomul se divide şi vor
rezulta doi centrosomi care se deplasează în direcţii opuse
formând polii fusului de diviziune care rămân uniţi prin
filamentele formate din microtubuli.
2. Prometafaza este o fază intermediară între profază şi
metafază care se caracterizează prin: fragmentarea membranei
nucleare, ataşarea cromozomilor la filamentele fusului de
diviziune, condensarea şi deplasarea cromosomilor spre zona
ecuatorială a fusului de diviziune.
3. Metafaza este faza în care cromosomii
bicromatidieni îşi continuă procesul de spiralizare şi
condensare, se aliniază la ecuatorul fusului de diviziune
formând placa metafazică sau ecuatorială. Această fază permite
vizualizarea şi studierea microscopică a cromosomilor întrucât
aceştia sunt bine individualizaţi morfologic şi dispuşi într-un
singur plan.
4. Anafaza se caracteriează, în principal, prin faptul că în
această fază se produce "clivarea longitudinală a
centromerului" şi separarea celor două cromatide surori, proces
cunoscut sub numele de "disjuncţie" sau "segregare
cromatidiană". Fiecare cromosom bicromatidian va forma doi
cromosomi monocromatidieni care sunt direcţionaţi spre polii
fusului de diviziune prin scurtarea fibrelor kinetocorice.
Cromosomii sunt deplasaţi cu aceeaşi viteză, simultan, ceea ce
produce "împărţirea totală şi egală a materialului genetic între
celulele fiice". La final, la fiecare pol al celulei există un
centrozom cu un set de cromatide.

Page 21 of 90
 5. Telofaza este faza în care evenimentele din profază
se petrec în sens invers: cromosomii se despiraliează, se
decondensează, fusul de diviziune dispare, se reface membrana
nucleară din resturile membranei nucleare a celulei-mamă,
reapar nucleolii.
Citochineza este o fază care urmează direct mitozei. Ea
poate să apară în acelaşi timp cu reconstrucţia membranei
nucleare sau poate să urmeze ulterior telofazei, citoplasma şi
organitele celulare sunt divizate în cele două celule-fiice.

Mitoza

http://www.materialedidactice.ro/produs/meioza/

Page 22 of 90
 MEIOZA
Reprezintă un proces complex care se desfăşoară în
gonade prin două diviziuni succesive, neseparate de interfază:
meioza I (diviziune meiotică primară, heterotipică,
reducţională) şi meioza II (diviziune meiotică secundară,
homotipică, ecvaţională).
Meioza I este caracteristică spermatogenezei şi
ovogenezei şi constă în înjumătăţirea numărului de cromosomi,
rezultând astfel gameţi haploizi care conţin câte un cromosom
din fiecare pereche (la om n= 23). Meioza, urmată de fecundare
(fuziunea a doi gameţi de sex diferit – ovulul sau oosfera-
imobil şi spermatozoidul – mobil, pentru a forma o nouă celulă
ou diploidă = zigot) contribuie la menţinerea constantă a
numărului de cromosomi caracteristic speciei la fiecare individ,
acesta fiind însă unic, irepetabil prin fenomenele de
recombinare cromosomică care se desfăşoară în timpul
meiozei.
Meioza primară are o durată lungă şi se desfăşoară în
mai multe etape:
1. Profaza I – este cea mai lungă din întreaga meioză primară
şi cuprinde 4 etape:
a. Leptoten (subţire) – se caracteriează prin condensarea
filamentelor de cromatină, cromosomii apar sub forma unor
filamente lungi şi subţiri care prin intermediul telomerelor
sunt ataşaţi de membrana nucleară. Cromosomii sunt
bicromatidieni, însă datorită grosimii reduse apar în
microscopie optică monocromatidieni.

Page 23 of 90
b. Zigoten (împreunat) – este faza în care are loc
conjugarea cromosomică sau sinapsă cromosomială,
cromosomii omologi se apropie şi se dispun paralel de-a
lungul cromatidelor, realizându-se o aliniere "genă la
genă". Cromosomii omologi sunt uniţi, în anumite regiuni,
la nivelul complexului sinaptonemal, aspect vizibil doar în
microscopie electronică. La sexul masculin, cromosomii
neomologi matern şi patern realizează un alt gen de sinapsă
"cap la cap" printr-o mică regiune omoloagă numită
"regiune pseudoautosomală".
c. Pahiten (gros) – se caracterizează prin fenomenul de
încrucişare cromosomică – "crossing-over" (ruperea
cromatidelor nesurori în anumite puncte şi schimbarea
reciprocă şi încrucişată a unor fragmente egale (transfer de
fragment de pe cromosomul matern pe cromosomul patern
şi invers). În această fază cromosomii se scurtează, se
îngroaşă, iar procesul de recombinare intracromosomică
vizează numai două din cele patru cromatide.
d. Diploten (dublu) – este etapa în care cromosomii
omologi încep să se separe longitudinal, dar rămân în
contact prin anumite puncte de la nivelul cromatidelor
numite "cheasmata", pluralul de la "cheasma".
e. Diakineză (mişcare, divergent) – cromosomii se
scurtează tot mai mult, se îngroaşă, se separă aproape
complet, cheasmatele fiind vizibile doar la capetele lor.

Page 24 of 90
 Profaza I

http://www.biyolojiegitim.yyu.edu.tr/k/leptnm/pages/leptoten_jpg.htm

2. Metafaza I - este etapa optimă de studiu a cromosomilor. În

această fază membrana nucleară dispare complet şi se formează
fusul de diviziune. Cromosomii bivalenţi se ataşează în plan
ecuatorial, prin intermediul centromerului, de filamentele
fusului de diviziune formând placa metafazică.
3. Anafaza I – se caracterizează printr-un proces foarte
important denumit "disjuncţia cromosomilor" prin care
cromosomii bicromatidieni ai fiecărui bivalent se separă, se
repartizează câte unul la fiecare celulă fiică şi apoi migrează,
simultan şi cu aceeaşi viteză, spre polii fusului de diviziune. La
final se produce o reducere a numărului de cromosomi lde la
2n la n, fiecare celulă va deţine doar un singur exemplar din
perechea de cromosomi.

Page 25 of 90
4. Telofaza I – se evidenţiază prin: reasamblarea nucleilor, se
produce citokineza, dar fără ca cele două celule fiice să fie
complet separate ci unite printr-o "punte citoplasmatică"
formând o "diadă".
Meioza secundară poate fi precedată de o scurtă interfază,
în care nu se produce nici o replicare a ADN-ului. Aceasta este
asemănătoare cu mitoza, dor că se desfăşoară în celule cu
număr haploid de cromosomi.
1. Profaza II – conţine procese similare celor din profaza
I.

2. Metafaza II - se formează o nouă placă ecuatorială,

cromosomii se condensează şi se ataşează de
filamentele fusului de diviziune.
3. Anaaza II - cromatidele-surori se separă, "disjuncţia
cromatidiană" şi se deplasează spre polii opuşi.
4. Telofaza II – din cele două celule fiice se formează
patru seturi haploide de cromosomi monocromatidieni.
În final rezultă patru celule haploide care prin matrurare
se transformă în gameţi fecundabili.
Deşi diviziunea meiotică cuprinde multe mecanisme
biochimice similare mitozei, este un proces care se desfăşoară
într-o singură direcţie, neputând discuta despre un ciclu celular,
ca în cazul mitozei.

Page 26 of 90
 Meioza

http://www.materialedidactice.ro/produs/meioza/

Page 27 of 90
 Mitoză versus meioză

Nr.crt.
Mitoza Meioza

1. Este caracteristică Este caracteristică

celulelor somatice. celulelor germinale.
2. În urma diviziunii se În urma diviziunii se
obţin două celule diploide. obţin patru celule haploide.
3. Este compusă dintr-o Este compusă din două
singură diviziune. diviziuni succesive.
Profaza are o durată
4. Profaza este de scurtă lungă (în comparaţie cu cea
durată. a mitozei) şi este alcătuită
din 5 stadii succesive.
Cromozomii omologi Cromozomii omologi în
5. nu formează organizat profaza I formează
bivalenţi. bivalenţi.
Nu se formează
6. În profaza I se formează
sinapsa (complexul
sinaptonul.
sinaptonemal).
De regulă, nu apar În profaza I are loc (cu o
7. chiasmate şi nu are loc frecvenţă destul de înaltă)
crossing-overul. crossing-overul.
În profază nu se În profază se poate
8. sintetizează suplimentar sintetiza suplimentar o mică
ADN. cantitate de ADN.
În anafază spre poli În anafaza I spre poli
9. migrează câte o cromatidă migrează câte un cromozom
din fiecare cromozom. din fiecare bivalent.

Page 28 of 90
PROTOCOL DE EVIDENTIERE A FAZELOR MEIOZEI
LA MAMIFERE

Principiul metodei

Constă în punerea în evidenţă a fazelor meiozei prin

secţionarea testiculelor de şoareci sau şobolani albi şi realizarea
de preparate care vor fi analizate la microscopul optic, la
obiectivul de imersie.

Materiale necesare

- masculi de şoareci sau şobolani albi

- trusă de microchirurgie
- vase Petri
- eprubete
- centrifugă
- lame
- ulei de imersie
- microscop optic
- reactivi: eter etilic, alcool metilic, acid acetic glacial,
soluţie hipotonă de citrat de Na 2,2%, soluţie Giemsa 10%,
colchicină 0,05%.
Etapele protocolului

1. animalele se injectează intraperitoneal cu soluţie de

colchicină 0,05%.
2. după 90 de minute animalele se anesteziază cu eter etilic
după care urmează sacrificarea şi recoltarea testiculelor.
3. testiculele după recoltare se introduc timp de 10 minute
într-un vas Petri care conţine apă distilată şi se fragmentează.
4. se elimină apa distilată şi se adaugă soluţie hipotonă de
citrat de sodiu timp de 20-30 minute.

