Fermentations Industrielles

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Gramme
FERMENTATIONS INDUSTRIELLES 2009-2010
TABLE DES MATIERES
1. Introduction......................................................................................................... 3
2. L’amont................................................................................................................ 6
2.1. La biomasse ................................................................................................... 6
2.1.1. Rappels ...........................................................Erreur ! Signet non défini.
2.1.1.1. Facteurs de développement ............................................................... 6
2.1.1.2. Métabolisme ....................................................................................... 6
2.1.2. Acquisition ................................................................................................ 6
2.1.3. Amélioration.............................................................................................. 6
2.1.3.1. Mutation.............................................................................................. 6
2.1.3.2. Recombinaison ................................................................................... 6
2.1.3.3. Manipulation génétique....................................................................... 6
2.1.3.4. Dérégulation ....................................................................................... 6
2.1.4. Production ................................................................................................ 6
2.1.4.1. Conservation....................................................................................... 6
2.1.4.2. Multiplication ....................................................................................... 6
2.1.4.3. Pré-culture .......................................................................................... 6
2.2. Le substrat...................................................................................................... 6
2.2.1. Rappels .................................................................................................... 6
2.2.1.1. Aspect quantitatif ................................................................................ 6
2.2.1.2. Aspect qualitatif .................................................................................. 6
2.2.2. Caractéristiques des substrats industriels ................................................ 7
2.2.3. Stérilisation ............................................................................................... 7
2.3. L’air................................................................................................................. 7
3. Le bioreacteur..................................................................................................... 8
3.1. Fonctions ........................................................................................................ 8
3.2. Types de digesteurs ....................................................................................... 9
3.2.1. Cellules libres ..................................................Erreur ! Signet non défini.
3.2.1.1. L'agitation ......................................................................................... 10
3.2.1.1.1. Agitation mécanique ..................................................................... 10
3.2.1.1.2. Agitation pneumatique.................................................................. 10
3.2.1.1.3. Agitation par pompage ................................................................. 11
3.2.1.2. Modes de fonctionnement ................................................................ 12
3.2.1.2.1. Discontinu..................................................................................... 12
3.2.1.2.2. Continu ......................................................................................... 12
3.2.2. Cellules fixées ........................................................................................ 13
3.2.2.1. Modes de fixation ............................................................................. 14
3.2.2.1.1 .Inclusion ....................................................................................... 14
3.2.2.1.2. Confinement ................................................................................. 14
3.2.2.1.3. Support inerte ............................................................................... 15
3.2.2.2. Mode de fonctionnement .................................................................. 16
4. L’aval ................................................................................................................. 17
4.1. La pureté du produit ..................................................................................... 17
4.2. Produits extracellulaires................................................................................ 17
4.3. Produits intracellulaires................................................................................. 17
4.4. Techniques de séparation ............................................................................ 17
Fermentations industrielles.doc B. Dauby 1 / 21
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4.4.1. Séparation solide / liquide....................................................................... 17

4.4.2. Séparation liquide / liquide...................................................................... 17
4.5. Perméation ................................................................................................... 17
4.6. Concentration ............................................................................................... 17
5. Les fonctions annexes..................................................................................... 18

5.1. Régulation .................................................................................................... 18
5.1.1. Utilité....................................................................................................... 18
5.1.2. Principe................................................................................................... 18
5.1.3. Paramètres à réguler .............................................................................. 19
5.2. Mouvements de fluides................................................................................. 21
5.3. Nettoyage, désinfection et stérilisation ......................................................... 21

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1. INTRODUCTION
Bière, vin, vinaigre, yogourt, pénicilline, acide lactique, biogaz, éthanol,
glycérine, … quelle relation peut-il bien exister entre tous ces produits ?
De même, quel point commun pourrait-on trouver entre l'activité principale du

boulanger - fabriquer du pain - et le fonctionnement d'une station d'épuration ?
En fait toutes ces productions, et bien d'autres, utilisent un outil vivant. Le

processus de transformation mis en œuvre exploite des microorganismes - la
biomasse - dont le développement modifie les caractéristiques de la matière - le
substrat - sur ou dans laquelle ils se sont développés.
Réaction
Substrat Biomasse Produit
biochimique
Moût (résultat de la Saccharomyces Fermentation
cuisson dans l'eau cerevisiae (levure de alcoolique
Bière
de grains d'orge brasserie)
germés)
Saccharomyces Fermentation
Jus de raisin Vin
cerevisiae alcoolique
Streptococcus Fermentation
thermophilus & lactique
Lait Yogourt
Lactobacillus bulgaricus
(bactéries)
Effluents agricoles Nombreux Fermentation
Biogaz +
ou ordures microorganismes méthanique &
compost
ménagères humification
Nombreux Eau pouvant Respiration aérobie
Eau d'égout microorganismes être rejetée en et oxydation du C
rivière organique en CO2.
Saccharomyces Fermentation
Pâte à pain cerevisiae (levure de Pain alcoolique +
brasserie) cuisson
Tableau 1 : Quelques exemples d'application du génie microbiologique
Le "génie" microbiologique, dans la même acception que le "génie" civil ou le

"génie" militaire, correspond à l'ensemble des technologies qui permettent
d'exploiter industriellement des microorganismes vivants. Avec le "génie"
enzymatique et le "génie" génétique, le "génie" microbiologique constitue un des
éléments du domaine industriel des biotechnologies.
N. B. : L'agriculture n'est pas considérée comme "biotechnologie" même si elle aussi exploite des
êtres vivants végétaux et/ou animaux. Cela est dû au fait que les techniques agricoles présentent
une spécificité qui les différencie nettement des logiques industrielles classiques. En particulier la

