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Les années 80
Cet adolescent turbulent vit des idylles avec des
partenaires différents: RFLP, fingerprinting, RAPD, PCR,
séquence mitochondriales puis nucléaires,
microsatellites, SNP, expression de gènes…: chaque
développement technique est l’occasion d’un flirt parfois
durable. Les méthodes d’analyse se raffinent.
L’histoire de l’écologie moléculaire
vue par John C. Avise (2006)
Sortie de l’adolescence:
1992: naisance du journal Molecular Ecology, et
publication de plusieurs ouvrages dédiés à la
discipline.
Le 21ème siècle:
La pleine maturité ? Ere génomique
Définition :
Marqueur moléculaire = fragment d'ADN (information génétique)
ou sa représentation moléculaire (ARN, protéines)
Une autre qualité de cette diversité est son caractère discret : les
formes alléliques d'un marqueurs moléculaires ont une distribution
discrète et finie par opposition aux traits phénotypiques
AA Aa aa
Enzymes de type
dimérique
AA Aa aa
IAM
i+n i i+n
Inconvénients :
- extraction enzymatique souvent fastidieuse et nécessitant quelque fois
la destruction totale de l'individu (lorsque petits organismes);
- patrons de bandes parfois complexes (estérases par ex.) ;
- existence d'allèles nuls (voir aussi les microsatellites);
- neutralité non assurée ;
- et surtout un polymorphisme quelquefois très très faible (ex. : espèces
autofécondantes) cf distribution à l’équilibre des fréquences alléliques
(S. Wright) lorsque faible taux de mutation
- IAM : ne peut pas simplement accéder à l’info phylogénétique;
- pas d'ordonnancement possible des allèles (au contraire des
microsatellites
Un exemple frappant de déviation de la neutralité
pour un marqueur enzymatique classiquement
utilisé en génétique des populations…
Exemple de pressions sélectives agissant sur l’expression
enzymatique : l’adaptation thermale chez Alvinella pompejana
Piccino, P., Viard, F., Sarradin, P.-M., Le Bris, N., Le Guen, D. & Jollivet, D. 2004 Thermal selection of PGM
allozymes in newly founded populations of the thermotolerant vent polychaete Alvinella pompejana. Proceedings of
the Royal Society of London B 271, 2351-2359.
La phosphoglucomutase PGM-1 : enzyme clé dans le
métabolisme énergétique
- 2 allèles équifréquent Pgm-1 (100) et Pgm-1 (90)
- 2 allèles rares (78) et (112)
Piccino, P., Viard, F., Sarradin, P.-M., Le Bris, N., Le Guen, D. & Jollivet, D. 2004 Thermal selection of PGM
allozymes in newly founded populations of the thermotolerant vent polychaete Alvinella pompejana. Proceedings of
the Royal Society of London B 271, 2351-2359.
90
100
0 mn 60 mn 90 mn 0 mn 60 mn 90 mn
100 µg 200 µg
4,00E-09
90/90
Initial velocity (mol/L/s/ug of proteins)
3,50E-09
3,00E-09 100/100
2,50E-09
2,00E-09
1,50E-09
1,00E-09
5,00E-10
0,00E+00
0 20 40 60 80
Temperature (°C)
Allele Pgm-1 (90) : mieux adapté aux fortes températures, i.e. dans
les diffuseurs
Allele Pgm-1 (100) plus fréquent dans les fumeurs noirs et blancs
Piccino, P., Viard, F., Sarradin, P.-M., Le Bris, N., Le Guen, D. & Jollivet, D. 2004 Thermal selection of PGM
allozymes in newly founded populations of the thermotolerant vent polychaete Alvinella pompejana. Proceedings of
the Royal Society of London B 271, 2351-2359.
Piccino, P., Viard, F., Sarradin, P.-M.,
Le Bris, N., Le Guen, D. & Jollivet, D.
2004 Thermal selection of PGM
allozymes in newly founded
populations of the thermotolerant vent
polychaete Alvinella pompejana.
Proceedings of the Royal Society of
London B 271, 2351-2359.
Piccino, P., Viard, F., Sarradin, P.-M., Le Bris, N., Le
Guen, D. & Jollivet, D. 2004 Thermal selection of PGM
allozymes in newly founded populations of the
thermotolerant vent polychaete Alvinella pompejana.
Proceedings of the Royal Society of London B 271,
2351-2359.
Accès direct à l’information du génome
Allozymes = protéines exprimées = phénotype
D’autres marqueurs donnent directement accès à l’information
génétique : c’est plus proche de ce qu’on souhaite…
Le « roi » des marqueurs : la séquence d’ADN. Contient toute
l’information.