Page 29 of 90
5. conţinutul este transferat într-o eprubetă de centrifugă şi se
centrifughează timp de 5 minute la 800 rotaţii/minut.
6. după centrifugare este îndepărtat supernatantul, iar
sedimentul se resuspendă în 5 ml de citrat de Na.
7. conţinutul se centrifughează timp de 12 minute la 1000 de
rotaţii/minut.
8. se îndepărtează supernatantul, iar peste sedimentul rămas se
adaugă, picurând pe marginea eprubetei fixator, alcool metilic
şi acid acetic glacial în proporţie de 3:1 şi se menţine la fixat
timp de 5 minute.
9. proba se centrifughează timp de 10 minute la 1200
rotaţii/minut.
10. se elimină supernatantul şi se resuspendă în 5 ml de
fixator proaspăt şi se menţine în fixator timp de 30 de minute la
temperatura camerei.
11. se recentrifughează timp de 10 minute la 1200
rotaţii/minut, iar sedimentul este resuspendat în 1 ml de fixator.
12. din suspensia celulară se realizează preparate care se
usucă la temperatura camerei şi se colorează cu soluâie Giemsa
timp de 10 minute
13. preparatele se analizează la microscopul optic la
obiectivul de 100X cu imersie.

Întrebări recapitulative
1. Ce reprezintă un preparat extemporaneu ?
2. Care sunt avantajele și dezavantajele preparatelor
extemporanee?
3. Care sunt etapele protoculul de lucru pentru
realizarea unui preparat de mucoasă linguală?
4. Ce reprezintă ciclul celular și care sunt fazele
acestuia?

Page 30 of 90
LP.3 TEHNICA ETALĂRII MATERIALULUI BIOLOGIC ÎN
MONOSTRAT: CONFECŢIONAREA, COLORAREA ŞI
INTERPRETAREA FROTIULUI DIN SÂNGE PERIFERIC
ŞI DIN SEDIMENTE CELULARE (URINĂ)

Prin tehnica etalării materialului biologic în monostrat

pot fi studiate individual celule întregi.
Tehnica prezintă o serie de avantaje, precum:
- se realizează rapid
- se pot efectua preparate proaspete, cu celule în stare vie,
nefiind necesară fixarea celulelor
- nu este necesară aparatură laborioasă şi nici personal
supracalificat.

Tehnica efectuării frotiurilor

Frotiurile sunt preparate microscopice care se
realizează prin etalarea în monostrat pe lame port-obiect a
probelor fluide. Aceste preparate se efectuează fie din sânge,
fie din secreţii (mamare, bronşice, vaginale), fie din celule
provenite din descuamări epiteliale sau exfoliere, din sedimente
celulare (urină, suc gastric, bilă, lichid de ascită sau lichid
pleural).

Tehnica efectuării frotiului din sânge periferic

Prin intermediul acestei tehnici se realizează analiza
sângelui sub aspect calitativ, dar şi cantitativ. Examenul
morfologic al elementelor figurate se efectuează pe preparate
proaspete sau pe preparate permanente, fixate şi colorate prin
tehnici de colorare obişnuite sau speciale.
Principiul metodei constă în etalarea pe o lamă port-
obiect a unei picături de sânge, într-un strat subţire şi uniform.

Page 31 of 90
 Materiale necesare
- material biologic (sânge)
- lame
- ace sterile
- mănuşi de protecţie
- alcool sanitar
-comprese sterile
- hârtie de filtru
- cuvă colorare
- colorant May Grünwald
- colorant Giemsa concentrată
- alcool etilic şi eter
- pipete
- microscop optic

Etape în realizarea frotiului din sânge periferic

1. Recoltarea sângelui
- se realizează din laterala pulpei degetului inelar la adult, lobul
urechii la copil, lateral halucelui sau călcâi la nou născut şi
sugar.
- locul de recoltare se dezinfectează cu alcool sanitar după care
se face o înţepătură de 2-3 mm adâncime, cu un ac steril.
- prima piătură de sânge se îndepărtează întrucât conţine mult
lichid interstiţial şi un număr redus de elemente figurate.

Page 32 of 90
Prelevarea sângelui periferic (stud. An I MD)

Page 33 of 90
2. Efectuarea frotiului propriu-zisă
- se recoltează următoarea picătură de sânge cu ajutorul lamei
efector
- se aşează lama efector sub un unghi de 45º peste lama port-
obiect
- la contactul cu lama port-obiect, se imprimă lamei efector
câteva mişcări de lateralitate pentru ca sângele să se întindă pe
toată linia de contact
- se imprimă apoi lamei efector o unică mişcare de translaţie în
lungul lamei port-obiect.

Etalarea în monostrat (stud. An I MD)

Caracteristicile unui frotiu executat corect:

1. are marginile drepte
2. se termină în franjuri
3. are o grosime potrivită (elementele figurate să nu fie
suprapuse, dar să fie în număr suficient de mare pentru a putea
fi studiate şi numărate).

Îndeplinirea acestor caracteristici depinde de:

1. mărimea picăturii de sânge
2. unghiul dintre lama efector şi lama port-obiect să fie de 30-
35º

Page 34 of 90
3. viteza de întindere - viteza trebuie să fie moderată şi
constantă, la o viteză mare se obţine un frotiu mai gros cu
elemente figurate distribuite în straturi suprapuse.

4. Fixarea frotiului din sânge periferic se poate realize prin:

a. metode fizice –uscare (desicare) la temperatura
camerei, prin agitarea lamei pentru a obţine o uscare rapidă
(uscarea lentă conduce la ratatinarea celulelor).
b. metode chimice – cu alcool metilic timp de 2
minute sau alcool etilic şi eter în părţi egale, timp de 5-15
minute.

5. Colorarea frotiului – cu tehnici de colorare obişnuite

(hematoxilină-eozină) sau folosind tehnici speciale. În practica
medicală se foloseşte coloraţia dublă May-Grünwald-Giemsa.

Fixarea şi colorarea frotiului (stud. An I MD)

Frotiul trebuie colorat cât mai curând (imediat după

întinderea picăturii de sânge sau în primele 24 de ore) deoarece
pe preparatele necolorate celulele se alterează pierzându-şi
activitatea tinctorială.
Practica colorării:
- Frotiul se aşează în cuva de colorare

Page 35 of 90
- se acoperă frotiul cu soluţie May-Grünwald timp de 2-3
minute
- se adaugă apoi un număr egal de picături de apă tamponată
şi se lasă 2 minute
- se îndepărtează colorantul fără spălare şi se acoperă cu
soluţie Giemsa diluată cu apă distilată în proporţie de 1/1,
întrucât soluţia Giemsa este mai vâscoasă, se lasă să acţioneze
timp de 15-20 minute
- se spală lama sub jet de apă după care se procedează la o
sugativare uşoară şi se lasă câteva minute pentru uscare.

6. Analiza microscopică a frotiului din sânge periferic

- se aşează frotiul pe platina microscopului şi se începe
examinarea la obiectivul de 10, pentru verificarea calităţii
tehnice a frotiului
- apoi imaginea se pune la punct cu obiectivul de imersie şi se
examinează pe rând:
 morfologia eritrocitelor
 frecvenţa şi morfologia trombocitelor
 frecvenţa şi morfologia leucocitelor (cu întocmirea
formulei leucocitare)
Pentru întocmirea formulei leucocitare, se examinează
frotiul de sânge pe margine, lama deplasându-se într-o singură
direcţie, notându-se fiecare tip de leucocit din 100 de leucocite
numărate. În practica medical analiza cantitativă a elementelor
figurate se realizează cu ajutorul hemocitometrului.

Page 36 of 90
 Analiza frotiului pe hemocitometru (stud. An I MD)

Hematii

Formula hemo-leucocitară normală

Hematii 4.000.000-5.000.000/ mm3
Leucocite 6.000-9.000/ mm3
Granulocite neutrofile nesegmentate NN = 1-4%
Granulocite neutrofile segmentate NS = 50-70%
Granulocite eozinofile E = 1-4%
Granulocite bazofile B = 0-1%
Limfocite L = 30-45%
Monocite M = 4-8%
Trombocite 200.000-300.000/ mm3

Procentele leucocitelor trebuie să însumeze 100%. Pentru a

creşte gradul de credibilitate a unei formule leucocitare se

Page 37 of 90
examinează 200-400 de elemente şi apoi se face procentajul
fiecărei clase de elemente.
Cifra absolută reprezintă numărul fiecăruia dintre
elemente pe mm3, precum şi variaţiile reale. (Tab.3)

Cifre absolut normale

Nr. Cifre absolut normale
crt.
1. Neutrofile nesegmentate 50-320/ mm3
2. Neutrofile segmentate 3000-4500/mm3
3. Eozinofile 100-200/mm3
4. Bazofile 20-10/mm3
5. Limfocite 1250-2400/mm3
6. Monocite 240-480/mm3

Modificări cantitative ale formulei leucocitare:

Creşteri
o Neutrofilie
 normal – sarcină, efort muscular
 patologic – infecţii generale şi locale, intoxicaţii,
leucemie granulocitară
o Eozinofilia
 alergii, parazitoze
o Bazofilia
 leucemie, intoxicaţie cu plumb
o Limfocitoza
 tuberculoza
o Monocitoza
 mononucleoza infecţioasă, febra tifoidă, malarie.
Scăderi
o Neutropenie

Page 38 of 90
  normal – inaniţie
 patologic – febra tifoidă, infecţii virale, agranulocitoza
o Eozinopenie
 faza de debut a bolii infecţioase, intoxicaţii, după
corticoterapie
o Limfopenie
 Infecţii supraacute, postcorticoterapie.

Caracterele morfologice ale celulelor sanguine prin coloraţia

MGG:
1. Hematiile sau eritrocitele, cunoscute şi sub
denumirea de globule roşii, se individualizează în cmpul optic
al microscopului ca având formă rotundă, biconcave pe profil,
cu diametrul de ~ 7,2 μm, culoarea caracteristică este cea de
roşu – cărămiziu, cu centrul mai puţin colorat. Deşi se
încadrează în categoria celulelor eucariote, hematia adultă
devine anucleată, discoidală şi biconcavă, fiind alcătuită din
citoplasmă şi membrană celulară.