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dépendance aux conditions climatiques et la liaison au sol en sont des caractéristiques tout à fait
exclusives.
Pour information, le génie enzymatique correspond aux techniques utilisant

des enzymes. Ces dernières sont des molécules organiques de nature protéique
dont la fonction biologique est de catalyser les réactions du métabolisme. Leur
activité est extrêmement spécifique et permet, dans des conditions très douces
(température faible et pression atmosphérique) de réaliser des réactions impossibles
sans leur intervention. Le génie génétique - qualifié également de "biologie
moléculaire" - regroupe tous les moyens qui facilitent les actions sur le génome
cellulaire. En particulier, c'est en partie grâce aux procédés du génie génétique que
l'ont est en mesure de modifier l'information génétique d'une cellule. Cela peut
s'avérer fort utile pour améliorer les performances d'une biomasse, en génie
microbiologique. Le présent cours est toutefois consacré exclusivement à l'étude des
tenants et aboutissants relatifs au génie microbiologique.
Dans ce contexte, l'ensemble des éléments constituant une installation de

fermentation a pour objectif général soit de favoriser au maximum la production de
cellules ou de métabolites cellulaires directement utilisables (bioproductions), soit
simplement de modifier un substrat par action biologique (bioconversion). Dans le
premier cas, l'étape de fermentation proprement dite devra être suivie par des
opérations de séparation (down stream process) en vue d'isoler, de purifier et de
stabiliser les cellules ou les métabolites (ex : filtration d'une bière de type pils, en vue
d'en retirer les levures). Par contre on parlera de bioconversion quand aucune
séparation n'intervient en aval de la fermentation (ex : fabrication de yogourt ou de
fromage blanc, dans lesquels la flore active demeure dans le produit fini).
Pour optimiser la production, il est impératif de fournir à la biomasse un

substrat parfaitement adapté, tant dans sa composition que du point de vue des
concentrations des différents éléments. En outre ce milieu de culture doit, le plus
souvent, être stérilisé afin d'éviter tout développement anarchique d'une biomasse
non désirée.
La biomasse elle-même doit, en général, être sélectionnée en vue d'obtenir

des souches hautement performantes garantissant une productivité élevée. Ces
souches, précieusement conservées, seront préparées en temps utile afin de
disposer d'un maximum d'efficacité dès leur mise en production.
Parmi les nombreux produits du génie microbiologique, certains font appel à

des micro-organismes aérobies exigeant une aération plus ou moins intense du
substrat. Les modalités de distribution optimale d'un air stérile font aussi l'objet
d'études à prendre en considération dans la conception d'un réacteur biologique.
Tenant compte de ces impératifs relatifs au substrat et à la biomasse, le

bioréacteur (ou digesteur ou fermenteur), partie maîtresse de l'installation, consiste
en une enceinte plus ou moins vaste (de quelques litres en installation de
laboratoire, quelques dizaines de litres en installation pilote ou de préculture, à
plusieurs mètres-cubes en production industrielle.) conçue pour optimaliser les
contacts biomasse-substrat-oxygène en vue de maximiser le rendement de la (des)
réaction(s) biochimique(s) recherchée(s). Ces contacts doivent permettre un
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transfert idéal, d’une part, des substances nutritives en solution dans le substrat vers
le cytoplasme cellulaire, et d'autre part, des produits de l'activité microbienne vers le
milieu extra-cellulaire.
Cependant, connaissant le fonctionnement microbien (courbe de croissance,

métabolisme primaire et secondaire,...), on s'aperçoit que si l'on n'y prend pas garde,
l'environnement de cette biomasse va évoluer au cours de la réaction, entraînant
éventuellement une modification du mode de fonctionnement des cellules. D'où
l'impérieuse nécessité de disposer de systèmes de régulation destinés à maintenir
constantes les conditions de travail. Ceci implique deux contraintes :
• pouvoir mesurer la valeur des principales variables (T°, pH, concentrations, débit
d'O2, ...),
• disposer d'un moyen de corriger, le cas échéant, les caractéristiques de la
réaction en cours.
Par ailleurs, lorsque la bioréaction s'achève, les produits recherchés (cellules

ou molécules) se retrouvent en mélange avec des résidus du substrat. Il s'agit donc
de concevoir des moyens de séparer le produit intéressant du reste sans
l'endommager et en lui assurant une pureté maximale.
Enfin, il ne faut pas perdre de vue que certains procédés du génie

microbiologique exigent l'utilisation d'une biomasse extrêmement spécialisée
(souche microbienne fortement sélectionnée et éventuellement protégée
commercialement par un brevet) susceptible d'être concurrencée, diluée voire
détruite par des infections (souches sauvages, autres espèces, virus,...). La lutte
contre les sources d'infection et la protection hygiénique du digesteur sont donc des
opérations incontournables dans la gestion d'une installation de fermentation.

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2. L’AMONT
2.1. LA BIOMASSE
2.1.1. DEFINITION
2.1.1.1. Facteurs de développement
2.1.1.2. Métabolisme
2.1.2. ACQUISITION
2.1.3. AMELIORATION
2.1.3.1. Mutation
2.1.3.2. Recombinaison
2.1.3.3. Manipulation génétique
2.1.3.4. Dérégulation
2.1.4. PRODUCTION
2.1.4.1. Conservation
2.1.4.2. Multiplication
2.1.4.3. Pré-culture
2.2. LE SUBSTRAT
2.2.1. RAPPELS
2.2.1.1. Aspect quantitatif
2.2.1.2. Aspect qualitatif

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2.2.2. CARACTERISTIQUES DES SUBSTRATS INDUSTRIELS

2.2.3. STERILISATION
2.3. L’AIR

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3. LE BIOREACTEUR
3.1. FONCTIONS
1
C'est au sein du bioréacteur que se réalise la transformation du substrat en
biomasse et produits, selon l’équation : Substrat + Biomasse = (Biomasse)n +
Métabolites + Résidus de substrat.
L'utilisation des nutriments du substrat par la biomasse lui permet de se

maintenir en vie et de se multiplier. Cette activité métabolique, comme beaucoup de
réactions chimiques, génère cependant, outre les produits normalement attendus
(les éléments constitutifs de la cellule) des sous-produits inutiles que la cellule
accumule dans son cytoplasme (endotoxine, endoenzymes,...) ou rejette
(exotoxines, exoenzymes, CO2, ...) Ce sont les métabolites, que l'on qualifie de
primaires ou secondaires selon qu'ils dérivent d'un métabolisme primaire (= normal =
en conditions optimales ou suboptimales) ou secondaire (= anormal = en conditions
non optimales [carence en substrat, accumulation de produits, conditions
écologiques insatisfaites]).
Le bioréacteur doit donc favoriser au maximum ces productions, qu'elles

