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Versão do FarmaBio
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HHPPLLCC

HHigighh PePerfrfoormancrmancee LiquiLiquidd ChrChroomatogmatographyraphy

CLAE Cromatografia a Líquida de Alta Eficiência

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ContContddoo

Versão do FarmaBio Cont Cont eú eú d d o o Parte I : FUNDAMENTOS DE

Parte I: FUNDAMENTOS DE HPLC

1. Introdução

2. Histórico

3. Áreas de aplicação / vantagens

4. Modos de separação / tipos de HPLC

5. Características cromatograma / eficiência coluna

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ConContteúdeúdoo ((ccoonntt.).)

Con Con t t eúd eúd o o ( ( c c o o n n

Parte II: INSTRUMENTAÇÃO / FUNCIONAMENTO HPLC

1. Colunas

2. Bombas / fase móvel

3. Injeção da amostra

4. Detectores

5. Tratamento dados

6. Dicas de manutenção

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ConContteúdeúdoo ((ccoonntt.).)

Con Con t t eúd eúd o o ( ( c c o o n n

Parte III: APLICAÇÕES

1. Desenvolvimento de metodologias

2.

Validação de metodologias

2.

Aplicações

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Parte I

FUNDAMENTOS

HPLC

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IIntrntrooduduçãoção

CROMATOGRAFIA = método físico de separação no qual os constituintes de uma amostra a serem separados são distribuídos entre 2 fases:

eestacstacioionárináriaa: geralmente de grande área, sólida ou líquida

móvel: um fluido insolúvel que percola através da primeira

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FASE MÓVEL
FASE MÓVEL
Versão do FarmaBio FASE MÓVEL injeção Fase estacionária separação Disponível em www.farmabio.k6.com.br eluição

injeção

Fase

estacionária

Versão do FarmaBio FASE MÓVEL injeção Fase estacionária separação Disponível em www.farmabio.k6.com.br eluição
Versão do FarmaBio FASE MÓVEL injeção Fase estacionária separação Disponível em www.farmabio.k6.com.br eluição

separação

do FarmaBio FASE MÓVEL injeção Fase estacionária separação Disponível em www.farmabio.k6.com.br eluição DETECTOR
do FarmaBio FASE MÓVEL injeção Fase estacionária separação Disponível em www.farmabio.k6.com.br eluição DETECTOR

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do FarmaBio FASE MÓVEL injeção Fase estacionária separação Disponível em www.farmabio.k6.com.br eluição DETECTOR
do FarmaBio FASE MÓVEL injeção Fase estacionária separação Disponível em www.farmabio.k6.com.br eluição DETECTOR
do FarmaBio FASE MÓVEL injeção Fase estacionária separação Disponível em www.farmabio.k6.com.br eluição DETECTOR
do FarmaBio FASE MÓVEL injeção Fase estacionária separação Disponível em www.farmabio.k6.com.br eluição DETECTOR

eluição

DETECTOR

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FASE MÓVEL:

Líquido

Gás

GC

HPLC

Gás em condições supercríticas (Cromatografia a fluido supercrítico)

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SFC

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CROMATOGRAFIA SFC Cromatografia a Fluido Supercrítico LC Cromatografia a Líquido GC Cromatografia a Gás LC
CROMATOGRAFIA
SFC
Cromatografia a
Fluido Supercrítico
LC
Cromatografia a
Líquido
GC
Cromatografia a
Gás
LC
LC
Planar
Coluna
Cromatografia
Coluna
Papel
CCD
Cromatografia
Camada Delgada
Empacotada
Coluna "Open
Tubular" Capilar
dc < 350 um
Coluna Capilar
empacotada
dc <= 350 um
Coluna
Microbore
350 um < dc < 1 mm
Coluna
"Analítica"
1 mm < dc < 8 mm
Coluna
Preparativa
dc >= 8 mm

FONTE: LOUGH & WAINER, 1997.