Hematii

Page 39 of 90
 Există şi hematii cu forme speciale, dar în număr mult
mai redus, cum ar fi: sferocitele (formă de balon sau sferică);
echinocitele (formă sferică), prezintă pe suprafaţa lor
prelungiri de dimensiuni egale – ţepi, (20-30 ţepi localizaţi
echidistant); eliptocitele (ovale); stomatocitele (hematii
rotunde) care prezintă într-o anumită zonă o înfundătură ca o
gură (stoma); acantocitele (formă rotunjită), prezintă pe
suprafaţa lor 5-15 prelungiri de dimensiuni inegale şi situate la
distanţe inegale între ele; drepanocitele (hematii în corn sau
seceră). Acantocitele şi drepanocitele sunt forme patologice
ireversibile ale hematiei. Creşterea hematiei determină apariţia
macrocitelor (peste 10 μm diametru), scăderea diametrului
hematiei sub 7 μm (microcit).
2. Leucocitele sau globulele albe se colorează diferit
în funcţie de tipul lor:
Granulocite (12-15 μm, citoplasma abundentă în
granulaţii) se clasifică în:
a. Nesegmentate - reprezintă neutrofilele tinere, având
nucleul în forma literei “S” sau în bandă.
b. Segmentate
- Polimorfonucleare neutrofile – prezintă nucleu bi sau
polilobat, poziţionat central, de culoare violet, iar citoplasma
colorată în violet deschis, cu granulaţii fine, de culoare brun.

- Polimorfonucleare acidofile (eozinofile) – prezintă nucleu

bilobat de culoare violet, iar citoplasma conţine granulaţii mari,
roşii, care nu se suprapun peste nucleu.

- Polimorfonucleare bazofile - constituite din nucleu bilobulat,

situat central, de culoare violet, citoplasma cu granulaţii rare,
dar grosiere, de culoare albastru violet - intens, care se
suprapun peste nucleu.

Page 40 of 90
 . Leucocite
(http://www.wisegeek.com/what-is-atypical-lymphocytosis.htm#white-
blood-cells-diagram)

1=hematii; 2=plachete sanguine; 3=limfocite mici; 4=neutrofile,

5=bazofile
(http://www.pathpedia.com/education/eatlas/histology/blood_cells/Images.a
spx?6)

3.Monocitele, cele mai mari celule ale sângelui, nu

prezintă granulaţii, iar diametrul variază între 23-25 μm.
Monocitele se caracterizează prin nucleu cu aspect reniform,
plasat uşor excentric, colorat violet, iar citoplasma se prezintă
în nuanţe de albastru-cenuşiu, bleu.

Page 41 of 90
 4. Limfocitele ca şi monocitele, nu prezintă granulaţii,
diametrul variază între 8-12 μm. Acestea se caracterizează prin
prezenţa unui nucleu rotund, violet, cu condensări ale
cromatinei, iar citoplasma de culoare bleu, apare ca o zonă
îngustă, semilunară, colorată slab bazofil în bleu.

Fig.25. Limfocite şi monocite

(http://www.labtestsonline.ro/tests/differential.html?tab=2)

5.Trombocitele sau plachetele sanguine sunt cele mai

mici elemente figurate, având diametrul cuprins între 2-4 μm,
cu formă sferică şi ovoidală, de culoare violet deschis. Cel mai
adesea se găsesc localizate în grupuri suprapuse pe eritrocite.
Întocmai cai şi hematia adultă, trombocitul este anucleat,
format din membrană şi citoplasmă.

Page 42 of 90
 Trombocit.
(http://mss.svarog.si/biologija/MSS/index.php?page_id=11311)

TEHNICA EFECTUĂRII FROTIULUI DIN SEDIMENTE

CELULARE (URINĂ)
Principiul metodei constă în etalarea pe o lamă port-
obiect a unei picături din sedimentul urinar în vederea
examinării microscopice a celulelor, cristalelor urinare,
mucusului, bacteriilor sau a altor microorganisme.
Materiale necesare
- material biologic (urină)
- urocultor
- lame
- lamele
- mănuşi de protecţie
- hârtie de filtru
- centrifugă
- pipete

Page 43 of 90
- colorant
- microscop optic

Etape în realizarea frotiului din sediment urinar

1. Recoltarea urinei – se realizeză dimineaţa deoarece

proba este de obicei hipertonă şi reflectă abilitatea rinichilor de
concentrare a urinei în perioada de deshidratare din timpul
nopţii. Dacă recoltarea urinei se realizează în orice moment al
zilei aceasta poate fi diuată, iar dacă nu se aplică toate măsurile
de igienă caracteristice, proba poate fi contaminată cu
leucocite, bacterii, celule epiteliale scuamoase, iar în cazul
femeilor proba poate fi contaminată, de la nivel vaginal, cu
specii de Trcihomonas sau Candida, dar şi eritrocite în
perioada menstrei. Este recomandată evitarea ingestiei de
alimente şi fluide după ore 1800 din ziua precedentă.
Colectarea urinei de dimineaţă se realizează din jetul
mijlociu, după curăţarea preliminară a meatului uretral extern.
Primul jet de urină serveşte pentru spălarea uretrei de celule şi
microbi. Recoltarea se face direct în urocultor, cantitatea
minimă de urină necesară analizei biologice fiind de 100 ml.
Rezultatele analiezei nu sunt influenţate dacă persoana a mai
urinat şi în timpul nopţii.
În anumite cazuri, pentru evitarea unui rezultat fals
pozitiv, pacientul trebuie să specifice personalului din laborator
dacă:
- se află sub tratament şi denumirea medicamentului
administrat;
- au fost consumate cantităţi mari de lapte sau derivate ale
acestuia cu 24 de ore înainte de recoltare (se poate
înregistra o creştere a calciului în urină);
- urmează un regim alimentar hiposodic;

Page 44 of 90
 Pregătire probă urină (stud. An I MD)

2. Pregătirea probei de analizat

Se centrifughează 10-15 ml de urină la o viteză de
2000-3000 rpm timp de 5-10 minute. După centrifugare
supernatantul este îndepărtat şi se lasă în tubul de centrifugă un
volum de 0,2-0,5 ml. Sedimentul astfel obţinut este resuspendat
în supernatantul rămas, iar o picătură din sedimentul
resuspendat este aşezată pe o lamă port-obiect. Pentru o mai
bună evidenţiere a sedimentului organizat preparatul poate fi
colorat cu coloranţi universali.

Centrifugarea probei (stud. An I MD)

Page 45 of 90
 Colorarea şi realizarea frotiului (stud. An I MD)

3. Examinare
a) vizuală, directă a urinei - în mod normal urina este
transparentă şi de culoare gălbui. Turbiditatea poate să apară în
cazul existenţei proteinelor sau a unui material celular în exces
în urină. O culoare roşie sau roşu-cărămizie a urinei poate fi
cauzată de un colorant alimentar, un medicament sau de
prezenţa hemoglobinei sau mioglobinei. Dacă proba conţine
numeroase eritrocite, va prezenta atât o culoare roşie intensă
cât şi opalescenţă. Filtratul glomerular este acidifiat la nivelul
tubilor contorţi şi colectori, de la un pH de 7,4 la pH 6,
valoarea medie a pH-ului urinei finale. Valorile pH-ul urinar
pot varia între 4,5 şi 8.

b) microscopică a sedimentului urinar

În urma examinării se apreciază:
- sedimentul mineral (anorganic), exprimat amorf sau prin
cristale cu forme specifice (carbonat de calciu, sulfat de calciu,
fosfat de calciu, etc);
- sedimentul organic, reprezentat sub două forme: neorgnizat
şi organizat. Sedimentul organic neorganizat este reprezentat
de cristale de săruri organice ale acizilor aminaţi, graşi (cistina,
tirozina, colesterina, acid uric, acid hipuric etc), şi organizat,
reprezentat de celule (epiteliale, bacteriene, sanguine, tumo-

Page 46 of 90
 rale etc), cilindroizi (foarte lungi) depăşind cadrul câmpului
microscopic şi cilindri (aglomerări de celule formând mulaje
ale tubilor urinari). Analiza microscopică a sedimentului urinar
are semnificaţia unei adevărate examinări biopsice a rinichilor.

Analiza microscopic a frotiului (stud. An I MD)

Hematuria (hematii în urină) - semnifică prezenţa de

hematiilor în urină, cauzată de: afectare glomerulară, tumori care
invadează tractul urinar pe lungimea lui, traumatisme renale,
calculi urinari, necroză tubulară acută, infecţii de tract urinar
superior sau inferior, nefrotoxine, stres fizic. Hematuria poate fi
iatrogenă, în urma traumatismului produs de cateterizarea vezicii
urinare, sau falsă, în timpul menstrei, când uretra poate fi
contaminată cu hematii de la nivel vaginal. Teoretic, în urină nu
ar trebui să existe eritrocite, dar hematuria poate apărea şi la
indivizii sănătoşi. În cazul în care se descoperă o hematie/câmp şi
contaminarea este exclusă nu se consideră un rezultat pozitiv.
Hematiile din urină pot prezenta diferite forme: normală, bombate
în urina diluată (celule „fantomă” şi hemoglobină liberă) sau
ratatinate în urina concentrată. Hematiile deformate sunt dificil de
diferenţiat de leucocitele urinare. Prezenţa eritrocitelor dismorfice
în urină sugerează afecţiuni glomerulare, cum este

Page 47 of 90
glomerulonefrita. Eritrocitele dismorfice au forme ciudate datorită
traversării structurilor glomerulare.
Piuria (leucocite în urină) - reprezintă prezenţa unui
număr crescut de leucocite în urină, care însoţeşte de obicei
infecţiile de tract urinar sau glomerulonefrita acută. În general,
leucocitele identificate în urină sunt granulocite. Leucocitele
provenite din vagin (mai ales în cazul infecţiilor vaginale) sau de
la nivelul meatului uretral extern pot contamina urina, cu apariţia
unei false leucociturii. Piuria se este diagnosticată atunci când
apar 2 sau mai multe leucocite pe câmpul microscopic.
Celulele epiteliale - tubulare sunt de dimensiuni mai mari
decât granulocitele, prezintă nuclei rotunzi sau ovali şi în mod
normal se găsesc în număr mic în urină. În sindromul nefrotic şi
în afecţiunile cu afectare tubulară, numărul de celule epiteliale
creşte. Celulele epiteliale tranziţionale de la nivelul pelvisului
renal, ureterului sau vezicii urinare sunt de dimensiuni mai mici
decât celulele epiteliale scuamoase şi prezintă margini neregulate
şi nuclei mari. Celulele epiteliale tubulare sunt mai mici şi mai
rotunde decât cele tranziţionale. Celulele epiteliale scuamoase de
la nivel cutanat sau de la nivelul uretrei externe pot apărea în
urină, în urma contaminării probei.

