UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE

ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ

CLUJ-NAPOCA

FACULTATEA DE ZOOTEHNIE ȘI BIOTEHNOLOGII

Disciplina: Tehnici de determinare a xenobioticelor din produsele de
origine animală

PROIECT

CYCLOHEXIMIDĂ

Tokes Șerban Emanuel

 Cuprins

1. INTRODUCERE.................................................................................................................................3
2. IDENTITATE, PROPRIETĂȚI FIZICE ȘI CHIMICE, ANALITICE....................................................3
2.1. Proprietați fizice si chimie................................................................................................................3
3. SURSE DE EXPUNERE UMANĂ ȘI DE MEDIU............................................................................4
3.1. Surse antropice de contaminare........................................................................................................4
4. TRANSPORTUL, DISTRIBUȚIA ȘI TRANSFORMAREA ÎN COMPARTIMENTELE
MEDIULUI.................................................................................................................................................9
4.1. Degradarea în sol.........................................................................................................................9
5. NIVELURI ALE CONTAMINANTULUI IN MEDIU ȘI EXPUNEREA UMANĂ..............................9
5.1. Concentrații în probe umane.............................................................................................................9
5.1.1 Sânge..........................................................................................................................................9
6. CINETICA ȘI METABOLIZAREA CONTAMINANTULUI..............................................................10
6.1. Alte rute..........................................................................................................................................10
6.1.1. Șobolan....................................................................................................................................10
7. Efecte asupra mamiferelor de laborator și a sistemelor de testare in vitro.............................................11
7.1. Mutagenitate și puncte finale conexe..............................................................................................11
7.1.1. Deteriorarea ADN-ului............................................................................................................11
7.2. Evaluarea mutagenității și a rezultatelor conexe.............................................................................11
7.3. Neurotoxicitate...............................................................................................................................12
BIBLIOGRAFIE.......................................................................................................................................14
 1. INTRODUCERE

Cicloheximida  este un fungicid natural produs de bacteria Streptomyces griseus . 

Cicloheximida își exercită efectele prin interferența cu etapa de translocație în sinteza proteinelor
(mișcarea a două molecule de ARNt și ARNm în raport cu ribozomul ), blocând astfel alungirea
translațională eucariotă . Cicloheximida este utilizată pe scară largă în cercetarea biomedicală
pentru a inhiba sinteza proteinelor în celulele eucariote studiate in vitro . Este ieftin și
funcționează rapid. Efectele sale sunt inversate rapid prin simpla eliminare a acestuia din mediul
de cultură. (Franz Müller și colab.)

2. IDENTITATE, PROPRIETĂȚI FIZICE ȘI CHIMICE, ANALITICE

2.1. Proprietați fizice si chimie

Cycloheximida apare ca un cristal inclor. Este folosit ca fungicid și tratament anticancerigen.

(EPA, 1998).

(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)

Formă și compoziție Plăci din acetat de amil, apă sau metanol 30%.
(Budavari, 1996)

Punct de topire 119.47 – 121.11°C (EPA, 1998)

 Solubilitate 10 până la 50 mg/L la 20°C (NTP, 1992)

Descompunere Când este încălzit până la descompunere, emite

vapori toxici de oxizi de azot. ( Gleason, 1969)

Corozivitate Necoroziv (Osol, 1980)

3. SURSE DE EXPUNERE UMANĂ ȘI DE MEDIU

3.1. Surse antropice de contaminare

În acest studiu cincizeci și șapte de specii de ciuperci rezistente la cycloheximidă,