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HHiissttóórricoico

1903 - TSWETT, botânico russo: separação e isolamento de pigmentos de plantas em colunas de sílica gel (cromatografia = color writing)

1931 - LEDERER & KUHN: trabalhos utilizando cromatografia na separação de carotenóides

1938 - ISMAILOV & SHRAIBER: CCD

1941 - MARTIN & SYNGE: cromatografia partição

1944 - CONSDEN, GORDON & MARTIN: cromatografia papel

1949 - SPEEDING & TOMPKINS: cromatografia troca iônica

1952 - MARTIN & JAMES: GC

1957 - GOLAY: colunas capilares para GC

1959 - PORATH & FLODIN: cromatografia exclusão tamanho

1965-1969 - HALASZ; HORVATH; KIRKLAND; PRETORIUS; SCOTT; SNYDER; etc: HPLC moderna*

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CrCromatografomatografiaia quiquidada CClláássicssicaa

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qui da da C C l l á á ssic ssic a a Versão do FarmaBio
 
  Fluxo por gravidade

Fluxo por gravidade

  Fluxo por gravidade
  Fluxo por gravidade
  Fluxo por gravidade
  Fluxo por gravidade
  Fluxo por gravidade
  Fluxo por gravidade
  Fluxo por gravidade

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HHPLCPLC MoModerna*derna*

Partículas

da

fase

estacionária

extremamente pequenas (diâmetro < 10

m)

pressões (até 500 atm) e baixas vazões

(0,01 a 2-3 mL / min) LC

Pressure

bombas para operações a altas

High

Solventes especiais e ultra-puros

Detectores seletivos e super-sensíveis, com tamanho de célula de detecção < 10 L

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HPHPLCLC ModernModerna*a*

Reservatórios para os solventes

Injetor Bomba HPLC
Injetor
Bomba HPLC

Filtro em linha Scavenger

Precoluna Detector
Precoluna
Detector

Coluna Analitica

Sistema de Tratamento de Dados
Sistema de Tratamento
de Dados

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ÁreasÁreas aplicaplicaçãoação // vvaantntagensagens

HPLCHPLC xx GCGC

Técnica

Analitos

Pré-requisito

Interação

GC

Voláteis e termicamente estáveis (nas consições de operação)

Fase estacionária

HPLC

Solúveis na fase móvel

Fase estacionária e fase móvel

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Substâncias não analisáveis por GC:

• compostos iônicos

• sais inorgânicos e orgânicos

• aminoácidos puros

• compostos polares de alto PM

• polímeros

• compostos termicamente instáveis

• corantes salinos

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AAppllicicaçõaçõeses HPLHPLCC SSuubbsstântâncciasias qquuímímiiccasas

• Proteínas

• Ácidos nucleicos

• Aminoácidos

• Corantes

• Polissacarídeos

• Pigmentos plantas

• Metabólitos plantas

• Produtos farmacêuticos

• Compostos iônicos

• Íons metálicos

• Cátions e ânions

• Lipídeos polares

• Complexos metais pesados

• Explosivos

• Polímeros sintéticos

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AAplplicaçõicaçõeess HHPPLCLC ÁÁrreaseas

PESQUISA QUÍMICA/BIOQUÍMICA (Universidade e Indústria)

• Análise de misturas complexas

• Purificação de compostos químicos

• Desenvolvimento de processos de síntese de compostos químicos

• Isolamento de produtos naturais com características biológicas benéficas

CONTROLE QUALIDADE

• Garantia pureza de materiais brutos

• Teste in process para controle e otimização de processos de produção

• Ensaios quantitativos de produtos finais (garantia especificações)

• Avaliação estabilidade de produto e monitorização degradação

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ApApliclicaaççõesões HHPLCPLC ÁrÁreeasas

CONTROLE AMBIENTAL

• Análise de poluentes do ar e água

• Monitorização materiais perigosos - Saúde ocupacional

• Monitorização níveis agrotóxicos no ambiente

AGÊNCIAS REGULAMENTAÇÃO (Federais e Estaduais)

• Vigilância de medicamentos / alimentos

• Identificação narcóticos confiscados

• Conformidade - reclamações etiquetas

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FONTE: BIDLINGMEYER, 1993.

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VVananttageagennss dada HPLCHPLC

Sensível a diversas amostras, incluindo orgânicas, biomoléculas e íons - Pode-se analisar > 60% de todos os componentes contra uns 15% para GC

Alta resolução

resolve (separa) centenas de componentes em amostras complexas

Detecção de alta sensibilidade

detecta nos limites de pg - ng

Análises rápidas e precisas

análises de 1 - 60 min

Análises automatizadas

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ModosModos ddee SeparaSeparaççãoão

Cromatografia de adsorção (sólido- líquido)

Cromatografia de partição (líquido- líquido)

Cromatografia de troca iônica

Cromatografia por exclusão de tamanho

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CromaCromattogogrrafafiaia ddee adsorçadsorçãoão ((ssólido-ólido- líqlíquiuiddo)o)