Întrebări recapitulative
1. Ce reprezintă frotiurile și din ce materiale biologice
pot fi confecționate?
2. Care sunt etapele de realizare a unui frotiu din
sânge perifecric?
3. Care sunt elementele figurate care se analizează la
microscop ?
4. Care sunt etapele de realizare ale unui sediment
urinar?
5. Ce presupune analiza microscopică a sedimentului
urinar?
Page 48 of 90
 LP.4 TEHNICA REALIZĂRII UNUI PREPARAT
PERMANENT (DEFINITIV, FIXAT SAU DURABIL) –
PRIN METODA EFECTUĂRII SECŢIUNILOR FINE
(ŞOARECI DE LABORATOR)
Comparativ cu tehnica de realizare a unui preparat
extemporaneu, prin această tehnică pot fi studiate, mult mai în
detaliu structurile celulare pe secţiuni fine, colorate.
Preparatul permanent prezintă o serie de avantaje,
precum:
- rezistenţă în timp (zeci de ani) întrucât structurile celulare
sunt conservate prin fixare, ceea ce permite o analiză
comparativă în timp, în cazul unor modificări morfologice
- permite stabilirea unui diagnostic exact.
Printre dezavantajele acestei tehnici se numără:
- rezultatele nu oferă un răspuns imediat întrucât tehnica de
prelucrare a preparatului poate dura şi câteva zile
- este necesară o aparatură complexă, costisitoare
- este necesară angajarea de personal supracalificat.
Preparatele definitive se realizează prin două metode:
I. Metoda etalării materialului biologic în monostrat
Această metodă este aplicată pentru realizarea
frotiurilor şi a amprentelor de organe.
Frotiul se execută pentru studiul celulelor aflate în
suspensie, se realizează în special din fluide, secreţii, dar şi din
sedimente celulare, celule descuamate.
Amprenta de organ se realizează din organe
parenchimatoase, prin aplicarea pe o lamă port-obiect a unei
secţiuni dintr-un organ.

Page 49 of 90
 II. Metoda efectuării secţiunilor fine – este o metodă
laborioasă care necesită parcurgerea cu stricteţe a mai multor
etape successive:
1. Recoltarea
2. Fixarea
3. Spălarea
4. Includerea
5. Secţionarea
6. Etalarea materialului biologic pe lamă
7. Colorarea şi clarificare
8. Montarea
9. Etichetarea

2. Recoltarea – este o etapă foarte importantă deoarece

după sacrificarea animalului de experienţă sau obţinerea unui
fragment de ţesut sau organ prin biopsie sau alt act operator,
trebuie realizată, în cel mai scurt timp, o piesă de material
biologic în care să se regăsească populaţia de celule care
prezintă interes diagnostic. (Fig. 10) Recoltarea materialului
biologic se realizează prin:
a. biopsie
b. puncţie bioptică
c. aspiraţie endoscopică
d. raclarea mucoaselor
e. puncţia cavităţilor
f. prelevarea intraoperatorie
g. recoltarea de material biologic de la cadavrele umane în
urma necropsiei
h. recoltarea materialului biologic de la animalele de
experienţă.

Page 50 of 90
 Materiale necesare
- şoareci de laborator sau şobolani rasa Wistar
- mănuşi
- masă de disecţie
- plăci de plută
- trusă chirurgicală
- apă distilată
- comprese sterile
- cloroform

Pregătirea experimentului (stud. An I MD)

Şoareci de laborator

Page 51 of 90
Disecţia animalului de laborator (stud. An I MD)

Prelevarea organelor (stud. An I MD)

Page 52 of 90
 O piesă citologică trebuie să îndeplinească următoarele
condiţii:
 să fie recoltată rapid, steril, direct în fixator pentru a preveni
putrefacţia
 să fie orientată pe secţiune, să aibă feţele plane şi paralele
 să se evite strivirea
 să aibă dimensiuni de 5/5/5 mm.

Materiale necesare următoarelor etape

- urocultoare sterile
- formaldehidă
- pense
- alcool etilic de diferite concentraţii
- toluen
- apă distilată
- parafină
- lamele Leukard
- lame
- lamele
- microtom
- plită histologică
- etuvă
- albumină Mayer
- alcool acidulat
- apă litinată
- balsam de Canada
- microscop optic

3. Fixarea – este un timp esenţial în realizarea

preparatelor permanente, deoarece permite întreruperea bruscă
a proceselor vitale, previne putrefacţia şi conservarea

Page 53 of 90
constituienţilor celulari într-o stare cât mai apropiată de cea
vie. Fixarea poate fi efectuată prin:
A. fixatori fizici – căldura – determină coagularea
proteinelor; desicarea la temperaturi scăzute (congelare-
desicare sau criodesicare) – determină sublimarea apei
conţinute în piese, răcire la o temperatură inferioară de 0ºC şi
plasarea într-o incintă unde presiunea este inferioară valorii de
4,6 Hg (coloană de mercur); desicarea la temperatura
laboratorului – conduce la denaturarea proteinelor şi necesită
un alt fixator – alcool metilic); congelarea - principiul este
apropiat de cel al criodesicării.

B. fixatori chimici – se clasifică după:

1. tipul de coagulare:
- coagulanţi (etanol, acetonă, acid clorhidric, etc).
- necoagulanţi (formaldehidă, acid acetic, tetraoxid de osmium
etc).
2. compoziţie:
- simpli (formol, alcool etilic, alcool metilic, acid acetic, acid
tricloracetic, acid cromic etc)
- compuşi – amestecuri de fixatori simpli (amestecuri cromo-
osmice, amestecuri cromice fără Os04 şi acid acetic, amestecuri
de bază de metale grele în afară de crom şi Os04,, amestecuri
formol-calciu, fixatorii Clarke şi Canoy, fixatorii Bouin, Susa,
Heidenhein etc).
3. după utilizare:
- universali – formol, Bouin.
- specifici – Canoy – pentru studiul acizilor nucleici, Da fano –
permite impregnarea argenică pentru studiul aparatului Golgi.
(Tab. 1)

Un bun fixator citologic trebuie să îndeplinească

următoarele proprietăţi:

Page 54 of 90
1. să patrundă rapid în ţesut
2. să producă o reacţi cât mai redusă a pieselor fără a determina
modificări de formă, talie etc.
3. să permită o bună includere
4. să permită o bună colorare a structurilor.

Condiţiile de fixare a unei piese citologice:

- fixarea să se realizeze imediat după recoltare
- fixatorul să fie ales conform scopului urmărit
- volumul fixatorului trebuie să fie de de 50 de ori mai mare
decât volumul piesei citologice
- temperatura de fixare trebuie sa fie adecvată tipului de
fixator
- durata fixării se realizează în funcţie de ţesut şi scopul
urmărit (1 oră – 4 zile)
- secţionarea unor fragmente suficient de mici
- fixatorul se utilizează o singură dată.
Fixatori specifici

Nr. ORGANIT FIXATORI UTILIZAŢI

crt.
1. NUCLEUL Clarke, Carnoy, Bouin +CrO3
2. CROMATINA SEXUALĂ Amestecuri cromo-osmotice
3. NUCLEOLUL Sanfelice şi fixatori pe bază de CrO3
4. COMPLEX GOLGI Champy, Nassonov, Da Fano
5. MITOCONDRII Orth, Kopsch, Regaud, Altman,
Benoît
6. R.E.G. Bouin, Susa, Clarke, Carnoy
7. TONOFIBRILE Carnoy
8. MICROVILI Carnoy, Flemming, Benda, Campy,
Benoît
9. CILI Sanfelice, Kolmer, Champy, Benda
10. GRANULE DE SECREŢIE Bouin, Zenker, Susa, Clarke, Carnoy

Page 55 of 90
 3. Spălarea piesei citologice – se realizează cu apă de
robinet, apă distilată, alcool diluat (60 - 70%). Această etapă
are rolul de opri acţiunea şi înlăturarea fixatorului. Timpul de
spălare trebuie să fie egal cu timpul de fixare.

4. Includerea este etapa prin care piesa citologică

dobândeşte elasticitate şi rezistenţă pentru a putea fi secţionată
la microtom. Includerea se realizează în parafină, tehnică care a
fost introdusă în histologie de către Krebs încă din 1869, fiind
şi la ora actuală cea mai utilizată. Parafina reprezintă un
amestec de hidrocarburi alifatice prezentând o serie de
caractere fizice de care depinde calitatea includerii. Din punct
de vedere chimic parafina nu este miscibilă cu apa şi cu
alcoolurile, fiind miscibilă cu eterul sulfuric, sulfura de carbon,
hidrocarburile benzenice etc.
Parafina se caracterizează prin următoarele proprietăţi:
- duritate, plasticitate,vâscozitate
- solubilitate în agenţi clarifianţi
- topire la temperaturi apropiate de 55º ce permite impregnarea
ţesuturilor fără ca acestea să sufere alterări structurale
importante
- redevine solidă, dar fără a prezenta o duritate excesivă la
temperatură obişnuită, ceea ce permite confecţionarea de
„blocuri” în care fragmentul inclus este perfect menţinut şi
poate fi secţionat la grosimi foarte mici, de ordinul micronilor.
Includerea la parafină a ţesuturilor fixate se realizează
parcurgând mai multe etape: deshidratarea – se realizează în
băi succesive de alcool de concentraţii crescânde 70, 80%, la
temperatura camerei. Piesa este menţiunută în aceste două băi
de alcool minim 3 ore, maxim o zi. După această etapă piesa
citologică este introdusă în alte două băi de alcool de 90%,
respectiv alcool absolut. Timpul de menţinerea a piesei în

