UNIVERSITATEA "DUNĂREA DE JOS" GALAŢI

FACULTATEA DE ŞTIINŢE ŞI MEDIU

MASTER MONITORIZAREA ŞI MANAGEMENTUL MEDIULUI

Senzori şi biosenzori pentru determinarea

dopaminei

Vasilache Cornelia

2020
 Cuprins

I. Senzori. Clasificarea și caracterizarea senzorilor

II. Biosenzori. Clasificarea și caracterizarea biosenzorilor. Alcătuirea unui
biosensor
III. Dezvoltarea cronologica a biosenzorilor
IV. Importanţa determinarii dopaminei
V. Metode de determinare
VI. Biosenzorul bazat pe celule sau țesuturi
Bibliografie
 I. Senzori. Clasificarea și caracterizarea senzorilor

Senzorii sunt dispositive care sesizează variația unui parametru din sistem prin emiterea
de semnal corespunzător, corelat cu mărimea (intensitatea) parametrului respectiv. Se mai
numesc traductoare si cele care au o construcție mai complex (care include și alte elemente
auxiliare).
Senzorii (traductoarele) au rolul de a transforma anumiți parametri ai sistemului în
mărimi de altă natură. Parametrul de transformat formează semnalul de intrare al traductorului,
iar cel transformat semnal de ieșire.
După principiul de funcționare senzorii se împart în:
 senzori electrochimici
 senzori optici
 biosenzori
 alte tipuri de senzori
Principalele caracteristici primare ale senzorilor (traductoarelor) sunt următoarele:

 funcția de transfer – reprezintă expresia relației dintre semnalul de intrare și semnalul de

ieșire al senzorului.
 sensibilitatea (limita de detecție) – este reprezentată de concentrația cea mai scăzută în
specia urmărită, care conduce la apariția unui semnal care poate fi distins de semnalul
obținut prin măsurători paralele în probele martor.
 selectivitatea (specificitatea) – se referă la efectul interferențelor cauzate de ioni sau
molecule, altele decât specia urmărită.
 stabilitatea – se referă la modificarea performanțelor traductoarelor în timp din cauza
unor diverși factori.
 timpul de răspuns – reprezintă decalajul în timp dintre variația semnalului de intrare și
variația corespunzaătoare semnalului de ieșire a traductorului respective.
 gradul de participare al senzorului – această caracteristică trebuie să fie redusă datorită
eliminării perturbațiilor cauzate de prezența senzorului în system.
 siguranța în exploatare – presupune asigurarea unui grad de fiabilitate a sistemului de
măsură, care este garantat de producător pentru o anumită durată de funcționare a
traductorului și este de dorit să fie cât mai mare.
 economicitate
 II. Biosenzori. Clasificarea și caracterizarea biosenzorilor. Alcătuirea unui
biosensor

Sunt senzori care au o interfață de natură biologic sau biochimică, care este foarte
selectivă la prezența în mediul de analizat a unui compus specific, ce poate fi determinat prin
detecția semnalului obținut prin interacțiunea dintre acest compus și biointerfața respectivă. La
rândul lor, biosenzorii se pot clasifica dupa mai multe criterii.
Biosenzorii sunt detectori ce se bazează pe molecule selective ce intră în componența
plantelor și animalelor.
Un biosenzor poate fi definit ca un dispozitiv, de obicei electronic, care folosește
moleculele de interes biologic pentru a detecta molecule specifice. Biosenzorul constă dintr-un
element biologic imobilizat pe un senzor fizico-chimic clasic care transforma informația chimică
într-un semnal care poate fi electric, optic, termic, etc.
Clasificarea biosenzorilor se poate realiza după mai multe criterii:
 după tipul traductorului folosit în prelucrarea informațiilor preluate de la elementul
biologic:
 biosenzori realizați pe baza senzorilor electrochimici (potențiometrici,
amperometrici, conductometrici)
 biosenzori realizați pe baza unor senzori termici
 biosenzori optici
 biosenzori piezoelectrici
 biosenzori manometrici

 dupa tipul elementului (substratului) biologic:

 Biosenzori de afinitate - analitul nu se modifică chimic în timpul măsurătorii. El

doar se leagă de receptor. La sfârşit el poate fi îndepărtat chimic sau prin spălare
 Biosenzori de metabolism - aici substratul biologic se consumă printr-o reacţie
chimică cu analitul. Se formează un nou produs. Starea iniţială se poate reface după completa
consumare a analitului
 Imunosenzori - detectarea substanţelor de tip antigen (Ag) se face cu ajutorul
anticorpilor (Ac), pe principiul "lacăt-cheie". Anticorpii sunt proteine cu molecule în formă de Y
(numite imunoglobuline). În vârfurile Y-ului sunt doar două locuri, unde se poate leaga un singur
tip de antigen. Aceşti anticorpi sunt produşi de organism ca răspuns la o anumită substanţă
străină (antigen), pe care nu o poate elimina prin fagocitoză şi căreia, în ultimă instanţă, îi
"încurcă planurile", legându-se de ea: Ac+Ag → AcAg
  Senzori biomimetici - cu ajutorul acestor senzori se detectează semnale fizice
(sunet, stres mecanic, lumină) pe baza interacţiunii lor cu substratul biologic activ (receptorul)

 după analiții sau reacțiile pe care le monitorizează:

a. monitorizarea directă
b. monitorizarea indirectă
Un biosenzor adecvat ar trebui să posede cel putin următoarele caracteristici:
 biocatalizatorul trebuie să fie înalt specific pentru scopul analizei
 să fie stabil în condiții de depozitare normale
 răspunsul lui trebuie să fie exact, precis, reproductibil și liniar pe domeniul analitic
 să nu aiba efecte antigenice sau toxice
 trebuie să fie ieftin, mic, portabil și capabil de a fi utilizat chiar de operatori mai puțin
dotați
Alcătuirea unui biosenzor
Indiferent de complexitatea lui un biosenzor este alcătuit din trei părți principale:
I. Elementul biologic sensibil (material biologic - țesut, microorganism, celule, enzime,
anticorpi, acizi nucleici sau material obținut prin intermediul științelor inginerești)
II. Traductorul sau detectorul (optic, pizoelectric, electrochimic) care transformă semnalul
rezultat din interacțiunea analitului cu elementul biologic într-o mărime fizică ușor de măsurat și
cuantificat
III. Sistemul de măsurare si prelucrare a semnalelor senzoriale, astfel ca rezultatele obținute
să poată fi exprimate într-un mod simplu și cunoscut

III. Dezvoltarea cronologica a biosenzorilor

♦ In 1950 Leland C. Clark Jr., a inventat un electrod pentru masurarea oxigenului dizolvat
in sange. In 1962 Clark extinde folosirea acestui "electrod de masurare a oxigenului" la
determinarea nivelului de glocoza in sange. Prin depunerea pe senzorul pentru oxigen a unui strat
subtire de gel ce contine enzima numita glucooxidaza, urmat de o membrana semipermeabila de
dializa ce permite glucozei sa difuzeze in senzor, dar impiedica enzima sa difuzeze.
♦ In 1969, G.Guilbault a inventat un sistem de masura a ureei in fluidele fiziologice, pe
baza detectiei potentiometrice.
♦ In deceniile ce au urmat, peste 100 de enzime au fost folosite, drept biocatalizatori
selectivi in realizarea de biosenzori. Cercetatorii in domeniu au realizat ca nu numai enzimele
singulare se pot folosi, ci si tesuturi ce care sunt sensibile la prezenta unor aminoacizi sau alte
biomolecule.
♦ Un an major pentru dezvoltarea biosenzorilor a fost anul 1975, cînd tehnologia acestora
a cunoscut o nouă revoluţie. Aceasta s-a datorat folosirii bacteriilor pe post de bioreceptori în aşa
numiţii electrozi microbieni (folosiţi iniţial pentru măsurarea alcolului). Acest moment a marcat
şi începutul folosirii biosenzorilor în controlul mediului înconjurător.
♦ In 1976 Clemens a încorporat un biosenzor de glucoză într-un panceas artificial.
♦ In 1990 Gold şi Ellington au fost primii care au folosit fragmente de acizi nucleici pe
post de bioreceptori.
♦ Isao Kurube si Shuichi Suzuki au masurat consumul biochimic de oxigenului, ce
reprezinta un indicator al prezentei substantelor organice biodegradabile in apa. Biosenzorul,
bazat pe o drojdie, poate realiza determinari a indicatorului mentionat in 30 minute fata de 5 zile
in care se obtin rezultatele prin metode conventionale.