ADSORÇÃO = tendência de acúmulo de uma substância sobre a superfície de outra, quando 2 fases imiscíveis são colocadas em contato

FASE MÓVEL
FASE MÓVEL
2 fases imiscíveis são colocadas em contato FASE MÓVEL FASE ESTACIONÁRIA (sólida) Disponível em
2 fases imiscíveis são colocadas em contato FASE MÓVEL FASE ESTACIONÁRIA (sólida) Disponível em
2 fases imiscíveis são colocadas em contato FASE MÓVEL FASE ESTACIONÁRIA (sólida) Disponível em
2 fases imiscíveis são colocadas em contato FASE MÓVEL FASE ESTACIONÁRIA (sólida) Disponível em

FASE ESTACIONÁRIA (sólida)

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AdAdsorçãosorção

QUÍMICA = formação de ligações químicas

FÍSICA = envolve interações como pontes de hidrogênio, dipolo-dipolo, dipolo-dipolo induzido, etc

* temperatura : adsorção física química

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adsorção

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FaseFase EstaciEstaciononáriaária

Sólida

Apresenta na superfície cargas iônicas ou polares.

Exemplos:

Sílica gel

Alumina

Florisil

Carvão

Carbonato de cálcio

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FaseFase MóvelMóvel

Hexano

• Hexano

Isooctano

• Isooctano

Cloreto de butila

Clorofórmio

Diclorometano

Tetraidrofurano

Acetonitrila

Iso e n-propanol

Metanol

Água

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CromCromatatografiografiaa dede parparttiçiçãoão (l(líquíquiido-do- llííquiquido)do)

PARTIÇÃO = distribuição de uma substância entre 2 fases heterogêneas fluidas, imiscíveis entre si. Por exemplo: um gás e um líquido, ou 2 líquidos imiscíveis

imiscíveis entre si. Por exemplo: um gás e um líquido, ou 2 líquidos imiscíveis Disponível em
imiscíveis entre si. Por exemplo: um gás e um líquido, ou 2 líquidos imiscíveis Disponível em
imiscíveis entre si. Por exemplo: um gás e um líquido, ou 2 líquidos imiscíveis Disponível em

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CromCromatatografiografiaa dede parparttiçiçãoão clclásássicsicaa

FASE ESTACIONÁRIA

Fina camada de líquido que cobre as partículas de um suporte sólido

Este líquido pode ser:

polar: polietilenoglicol, ODPN ( , ´-oxidipropionitrila)

apolar: hexano

FASE MÓVEL

Sempre de polaridade contrária

Baixa estabilidade

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CCrroomatomatogrgraaffiaia dede partpartiçiçããoo cocomm ffaasesess qquuiimimicamecamentntee lligadasigadas

FASE ESTACIONÁRIA

Líquido é quimicamente ligado ao suporte sólido.

FASE MÓVEL

Sempre de polaridade contrária Alta estabilidade

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AAplicaplicaçõeçõess

Hidrocarbonetos aromáticos, óleos, esteróides, plásticos, polímeros, alcalóides (C18)

Ácidos urinários, ácidos carboxílicos, sulfonamidas, hormônios tireóide, azocorantes

(C8)

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CCrromatogomatografiarafia FFasease NNormormalal (N(NPPC)C)

xx

CCrromatomatografiaografia FFasasee RevReversaersa (RPC)(RPC)

Classificação baseada na Natureza da Fase Móvel

NPC

Fase móvel Apolar

Fase estacionária Polar

hexano, isooctano

sílica, alumina

RPC

Fase móvel Polar

Fase estacionária Apolar

metanol, água

C8, C18

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Portanto

GERALMENTE:

NPC

RPC

Cromatografia Adsorção

Cromatografia Partição

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CroCromatomatogrgrafiaafia ddee ttrorocaca iôiônicanica

FASE ESTACIONÁRIA = grupos iônicos quimicamente ligados a um suporte (sílica ou polímeros de alto PM).

FASE MÓVEL = soluções tampões (controle pH). Por exemplo: ácido cítrico, fosfato amônia, acetato sódio, borato sódio.