portent sur la biomasse (ex. : levurerie, production de bactéries pour enrobage de
semences [P.G.P.R., Rhizobium, ...], ou à des fins thérapeutiques [Bacillus
thermophilus, ...]), ou sur les métabolites (ex. : production d'alcool, d'acides
acétique, lactique, butyrique, d'enzymes, d'antibiotiques, ...).
Pour ce faire, il s'agit d'assurer, en tous points du digesteur un contact parfait

entre les différentes phases en présence. On peut considérer, en effet, que le
contenu du réacteur se scinde en trois parties de natures physiques différentes. On
a ainsi habituellement :
• une phase liquide qui correspond initialement au substrat mais dont la nature
chimique, et, partant, les propriétés physico-chimiques (pH, viscosité,...),
évoluent au cours du temps. Par exemple, on assiste à un enrichissement
progressif en produits conjointement à un appauvrissement en éléments nutritifs.
Cette phase liquide consiste le plus fréquemment en une solution aqueuse. Dans
certains cas cependant elle est composée de deux ou plusieurs liquides non
miscibles, ce qui rend l'homogénéisation encore plus malaisée.
• une phase solide en suspension dans la partie liquide qui est constituée
principalement par la biomasse (cellules). Celle-ci a spontanément tendance à
s'agglomérer et à sédimenter ou à flotter. Ces trois comportement nuisent à
l'efficacité de la réaction car dans ce cas l'interface biomase-substrat diminue.
D'autres particules que les cellules vivantes peuvent parfois apparaître dans le
substrat (rafles, pépins en vinification, particules de CaCO3 lorsqu'on tamponne
le milieux à la chaux, ...).
1
synonyme : réacteur biologique, fermenteur, digesteur. N. B. : le terme "digesteur" est souvent
employé pour désigner les réacteurs anaérobies
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• une phase gazeuse qui comprend d'une part les gaz de fermentation si le
processus est gazogène (CO2 en fermentation alcoolique, biogaz de la
méthanisation, ...) et d'autre part l'air ou l'oxygène pur destiné à apporter l'O2
nécessaire aux micro-organismes aérobies.
N. B. : Il existe des situations où le substrat est solide. La phase aqueuse se limite alors aux zones
proches des éléments solides. La présence d'eau est néanmoins toujours nécessaire. C'est
pourquoi, il est parfois nécessaire d'arroser le substrat pour garder une valeur d'Aw favorable à
l'activité microbienne. A titre d'exemples, on peut citer : le compostage d'ordures et/ou de déchets
végétaux, l'ensilage, …
Toute inhomogénéité dans la répartition des trois phases (L, S, G) risque

d’entraîner localement des carences en substrat ou O2 et/ou des excès de produits,
voire des accumulations de chaleur, tous phénomènes incompatibles avec l'activité
microbienne. C'est pourquoi il convient impérativement d'homogénéiser la masse en
fermentation. Cette opération, en dispersant les cellules et les bulles de gaz dans
l'ensemble du volume mis à leur disposition, favorise également les transfert de
matière entre les différentes phases.
Homogénéiser consiste en fait à provoquer un mouvement entre les trois phases.

Deux cas se présentent alors :
• soit on a affaire à un réacteur à cellules libres ou fixées sur des particules en
suspension, auquel cas l'homogénéisation se réalise par agitation ;
• soit il s'agit d'un réacteur à cellules fixées sur un support immobile, auquel cas
c'est le mouvement de la phase liquide par rapport à la phase solide fixe qui
assure l'uniformité des paramètres de fonctionnement.
3.2. TYPES DE REACTEURS
3.2.1. BIOMASSE EN SUSPENSION

De toutes ces considérations il ressort que le réacteur ne se limite pas à être une
simple "cuve de fermentation" mais que si l'on désire atteindre une productivité
(quantité produite par unité de temps) idéale, le contenu de cette "cuve" doit être
agité.
Ce mouvement relatif entre les trois phases peut être réalisé de diverses
manières :
• agitation mécanique rotative à l'aide de pales et contre-pales ;
• agitation pneumatique par air ou gaz de fermentation ;
• agitation par pompage et recirculation.
Quel qu'il soit, le module d'agitation permet donc de répartir uniformément

dans le substrat les particules solides (cellules et matières insolubles), les bulles
gazeuses (aération et/ou gaz de fermentation), les liquides (substrat ajouté,
correctifs,...), les calories (issues du métabolisme ou apportées par les entrants). Et
ce de façon à atteindre partout les conditions optimales de production.

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3.2.1.1. L'agitation
3.2.1.1.1. Agitation mécanique
La technique la plus classique consiste en une série de pales montées sur un

axe central soumis à un mouvement de rotation.
La forme des pales influence l'efficacité de l’agitation car deux impératifs sont
à respecter. D'une part, s'assurer que tout le volume est réellement mis en
mouvement, et d'autre part, éviter d’abîmer les cellules par effet de cisaillement au
niveau des parties mobiles.
Différents modèles d'agitateur sont donc proposés. Les uns induisent un

mouvement radial du fluide (mouvement initialement centrifuge), tandis que les
autres fournissent un effet axial (mouvement parallèle à l'axe).
Dans le cas des digesteur aérés, on a le plus souvent recours à une agitation
radiale qui permet une meilleure répartition des bulles dans le volume.
Sinon, le choix d'un type d'agitateur ou d'un autre dépend principalement du

volume à traiter, de la viscosité du fluide, de la sensibilité des micro-organismes.
Par ailleurs, afin d'éviter la création d'un vortex, c'est à dire d'un mouvement
de l'ensemble du contenu du digesteur sans homogénéisation réelle, il est
nécessaire d'installer sur les parois des contre-pales qui, en créant des turbulences,
améliorent l'efficacité de l'agitation.
De plus, toujours dans l'optique d'optimaliser l'homogénéisation, certains