aparținând a 18 genuri, au fost izolate de solurile de câmp și ape uzate brute din oraș
folosind tehnici de îmbinare a părului și de diluare a suprafeței (Tabelul 1). . (ALI-
SHTAYEH, M. S.; JAMOUS, Rana MF; ABU-GHDEIB, 1998)
Două dintre aceste specii erau dermatofite (Microsporum gypseum și
Trichophyton ajelloi) și alte 5 specii au fost ciuperci keratinofile înrudite (Arthroderma
cuniculi, A. curreyi, Chrysosporium keratinophilum, C.pannorum și C. tropicum). . (ALI-
SHTAYEH, M. S.; JAMOUS, Rana MF; ABU-GHDEIB, 1998)
Folosind HBT, douăzeci și trei de specii de ciupercile keratinofile rezistente la
cycloheximidă au fost recuperate din solurile de unul în mod normal irigat (CW) și două
câmpuri irigate cu apă uzată (NWST, OWST), eșantionate pe o perioadă de 5 luni
folosind HBT (Tabelul 2). Dermatofiți și alte ciuperci keratinofile înrudite
(Chrysosporium spp.) au fost reprezentate de 4 specii. Acestea au cuprins 2,4% (24/1001
izolate) din micobiota keratinofilă a solului. (ALI-SHTAYEH, M. S.; JAMOUS, Rana MF;
ABU-GHDEIB, 1998)
Numărul de specii izolate din cele trei soluri a variat între 13 în câmp nepoluat
(CW) la 16 în poluat (OWST) camp. Cele mai frecvente și abundente specii din trei
soluri, așa cum arată valorile lor de importanță relativă (RIV), au fost Paecilomyces
lilacinus, Aspergillus candidus, Geotrichum candidum și Alternaria alternata. Aveau
RIV-urile de 138, 119, 117 respectiv 106. . (ALI-SHTAYEH, M. S.; JAMOUS, Rana MF;
ABU-GHDEIB, 1998)
Cele mai frecvente și abundente specii din solul de câmp nepoluat (CW) au fost P.
lilacinus (RIV, 148),A. candidus (127), Al. alternata și G. Candidum (108); întrucât în
noul câmp irigat cu ape uzate (NWST) au fost A. candidus (136), G. candidum (124), și
P. lilacinus (122); iar în câmpul puternic poluat (OWST) (sub irigații de apă uzată timp
de> 10 ani) au fost: P. fumosoroseus (131), G. candidum și A. candidus (113) și Nectria
ventricosa (109). Chrysosporium tropicum a fost cel mai frecvent și abundent (RIV, 101)
al ciupercilor legate de dermatofite și a fost prezent în toate cele trei site-uri cu cea mai
mare frecvență în câmpul puternic poluat (OWST) (RIV, 105). Pe pe de altă parte, C.
keratinophilum (52.1) și T. Ajelloi (35.1) a avut loc numai în OWST. Microsporum
gypseum a avut loc numai în NWST (34). . (ALI-SHTAYEH, M. S.; JAMOUS, Rana MF;
ABU-GHDEIB, 1998)
Utilizarea SSDP cu mediul SDA, 26 de specii de ciuperci rezistente la
cicloheximide aparținând a 14 genuri, au fost izolate din cele 3 soluri de câmp (NWST,
CW, OWST) eșantionat de 6-9 ori pe o perioadă de 9 luni, folosind tehnica SSDP cu
plăci medii SDA (Tabelul 3). Trei dintre acestea erau legate de dermatofite ciuperci
keratinofile. Cea mai frecventă și abundentă dintre aceste specii a fost C. tropicum,
izolată din cele trei câmpuri, cu cea mai mare frecvență în (CW) (60%) și o densitate mai
mare a populației în OWST (906 CFU g-1 Dwt). Celelalte două specii erau Arthroderma
cuniculi izolate numai din câmpul nou poluat (NWST) și A. curreyi din câmpul nepoluat
(CW). Cea mai frecventă (%) specie din cele trei domenii au fost G. candidum (73),
Cladosporium herbarum și A. candidus (67). Cea mai abundentă specie cu cele mai mari
densități de populație (CFU g-1 Dwt) au fost: C. herbarum (1845), Gliocladium viride
(1013) și G. candidum (830). . (ALI-SHTAYEH, M. S.; JAMOUS, Rana MF; ABU-GHDEIB,
1998)
În câmpul nepoluat (CW), cel mai frecvent (%) specii au fost: Acremonium
strictum, A. candidus, și Geotricum candidum (80) și speciile cele mai abundente (CFU
g-1 Dwt) a fost Cl. herbarum (1301). În nou câmpul irigat cu ape uzate (NWST), cel mai
frecvent (%) au fost: o specie C. și G. candidum (83%) și cele mai abundente specii au
fost: Geotricum candidum (1492), și Penicillium citrinum (1200). . (ALI-SHTAYEH, M.
S.; JAMOUS, Rana MF; ABU-GHDEIB, 1998)
În câmpul puternic poluat (OWST) cele mai frecvente (%) specii au fost:
Geotricum candidum, Gl. viride, și Purpureocilium lilacinus (100), și cea mai abundentă
specie au fost: Cladosporium herbarum (3146), Gl. viride (3004) și G catenulatum
(1881). . (ALI-SHTAYEH, M. S.; JAMOUS, Rana MF; ABU-GHDEIB, 1998)
Variația nivelurilor populațiilor fungice rezistente la CH (CFU‘g-1 Dwt) din cele
trei soluri de câmp, care au fost prelevate în cea mai lungă perioadă de timp, a urmat
modele de fluctuație comparabile. Cu toate acestea, o creștere considerabilă a nivelului
populației a fost detectată ca urmare a apariției irigării apelor uzate în câmp nou poluat.
(ALI-SHTAYEH, M. S.; JAMOUS, Rana MF; ABU-GHDEIB, 1998)
Tabel 1. Ciuperci rezistente la cicloheximidă izolate din toate locurile de prelevare (câmpurile de sol și apele uzate brute ale
orașului) prin tehnici de acoperire prin diluare a suprafeței solului (SSDP) și tehnici de captare a părul