Page 56 of 90
aceste două băi de deshidratare este identic cu cel prezentat la
baile de mai sus. Piesa este ulterior trecută prin alte trei băi
succesive: de alcool absolut şi două băi de toluen. Durata de
menţinere a piesei în aceste băi fiind aceeaşi ca şi pentru băile
menţionate mai sus. Durata deshidratării este în funcţie de
volumul fragmentelor tisulare, pentru cele de talie mijlocie
deshidratarea se efectuează în 2-3 ore. Volumul alcoolului din
baia de deshidratare trebuie să fie de aproximativ 10 ori mai
mare decât volumul piesei. Includerea piesei în cele două băi
de toluen conferă piesei clarificare, aceasta se poate realiza şi
în băi de xilen, benzen, clorofom.
Impregnarea cu parafină se realizează în parafină lichidă,
prin încălzirea acesteia într-un termostat la 56ºC. De calitatea
secţiunile, depinde dacă până la includerea propriu-zisă în
parafină, piesa a fost trecută prin cel puţin 3 băi succesive de
parafină. Durata impregnării piesei citologice cu parafină
depinde de volumul piesei, fiind în medie de 6 ore.
Includerea propriu-zisă se realizează după scoaterea
piesei din ultima baie de parafină. Piesa se aşează în parafină
nouă, neutilizată, care se toarnă în lamele Leukard, după care
urmează etichetarea şi răcirea blocului de parafină la
temperatura camerei.
5. Secţionarea este etapa în care piesa citologică inclusă
în blocul de parafină este secţionată la microtomul
semiautomat cu mişcare verticală. Astfel, se obţin secţiuni fine
a căror grosime poate varia între 3-7 şi10 µm.
Piesa citologică inclusă în blocul de parafină, care
urmează a fi secţionat se modelează în formă de trunchi de
piramidă patru unghiulară, în jurul piesei ramânând o bandă de
parafină de 1-2 mm grosime. Blocul finisat se montează la
microtom.
6. Etalarea şi lipirea secţiunilor pe lamă - secţiunile
trebuie aşezate pe o lamă port-obiect sterilă pe care se adaugă o

Page 57 of 90
picătură de albumină Mayer. Din panglica de parafină obţinută
se taie fragmente conţinând 3-4 secţiuni care se aplică (cu faţa
lucioasă în jos) pe lama pe care s-a pus în prealabil albumină
Mayer. Se picură apă distilată la una din extremităţile panglicii
de parafină şi se înclină puţin lama pentru ca secţiunile să
plutească. Lama port-obiect care conţine secţiunile se aşează pe
plita histologică încălzită la 560C, astfel secţiunile se descreţesc
şi se întind complet, timpul minim fiind de 30 de minute.

Fig.14. Includerea la parafină (stud. An I MD)

Secţionarea blocului de parafină la microtom şi realizarea de preparate

permanente (stud. An I MD)

Page 58 of 90
 Lama cu secţiunile astfel pregătite este trecută prin 3
băi succesive de toluen, câte două minute în fiecare baie şi prin
3 băi succesive de alcool etilic absolut, câte 2 minute fiecare.
Lama este introdusă ulterior într-o baie care conţine apă de
robinet.
7. Colorarea şi clarificarea - permite diferenţierea
structurilor celulare pe baza afinităţii lor faţă de diferiţi
coloranţi. Colorarea se realizează cu coloranţi naturali sau
sintetici: May Grunwald-Giemsa, Sudan III, IV, Hematoxilină,
Eozină (HE) care colorează componentele bazice ale celulelor,
nucleul, nucleolul în mov, iar eozina colorează componentele
acide ale celulelor, respectiv citoplasama şi unele organite în
roz. Coloraţia HE este cea mai des folosită în practica
histologică.
Lama cu secţiunile realizate este trecută print-o baie de
hematoxilină 20-30 minute, urmează includerea lamei într-o
baie care conţine apă de robinet, după care, pentru a înlătura
excesul de colorant lama este trecută printr-o baie de alcool
acidulat, urmează o uşoară clătire cu apă de robinet, după care
lama se introduce într-o baie de apă litinată 1-2 până la 5
minute. Lama cu secţiunea este introdusă pentru o a doua
colorare în eozină, timp de 5-10 minute, după care se realizează
o clătire rapidă într-o baie de apă de robinet. Ultimele băi sunt
de alcool etilic (3 băi succesive a câte 2 minute) şi toluen (3 băi
succesive a câte 2 minute).
Un colorant este un produs care poate colora durabil o
substanţă sau un fragment histologic.

Clasificarea coloranţilor:
A. După origine:
- naturali – de origine vegetală (hematoxilina), animală
(carminul)

Page 59 of 90
- sintetici – majoritatea coloranţilor.
B. După natura auxocromilor:
- coloranţi acizi (anionici, citoplasmatici) – colorează
componentele celulare încărcate pozitiv (eozina, albastru de
anilină etc)
- coloranţi bazici (cationici, nucleari) - colorează
componentele celulare încărcate negativ (hemalaunul, albastrul
de metil etc)
- coloranţi neutri – se obţin din soluţii apoase de coloranţi
acizi şi bazici amestecaţi în anumite proporţii.

Metodelor de colorare:
1. După numărul coloranţilor utilizaţi:
 simple – când se foloseşte un singur colorant (albastru
de metilen etc)
 combinate – când secţiunile se colorează succesiv cu
doi sau mai mulţi coloranţi (HE etc)
2. După intensitatea colorării:
 progresive – se fac încercări successive sub control
microscopic până se ajunge la nuanţa de culoare optimă a
structurii celulare)
 regresive – se face o supracolorare care prinde şi alte
structuri celulare decât cele dorite, după care excesul de
colorant este îndepărtat prin substanţe.
3. După starea materialului:
 coloraţii vitale – care se fac pe celule în stare vie prin
utilizarea unor coloranţi vitali şi care persistă numai atât
timp cât supravieţuieşte celula (pentru evidenţierea unor
organite celulare – mitocondriile se colorează cu verde
Janus B, aparatul Golgi cu roşu neutru).
 coloraţii permanente – care se execută la colorarea unor
preparate permanente.

Page 60 of 90
4. După structurile pe care le colorează:
 uzuale (de rutină) – evidenţiază structura generală a celulei,
forma celulelor, numărul celulelor, nucleilor (coloraţie
HE).
 specifice – evidenţiază anumiţi constituienţi şi structuri
celulare, datorită legării anumitor coloranţi numai la nivelul
acestor structurii. Spre exemplu, lipidele sunt ecidenţiate cu
coloraţia Sudan etc.

8. Montarea – se realizează cu răşini sintetice sau

naturale (Balsam de Canada). Această etapă are rol în creşterea
translucidităţii şi protecţiei preparatului. Se pune o picătură de
Balsam de Canada pe o lamelă care este apoi aplicată pe
preparat. Preparatul montat se pune la termostat la 37ºC timp
de 24 ore pentru uscare.

9. Etichetarea – este ultima etapă în obţinerea unui

preparat permanent. În partea laterală a lamei, în zona mată se
etichetează preparatul cu următoarele date: numele şi
prenumele pacientului, diagnosticul, data şi numele persoanei
care a efectuat preparatul.

Histoteca din cadrul laboratorului de morfologie şi

microscopie

Page 61 of 90
 Preparatele permanente astfel confecţionate se
păstrează în histotecă. În Laboratorul de Discipline
Morfologice şi Microscopice al Universităţii “Apollonia” din
Iaşi în colecţia histotecii există peste 2000 preparate
permanente care sunt utilizate în scop didactic pentru
disciplinele de: biologie celulară, histologie, anatomie
patologică.

Întrebări recapitulative
1. Ce sunt avantajele și dezavantajele unui preparat
permanent?
2. Care sunt condițiile pe care trebuie să le
îndeplinească o piesă citologică?
3. Care sunt etapele de realizare ale unui preparat
permanent?
4. Care sunt condițiile pe care trebuie să le
îndeplinească un bun fixator?
5. Cum se realizează montarea preparatului pe lamă?

Page 62 of 90
LP.5 A.TEHNICA ETALĂRII MATERIALULUI BIOLOGIC
ÎN MONOSTRAT: TEHNICA EFECTUĂRII
AMPRENTEI DE ORGAN (FICAT DE PORC SAU VITĂ)
B. Evidenţierea formelor celulare şi nucleare
(preparate permanente şi fotografii).
Prin această tehnică se pot pot analiza fragmente de
organe parenchimatoase (rinichi, ficat, splină, ganglioni
limfactici etc).
Tehnica amprentei de organ nu oferă detalii tisulare,
precum tehnica efectuării preparatelor permanente prin metoda
efectuării secţiunilor fine, dar are avantajul că permite
diagnosticarea rapidă a formaţiunilor tumorale (tumori renale,
metastaze ganglionare), deoarece pune în evidenţă prezenţa
anomaliilor nucleare.
Materiale necesare
- material biologic (ficat proaspăt de vită sau porc)
- bisturiu
- pensă
- mănuşi de protecţie
- lame
- fixator (alcoolo etilic şi eter)
- colorant (albastru de toluidină sau hematoxilină-eozină)
- cuvă colorare
- hârtie de filtru
- pipete
- microscop optic

Practica efectuării amprentei de organ

Organul de examinat se secţionează transversal prin
zona care prezintă interes diagnostic.
Page 63 of 90
1.RECOLTAREA – secţionarea fragmenului se face cu un
bisturiu sau cu o lamă bine ascuţită, pentru a evita deformarea
sau strivirea ţesuturilor.
2.ETALAREA – cu ajutorul unei pense se prinde fragmentul
secţionat şi se apasă uşor cu faţa secţionată pe lama port-obiect.
Pentru a nu obţine celule dispuse pe lamă în straturi suprapuse
fragmentul nu trebuie deplasat după etalarea pe lama port-
obiect.

Secţionarea ficatului (stud. An I MD)

3.FIXAREA – se realizeaă cu un amestec de alcool etilic şi eter

în părţi egale timp de 15 minute. După fixare, fragmentul se
îndepărtează şi urmează etapa de colorare pe amprenta astfel
obţinută.
4.COLORAREA – se face cu albastru de toluidină pentru
examenul extemporaneu sau cu hematoxilină-eozină.

Page 64 of 90
 Fixarea şi colorarea amprentei de organ (stud. An I MD)

Rezultatele amprentei de organ din ficat colorată HE

Din punct de vedere microscopic se analizează
hepatocitele care sunt dispuse în grupuri de câteva celule,
prezentând citoplasmă roz şi nuclei violet. Se pot observa
hepatocite uni sau binucleate, precum şi eritrocite de culoare
roşie, deoarece ficatul este un organ foarte bine vascularizat.