digesteurs sont munis de système de circulation interne (inner loop reactor). Ceux-ci
consistent en structures internes dont la disposition oriente le flux du fluide de façon
à améliorer le contact entre les phases.
NB : Dans le cas d'agitation classique par pales, la hauteur du digesteur impose parfois une très
grande longueur de l'axe de rotation. auquel cas un risque de torsion et de rupture existent. A ce
danger s'ajoute la nécessité d'installer des guides pour maintenir l'axe, lesquels constituent des
entraves à la circulation du fluide et des sources potentielles d'infection vu les difficultés de
nettoyage. Ces dispositions sont néanmoins nécessaires car, pour profiter au maximum de l'effet
de l'agitation pneumatique et pour disperser idéalement les bulles, l'apport d'air a lieu à la base du
digesteur. Et on a tout intérêt à disposer d'une série de pales juste au dessus de la couronne
d'amenée d'air afin de provoquer un cisaillement maximum des bulles. Ce qui a pour conséquence
d'augmenter leur surface spécifique en diminuant leur taille. Afin de limiter ces risques liés à la
longueur de l'arbre, on installera, dans la mesure du possible, le moteur d’entraînement sous le
digesteur. Ce qui allège en outre la partie supérieur de la cuve.
3.2.1.1.2. Agitation pneumatique
Dans ce type d'appareil, l'agitation résulte exclusivement du déplacement des

bulles de gaz dans le fluide (ex. : bouillonnement dans les cuves de fermentations
de la bière dû au dégagement de CO2, agitation dans un digesteur à CH4 par les
gaz de fermentation, ...). Dans le cas particulier des digesteur aérés, le
dimensionnement des aérateurs présente certaines difficultés car il résulte d'un
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compromis entre d'un côté la surface spécifique des bulles et de l'autre la vitesse
ascensionnelle de celles-ci.
Le premier paramètre - surface spécifique - doit être maximisé de façon à

obtenir la plus grande surface d'échange possible entre la phase gazeuse et la
phase liquide. En effet, l'oxygène n'est assimilable par les micro-organismes que s'il
est dissous dans le substrat. Il n'est donc pas accessible sous forme gazeuse. Et
plus l'interface gaz-liquide sera étendue, meilleurs seront les transferts. Ceux-ci étant
toutefois limités par les possibilités de solubilité de l'O2 dans le substrat, lesquelles
dépendent entre autres choses de la température, de la pression et bien sûr de la
nature du substrat.
Le second impératif de dimensionnement des bulles - la vitesse

ascensionnelle - s'explique par le besoin d'une turbulence suffisante. Or celle-ci
exige des bulles de grande taille.
L'énorme avantage de l'agitation strictement pneumatique provient de

l'absence totale de phénomène de cisaillement, générateur de traumatisme pour la
biomasse.
Différentes technologies, plus ou moins sophistiquées, ont été conçues :

• Colonnes à bulles : Il s'agit de cuves très allongées et de section très faible de
façon à ce que les bulles puissent se répartir uniformément dans tout le volume.
La hauteur de la cuve se justifie par la nécessité de pouvoir disposer de volumes
suffisants. Cela présente en outre l'avantage de permettre un temps de séjour
relativement long des bulles dans la phase liquide, ce qui permet une bonne
solubilisation de l'O2.
• Digesteurs à boucle : Le principe de ce genre de digesteur repose sur le
mouvement ascendant du fluide provoqué par l'apport d'une grande quantité d'air.
En effet, cette aération intense se traduit par une augmentation importante du
volume sans pratiquement toucher à la masse. Dès lors le fluide ainsi expansé
tend à s'élever puisque sa masse volumique est inférieure à celle du fluide non
aéré. Pour peu que le digesteur soit compartimenté, en vue de séparer la zone
d'expansion du reste, toute la masse va se mettre en mouvement. La partie
expansée s'élevant et la partie plus dense descendant.
La compartimentation du digesteur peut être interne (inner loop air lift reactor)
ou externe (outer loop air lift reactor). Dans ce dernier cas, les deux zones
communiquent bien entendu par leurs parties hautes et basses.
3.2.1.1.3. Agitation par pompage

L'aspiration du fluide et sa projection brutale dans la cuve peuvent contribuer
à l'agitation. Cela sous entend une structure en boucle externe puisque la pompe,
qui ne peut pas être immergée dans le substrat, va devoir aspirer le fluide dans une
zone externe avant de le projeter avec un maximum de turbulence dans la cuve de
fermentation proprement dite. On profitera du passage dans la boucle externe pour
apporter l'O2 nécessaire et éventuellement corriger les paramètres du substrat.

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3.2.1.2. Modes de fonctionnement

3.2.1.2.1. Discontinu
Faire fonctionner un digesteur à cellules en discontinu consiste à mettre en
contact la biomasse et le substrat une fois pour toutes. Et à arrêter le processus
lorsque, par épuisement du substrat ou accumulation de produits, la réaction ralentit
provoquant une diminution de la productivité.
Deux modalités de gestion existent : en "batch" ou en "fed batch".
Dans la première - fonctionnement en batch - l'entièreté du substrat est

apportée dès la mise en route de la fermentation. Il s'agit d'un procédé très rustique
et employé par exemple en vinification. Il présente l'avantage évident de la simplicité
et du faible coût puisque les investissements se limitent à la cuve de fermentation et
aux régulations. L'inconvénient majeur de cette technologie réside dans le risque de
répression catabolique. Il s'agit en fait d'une inhibition par le substrat. On
constate, en effet, que l'excès de certaines molécules théoriquement nutritives,
comme par exemple le glucose, peut perturber le métabolisme microbien et induire
une diminution du taux de croissance ou la production de métabolites non attendus.
Pour pallier à ce problème, on amène le substrat progressivement au cours

de la fermentation, en adaptant les quantités à la biomasse déjà formée. Comme la
croissance de celle-ci est exponentielle les doses de nutriment doivent croître dans
les mêmes proportions. Il s'agit donc de disposer d'un moyen de mesurer aisément
et rapidement l'importance de la biomasse. Quoi qu'il en soit, le procédé fed batch
demeure discontinu puisqu'il n'y a pas de soutirage de produits avant l'arrêt de la
fermentation.
3.2.1.2.2. Continu
Les digesteurs à cellules libres (ou fixées sur des particules libres)
fonctionnant en continu sont considérés sur le plan théorique comme des
"Fermenteurs Infiniment Mélangés" (F.I.M.). Cela signifie qu'en chaque point de la
cuve les paramètres de fonctionnement ( température, pH, concentrations, ...) sont
identiques.
Pour obtenir une production stable quantitativement et qualitativement il est