IV. Importanţa determinarii dopaminei

Dopamina face parte din grupa unor importante substanţe numite catecolamine sau
hormoni medulosuprarenalieni. Este un intermediar important în biosinteza adrenalinei şi a
noradrenalinei, principalele secreţii ale acestor hormoni. Principalul efect fiziologic al
catecolaminelor este cel asupra sistemului circulator. În acelaşi timp sunt efectori ai stării
nervoase şi au rol important în transmiterea fluxului nervos simpatic.

Rolul biochimic al catecolaminelor constă în implicaţiile lor în circuitul hidromineral.

Reglarea secreţiilor hormonale se face cu ajutorul influxurilor nervoase transmise cu ajutorul
neurotran-smiţătorilor. Secreţia de hormoni medulosuprarenali este provocată de excitarea căilor
nervoase transmise cu ajutorul dopaminei, noradrenalinei şi serotoninei.

Totodată, s-a demonstrat faptul că dopamina este un factor de inhibiţie al prolactinei,

care este hormonal lactogen sau lactotrop ce acţionează asupra secreţiei glandei mamare prin
mărirea atât a cantităţii de ţesut glandular, cât şi a producţiei de lapte.

Cu ajutorul tehnicii de histofluorescenţă s-a putut alcătui o “hartă” a conexiunilor

dopaminei. Dopamine este unul dintre cei mai interesanţi neurotransmiţători pentru că este
implicată în câteva funcţii interesante cum este mobilitatea, atenţia şi capacitatea de învăţare.

Degenerarea neuronilor dopaminergici ce conectează substanţă cenuşie în circuitul

nervos cu nucleul căutat provoacă boala Parkinson, caracterizată prin tremurul şi rigiditatea
extremităţilor, lipsa de echilibru şi dificultate în iniţierea mişcărilor. Dopamina este implicată ca
şi substanţă neurotransmiţătoare în schizofrenie, o dereglare mentală serioasă, caracterizata prin
halucinaţii, deziluzii şi întreruperea procesului normal logic, de gândire.

Prin descompunerea dopaminei se obţine melanina, care este pigmentul pielii. Scăderea
cantităţii de dopamină poate avea loc prin inhibiţia unor enzime ca tirozinhidroxilaza, DOPA-
decarboxilaza prin dereglarea acumulării de dopamină şi acid homovanilic, metabolitul principal
al dopaminei în organismul uman. Obţinerea efectului scontat în tratamentele ce folosesc
medicamente ce provoacă stări antidepresive se bazează pe buna funcţionare a sistemului
dopaminergic.

Totodată, datorită implicării în sistemul circulator, dopamina se foloseşte în tratarea

afecţiunulor cardiace şi în cazurile de edem pulmonar.

Având în vedere importanţa sa clinică şi biochimică, în literature de specialitate sunt

prezentate o serie de procedee de determinare a acesteia.