Analiza microscopică a hepatocitelor

Page 65 of 90
Evidenţierea formelor celulare şi nucleare (analiza
microscopică pe preparate permanente şi fotografii).

Întrebări recapitulative
1. Ce reprezintă tehnica ampretei de organ?
2. Care sunt avantajele acestei tehnici ?
3. Care sunt etapele de realizare ale unui preparat prin
această tehnică, utilizând ca material biologic
ficatul de vită sau porc?
4. Ce colorant se folosește la această tehnică?
5. Ce se analizează microscopic pe preparatele
obținute?

Page 66 of 90
 Lp.6 Metode de separare a componentelor celulare.
Omogenizarea şi omogenatele celulare. Centrifugarea.
Ultracentrifugarea. Centrifugarea nucleilor şi mitocondriilor –
etape de lucru (şobolan alb din rasa Wistar)

Noţiunea de component celular are o semnificaţie largă, ea

desemnând atât structurile celulare organizate, cu semnificaţie
funcţională (organite celulare), substanţele de rezervă şi depozit ale
celulei (incluziuni celulare), cât şi macromoleculele,
micromoleculele şi ionii ce definesc compoziţia chimică a
celulelor.
Separarea componentelor celulare reprezintă o etapă
iniţială şi obligatorie necesară studiului ulterior al acestor
componente, prin variate mijloace de investigaţie.
Metode de separare a componentelor celulare:
- separarea pe cale chimică;
- electroforeza;
- cromatografia;
- centrifugarea şi ultracentrifugarea etc.
În vederea separării componentelor celulare este necesar ca,
într-o primă etapă integritatea morfostructurală a celulelor intacte
să fie alterată, prin tehnici de omogenizare (omogenare) celulară.

A. Omogenizarea şi omogenatele celulare

Noţiunea de „omogenizare” este definită ca procedura prin

care se obţine un omogenat celular.
Omogenatul celular reprezintă o suspensie de celule întregi (sau
de componente subcelulare), realizată într-un mediu lichid cu două
caracteristici esenţiale: pH fiziologic şi izotonicitate.

Page 67 of 90
Se aplică mai multe metode de realizare a omogenatelor celulare,
care, în funcţie de factorul principal ce determină dezorganizarea
celulelor (sau detaşarea celulelor întregi dintr-un ţesut), se pot
clasifica în:

1. Metode mecanice de omogenizare.

Tipuri de metode mecanice de omogenizare: omogenizarea
cu ajutorul
- omogenizatorului Potter, omogenizarea cu ajutorul
- omogenizatorul Warring (cu cuţite)
- prin mojarare, cu sticlă pisată (sau nisip de cuarţ)

2. Metode fizice
Ultrasonarea (ultrasonicarea) – este cea mai utilizată
metodă, pe bază de ultrasunete (sunete cu frecvenţă înaltă) care
acţionează în primul rând asupra membranei celulare, pe care o
distrug, conţinutul celular fiind eliberat apoi în mediul de omo-
genizare.
Metoda îngheţului – dezgheţului alternative - constă în
expunerea celulelor la o alternanţă de şocuri termice succesive
(temperaturi extreme), care conduc în timp la dezorganizarea în
fragmente a acestora, datorită variaţiilor de volum ale apei
intracelulare produse în timpul îngheţului-dezgheţului.

3. Metode fizico – chimice

Metoda şocurilor osmotice – este cea mai utilizată și constă
în introducerea celulelor într-un mediu ce prezintă o diferenţă mare
de presiune osmotică în comparaţie cu mediul intracelular (mediu
hipotonic sau hipoosmotic), actiune care are ca rezultat liza osmo-
tică a celulelor. O variantă frecvent utilizată de liză osmotică este

Page 68 of 90
hemoliza hematiilor, obţinută prin introducerea acestor elemente
figurate în apă distilată (sau bidistilată).

4. Metode chimice
Sunt utilizate, cu precădere, în scopul detaşarii şi separarii
unor celule întregi din diverse ţesuturi. Acestea constau în tratarea
fragmentelor tisulare cu diverse enzime, în special proteolitice (de
exemplu, tripsina şi colagenazele), care atacă şi digeră diferite
tipuri de joncţiuni intercelulare. Componentele celulare aflate în
suspensie în mediul de omogenizare, eliberate în urma practicării
uneia sau alteia dintre metodele descrise, pot fi supuse în
continuare diferitelor tehnici de separare.

B. Centrifugarea

Aceasta reprezintă o metodă mecanică clasică de separare

a componentelor celulare. Separararea se realizează sub acţiunea
unei forţe centrifugale (G), generate în timpul mişcării piesei
rotative (rotorului) a unei centrifuge. Forţa centrifugală este o forţă
derivată din forţa de atracţie gravitaţională, dar de sens opus, ea
determinând îndepărtarea corpurilor de la centru spre periferie, în
timpul unei rotaţii.

Tipuri de centrifuge

În practica de laborator se folosesc, în general, două tipuri

de centrifuge, ce diferă în principiu după construcţia rotorului:
 centrifuga cu eprubete balansante (cu rotor
orizontal)
 centrifuga cu rotor angular

Page 69 of 90
 Factori care condiţionează sedimentarea componentelor
celulare

În condiţiile în care G şi timpul de centrifugare sunt

constante, în timpul centrifugării sedimentează numai anumite
componente celulare, tipul particulelor care se colectează, în
condiţiile menţionate, depinzînd în principal de două categorii de
factori:
a. Caracteristicile particulelor:
- masa şi densitatea particulelor - care sunt direct proporţionale
cu viteza de sedimentare (componentele mai grele şi mai dense
se depun întotdeauna, sub formă de sediment, înaintea celor
mai uşoare, cu densitate mai mică);
- forma şi suprafaţa particulelor – un component celular, deşi
greu, se poate deplasa şi depune în tubul de centrifugare cu o
viteză cu atât mai mică cu cât suprafaţa sa este mai extinsă şi
forma mai neregulată.
b.Caracteristicile mediului de centrifugare țin de
densitatea şi vâscozitatea acestui mediu (caracteristici invers
proporţionale cu viteza de deplasare şi sedimentare a
componentelor celulare)
În cazul centrifugării omogenatelor celulare, la sfârşitul
centrifugării se obţin întotdeauna două componente: o parte solidă,
precipitată (sediment) şi o parte lichidă, dispusă deasupra primei,
care conţine particulele nesedimentate, aflate în suspensie (su-
pernatant).
Mărind progresiv valoarea lui G şi a timpului de
centrifugare, se pot obţine practic principalele componente
celulare, în etape successive, sub formă de sediment, motiv pentru
care o astfel de centrifugare mai este cunoscută şi sub numele de
fracţionare diferenţiată sau centrifugare diferenţiată a celulelor.

Page 70 of 90
 C. Ultracentrifugarea
– reprezintă o variantă superioară de centrifugare a componentelor
celulare
Între centrifugare şi ultracentrifugare există diferențe de ordin
cantitativ, (ultracentrifugare = forţa centrifugală (G) depăşeşte
100.000 g).
Ultracentrifugele reprezintă aparate mai complexe decât
centrifugele obişnuite:
- la viteze de rotaţie foarte mari ale rotorului, frecările care
apar sunt immense
- rotorul este ridicat în timpul rotaţiei, odată cu axul său, iar
mişcarea de rotatie a acestuia este controlată şi de acţiunea unui
câmp de forţe electromagnetice
- pentru evitarea la maxim a degajării de căldură, care apare
totuşi în timpul mişcării rotorului, ultracentrifuga este prevăzută
cu un sistem de răcire complex, menit să reducă la maxim
excesul termic.
- tuburile de ultracentrifugare sunt mai rezistente și au
prevăzute un sistem mai complex de închidere.

Centrifugarea nucleilor şi mitocondriilor – protocol de

lucru

1. se sacrifică animalul de laborator (şobolan alb din rasa

Wistar)
2. se practică o incizie pe linia medioventrală a corpului
animalului, din regiunea suprapubiană până la nivelul
rebordului costal
3. se prelevă organe, parcurgând următoarele subetape:
 se toarnă soluţie de zaharoză (sucroză) 0,25M în cristalizoare
şi acestea se depun în plăci Petri, pe cuburi de gheaţă de mici

Page 71 of 90
 dimensiuni, pentru răcirea soluţiei;
 se decupează cu foarfecele fragmente de organe şi se introduc
cu pensa în soluţia de zaharoză răcită la gheaţă;
4. se realizează omogenate din organele luate în lucru:
 se cântăresc câte 0,5 g din fiecare organ pe sticle de ceas,
fragmentele cântărite se mărunţesc fin cu foarfecele, organul
mărunţit se transvazează în cuva omogenizatorului Potter şi se
adaugă, prin pipetare 4,5 ml soluţie de zaharoză 0,25 M (astfel
încât diluţia omogenatului sa fie 1 / 10)
 se triturează mecanic fragmentele suspendate în zaharoză,
până când omogenatul, privit prin transparenţă, capătă un
aspect fin şi omogen
5. se decantează omogenatele obţinute în eprubete de
centrifugare şi se echilibrează la balanţă
6. se introduc eprubetele în rotorul centrifugei (faţă în faţă) şi se
realizează centrifugarea pentru sedimentarea nucleilor (10 min,
la o viteză unghiulară corespunzătoare la g = 1000 g
7. la finalul centrifugării se obţine un sediment, depus pe fundul
eprubetei şi un supernatant opalescent, care se colectează într-
un alt tub de centrifugare, în vederea centrifugării ulterioare
(pentru separarea mitocondriilor);
8. se realizează controlul citologic (microscopic) al separării
nucleilor în modul următor:
 se depune o picătură de zaharoză pe lama de microscop;
 mică porţiune din sedimentul colectat se amestecă pe lamă cu
zaharoza, se acoperă cu lamela şi se observă succesiv, la
obiective din ce în ce mai mari (10x – 40x); dacă separarea este
corespunzătoare, în câmpul microscopic se pot observa direct,
prin transparenţă, corpusculi în general sferic-ovoizi, delimitaţi
de o membrană refringentă, care reprezintă nucleii izolaţi prin
centrifugare. Este indicat însă ca, înainte de separarea propriu-
zisă, să se realizeze mai multe spălări de purificare a
sedimentului nuclear (2 – 3 cicluri de resuspendare în zaharoză

Page 72 of 90
– centrifugare), care conduc la o purificare a sedimentului în
proporţie de 95 – 98%.
9. pentru centrifugarea mitocondriilor,supernatantul, colectat
în urma separării nucleilor, se centrifughează (7000 g, 10 min)
10. la sfârşitul centrifugării rezultă un sediment (mai redus
cantitativ decât în cazul nucleilor) şi un supernatant, care se
îndepărtează;
11. controlul microscopic al separării mitocondriilor se face
într-o manieră analogă cu cea precizată pentru observarea
nucleilor, cu deosebirea că pe lama de microscop se adaugă şi o
picătură de colorant specific pentru aceste organite celulare
(verde Janus).
12. în cazul unei coloraţii şi separări adecvate, mitocondriile
pot fi vizualizate doar cu obiective mari (40x – imersie),
apărând ca nişte formaţiuni ovale sau sferice, verzi cu reflexe
gălbui şi cu densitate relativ redusă în câmpul microscopic.