impératif de maintenir constant l'état de la biomasse. Or celle-ci est influencée par
deux actions antagonistes. En effet, d'une part l'apport continu de substrat stimule la
croissance microbienne puisqu'aucune carence ne peut se manifester. Mais d'autre
part, cet apport de substrat doit être contrebalancé par des soutirages, lesquels
entraînent des cellules et font donc diminuer la biomasse. Idéalement donc, pour
garder un effectif cellulaire constant il convient de gérer le digesteur de façon à
conserver en permanence l'égalité entre le taux de croissance (µ) et le taux de
dilution (D). Ce dernier est défini comme étant le rapport du débit d'entrée de
substrat frais au volume total du digesteur. Il est évident qu'il doit correspondre au
taux de soutirage sous peine de voir la cuve se remplir ou se vider.
Par ailleurs, si µ < D on assistera à un lessivage du digesteur car, vu qu'il

s'agit d'un F.I.M., la dispersion des cellules est idéale et par conséquent une partie
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de celles-ci est entraînée lors du soutirage. Or si la croissance microbienne ne

permet pas de compenser la disparition de biomasse par soutirage, le digesteur
s'appauvrit et son rendement s'en trouve affecté.
D'autre part, lorsque u>d, ce qui signifie que le renouvellement de substrat ne

suffit pas à satisfaire les besoins de la biomasse, alors des symptômes de carence
apparaissent, entraînant un ralentissement du métabolisme, c'est à dire une
diminution du µ. Il y a donc dans ce dernier cas une autorégulation du digesteur
puisque la biomasse s'adapte automatiquement aux conditions de fonctionnement.
Un digesteur ainsi autorégulé est appelé chémostat .
En recherche en biotechnologie, dans l'optique de modéliser le

fonctionnement de la biomasse, on a parfois recours au turbidostat. Il s'agit d'un
type de digesteur continu à cellules libres dans lequel l'état physiologique de la
culture est maintenu constant. Ceci est obtenu en mesurant régulièrement la
quantité de biomasse présente de façon à la situer dans sa courbe de croissance.
Ainsi, en jouant sur la quantité de substrat apportée (via le taux de dilution) on peut
conserver les cellules en phase exponentielle ou de ralentissement ou même en
phase stationnaire. L'appréciation de l'effectif de la population microbienne se réalise
dans ce cas par turbidimétrie (mesure de la densité optique), d'où le nom de
l'appareil.
3.2.2. CELLULES FIXEES
L'utilisation de digesteurs à cellules libres implique un processus de
séparation en aval de la fermentation pour récupérer les cellules d'une part (cfr. 1.3.
L'aval), et les molécules intéressantes d'autre part.
Pour éviter cette opération, consommatrice de temps et d'énergie, on a

imaginé d'immobiliser les cellules soit en les emprisonnant dans des matrices de
plus ou moins grandes tailles, soit en les fixant sur un support inerte.
Outre l'absence de séparation en aval, l'immobilisation des cellules présente

également divers avantages tels que :
- production continue relativement aisée.
En effet, si le produit recherché est un métabolite secondaire, sa production

est incompatible avec la croissance microbienne. Or dans un digesteur à cellules
libres fonctionnant en continu, l'apport de substrat pour maintenir l'activité doit être
compensé par un soutirage équivalent. Lequel contient des cellules. Dès lors, si on
ne stimule pas la croissance, le digesteur s'appauvrit en biomasse et la productivité
chute. Par contre si on favorise la multiplication cellulaire, le rendement diminue
aussi puisque la production de métabolites secondaires est quasi nulle en phase
exponentielle.
Cette difficulté n’apparaît pas si les cellules sont fixées puisqu'une fois la
concentration cellulaire idéale atteinte, la biomasse demeure dans le digesteur. et
son mode de fonctionnement est directement commandé par la quantité de substrat
apportée.

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- productivité élevée .
Dans un digesteur à cellules immobilisées, il est possible d'obtenir des

concentrations cellulaires extrêmement élevées. A cette fin, on fonctionne
classiquement en deux temps. Après une première phase favorable à la
multiplication microbienne, une modification d'un ou de plusieurs paramètres de la
croissance entraîne la production des métabolites désirés.
La fixation cellulaire n'est cependant pas toujours applicable car des difficultés
de transfert de nutriments et particulièrement d'oxygène peuvent apparaître. Elles
sont causées par l'épaisseur du "film" cellulaire [disposé sur le support ou agrégé en
pelote (floc)], qui empêche une bonne diffusion des éléments nécessaires aux
cellules, ce qui se traduit par un ralentissement du métabolisme des couches sous-
jacentes.
De même lorsque la biomasse est enfermée dans une membrane ou intégrée

dans un gel, la translation des nutriments et des produits aux travers de ceux-ci peut
être ralentie.
Enfin, on peut assister à des phénomènes de "relargage" [détachement de la

biomasse (ex : autocurage d'un lit bactérien)] qui imposent malgré tout souvent des
processus de séparation en aval de la fermentation.
3.2.2.1. Modes de fixation

3.2.2.1.1. Inclusion
La technique d'immobilisation de cellules par inclusion consiste à enfermer
celles-ci dans un gel de polymère perméable au substrat et aux produits. Dans ce
cas la biomasse est intégrée dans le réseau du polymère et est par conséquent
totalement immobile (ex : inclusion en billes d'alginate).
Une fois cette opération réalisée, le gel peut être fractionné afin de fournir des
particules de taille choisie que l'on pourra gérer exactement comme s'il s'agissait de
cellules libres.
On peut ainsi mettre en oeuvre un système d'agitation par lit fluidisé. Il s'agit
d'une technique utilisée dans de nombreux domaines et qui consiste, dans ce cas-ci,
à alimenter le digesteur par le bas. Le débit de fluide entrant, en l’occurrence le
substrat, doit être tel qu'il maintienne les particules de biomasse en suspension, à un
niveau constant dans le digesteur. En fait, pour réaliser cela, il convient de conférer
aux particules une force ascensionnelle équivalente à la force de la gravité qui tend
à les faire chuter. Cette technique n'est pas imaginable sur des cellules
individualisées car, vu leur très faible masse, leur tendance à sédimenter demeure
relativement faible, si bien que le flux d'entrée du substrat devrait être excessivement
petit. Ce qui est techniquement difficile à réaliser et incompatible avec une bonne
alimentation en substrat.
3.2.2.1.2. Confinement