Mais coûteux, fastidieux et pas toujours nécessaire
Microsatellites
RAPD
Randomly Amplified Polymorphic DNAs
ADN polymorphes amplifiés aléatoirement
RFLP
Restriction Fragment Length Polymorphism
Polymorphisme de longueur d’un fragment de restriction
AFLP
Amplified Fragment Lenght Polymorphism
Polymorphisme de longueur de fragments amplifiés
Plus…
♦Température d'annealing amorce/matrice (dépend de
la température de fusion ou Tm = T°C à laquelle 50%
de l'ADN est double brin).
Domaines d'application
Tests de diagnostic en génétique médicale, criminologie, contrôle de filiation, élaboration de cartes génétiques,
contrôle sanitaire, industrie agro-alimentaire…et biologie évolutive (génétique des populations, phylogénie, analyse de
parternité…)
Limites
Le coût élevé de la Taq polymérase, les inévitables contaminations… !!!
Les marqueurs microsatellites
AGTGTCAGTAGCTAG…….CACACACACACACACA……...CGTGATACATGCA
Séquence flanquante 8 répétitions Séquence flanquante
Nombre Longueur
de répétitions du fragment
14 112
12 106
11 103
9 97
6 88
3 pb
Il s'agit donc d'un polymorphisme aisément identifiable, une fois que les
locus microsatellites ont été identifiés et les amorces définies…
(acquisition d'une banque de données microsat., GenBank ou clonage)
Exemple d'un locus
microsatellite révélé sur gel de
polyacrylamide
Exemple de 3 locus
microsatellites amplifiés en
multiplex et visualisé par
électrophorèse capillaire
1 2 3 4 1 2 3 4
Initiation
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
4 4
1 2 3 1 2 3
Dissociation
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
3
1 2 3 4
1 2 4
Re-hybridation :
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Mauvais appariement 1 2 4 5 6 7 8 9 10
3
3
1 2 4 5 6 7 8 9 10 11
Le nouveau brin 1 2 3 4 5 6 7 8 9
possède une longueur
différente du brin
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 4 5 6 7 8 9 10
initial
3
0.2
0.18
0.16
0.14
0.12
Fréquence
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
Région 2
Région 1
Barrière à la dispersion
Temps de divergence
Géographie
HS
FST = 1 −
HT
SMM
i-1 i-1 i-1 i-1 i+1 i+1 i+1 i+1
IAM
i+n i i+n
0.30
0.25
0.00
100 102 104 106 108 110 112 114 116 118 120
Intérêt : un état allélique conserve Allèles (pb)
la « mémoire » de son état
antérieur
Milieu des années 90 : développement foudroyant de tous un panel
de nouvelles statistiques incorporant l'information contenue dans
les différences de tailles alléliques, statistiques fondées sur un SMM
strict (Slatkin 1995, Goldstein et al. 1995) ou des modèles dérivés
acceptant de rares mutations de plus grandes amplitudes (ex. TPM,
Di Rienzo et al. 1994)
S − Sw SW et S barre étant
RST = proportionnels à la
S variance intra-
populationnelle et à la
RST = fraction de la variance totale des variance totale
tailles alléliques entre populations
Δμ 2
= (μ a − μ B ) 2 μA et μB sont les moyennes
des tailles alléliques
observées dans les
populations A et B
Barrière à la dispersion
Temps de divergence
Géographie
1
27
10
25
9 Arbre de populations fondés,
2
6
8
non plus sur les fréquences
3
7 alléliques, mais sur les
12
4
5
différences dans les longueurs
18
28 de tailles alléliques entre
26
16
17
populations
11
14
13
29
31
19
15
32
22
23
20
21
24
30
0.1
MAIS
La dynamique d'évolution des microsatellites apparaît maintenant
beaucoup plus complexe qu'un simple SMM :
(1) La naissance d’un microsatellite dans une région où des variants de séquences
répétitives simples d’ADN sont présents en nombre important (régions de "cryptic
simplicity").
(2) L’augmentation progressive d’un même type de motif qui, au-delà d’un certain
nombre de répétitions, verra son taux de mutation augmenter et s’accroîtra en
longueur, le taux d’erreur de la polymérase étant alors accru.
(3) L’importance des pressions évolutives que sont la mutation, la dérive génétique, la
sélection ou la migration peut alors être estimée par le nombre d’allèles, le spectre des
fréquences alléliques illustrant alors le portrait d’un locus microsatellite "mature".
Mutations "expansives"
Longueur Critique
Longueur du microsatellite
Polymorphisme de longueur de fragment de restriction (RFLP)
"Restriction fragments length polymorphism"
Principe :
Le principe de base de cette méthode consiste :
(1) extraction de l'ADN;
(2) digestion de l'ADN au moyen d'enzymes de restriction (endonucléases);
(3) séparation (selon la taille) et visualisation des fragments ainsi obtenus par électrophorèse;
(4) transfert et hybridation des fragments séparés avec des sondes marquées (southern blot).