(ALI-SHTAYEH, M. S.; JAMOUS, Rana MF; ABU-GHDEIB, 1998)

Tabel 2. Ciuperci keratinofile izolate din soluri din trei câmpuri eșantionate de 2-3 ori, prin tehnica de îmbinare a
părului (numărul de colonii izolate, numărul total al acestora și% în diferite soluri; numărul de soluri pozitive și
procentul lor din toate solurile; valorile relative ale importanței speciilor, RIV; RIV la fiecare câmp).

(ALI-SHTAYEH, M. S.; JAMOUS, Rana MF; ABU-GHDEIB, 1998)

Tabelul 3. Densitatea medie a populației și frecvența apariției a ciuperci rezistente la cicloheximidă din trei
câmpuri ∗ (CW, NWST, OWST) pe o perioadă de 9 luni.
 (ALI-SHTAYEH, M. S.; JAMOUS, Rana MF; ABU-GHDEIB, 1998)

4. TRANSPORTUL, DISTRIBUȚIA ȘI TRANSFORMAREA ÎN

COMPARTIMENTELE MEDIULUI

4.1. Degradarea în sol

 Au fost adăugate streptomicină și cicloheximidă abstracte (3 și, respectiv, 2
mg/1g sol uscat) individual și în combinație cu un sol forestier pentru a urmări posibila
lor degradare și efectele acestora asupra procesului mineralizare-imobilizăre a solului.
După 0, 1, 2, 4, 7 și 10 zile de incubație la 25 °C și 60% capacitate de reținere a apei,
măsurătorile au fost preluate din biomasa microbiană C și N, evoluția de CO 2,
schimbarea NH4, 0,5MK2SO4-extractibil C organic și N total în ambele nefumigate și
sol CHCl3-fumigat. Rezultatele au indicat faptul că în timpul în primele 2 zile de
incubație, microorganismele solului au fost ucise de antibiotice și / sau de
CHC13(cloroform) și folosite ulterior ca substrat de către supraviețuitori. Ulterior,
microorganismele supraviețuitoare au început probabil să se folosească de molecule
biocide ca sursă de energie și nutrienți. Raporturile dintre biomasa C și biomasa N și CO2
au evoluat la NH4(amoniu) net produs a indicat că ambele biocide au avut efecte non-
țintă pentru cea mai mare parte a incubației. Astfel, streptomicina și cicloheximida nu
sunt adecvate în determinarea contribuției relative a ciupercilor și bacteriilor la procese
de mineralizare-imobilizare în soluri. (BADALUCCO, L.,(1994))