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Le principe du confinement s'apparente à celui de l'inclusion en ce sens qu'il

s'agit également de faire appel à un polymère pour immobiliser les cellules.
Toutefois, dans ce cas-ci, ce dernier se limite à une membrane perméable
exclusivement aux molécules de substrat et de produit. A l'intérieur de la zone
délimitée par ce voile, les cellules sont totalement libres, ce qui évite les problèmes
locaux de diffusion des nutriments et/ou des excrétions.
La microencapsulation est une application du confinement qui consiste à

immobiliser dans de petites "capsules" les cellules utiles. On dispose ainsi de
particules actives dont la gestion correspond à celle d'un digesteur à cellules libres.
L'avantage de la méthode réside, d'une part, dans le fait qu'on dispose ainsi d'entités
de plus grande taille (et donc plus faciles à séparer de la phase liquide),et d'autre
part, ces microcapsules protègent la biomasse des chocs et de l'effet de cisaillement
dû à l’agitation
3.2.2.1.3. Support inerte

Ici la biomasse adhère par adsorption à un support inerte minéral (argiles,
sable, graviers, ...) ou organique. Le substrat est amené par le haut ou par le bas et
peut être recyclé dans le digesteur en vue d'améliorer le taux de conversion (
[P]/[S] = moles de produit par mole de substrat ). La technique d'épuration des eaux
résiduaires dite "par lits bactériens" est un exemple typique de ce procédé.
Le support doit bien sûr rester absolument neutre par rapport aux cellules.
Dans cette optique, il apparaît que la fixation de celles-ci par des liaisons chimiques
ou par l'intermédiaire de substances collantes risque de perturber la perméabilité de
la membrane et par conséquent d'altérer le métabolisme.
La nature et la conception du support doivent également permettre de

contenir une biomasse maximale. A cette fin, deux caractéristiques essentielles
méritent d'être prises en considération : la surface spécifique et la résistance
mécanique.
En effet, le rendement de la fermentation dépend, entre autres choses, de la

surface de contact biomasse-substrat. Et celle-ci sera d'autant plus grande que le
support est poreux, c'est à dire percé d'interstices susceptibles d'être tapissés par la
biomasse. Cependant le diamètre de ces pores ne peut pas être trop réduit car on
risquerait alors d'assister à un colmatage du support. Celui-ci est provoqué par
l'augmentation de la biomasse. En effet, initialement, celle-ci va se répartir en une
couche monocellulaire sur toute la surface mise à sa disposition. Ensuite, tant que
les conditions de croissance sont respectées, ce "biofilm" va s'épaissir par
accumulation de cellules. Dès lors, si deux biofilms placés vis à vis se rejoignent, le
pore est bouché et le substrat ne peut plus traverser le digesteur.
Par ailleurs, pour assurer un rendement élevé de production il est nécessaire

de prévoir un temps de contact biomasse-substrat suffisant. Celui-ci correspond en
fait au temps mis par le substrat pour traverser le digesteur de part en part. Il est
donc directement fonction de la hauteur, lorsque l'écoulement se fait par gravité. Par
conséquent, dans le cas d'un digesteur très haut, la quantité de support sera telle

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que les couches basses risquent de subir une pression énorme, due au poids d'une
part du support lui-même, et d'autre part du biofilm. Le choix de la nature du support
devra donc tenir compte de sa résistance mécanique à l'écrasement afin d'éviter un
tassement à la base. Ce qui aurait pour effet de bloquer le processus vu la réduction
des interstices.
3.2.2.2. Mode de fonctionnement

Le modèle mathématique correspondant le mieux au digesteur à cellules
immobilisées est celui du Réacteur à Gradient de Concentration. En effet, dans ce
cas, au fur et à mesure de l'avancement de la phase liquide dans le digesteur les
teneur relatives en substrat et en produit, évoluent. Le substrat est bien sûr
majoritaire à l'entrée, alors qu'à la sortie ce sont les produits qui l'emportent. On
parle aussi, pour désigner ce genre de technologie, de digesteur à écoulement
"piston", dans la mesure où on peut considérer qu'en conditions idéales, le fluide
avance dans le digesteur de façon homogène. Dans ce cas, une "tranche" de
digesteur prise perpendiculairement à l'axe d'écoulement aura toujours les mêmes
caractéristiques pendant toute la durée du processus.

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4. L’AVAL
4.1. LA PURETE DU PRODUIT
4.2. PRODUITS EXTRACELLULAIRES
4.3. PRODUITS INTRACELLULAIRES
4.4. TECHNIQUES DE SEPARATION
4.4.1. SEPARATION SOLIDE / LIQUIDE

4.4.2. SEPARATION LIQUIDE / LIQUIDE
4.5. PERMEATION
4.6. CONCENTRATION

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5. LES FONCTIONS ANNEXES

5.1. REGULATION
5.1.1. UTILITE
Le fonctionnement d'un micro-organisme, quelle que soit sa nature, reste
sous la dépendance des conditions d'environnement. Pour assurer une activité
idéale, qu'il s'agisse de production de biomasse ou de métabolites primaires ou
secondaire, il est donc absolument impératif de le maintenir dans une situation où
ses paramètres de croissance ou métabolisme demeurent optimaux et constants.
Les systèmes de régulation adjoints aux digesteur ont précisément cette

fonction de corriger en permanence, et, si possible, instantanément, les
caractéristiques du milieu.
5.1.2. PRINCIPE
Réguler un facteur consiste donc à le maintenir constant malgré d'éventuelles
variations des conditions de fonctionnement.
Cette uniformisation de la valeur du ou des paramètre(s) considéré(s) exige