Întrebări recapitulative
1. Ce reprezintă un omogenat celular ?
2. Care sunt metodele de separare a componentelor
celulare ?
3. Care sunt metodele de realizare a omogenatelor
celulare?
4. Cum se realizează centrifugarea nucleilor și a
mitocondriilor obținute de la șobolan Wistar?
5. Care sunt factorii care condiţionează sedimentarea
componentelor celulare?

Page 73 of 90
 LP.7 TEHNICA EXPERIMENTULUI IN VITRO PE
CULTURI DE CELULE

Aceată tehnică permite menţinerea în viaţă şi

multiplicarea unui anumit tip celular în afara organismului.
Cultura de celule a fost pentru prima dată efectuată cu succes
de către Ross Harrison în 1907 care a cultivat celule nervoase
de broască, folosind ca mediu limfa. Harrison, considerat de
unii - tatal culturilor de celule, a observat creșterea fibrelor
nervoase in vitro timp de câteva săptămâni. Tehnica a fost pusă
la punct, mai târziu, în 1912 de către Carrel, Harison şi
Levaditi care au introdus tehnici aseptice stricte, astfel încât
celule au putut fi cultivate pentru perioade lungi de timp, au
conceput primul model de flasc pentru culturi celulare, au
contribuit la dezvoltarea microscopiei – culturilor celulare etc.
La noi în ţară tehnica a fost dezvoltată de către Crăciun.
Experimentul in vitro pe culturi de celule a bus practic bazele
biologiei celulare. Experimentele in vitro, pe culturi de celule,
oferă o evaluare critică, obiectivă, utilizând cele mai noi
metode și metodologii cu privire la determinarea citotoxicității
prin calculul viabilităţii celulare. Rezultatele obţinute se
verifică în comparaţie cu comportamentul celulelor in vivo.

Dintre aplicaţiile practice ale cultivării celulelor in

vitro se regăsesc:
- cultivarea de virusuri pentru producerea de
vaccinuri.
- studierea efectelor medicamentelor asupra
comportamentului celulelor normale şi patologice,

Page 74 of 90
 - studiul citotoxicităţii microbiene şi virale.
- studiul structurii si al ultrastructurii tipurilor de
celule animale, umane, vegetale, microbiene,
studiul celulei canceroase şi a gradului de
responsivitate la acţiunea medicamentelor.
- manipularea materialului genetic (inginerie
genetică).
- studiul procesului de diferenţiere celulară.
- studiul procesului de îmbătrânire celulară.
- studii de nutriţie.
- manipularea celulelor stem.
- transformarea celulelor slab diferenţiate în celule
diferenţiate şi utilizarea lor în scop terapeutic.
- studiul terapiei genice etc.
Dotarea Laboratorului de culturi de celule la ora
actuală se realiază conform standardelor internaţionale,
tehnologiile şi condiţiile de lucru în laborator fiind avansate.
Prin urmare, Laboratorul de culturi de celule a devenit un
mediu sofisticat, pretenţios, bazat pe includerea ultimelor
descoperiri din domeniul biologiei celulare.

Dotarea Laboratorului de culturi de celule al

Universităţii “Apollonia” din Iaşi,

Hotă cu flux laminar, incubator cu CO 2

Page 75 of 90
 - stativ pentru eprubete, cutii metalice pentru sterilizare,
pompă vid, pipete sticlă de diferite gradaţii, pipete
automate.

Centrifugă, baie de apă ultrasonică

Etuvă, frigider, incubator

Microscop inversat cu cameră foto încorporată şi soft specific

Page 76 of 90
 Linie celulară de fibroblaşti, reactivi

Reactivii sunt în funcţie de tipul de cultură celulară,

spre exemplu pentru culturile de fibroblaşti umani reactivii
necesari sunt:
1. Mediu Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)
2. Fetal bovin serum
3. Penicilină şi Streptomicină
4. Aminoacizi neesenţiali
5. Phosphate Buffered Saline (PBS)
Reactivii se păstrează la frigider, la temperatura de 40C,
unii dintre reactivi, precum soluţia de penicilină cu
streptomicină, tripsina etc se păstrează la congelator.

Reactivi

Page 77 of 90
Alte consumabile:
- ethanol, detergenţi de curăţare, flaskuri culturi, pipete
Pasteur,vârfuri pipete, flacoane gradate din plastic.

Obţinerea unei culturi primare din embrion de

şobolan
Realizarea unei culturi de celule din explante tisulare
viabile este facilitată de vârsta tânără a donatorilor. Cu cât
donatorul (om sau mamifer) este mai tânăr cu atât se pot obţine
mai multe replicaţii ale celulele. Celulele din ţesutul embrionar
sunt realizate rapid, proliferează şi se pot obţine mai multe
subculturi sau pasaje decât se poat obţine de la un donator
adult. Cultura celulelor începe cu prelevarea în condiţii de
asepsie a explantului (1/2 x 1 mm) dintr-un organ sau ţesut.
Celulele sunt separate mecanic sau chimic de matricea
extracelulară şi sunt crescute în mediul de cultură, în contact cu
suprafaţa inferioară a vasului de cultură. Celulele periferice ale
explantului, fiind mult mai eficient puse în contact cu mediul
de cultură migrează şi proliferează. Astfel, celulele care
migrează din ţesut alcătuiesc o cultură primară.

Protocol de lucru:
1. După prelevarea embrionului acesta trebuie furnizat,
înainte de secționarea craniului, în gheaţă.
2. Se lucrează într-o cameră sterilă, cu intrumentar steril, şi
echipament de protecţie autoclavat.
3. Craniul embrionului de şobolan secţionat este analizat la
lupă, se prelevă limba, care ulterior se introduce într-un vas
Petri, în soluţie de PBS sau HANKS. Limba astfel

Page 78 of 90
 prelevată este spălată prin trecerea acesteia prin 3 vase cu
soluţie de PBS.
4. Se fragmntează limba, sub hotă, în bucăţi cât mai mici
posibil.
5. Fragmentele obţinute se introduc într-un flacon cre conţine
tripsină.
6. Pentru o mai bună fragmentare, în tubul de centrifugă care
conţine materialul, se introduc bile de sticlă sterilizate.
7. Flaconul cu conţinutul, se menţine în baia de apă, se agită,
cca 30 de minute, până se observă o oarecare turbiditate.
8. Se utilizează Cell Strainer, sită pentru filtrarea probei.
9. Dacă este necesar se mai poate adăuga de câteva ori
tripsină peste bilele de sticlă şi ţesut.
10. Peste proba filtrată se adaugă mediu de cultură şi se
centrifughează timp de 5-10 minute.
11. După obţinerea sedimentului, a peliculei, se urmează
procedeul care se aplică la pasajarea celulelor.

Proceduri de lucru utilizând linii celulare de fibroblaşti

umani de origine dermică (Human Dermal Fibroblasts,
adult - HDFa)

Celulele dintr-o cultură primară proliferează şi ajung să

ocupe întreaga suprafaţă a vasului de cultură expusă mediului.
Astfel, cultura atinge stadiul de confluenţă, ce are microscopic
aspectul unui monostrat de celule. Astfel, celulele pot fi
subcultivate sau pasajate şi transferate în alte vase (plăci Petri,
flascuri) de cultură cu mediu proaspăt. Ca urmare a aplicării
acestei tehnici, cultura nu se mai află în stadiul primar şi este
denumită linie celulară continuă. În prezent pentru teste de
citotoxicitate sunt utilizate liniile celulare. Acestea au avantajul

Page 79 of 90
că sunt relativ uşor de menţinut, iar celulele aderente sunt uşor
de manipulat şi se pot obţine pasaje multiple.
Fibroblastele sunt celule prezente în ţesutul conjunctiv,
responsabile pentru secreţia fibrelor de elastină şi colagen şi a
glicozaminoglicanilor care formează matricea de susţinere a
dermei. Acestea sunt situate în matricea fibroasă şi rămân
conectate la reţeaua de fibre pe care le produc. Numărul
fibroblastelor scade odată cu înaintarea în vârstă, acestea devin,
de asemenea, mai puţin productive, ducând la diminuarea
numărului de macromolecule din matricea intercelulară. Prin
urmare, ţesutul de susţinere este mai puţin dens şi are tendinţa
de a se deforma. Fibroblastele au formă fusiformă, mai mult
sau mai puţin ramificată, sau stelată şi o lungime ce variază
între 20-30 µm. Acestea preizintă nucleu de formă ovalară, iar
citoplasma este bogată în organite intracitoplasmatice, precum:
ribozomi liberi, sub formă de poliribozomi, mitocondrii, reticul
endolplasmatic rugos, aparat Golgi.

1. Prepararea mediului de cultură

- se diluează 25 ml PBS concentrat cu apă autoclavată într-
un flacon, până la 250 ml (flacon de 500 ml).
- se adaugă fetal bovin serum – 10 procente din mediu de
cultură.
- se adaugă mediu DMEM până la 400 ml.
- se adauga 4 ml soluţie de penicilină cu streptomicină
concentrată.
- se adaugă 4 ml soluţie de aminoacizi neesenţiali
concentrată.