5. NIVELURI ALE CONTAMINANTULUI IN MEDIU ȘI EXPUNEREA

UMANĂ

5.1. Concentrații în probe umane

5.1.1 Sânge

Când limfocitele umane sunt preiradiate cu 1 cGy(unit Gray) de raze X, celulele

devin mai puțin sensibile la expunerile ulterioare la doze mari de aproximativ 150 cGy, în
care sunt induse aproximativ jumătate din aberațiile cromatidei, așa cum era de așteptat.
Această adaptare a fost atribuită inducerii enzimelor reparatoare (proteine) aproximativ 4-
6 după expunerea inițială la doze mici. S-au efectuat acum experimente care arată că
aplicarea inhibitorului sintezei proteinelor cicloheximidă în acest moment, dar nu mai
devreme, împiedică răspunsul adaptativ. (Janey H. Youngblom, John K. Wiencke, Sheldon
Wolff, (1989))

6. CINETICA ȘI METABOLIZAREA CONTAMINANTULUI

6.1. Alte rute

6.1.1. Șobolan
 O singură administrare a inhibitorului de sinteza de proteine cicloheximida are ca
rezultat apariția apoptozei la ficatul de șobolan. Prezența intracelulară a corpurilor
apoptotice au fost detectate încă de la 2 ore dupa tratament. Nicio dovadă a necrozei
celulare nu a fost observată prin analize histologice și biochimice. (Ledda-Columbano, G.
M., Coni, P., Faa, G., Manenti, G., & Columbano, A. (1992))
Apoptoza a fost urmată de o crestere a expresiei de prostată reprimat cu
testosteron-2 RNA a genei cărei activitate a fost asociată moartea celulara în involuția
prostatei la șobolan. Inducerea în vivo a apoptozei în celulele neproliferante de un
inhibitor al sintezei proteinelor, împreună cu rapiditatea și sincronizarea în apariția celulei
moarte fac acest model util pentru analiza cineticii ciclului apoptotic și în explorarea
unora dintre mecanismele de reglementare si implicare a genelor în acest tip de moarte
celulară. (Ledda-Columbano, G. M., Coni, P., Faa, G., Manenti, G., & Columbano, A. (1992))
Figura 1. Ficatul de șobolan la 2 ore după tratamentcu CHX (50 mgl/kg). Corpurile apoptotice se
află lumenul sinusoidal (săgeți) sau în interiorul citoplasmei celulelor sinusoidale (vârful săgeții) (x5800).

(Ledda-Columbano, G. M., Coni, P., Faa, G., Manenti, G., & Columbano, A. (1992))

7. Efecte asupra mamiferelor de laborator și a sistemelor de testare in vitro

7.1. Mutagenitate și puncte finale conexe

7.1.1. Deteriorarea ADN-ului

 Concentrații scăzute ale unui inhibitor al sintezei proteinelor, cicloheximida, au
fost adăugate pe tot parcursul procesului de diferențiere in vitro a celulelor de lentile
embrionare de pui de 11 zile. Am constatat, cu concentrații scăzute de cicloheximidă
(0,01 până la 0,03 μg / ml, pe parcursul a 3 zile de cultură), că a existat o întârziere
aproape completă a degradării ADN, așa cum sa observat pe gradientul de zaharoză
alcalină. Concentrațiile identice și timpul de expunere nu au avut niciun efect de blocare
asupra sintezei crescute de δ-cristalină, așa cum a fost detectată prin imunoprecipitare și
electroforeză. Concentrații mai mari de cicloheximidă (0,1 până la 1 μg / ml) au arătat un
efect marcat asupra dimensiunii ADN-ului și o inhibare netă asupra sintezei δ-cristalinei.
Astfel, s-a observat un efect selectiv al dozelor mici de cicloheximidă asupra diferențierii
terminale, sugerând că nu a existat o relație între degradarea ADN-ului și sinteza δ-
cristalinei în aceste experimente pe termen scurt. (M.F. Counis, E. Chaudun, J.P. Carreau,
Y. Courtois, 1980)

7.2. Evaluarea mutagenității și a rezultatelor conexe

Cycloheximida este un inhibitor puternic al sintezei proteinelor eucariote.