APLICAÇÕES = compostos iônicos, aminoácidos, proteínas/peptídeos, etc

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CromCromatatografiaografia pporor excexclusãolusão dede

ttamamanhoanho

A separação é baseada no tamanho da molécula e não em fenômenos de interações físicas ou químicas

FASE ESTACIONÁRIA = partículas com diâmetro médio de poro fabricado sob medida. Assim, algumas moléculas (menores) podem entrar nos poros pequenos, outras nos poros médios, ou seja, são permeadas seletivamente. As

moléculas grandes são excluídas tamanho.

exclusão

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CromaCromatogtografirafiaa poporr exexccllusãousão ddee ttaammaanhonho

FLUXO Gel Por o
FLUXO
Gel
Por o

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AAplicaplicaçõeçõess

Controle qualidade de polímeros de alto PM (assegurar propriedades físicas)

Separação

polímeros

de

baixo

(poliestireno, ftalatos)

PM

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EscEscoolhlhaa dodo sissistetemama cromcromatoatográficográfico

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Amostra PM < 1.000 Insolúvel Solúvel água água Solúvel Solúvel
Amostra
PM < 1.000
Insolúvel
Solúvel
água
água
Solúvel
Solúvel
PM > 1.000 metanol Não-iônica Iônica hexano Amostra Amostra não-aquosa aquosa NPC NPC RPC
PM > 1.000
metanol
Não-iônica
Iônica
hexano
Amostra
Amostra
não-aquosa
aquosa
NPC
NPC
RPC
Cromatografia
RPC
(sílica)
(fase ligada)
"ion-pair"
troca iônica
Biopolímeros
solúveis água
Polímeros
Condições
insolúveis água
não-desnaturantes
Condições
desnaturantes
(separação analítica)
Preparativa
Informação tamanho
Preparativa
Cromatografia
Cromatografia
Cromatografia
RPC
permeação gel
filtração gel
troca iônica

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CaCarraaccterísticterísticasas crocrommaattogrogramaama // eefficiciêiêncinciaa ccololunauna

Tempo de retenção (t r )

Largura do pico (w b )

• Fator de Capacidade (k´)

• Seletividade ( )

• Resolução (Rs)

• Rendimento da coluna / número de pratos teóricos

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Parte II

INSTRUMENTAÇÃO / FUNCIONAMENTO HPLC

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Injetor Reservatórios para os solventes Precoluna Bomba HPLC Coluna Analitica Sistema de Tratamento Detector de
Injetor
Reservatórios para
os solventes
Precoluna
Bomba HPLC
Coluna Analitica
Sistema de Tratamento
Detector
de Dados
Filtro em linha Scavenger

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11 CoColulunanass

Versão do FarmaBio 11 CoColulunanass • Sistema separação (adsorção, partição, etc) • Comprimento (10-25 cm) –

• Sistema separação (adsorção, partição, etc)

• Comprimento (10-25 cm)

– cromatografia rápida

3 cm

• Diâmetro interno*

• Tipo de suporte (sílica gel ou polímeros)

• Grupos quimicamente ligados (amino, ciano, C8, C18, sulfonato)

• Tamanho da partícula (3-20 m)

• Tamanho do poro (60-300 Å)

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2.2. BBoombmbaass // FaseFase MóvMóvelel

• Velocidade fluxo

BBoombmbaass // FaseFase MóvMóvelel • Velocidade fluxo – 0,1-3,0 mL/mim para colunas analíticas – > 5,0

– 0,1-3,0 mL/mim para colunas analíticas

– > 5,0 mL/min para colunas preparativas

• Pressão operação

– 500-2000 psi para colunas analíticas

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ElEluiuiçãoção IsocrátiIsocráticaca // GGradiradiententee

IsocrátiIsocráticaca // GGradiradiententee • ISOCRÁTICA = a composição da fase móvel não muda

• ISOCRÁTICA = a composição da fase móvel não muda durante a corrida.

• GRADIENTE = a composição da fase móvel varia de acordo com a polaridade dos analitos. Bomba binária/quaternária.

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EEluluiçãoição

GraGradiediennttee

Versão do FarmaBio EEluluiçãoição GraGradiediennttee Passo Solvente A Solvente B Tempo 1 30 %

Passo

Solvente A

Solvente B

Tempo

1

30

%

70

%

3

min

2

50

%

50%

2

min

3

50

%

50

%

3

min

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Versão do FarmaBio

InjeçInjeçãoão dada AAmmostostrraa

• INJETOR MANUAL

InjeçInjeçãoão dada AAmmostostrraa • INJETOR MANUAL Da bomba Amostra da seringa Para coluna Descarte Loop
Da bomba Amostra da seringa Para coluna Descarte Loop
Da
bomba
Amostra
da seringa
Para
coluna
Descarte
Loop
Da bomba Para coluna
Da
bomba
Para
coluna