Page 80 of 90
 Fig.40. Preparareb mediu cultură

Din flaconul cu mediul preparat se distribuie în 2 flacoane

mai mici care se pun în baia de apă încălzită la 370 C, timp de 5
minute, mediul ramas se pune la frigider la temperatura de 40C.

2. Dezghetarea liniei celulare de fibroblaşti

- liniile celulare se conservă în recipiente cu azot lichid, la
temperatura de -1960 C. Datorită acestei temperaturi scăzute,
personalul laboratorului trebuie să deţină echipament de
protecţie corespunzător.
- dezgheţarea liniei celulare trebuie realizată treptat, după
preluarea criotubului în care se găseşte cultura de celule
acesta trebuie imediat introdus într-un recipient cu azot lichid
la temperatura de -800 C.
- proba se dezgheaţă ulterior în baia de apă, menţinută la
temperatura de 37, până rămân câteva cristale de gheaţă la
suprafaţă.
- se adaugă 5 ml mediu de cultură într-un tub de centrifugă.
- conţinutul probei se introduce în cei 5 ml mediu pregătit deja.

Page 81 of 90
 Recipiente cu azot lichid

Linie celulară păstrată în gheaţă carbonică

Dezgheţare linie celulară

Page 82 of 90
 Pregătire linie celulară pentru cultivare

3. Cultivarea fibroblaştilor
- proba cu mediul se centrifughează timp de 5 min/1000
rotaţii/minut.
- după centrifugare se aspiră supernatantul.
- se adaugă 1 ml mediu proaspăt, se omogenizează, şi se
introduce într-un flasc de cultură de 25ml, în care s-au
introdus 5 ml mediu proaspăt.
- proba se analizează la microscopul inversat după care se
introduce la incubator, la temperatura de 370 C.

Page 83 of 90
 Cultivarea fibroblaştilor şi analiza microscopică

4.Tripsinizare, Pasajul celulelor

- subcultivarea sau pasajul celulelor implică dispersia
monostratului, separarea celulelor şi transferarea acestora în
noi flascuri de cultură.
- cu ajutorul pompei de vid se aspiră mediul din flascul care
conţine cultura celulară.
- cultura celulară se spală cu PBS, 8 ml, timp de câteva
secunde.
- se aspiră PBS-ul din flascul de cultură.
- se adaugă 1 ml tripsină (trebuie să acopere întreaga peliculă)
- timp de 2,3 minute flascul cu tripsina se pun la incubator,
dacă celulele nu s-au detaşat în tot acest timp se mai lasă la
incubator până la 5 minute. După tripsinizare, la invertoscop
toate celulele trebuie să fie în mişcare.
- între timp se pregateşte mediul cald, încălzit în baia de apă la
370 C.
- peste flascul care conţine cultură şi tripsină se adaugă 5 ml
mediu cald, se omogenizează, iar întreg conţinutul este
transferat într-un tub de cetrifugă, care se centrifughează timp
de 5 min, la 1000 rotaţii/minut.
- după centrifugare este eliminat supernatantul cu ajutorul
pompei de vid.

Page 84 of 90
- peste sedimentul rămas se daugă 5 ml mediu care se
omogenizează.
- conţinutul este distribuit într-un flasc sau mai multe, în care
s-a introdus 5 ml mediu.
- se analizează la miscroscop, se notează data, mediul, cultura,
pasajul, se introduce la incubator pentru proliferarea
celulelor.

Tripsinizare

Fibroblaşti ataşaţi şi detaşaţi

- pe măsură ce suprafaţa flascului devine congestionată,

celulele sunt prea aglomerate şi vin în contact unele cu altele
prin intermediul membranelor. Deşi monostratul este viabil,
proliferarea încetează şi celulele manifestă inhibiţia de
contact caracterizată prin oprirea ciclului celular în faza Go,

Page 85 of 90
 de latenţă sau de repaus. În această fază celulele pot rămâne
perioade lungi de timp sau chiar nedefinit. Prin urmare, dacă
celulele lau ajuns la un grad de confluenţă de 100% trebuiesc
pasajate (splituite sau subcultivate). În acest caz culoarea
mediului devine galben-maronie, datorită modificării pH-
ului, a unui metasbolism intens. Normal, pasajul celulelor se
realizează când acestea au depăşit procentul de confluenţă de
peste 60%.

5. Introducerea de suspensii lichide sau materiale solide în

cultură
- pentru suspensii lichide se introduc în cultură 100 µl
material/ml probă.
- pentru materiale solide se introduc în cultură 100 µg/ml.
- pentru ambele situaţii se utilizează minim 3
concentraţii/probă.

Introducere materiale în cultură

6.Schimbarea mediului de cultură

- dacă se observă o schimbare a culorii mediului de cultură, de
la roşu intens la gălbui-cărămiziu, se procedează la
schimbarea acestuia cu unul proaspăt pregătit, de asemenea
se analizează flascul conţinând cultura la invertoscop pentru
a se aprecia numărul de celule moarte.

Page 86 of 90
- în cazul în care celulele au proliferat, şi sunt prea multe
moarte, se înlocuieşte mdiul de cultură, de obicei la intervale
de 2-3 zile.
- se aspiră mediul din flaconul care conţine cultura celulară.
- se intorduce mediu proaspăt preparat încălzit la temperatura
de 370 C.

7.Colorarea, numărarea celulelor, determinarea viabilităţii

- se calculează viabilitatea celulelor în cultură, se utilizează
Testul de excludere cu albastru-tripan (20μl suspensie celulară
+ 20 μl soluţie albastru-tripan) şi calculată prin raportarea
numărului de celule vii la numărul total de celule.( Nr.cel vii/
Total celule (vii si moarte) x 100 = % ).
- citirea se face pe hemocitometru sau pe camera de numărare
automată utilizând microscopul în contrast de fază.
- la microscop, celulele moarte sunt vizibile prin faptul că le
dispare membrana, flotează şi nu mai conţin citoplasmă.

Hemocitometru

Page 87 of 90
 Numărarea celulelor, determinarea viabilităţii celulare

În urma calculului viabilităţii celulare se poate

determina gradul de citotoxicitate al materialului pus în contact
cu tipul de cultură stabilit. Citotoxicitatea provoacă inhibarea
creşterii clulare, iar încadrarea în clasa de citotoxicitate se
realizează conform SR EN ISO10993-5:2009 Evaluarea
biologică a dispozitivelor medicale. Partea 5: Teste pentru
citotoxicitate in vitro, precum şi conform standardelor
internaţionale.

Valori standard pentru culturi celulare

Supraf Densitat Confluenţ Soluţie Tripsină Mediu
aţă e a celulelor 0,53 0,53mM de
(mm2) Mm EDTA cultură
EDTA (ml)

Dishes 9,62 0,3x106 1,2x106 1 1 2

2,827 0,8x106 3,2x106 3 2 3
6 6
7,854 2,2x10 8,8x10 5 3 10
6 6
17,671 5,0x10 20,0x10 10 8 20
Placă de 962 0,3x106 1,2x106 2 2 3-5
godeuri 6 6
401 0,1x10 0,4x10 1 1 1-2
6
200 0,05x10 0,2x10 0,5 0,5 0,5-1,00

Page 88 of 90
 6

Flascuri 2,500 0,7x106 2,8x106 3 3 3-5

6 6
7,500 2,1x10 8,4x10 5 5 8-15
6 6
16,000 4,6x10 18,4x10 10 10 15-30

Volume standard de utilizare a tripsinei

Plăci Petri Flascuri Volum Tripsină

15 cm 177 cm2 20 ml 5 ml
10 cm 78 cm2 15 ml 3 ml
6 cm 28 cm2 6 ml 1 ml
6-well 9,6 cm2 4 ml 0,5 ml
2
24-well 1,9 cm 2 ml 0,2 ml
2
96-well 0,33 cm 0,2 ml 0,05 ml

Întrebări recapitulative
Ce reprezintă
1. Care sunt avantajele utilizării liniilor celulare?
2. Care sunt etapele de lucru în tehnica culturilor de
celule?
3. Cum se realizează detașarea celulelor de pe flask, în
cazul celulelor aderente?
4. Cum se realizează crioconservarea celulelor?

Page 89 of 90
 BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

1. Anca Cadinoiu, Oana Darabă, Paula Merlușcă, Dan

Anastasiu, Mihaela Vasiliu, Ana Maria Chirap, Vasile Burlui,
2014: Liposomal formulations with potential dental
applications, Int. J, of Med. Dentr., nr.4.
2. Bejenaru Cornelia, Bejenaru L. E., 2006: Biologie
celulară, molecular şi genetic. Caiet de lucrări practice, Ed.
Medicalaă universitară Craiova, 87 pp.
3. Canţăr Liliana şi colab., 2002: Citologie şi Biologie
celulară, Ed. Univ. “Aurel Vlaicu” Arad, 271 pp.
4. Crişu Bota Alexandra şi colab., 2003: Biologie celulară
pentru studenţii stomatologi, Ed. Univ. “Lucian Blaga” Sibiu,
217 pp.
5. Cotrutz C. Cotrutz Carmen, Kocsis Maria, Ionescu C.
R, 1994: Manual de lucrări practice de biologie celulară, Ed.
Tehnica, Chişinău, 248 pp.
6. Mehedinte Rodica, Hîncu Mihaela şi colab., 2000:
Introducere în studiul celulei. Îndrumar pentru lucrări practice
de Biologie celulară şi moleculară, Ed. Fundaţiei Univ.
“Dunărea de Jos” Galaţi, 89 pp.
7. Mihaela Rață, Oana Darabă, Paula Merlușcă, Laura
Dârțu, Cristi Mihalache, Ana Maria Chirap, Adina Buburuzan,
2014: Hydrogels based on natural polymers with possible
application in the treatment of periodontitis, Int. J, of Med.
Dentr., nr.4.
8. Vasile Burlui, Oana Maria Darabă, Irina Paula
Merluşcă, 2014: In vitro testing of some implant materials,
National Congres of Romanian Society for cell Biologie, the
32nd Annual Scientific Session of RSCB .
9. Verdeş Doina şi colab., 2007: Îndrumător de lucrări
practice de Biologie celulară şi moleculară, Ed. Eurobit, 176
pp.

Page 90 of 90