V. Metode de determinare
Una din metodele de determinare a dopaminei a fost cea folosind tehnica perfuziei “push-
pull“ care constă din două tuburi concentrice prin care lichidul fiziologic este în acelaşi timp
infuzat (push) şi scos (pull). Sensibilitatea ridicată a tehnicii cromatografiei de lichide cu detecţi
electrochimică, face ca această tehnică cuplată cu tehnica “push-pull“ să devină ideală pentru
aceste analize. Astfel, compusul de analizat din sistemul nervos este scos şi analizat prin orice
metodă folosită pentru cantităţi mici de probă. Tot datorită prezenţei în cantităţi mici a
dopaminei în sistemul nervos s-au folosit markeri radioactivi.
Această metodă seamănă cu cea amintită înainte, doar că lichidul de perfuzie trece prin
membrana de dializă. Moleculele mici prezente în mediul extern pot difuza prin membrană şi
îndepărtate din sistemul nervos.
Experimentele “in vivo“ necesită folosirea unor aparate foarte sensibile şi în acelaşi timp
de dimensiuni mici. Electrozii voltametrici îndeplinesc aceste condiţii şi cu timpul au devenit din
ce în ce mai specializaţi. Pentru a îndeplini cerinţele de mărime, cercetătorii au adoptat tehnica
folosirii unui electrod cu fibră de carbon. Fibra de carbon se închide într-o capilară de sticlă şi i
se lasă un vârf ascuţit la exterior. Aria sensibilă a acestui vârf are o rază minimă de 5 μm şi
maxima de 35 μm. Pentru a se creşte selectivitate pentru catecolamine, se fixează pe suprafaţa
elctrodului o membrană perfluorinată schimbătoare de ioni ( Nafion).
Folosirea membranelor schimbătoare de ioni este o tehnică des adoptată de cercetători,
simplicitatea metodei fiind un avantaj valoros. Polimerii folosiţi ca membrane sunt diferiţi, având
fiecare avantajele şi dezavantajele lor, dar toţi îşi pastrează caracteristica de bază, adică lasă să
treacă dopamina care este protonată la pH fiziologic, celelalte substanţe fiind excluse. Pentru a se
putea creşte timpul de rezoluţie al acestei tehnici, s-au dezvoltat câteva tehnici electrohimice
rapide.
O astfel de tehnică este cronoamperometria, tehnică în care se aplică un potenţial asupra
unui electrod, suficient pentru electroliza speciei care ne interesează.
Voltameria ciclică şi îmbunătăţirile aduse acestei metode sunt o tehnică folosită în mod
current pentru determinarea dopaminei. Se fac comparaţii între metodele de amperometrie la
potenţial constant şi voltametria ciclică de scanare rapidă ca tehnici de monitorizare “in vivo“.
Determinările de dopamină se realizează şi enzimatic prin intermediul unor preparate
enzimatice obţinute prin extracţia enzimelor din diferite ţesuturi ale plantelor. Folosind un sistem
de injecţie în flux se poate determina dopamine cu soluţia de enzimă folosită ca purtător. Pentru
acest sistem s-a determinat că soluţia de enzimă obţinută din frunze de spanac este mai adecvată
decât cea obţinută din pulpă de banană.
Acest sistem de injecţie în flux poate fi combinat cu folosirea de microelectrozi ca şi
detectori amperometrici.
Ca mediator redox se foloseşte tetratiofulvalena tetracianochinodimetanul (TTF-TC) care
se amestecă cu clorură de polivinil (PVC) în raport de 13:1 şi se suspendă într-o soluţie de
tetrahidrofuran (THF).
Concluziile acestor determinări sunt acelea că, datorită unei cinetici de o rapiditate
rezonabilă, dopamină prezintă o sensibilitate mai mare decât acidul ascorbic şi hidrochinonă, la
diferenţe relativ mici în fracţiunile ariei active a suprafeţei investigate, astfel încât sensibilitatea
de detecţie a dopaminei este mai mare.
“ In vivo “, determinările sunt mult mai dificile decât “ in vitro “. De aceea determinările
de acest tip trebuie să fie mult perfecţionate.
Voltametria cu electrozi suficient de mici pentru a putea fi introduşi într-o celulă, asigură
un mijloc de monitorizare cantitativă a substanţelor uşor oxidabile, atunci când concentraţia lor
se schimbă în citoplasma celulei. Această metodă se bazează pe o diferenţă de potenţial între
electrodul voltametric şi electrodul de referinţă, ce duce la reacţia de oxidare, result intensitate
mâsurabil în picoamperi.
Electroforeza capilară este o metodă de înaltă eficienţă, ce foloseşte volume foarte mici
( picolitri), pentru separarea moleculelor ionice, metoda ce se bazează pe mobilitatea
electroforetică. Cu ajutorul electroforezei capilare s-a determinat pentru prima dată cantitatea
relativă de neurotransmiţător liber, respective vascularizat, din corpul cellular al unei cellule