l'intervention de trois éléments intégrés :
* un capteur d'information (sonde) capable d'enregistrer et de
transmettre une information sur l'état de la variable à stabiliser
* un actionneur chargé de comparer la donnée transmise par le
capteur avec une constante qui lui a été imposée (la consigne). En cas de
divergence entre la mesure issue du capteur et la consigne, l'actionneur enclenche
un processus de correction.
* un correcteur, susceptible d'agir sur le paramètre régulé en vue de le
faire correspondre à la consigne.
Ces trois actions, qui visent donc à minimiser l'écart entre une valeur mesurée
(ce qui est réellement) et une valeur imposée (ce qui devrait être), constituent un
système dit servocommande ou asservi. Ce dernier peut être plus ou moins
sophistiqué.
Ainsi, au niveau artisanal, c'est l'homme qui fait office d'actionneur. En

vinification, par exemple, le maître de chais décidera de refroidir le moût s'il constate
une élévation de température (risque de "coup de chaud"). Dans ce cas, la sonde
n'est autre qu'un vulgaire thermomètre, l'ouvrier officie en tant qu'actionneur, et le
correcteur consiste en un serpentin alimenté en eau froide immergé dans la cuve.
Mais il existe des procédés totalement automatisés où un microprocesseur est

programmé pour contrôler simultanément tous les paramètres. Dans ce dernier cas,

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il est même possible d'adapter les consignes en cours de process par comparaison
de l'évolution de la biomasse (ou du substrat ou des produits) à un modèle imposé.
5.1.3. PARAMETRES A REGULER
Idéalement tous les facteurs de l'activité (croissance ou synthèse de
métabolites) des micro-organismes producteurs devraient être régulés. La
multiplicité de ceux-ci rend cependant cela impossible. Ainsi, il est tout à fait
inconcevable de maîtriser en permanence tous les paramètres nutritifs. On se
limitera donc dans ce cas à concevoir un substrat de composition optimale, et la
régulation éventuelle concernera l'adaptation des quantités fournies aux besoins de
la biomasse (fonctionnement en fed batch).
Par ailleurs, certaines techniques de régulation permettent de contrôler

simultanément plusieurs facteurs. Ainsi, la vitesse de rotation de l'arbre d'agitation
intervient bien sûr dans la qualité de l'homogénéisation, mais elle peut aussi
collaborer à l'efficacité de l'oxygénation via le cisaillement des bulles sortant du
diffuseur d'air.
Quoi qu'il en soit, on ne peut imaginer un processus performant sans un

minimum de contrôles.
En priorité le maintien de la température optimale doit être assuré. Il est à

remarquer que celle-ci ne correspond pas nécessairement avec l'optimum de
croissance. En effet, la production de métabolites exige parfois un niveau différent
de la température de croissance.
La nature des sondes thermométriques est très diverse. Cela va du simple

thermomètre à mercure, à des thermocouples plus ou moins sophistiqués selon la
sensibilité de la biomasse, ... et les budgets.
Quant à la correction, elle s'opère selon deux techniques principalement : le

serpentin ou les doubles parois. Le principe de base étant toujours de faire circuler à
l'intérieur de ceux-ci, et donc à proximité du substrat, une quantité d'eau froide ou
chaude, voire de vapeur, destinée respectivement à prélever ou à fournir des
calories. Dans les digesteurs modernes c'est en général la deuxième solution qui est
retenue car le serpentin présente le double inconvénient d'une part d'occuper du
volume dans le digesteur, et d'autre part d'être difficilement nettoyable.
Enfin, comme le but de la régulation thermique consiste à maintenir la

température au niveau de l'optimum biologique, et que par ailleurs la plupart des
biomasses utilisées en biotechnologie sont de type mésophile ou même thermophile,
on est la plupart du temps amené à chauffer le digesteur en début de fermentation.
Toutefois, lorsque l'activité métabolique est enclenchée (phase exponentielle de
croissance), vu la tendance exothermique du système, il devient impératif de pouvoir
refroidir le digesteur. La régulation thermique doit donc pouvoir s'opérer positivement
et négativement.
Deuxième critère fondamental du développement et de l'activité microbiens, le

pH. Pour rappel, les bactéries sont en général neutrophiles à légèrement

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acidophiles, avec, pour certaines espèces, une adaptation génétique à des niveaux
d'acidité relativement élevé ( certains Lactobacillus sont encore actifs à des pH
proches de 5, Thiobacillus ferrooxydans a un optimum de pH aux alentours de 2 ).
Les moisissures et levures par contre sont plus franchement acidophiles.
Concernant les sondes à pH, il n'y a rien de spécial à signaler si ce n'est que
le choix de l'électrode doit bien sûr tenir compte de la nature du substrat, afin d'éviter
tout risque d'altération.
Le maintien d'une acidité constante aux cours du processus peut s'obtenir soit
en utilisant un substrat préalablement tamponné, soit en apportant des correctifs
(acide ou base) tout au long de la fermentation. Dans le premier cas, la régulation
n'est assurée que dans une plage de pH limitée et pour autant que les production
d'acides ou de bases ne soient pas excessives. Dans le second cas,
l'homogénéisation du substrat corrigé doit être particulièrement efficace pour éviter
toute accumulation locale du correctif.
Ici aussi une régulation positive et négative est à prévoir car selon l'état du
substrat, un même micro-organisme peut avoir tendance soit à acidifier, soit à
alcaliniser. C'est ainsi que dans la plupart des cas, le métabolisme des sucres fait
chuter le pH, alors que la dégradation des substances aminées (acides aminés et
protéines) induit l'effet inverse.
L'aération du substrat, qui conditionne la disponibilité en oxygène pour les

micro-organismes aérobies, exige aussi un système régulateur. Celui-ci peut agir sur
trois facteurs : d'une part le débit d'air entrant dans le digesteur, d'autre part la
richesse de l'air en O2, et enfin l'intensité de l'agitation. Ce dernier paramètre agit
doublement puisque une vitesse de rotation élevée des pales de cisaillement induit à
la fois la formation de bulles fines favorables aux transferts gaz-liquide, et une
répartition homogène de celles-ci.
Il est bien sûr évident que tout ce raisonnement ne présente aucun intérêt
pour les digesteurs anaérobies, puisque dans ce cas l'oxygène doit absolument être
banni du processus.
L'enregistrement de la concentration en oxygène dissous dans le milieu est

réalisé par une sonde à oxygène qui mesure la concentration en O2 via une
électrode ad hoc.
Quant à la correction elle consistera, comme indiqué plus haut, soit à adapter
le débit et/ou la concentration en O2 de l'air, soit à moduler la vitesse de l'arbre
d'agitation.
Indépendamment de son action sur l'oxygénation du digesteur, l'agitation a

en fait pour fonction principale d'assurer une bonne homogénéisation des différentes
phases. Or les caractéristiques physiques de celles-ci peuvent évoluer aux cours de
la fermentation (production de chaleur, modification de la viscosité,...) d'où la
nécessité de pouvoir moduler la vitesse de rotation de l'arbre d'agitation.