Adăugarea unui nivel ridicat de cicloheximidă la o cultură în creștere de Saccharomyces
cerevisiae are ca rezultat o oprire imediată în sinteza și creșterea proteinelor. Când este
mult mai jos nivelurile de cicloheximidă se adaugă culturilor în creștere, rata de creștere
scăzută rezultată fiind în întregime cauzată de o creștere a lungimii G1 faza ciclului
celular (HARTWELL și UNCER 1977).
Această perturbare a ciclului celular a fost interpretată pentru a susține un model
pentru controlul ciclului celulei unde trebuie atinsă o dimensiune critică inainte ca ciclul
celulei poate fi inițiat. Concentrația minimă inhibitoare de cicloheximidă inhibă complet
creșterea, dar nu inhibă complet proteinele de sinteză (SHILO, RIDDLE și PARDEE
1979).
Cand concentrația minimă inhibitoare de cicloheximidă este utilizată pentru a
inhiba creșterea, majoritatea populației este prezenta ca celule unice neafectate (J. H.
MCCUSKER, observație nepublicată). Mutații care ar fi permite celulei să crească în
astfel de condiții de sinteza de proteine, limitarea sintezei nu a fost descrisă anterior.
(SHILO, RIDDLE și PARDEE 1979).
Când avem nivelurile ridicate (10 pg / ml) de cicloheximidă si sunt folosite pentru
a selecta mutanți rezistenți doar pe care îi recupereaza leziuni în locusul c ~ h2 al
proteinei ribozomale, gena structurală a proteinei ribozomale L29. Utilizarea de niveluri
scazute de cicloheximidă pentru a selecta mutații rezistente (Departamentul de Chimie
Biologică, Colegiul de Medicină din California, Universitatea din California, Irvine,
California 92717 , Genetica 119 303-315 Uune, 1988) rezultă o frecvență mult mai mare
a mutatiilor spontane. Trei clase de mutatii rezistente la cicloheximidă de nivel scăzut ar
putea fi asteptate:
 (1) mutații care afectează ciclul celular, permițând celulelor să crească în condiții
în care sinteza proteinelor este limitată;
(2) mutații care reduc efectul cicloheximidei asupra sintezei proteinelor;
(3) mutații care afectează capacitatea cicloheximidei de a intra în celulă.
Majoritatea mutațiilor anterior izolate ca fiind rezistente la niveluri scăzute de
cicloheximidă sunt alele de mutațiile permeabilității cyh3 (denumită acum pdrl) (RANK,
ROBERTSON și PHILLIPS 1975). Frecventa ridicata a permeabilitatii mutațiilor poate
ascunde alte mutații care afectează sinteza proteinelor care ar conferi doar o rezistență
redusă la cicloheximidă.
Am utilizat concentrația minimă inhibitoare de cicloheximidă pentru a selecta
mutanți rezistenți pe care apoi l-am verificat pentru a fi sensibil la temperatura de
letalitate.
Niciuna dintre mutațiile crl nu conferă rezistență la concentrații scăzute de alți
inhibitori ai sintezei proteinelor (MCCUSKER și HABER 1988), indicând acest lucru nu
sunt mutații care permit inițierea ciclului celulei în condiții în care este sinteza proteinelor
este limitata. Toate mutațiile crl prezintă o gamă largă de fenotipuri care pot rezulta din
modificări din fidelitatea sintezei proteinelor. (John H. McCusker' and James E. Haber 1988).