nervoase singulare din Planorbis corneus.
 Sensibilitatea şi selectivitatea unei tehnici depinde de cele mai multe ori de natura
electrozilor. S-a demonstrat că , electrozii modificaţi chimic prezinţă o mai mare stabilitate şi
selectivitate în determinările bioanalitice.
Un exemplu de astfel de electrod chimic modificat, este electrodul din pasta de cărbune
modificat cu stearat ( SMes). Modificările de bază aduse de acest nou tip de electrod sunt acelea
ca prezintă pe SMEs aresturilor carboxilice neprotonate la pH fiziologic întârzie electrooxidarea
speciilor anionice, că ascorbatul şi DOPAC, astfel încât speciile cationice de dopamină pot fi
determinate în prezenţa lor. Cu toate avantajele metodei amperometrice, cercetătorii au găsit o
altă metodă mai eficientă combinând detecţia electrochimică cu tehnica cromatografiei de
lichide.
S-a descries o metodă de microcromatografie de lichide cu detecţie electrochimică
folosind un nou tip de electrod. Acest tip de electrod se obţine , în principiu, prin comprimarea şi
încălzirea a două bucăţi de polimer umplute cu cărbune pe un fir metallic introdus în două
capilare din silice care se alipesc. Obiectul obţinut seamănă mai mult sau mai puţin cu un cip
folosit în electronică şi de aceea a fost denumit electrodul “Chip”. Firul se scoate când cipul este
cald. Cele două capilare silicioase conduc fluxul lichidului cromatografic de-a lungul
electrodului, parte a cipului. Volumul celulei de analiză este determinat de dimensiunile firului şi
a capilarelor silicioase folosite. Această metodă s-a folosit pentru determinarea catecolaminelor
din urină şi dintr-un amestec preparat.
O metodă foarte recentă şi spectaculoasă în acelaşi timp, presupune folosirea unor lentile
termice pentru determinarea spectrometrică (TLS) a catecolaminelor după oxidarea acestora la
aminocromi. În această derminarea se foloseşte o tehnică laser foarte sensibilă. Substanţele cu un
spectru larg de absorbţie molară la o lungime de undă a pompei de radiaţie pot fi determinate
prin TLS; substanţele cu o absorbanţă mică pot fi determinate, deasemenea, prin această metodă,
chiar la o concentraţie foarte mică. TLS permite determinarea dopaminei la nivelul de
concentraţie găsit în probele fiziologice cu o sensibilitate şi reproductibilitate satisfăcătoare. La
concentraţii foarte mici, oxidarea dă soluţii stabile de aminocromi. Stabilitatea ridicată permite
ca oxidarea să poată avea loc la valori mari de pH, având loc cu o viteză foarte mare.
Sensibilitatea asemănătoare obţinută pentru toate catecolaminele constituie un avantaj
dacă se compară cu majoritatea metodelor fluorimetrice. Caracteristicile analitice indică faptul că
detecţia TLS poate constitui o alternativă valoroasă în determinarea catecolaminelro folosind
HPLC ( high performance liquid chromatography).
Determinarea dopaminei din urina umană prin HPLC constă din trei etape: prepurificarea
catecolaminelor, separarea catecolaminelor prin cromatografia perechilor de ioni sau prin schimb
de ioni şi detecţia prin metoda electrochimică sau fluorimetrică. Aceste procese pot fi
automatizate şi rezultatele obţinute asigură utilizarea cu rezultate bune a acestei metode pentru
determinările directe ale catecolaminelor din urină.
 Construcţia, caracterizarea şi aplicaţiile electrozilor modificaţi chimic posedând suprafeţe
funcţionalizate specifice, reprezintă un nou domeniu de cercetare electrochimică, care în
principiu poate deschide o serie de posibilităând suprafeţe funcţionalizate specifice, reprezintă un
nou domeniu de cercetare electrochimică, care în principiu poate deschide o serie de posibilităţi
analitice unice în domeniul electrochimiei.
Recent, pretatarea electrochimică a electrozilor de grafit realizată prin ciclizarea
potenţialului între valori anodice şi catodice extreme a permis daterminarea selectivă “ in vivo”
a doapminei şi acidului ascorbic.
În majoritatea cazurilor, în literature de specialitate sunt prezentate numeroase exemple
de ECM. În majoritatea cazurilor electrozii chimic modificaţi au fost proiectaţi pentru a mima la
nivel heterogen sistemele redox observate în soluţii (medii omogene). În mod obişnuit, gruparea
modificatoare selectată şi legată pe suprafaţa electroduuli este o moleculă electrolizabilă
reversibilă, capabilă să medieze un process de oxidare sau reducere care în condiţii normale are
loc la valori mari de potenţial datorită vitezei mici de transfer a electronilor între compuşii de
analizat şi electrodul nemodificat.