L o o p Loop

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Versão do FarmaBio

InjeçInjeçãoão dada AAmmostostrraa

• AUTOSAMPLER

InjeçInjeçãoão dada AAmmostostrraa • AUTOSAMPLER Corpo da Seringa Válvula de injeção Disponível em

Corpo

da

Seringa

Válvula de injeção

• AUTOSAMPLER Corpo da Seringa Válvula de injeção Disponível em www.farmabio.k6.com.br Solvente Amostragem

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Solvente Amostragem da Seringa Vials na bandeja Frasco de lavagem
Solvente
Amostragem
da Seringa
Vials na bandeja
Frasco de lavagem

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DDeetetectoctorreess

• Equipamento com uma pequena célula de fluxo conectado na saída da coluna e que monitora a concentração dos analitos.

• Detectores mais comuns:

– UV/Vis (absorvância)

– Fluorescência

– Índice de Refração

– Outros: Eletroquímico, Condutividade, Infravermelho, etc.

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DeDetectecttoresores UV/VUV/Visis ee RRedeede dede DDiodosiodos ((DADDAD))

• PRINCÍPIO: quando vários grupos funcionais são expostos à radiação, sofrem excitação eletrônica a qual resulta na absorção de energia em comprimentos de onda específicos para os grupos.

• Comprimento onda: 210-380 nm

UV

• Comprimento onda: 380-800 nm

Visível

90% compostos orgânicos absorvem luz em algum lugar da região UV-Vis

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DDeetetectoctorreess

• SENSIBILIDADE

– Fluorescência: 1.000 vezes mais sensível que UV-Vis

– UV-Vis: 1.000 vezes mais sensível que IR

• ESPECIFICIDADE

– Aumenta com a sensibilidade

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TraTrattaamemenntoto ddosos DaDadodoss

• Integradores

• Software / Computador

TraTrattaamemenntoto ddosos DaDadodoss • Integradores • Software / Computador Disponível em www.farmabio.k6.com.br

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Analgésicos Comprimidos

Versão do FarmaBio Analgésicos Comprimidos Coluna: Pecosphere 3x3 C18 (3-µm, 33 x 4.6 mm i.d.) Fase

Coluna:

Pecosphere 3x3 C18 (3-µm, 33 x 4.6 mm i.d.)

Fase Móvel:

15% ACN em HAc a 0.1%

Fluxo:

2 mL/min

Detecção:

UV a 240 nm

Identificação Picos

1.Acetaminofeno

2. Cafeína

3. Salicilamida

4. Ácido Acetilsalicílico

1
1

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LC Application Note LCPH-1.

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Teofilina

Coluna:

Pecosphere 3x3 C18 (3-µm, 33 x 4.6 mm i.d.)

Fase Móvel:

11% ACN em água

Fluxo:

3 mL/min

Detecção:

UV a 273 nm

Identificação Picos:

1. Teobromina

2. Teofilina

3. -OH-etilteofillina

4. Cafeína

Teobromina 2. Teofilina 3. -OH-etilteofillina 4. Cafeína Disponível em www.farmabio.k6.com.br LC Application Note
Teobromina 2. Teofilina 3. -OH-etilteofillina 4. Cafeína Disponível em www.farmabio.k6.com.br LC Application Note
Teobromina 2. Teofilina 3. -OH-etilteofillina 4. Cafeína Disponível em www.farmabio.k6.com.br LC Application Note

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LC Application Note LCCL-7.

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Prednisona Comprimidos

Coluna:

Pecosphere 3 C18

i.d.)

(3-µm, 83 x 4.6 mm

Fase Móvel:

50% metanol em

água

Fluxo:

2.0 mL/min

Detecção:

UV a 254 nm

Identificação Picos

1. Acetanilida

2. Prednisona

a 254 nm Identificação Picos 1. Acetanilida 2. Prednisona 2.5 mg Standards Deltasone Tablet Application Note

2.5 mg Standards Deltasone Tablet

Acetanilida 2. Prednisona 2.5 mg Standards Deltasone Tablet Application Note LCPH- Disponível em www.farmabio.k6.com.br
Acetanilida 2. Prednisona 2.5 mg Standards Deltasone Tablet Application Note LCPH- Disponível em www.farmabio.k6.com.br
Acetanilida 2. Prednisona 2.5 mg Standards Deltasone Tablet Application Note LCPH- Disponível em www.farmabio.k6.com.br

Application Note LCPH-

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