On aboutit ainsi à des profils de restriction caractéristiques, variant selon la position et/ou le
nombre des bandes marquées. Cette technique permet de dresser la carte des sites de
restriction et de localiser les mutations (cf figure) à l'origine du polymorphisme de restriction.
Individu 1 Individu 2 Fragment inséré
Site perdu
Région
reconnue
par la sonde
Site de
coupure
d’enzyme de
restriction
+
Individu 1 Individu 2
1 2
Site de
coupure
d’enzyme de
restriction
+
Individu 1 Individu 2
1 2
-
Enzyme avec un site
interne monomorphe et
un site externe
polymorphe
+
Le polymorphisme RFLP est donc lu comme un polymorphisme de
longueur de fragments d'ADN ou de présence de sites.
La technique de PCR-RFLP présentent des avantages par rapport à la
technique de RFLP simple : possibilité de détecter hétérozygotes et
homozygotes (codominance) et d'étudier des organisme pour lesquels
la quantité de matériel biologique est faible, + manips moins
contraignantes.
Limites
Des fragments de tailles identiques peuvent être générés par des sites
de restriction différents. Patrons de bandes parfois très complexes à
analyser. La variation de ces fragments de restriction est souvent
insuffisante au niveau populationnel (deux états uniquement par site
de restriction). La grande quantité d'ADN requise, le coût et la
difficulté d'emploi de sondes marquées, limitent l'utilisation de cette
technique en biologie des populations. L'amplification (PCR)
préalable du fragment à analyser permet toutefois de s'affranchir de
l'étape d'hybridation.
PRINCIPE
La PCR-RFLP
M +
Taille des
fragments
_
Appliquée avec huit couples
(région ; enzyme)
: site de restriction
: enzyme
: indel
APPLICATIONS
Exemple de tableau
des haplotypes
Amplifié
(1)
(2)
Non amplifié
(1) (2)
= amorce nucléotidique arbitraire -
+
Les bandes obtenues sont couramment séparées en gel d'agarose
puis visualisées au BET
Avantages :
- nombre élevé de bande
- Stabilité des profils
- qualité des profils
Inconvénients :
- Gourmant en ADN
- Relative difficulté technique
année
Utilisations :
- études de génétique des pop
- cartographie
- diversité génétique (clone ou pas, mode de reproduction plutôt clonale…)
- recherche de marqueurs liés à un gène (résistance à un herbicide…)
Table 1 Usefulness of AFLP for some typical research questions in molecular ecology compared with some
common alternative methods (5 excellent, 1 poor). The scoring is an attempt to judge both the quality and
quantity of data that can be generated within a standard research program on a wild nonmodel organism for
which no genetic markers are yet available
Parentage analyses 3 2 5 1 3
QTLs 4 1 4 2 3
Phylogenetic reconstructions 4 1 3 3 3
(shallow)
Fragment à
séquencer amorce
- RM13
La réaction va se dérouler
de façon cyclique et va
comporter les mêmes
phases que la PCR. A la
différence près que les
désoxynucléotides sont
remplacés, en partie, par
Sens de lecture
Sens de migration
des didésoxynucléotides
(ddNTP ou "nucléotides
stops"). L'incorporation,
au hasard, de ces ddNTP
va provoquer l'arrêt de
l'élongation du brin
néoformé. D'un point de
vue technique, il s'agit de
réaliser 4 mélanges
réactionnels, chacun avec
l'un de ces 4 ddNTP.
Ainsi, par exemple, en
présence du ddATP, on va
obtenir des fragments de
différentes tailles
+ correspondants au
différentes positions des
"A" dans la séquence.
1er fragment : C
2ème CA
3ème CAT
4ème CATT
etc…
LES SEQUENCES D'ADN :
Avantages :
- Accès direct à la totalité de l'information génétique, ce qui en fait
le marqueur actuel le plus précis quant à la reconnaissance de
l'identité par descendance d'allèles (même allèle ancêtre)
- Accès à un grand nombre de sites informatifs
X25 Cycles
La couleur du pic
indique la base au
point de polymorphisme
Le TILLING en écologie moléculaire
(Targeting Induced Local Lesions in Genomes)
Criblage du polymorphisme
Le TILLING en écologie moléculaire
Targeting Induced Local Lesions in Genomes),
Un grand
nombre de
gènes d’une
espèce
(parfois, tous).
Connus ou
anonymes.
Deux utilisations:
1. Hybridation peu stringente 2. Hybridation très stringente
avec ADNc marqué à la avec ADNg marqué à la
fluorescence fluorescence
--> intensité fluorescente = --> intensité fluorescente =
quantité ADNc = quantité affinité homologues =
ARNm similarité de séquence :
repérage SNP