VI. Biosenzorul bazat pe celule sau țesuturi

Măsurarea speciilor moleculare în acest caz nu se rezumă la interactia cu compușii de

analizat, transformările ce au loc pot fi măsurate că produși rezultați. Este de droit să se opereze
cu populații de celule a căror cai metabolice principale să fie cunoascute. Un relevat exemplu
este oferit de biosenzorul L-arginina, care asociază populații de celule bacteriene de
Streptococcus faecium în combinație cu un electrod pentru amoniac.
Asemănător cu utilizarea populațiilor celulare ca elemente sensitive se pot folosi
fragmente sau parți de țesuturi, vegetale sau animale. În acest caz, avantajul este mai mare,
deoarece nu se fac eforturi suplimentare pentru menținerea celulelor viabile, într-un aranjament
natural. Pentru biosenzorul de adenozină a fost propus un element biosenzitiv tisular, obținut din
mocoasa intestinului subțire de la un șoarece. Pentru biosenzorul de dopamină, specialiștii s-au
orientat la pulpa fructului de banană, având în vedere că acesta are proprietăți biocatalitice
remarcabile.
Țesutul din banană (la fel ca și țesuturile din măr, castravete și ciupercă) conțin
polifenolaza. Aceasta catalizează oxidarea moleculelor, care conțin grupuri catecol, în o-chinonă.
Biosenzorul pentru măsurarea dopaminei este bazat pe un țesut din banană. Enzima
polifenol oxidază din țesutul din banană catalizează oxidarea formei dihidroxid a dopaminei în
forma chinonă utilizând oxigenul din mediul ambiant. Reacția de reducere a chinonei înapoi în
forma dihidroxid conduce la apariția unui curent, care este proporțional cu concentrația de
dopamină.
 Biosenzorul conține un electrod de pastă de carbon. La acest electrod se realizează un
amestec de pulbere de grafit cu ulei de parafină (Nujol) și se formează o pastă densă. În plus, la
acest biosenzor, țesutul din banană este amestecat cu această pastă. Această pastă este, apoi,
introdusă în suportul în care se află electrodul.
Avantaje:
 Enzimele sunt menținute în mediul lor natural.
 Activitatea enzimei este stabilizată.
 Uneori pot funcționa acolo unde enzimele purificate nu pot funcționa.
 Sunt mai ieftine decât cele care utilizează enzime purificate.
Dezavantaj:
 Poate avea loc un proces de interferență, care conduce la reducerea sensibilității.
 Bibliografie

 L. Kekedy, Senzori elecrochimici metalici şi ionselectivi, Ed. Academiei, Bucureşti,

1987.
 Kyoungseon M., Young Je Y, Amperometric detection of dopamine based on
tyrosinaseSWNTs-Ppy composite electrode, Talanta 2009 80, 1007-1011.
 Maciejewska J., Pisarek K., Bartosiewicz I., Krysinski P., Jackowska K.., Biegunski A.
T., Selective detection of dopamine on poly (indole-5carboxylic acid)/ tyrosinase
electrode, ElectrochimicaActa 2011, 56, 3700-3706.
 B. Eggins, Biosensors. An Introduction, Ed. Willey Teubner, 1996.
 X. Zhang, H. JU, and J. Wang, Electrochemical Sensors, Biosensors and Their
Biomedical Applications, Ed. Elsevier, 2008.
 Wightman R., Amatorh C., Engstrom R., Hale P., Kristensen E., Kubr W., May L.
Neuroscience, 1988, 25:513–523.
 Bard A., Faulkner L., Electrochemical methods, Ed. Wiley, New York, 1980.
 Murray R., Electroanalytical chemistry, Ed. Marcel Dekker, New York, 1984, 13:191–
368.