7.3. Neurotoxicitate

În această lucrare se raportează un experiment cu șobolani de sex femel albini Sprague-

Dawley repartizați la 5 grupuri de tratament de câte 10-24 subiecți fiecare. Rezultatele confirmă
faptul că suprarenalectomia bilaterală modifică semnificativ permeabilitatea barierei
hematoencefalice la cocaină, rezultând acumularea crescută în țesutul cerebral al șobolanului.
Restabilirea integrității barierei hematoencefalice a fost realizată prin injectarea de hidrocortizon
timp de 5 zile la o rată de 20 mg / kg / zi. Când cicloheximida a fost administrată la un subiect
suprarenalectomizat, medicamentul a crescut penetrarea barierei de către cocaină; cu toate
acestea, pretratarea subiectului suprarenalectomizat cu hidrocortizon în doza menționată mai sus a
redus defectarea barierei asociată cu pretratarea cicloheximidei. Tratamentul prealabil al
subiectului intact cu hidrocortizon nu a afectat în mod semnificativ acumularea de cocaină în
țesutul cerebral; cu toate acestea, a prevenit penetrabilitatea sistemului barierei hematoencefalice
indusă de cicloheximidă. (Angel, C., & Burkett, M. L. (1971))

BIBLIOGRAFIE

1. ALI-SHTAYEH, M. S.; JAMOUS, Rana MF; ABU-GHDEIB, S. I. Ecology of cycloheximide-

resistant fungi in field soils receiving raw city wastewater or normal irrigation
water. Mycopathologia, 1998, 144.1: 39-55.
2. Angel, C., & Burkett, M. L. (1971). Effects of hydrocortisone and cycloheximide on blood-brain
barrier function in the rat. Diseases of the Nervous System, 32(1), 53–58.
3. BADALUCCO, L.,(1994) et al. Activity and degradation of streptomycin and
cycloheximide in soil. Biology and fertility of soils, 18.4: 334-340.
4. Budavari, S. (ed.). The Merck Index
An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals. Whitehouse Station, NJ: Merc
k and  Co., Inc., 1996., p. 460
5. Gleason,  M.N., R.E. Gosselin, H.C. Hodge, and R.P. Smith. Clinical  Toxicology of Co
mmercial Products. 3rd  ed.  Baltimore: Williams and Wilkins, 1969., p. 960
6. Janey H. Youngblom, John K. Wiencke, Sheldon Wolff, (1989), Inhibition of the adaptive
response of human lymphocytes to very low doses of ionizing radiation by the protein synthesis
inhibitor cycloheximide, California State Health Department, Volume 227, Pages 257-261
7. John H. McCusker' and James E. Haber, 1988, Cycloheximide-Resistant Temperature-Sensitive
Lethal Mutations of Saccharomyces cerevisiae, Department of Biology and Rosenstiel Basic
Medical Sciences Research Center, Brandeis University, Waltham, Massachusetts 02254.
8. Ledda-Columbano, G. M., Coni, P., Faa, G., Manenti, G., & Columbano, A. (1992). Rapid
induction of apoptosis in rat liver by cycloheximide. The American journal of pathology, 140(3),
545.
9. M.F. Counis, E. Chaudun, J.P. Carreau, Y. Courtois, 1980, Cycloheximide effect on
DNA degradation and δ-crystallin synthesis in terminally differentiating lens cells,
Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Nucleic Acids and Protein Synthesis, Volume
607, Issue 1, 1980, Pages 43-52
10. Müller, Franz; Ackermann, Peter; Margot, Paul (2012). "Fungicide, agricole, 2.
Fungicide individuale". Enciclopedia lui Ullmann de chimie industrială . Weinheim:
Wiley-VCH.
11. National  Toxicology Program, Institute of Environmental Health Sciences, National  In
stitutes  of  Health (NTP). 1992. National Toxicology Program Chemical Repository Da
tabase. Research Triangle Park, North  Carolina.
12. Osol, A. (ed.). Remington's Pharmaceutical Sciences.  16th  ed.  Easton,  Pennsylvania: 
Mack Publishing Co., 1980.,  p. 1206
13. U.S. Environmental  Protection Agency. 1998. Extremely  Hazardous Substances (EHS) 
Chemical  Profiles and Emergency First Aid Guides. Washington, D.C.: U.S. Governm
ent Printing Office.