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Diverses techniques électroniques permettent d'apprécier celle-ci. Elles sont

basées sur la fréquence d'apparition d'un indice fixé sur l'arbre. La correction agira
sur le moteur d’entraînement.
L'étude des métabolismes microbiens indique que la croissance et la

production dépendent, entre autres, choses des disponibilités en substrat d'une
part, et de l'accumulation éventuelle des produits d'autre part. Il est donc impératif
de pouvoir maîtriser ces deux paramètres.
Ici aussi différents types de sondes existent selon la nature de la substance à

détecter. En particulier les capteurs enzymatiques semblent promis à un bel avenir
dans ce domaine (cfr. Cours de Génie Enzymatique).
Côté correction, il s'agira simplement d'apporter le substrat en fonction des

exigences de la biomasse Dans cette optique, plutôt que de mesurer la quantité de
substrat disponible, on se contente parfois de doser la biomasse pour en déterminer
les besoins et adapter ainsi les apports. Pour réaliser ces derniers l'installation de
fermentation doit bien sûr être équipée de réservoirs de substrat stérile susceptible
d'être transféré aseptiquement vers le digesteur. A l'autre extrémité du processus,
l'excès de produits peut également conduire à un dysfonctionnement du digesteur.
Le soutirage permanent de celui-ci s'impose donc dans les appareils fonctionnant en
continu.
5.2. MOUVEMENTS DE FLUIDES
5.3. NETTOYAGE, DESINFECTION ET

STERILISATION

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TABLE DES MATIERES

4.4.1. Séparation solide / liquide....................................................................... 17

5. Les fonctions annexes..................................................................................... 18

Fermentations industrielles.doc B. Dauby 2 / 21

De même, quel point commun pourrait-on trouver entre l'activité principale du

En fait toutes ces productions, et bien d'autres, utilisent un outil vivant. Le

Le "génie" microbiologique, dans la même acception que le "génie" civil ou le

Fermentations industrielles.doc B. Dauby 3 / 21

Pour information, le génie enzymatique correspond aux techniques utilisant

Dans ce contexte, l'ensemble des éléments constituant une installation de

Pour optimiser la production, il est impératif de fournir à la biomasse un

La biomasse elle-même doit, en général, être sélectionnée en vue d'obtenir

Parmi les nombreux produits du génie microbiologique, certains font appel à

Tenant compte de ces impératifs relatifs au substrat et à la biomasse, le

Cependant, connaissant le fonctionnement microbien (courbe de croissance,

Par ailleurs, lorsque la bioréaction s'achève, les produits recherchés (cellules

Enfin, il ne faut pas perdre de vue que certains procédés du génie

Fermentations industrielles.doc B. Dauby 5 / 21

2.1.1.1. Facteurs de développement

2.1.3.3. Manipulation génétique

2.2.1.1. Aspect quantitatif

2.2.1.2. Aspect qualitatif

Fermentations industrielles.doc B. Dauby 6 / 21

2.2.2. CARACTERISTIQUES DES SUBSTRATS INDUSTRIELS

Fermentations industrielles.doc B. Dauby 7 / 21

L'utilisation des nutriments du substrat par la biomasse lui permet de se

Le bioréacteur doit donc favoriser au maximum ces productions, qu'elles

Pour ce faire, il s'agit d'assurer, en tous points du digesteur un contact parfait

Toute inhomogénéité dans la répartition des trois phases (L, S, G) risque

Homogénéiser consiste en fait à provoquer un mouvement entre les trois phases.

3.2. TYPES DE REACTEURS

3.2.1. BIOMASSE EN SUSPENSION

Quel qu'il soit, le module d'agitation permet donc de répartir uniformément

Fermentations industrielles.doc B. Dauby 9 / 21

La technique la plus classique consiste en une série de pales montées sur un

Différents modèles d'agitateur sont donc proposés. Les uns induisent un

Sinon, le choix d'un type d'agitateur ou d'un autre dépend principalement du

De plus, toujours dans l'optique d'optimaliser l'homogénéisation, certains

3.2.1.1.2. Agitation pneumatique

Dans ce type d'appareil, l'agitation résulte exclusivement du déplacement des

Le premier paramètre - surface spécifique - doit être maximisé de façon à

Le second impératif de dimensionnement des bulles - la vitesse

L'énorme avantage de l'agitation strictement pneumatique provient de

Différentes technologies, plus ou moins sophistiquées, ont été conçues :

3.2.1.1.3. Agitation par pompage

Fermentations industrielles.doc B. Dauby 11 / 21

3.2.1.2. Modes de fonctionnement

Deux modalités de gestion existent : en "batch" ou en "fed batch".

Dans la première - fonctionnement en batch - l'entièreté du substrat est

Pour pallier à ce problème, on amène le substrat progressivement au cours

Pour obtenir une production stable quantitativement et qualitativement il est

Par ailleurs, si µ < D on assistera à un lessivage du digesteur car, vu qu'il

de celles-ci est entraînée lors du soutirage. Or si la croissance microbienne ne

D'autre part, lorsque u>d, ce qui signifie que le renouvellement de substrat ne

En recherche en biotechnologie, dans l'optique de modéliser le

Pour éviter cette opération, consommatrice de temps et d'énergie, on a

Outre l'absence de séparation en aval, l'immobilisation des cellules présente

- production continue relativement aisée.

En effet, si le produit recherché est un métabolite secondaire, sa production

Fermentations industrielles.doc B. Dauby 13 / 21

Dans un digesteur à cellules immobilisées, il est possible d'obtenir des

De même lorsque la biomasse est enfermée dans une membrane ou intégrée