Revizuire
Aspecte tehnice ale PCR
competitiv cantitativ
BioTechniques 21: 268-279 (august 1996)
Klaus Zimmermann și Josef
W. Mannhalter
Immuno AG
Viena, Austria
INTRODUCERE
Reacția în lanț a polimerazei (PCR),
descrisă mai întâi de Saiki și colab. (79),
este o metodologie foarte sensibilă și
specifică pentru detectarea acizilor
nucleici și un instrument util pentru
cuantificarea cantității de acizi nucleici
specifici prezenți într-o probă. Cea mai
simplă abordare a cuantificării
produselor PCR și transcriere a
versurilor PCR (RT-PCR) (revizuite de
referințele 17, 21, 31 și 32) este
măsurarea cantității de produs de
amplificare în faza exponențială prin
referire la diluare. seria unui standard
extern. Cu toate acestea, cuantificarea
exactă cu acest tip de PCR este
împiedicată de o serie de variabilități
care pot apărea în timpul pregătirii
eșantionului sau în cursul reacției, iar
variațiile minore în condițiile reacției
sunt mult mărite în timpul procesului de
amplificare.b-globina (20) amplificată
în același tub de reacție.
Alternativ, diluarea limitativă
utilizând o metodologie de primer
imbricat (57,90) poate fi utilizată în
combinație cu statisticile Pois-son
pentru evaluarea rezultatelor.
Cuantificarea cea mai precisă a
ADN-ului și ARN-ului poate fi, totuși,
obținută prin PCR competitive și RT-
PCR concurențiale (revizuite în
Referință).
mitocondrial (100) sau a expresiei
ARNm (29,69) și evaluarea deficiențelor
ereditare (de exemplu, Referința 43) sau
leucemiilor (22,93 ). virusul herpes
simplex (74) sau virusul
imunodeficienței hu-man tip 1 (HIV-1)
16–18, 21, 31, 32 și 84). Această analiză (3,5,36,51,62,70,71,81,88,92) și
se bazează pe co-amplificarea cuantificarea bacteriilor, în special a
competitivă a unei secvențe țintă creșterii lente specii precum my-
specifice împreună cu concentrații
cunoscute ale unui standard intern într-
cobacteria (55). Mai mult, utilitatea PCR
competitivă sau RT-PCR a fost
un tub de reacție. Standardul intern demonstrată în cuantificarea ADN-ului
trebuie să împartă site-urile de mitocondrial (100) sau expresiei mARN
recunoaștere a grundului cu șablonul (29,69) și evaluarea deficiențelor
specific, atât șablonul specific, cât și ereditare (de exemplu, Referința 43) sau
standardul intern trebuie să fie PCR-am- leucemiilor (22,93 ).
plified cu aceeași eficiență și trebuie să Având în vedere sutele de lucrări
fie posibil să se analizeze produsele publicate despre utilizarea PCR
amplificate PCR ale șabloanelor competitive, nu este surprinzător faptul
specifice și interne. standard separat. că există o mare varietate de protocoale.
Atunci titrarea se realizează prin În prezentul articol, vom revizui această
compararea semnalului PCR al metodologie, concentrându-ne în special
șablonului specific cu semnalele PCR pe aspectele tehnice ale PCR
obținute cu concentrațiile cunoscute ale competitive, cum ar fi construirea unor
concurentului (standardul intern). De teme competitive.
când a fost descrisă prima dată această
metodă (6,38,99), ea a fost utilizată pe
scară largă pentru cuantificarea ARN-
ului celular și a ADN-ului, precum și a
acizilor nucleici vi-rali și bacterieni.
Examenele raportate includ cuantificarea
expresiei citokinelor (6,38,52,91,
99,103) și a acizilor nucleici virali
precum hepatita B (46), hepatita C
(9,40,53, 58,75, 78.106),
citomegalovirus uman (35), virusul
herpes simplex (74) sau virusul
imunodeficienței hu-man tip 1 (HIV-1)
(3,5,36,51,62,70,71,81,88,92) și
cuantificarea bacteriilor, în special a
speciilor cu creștere lentă, cum ar fi my-
cobacteria (55). Mai mult, utilizarea
PCR competitivă sau RT-PCR a fost
demonstrată în cuantificarea ADN-ului
mitocondrial (100) sau expresiei ARNm
(29,69) și evaluarea deficiențelor
ereditare (de exemplu, Referința 43) sau
leucemiilor (22,93 ). virusul herpes
simplex (74) sau virusul
imunodeficienței hu-man tip 1 (HIV-1)
(3,5,36,51,62,70,71,81,88,92) și
cuantificarea bacteriilor, în special a
creșterii lente specii precum my-
cobacteria (55). Mai mult, utilitatea PCR
competitivă sau RT-PCR a fost
demonstrată în cuantificarea ADN-ului
 alege primii potriviți este de a utiliza, pot fi utilizate diverse strategii pentru
pe cât posibil, grunduri deja utilizate construcția standardelor interne.
pe scară largă și / sau bine descrise. Standardele interne pentru PCR
Dacă trebuie concepute noi primeruri, competitiv sau RT-PCR sunt fragmente
programele de calculator în de ADN sau ARN care împărtășesc
combinație cu bazele de date secvențele de recunoaștere a primerului
plăci, diferite strategii PCR și moduri secvențiale pot fi instrumente utile. cu ținta specifică, dar care produc
de detectare a produselor PCR. Conceptele generale ale semnalării produse PCR care se disting de pe
primerului PCR au fost revizuite de plăcuța tematică de tip sălbatic. Cel mai
Dieffen-bach și colab. (26). Deoarece simplu mod de a face distincția între
CONSTRUCȚIA diferite perechi de primer pentru aceeași șablonul de tip sălbatic și standardul
STANDARDELOR INTERNE genă pot prezenta diferențe de până la intern este prin diferențe în mărimea
PENTRU PCR COMPETITIV 1000 de ori în sensibilitate (44), ar trebui celor două produse. Acest lucru poate fi
pus un accent special pe testarea realizat, de exemplu, prin construirea de
Generarea și testarea standardelor specificității și eficienței perechilor de standarde care au aceeași secvență ca
interne adecvate și alegerea perechilor primer în avans, înainte de generarea ținta specifică, dar care conțin o deleție
de grund se numără printre cele mai standardelor inter-interne. Odată sau o inserție. Cea mai simplă procedură
cruciale și consumatoare de timp ale selectată perechea de grunduri adecvată, de construcție este utilizarea unui
stabilirii unui protocol PCR compozit
competitiv. Cel mai simplu mod de a
268 BioTehnici Vol. 21, nr. 2 (1996)
standardele care conțin astfel de situri de restricție sunt digerate cu enzima de
restricție respectivă. Deoarece produsele digerate au dimensiuni mai mici, ele pot
fi ușor distinse de șablonul de tip sălbatic și pot fi analizate separat.
primerul care conține două secvențe tar- Schimbul de nucleotide în șabloane specifice este un alt mod de a construi
get specifice la o distanță predeterminată standarde interne competitive (54,75, 78,106). După PCR competitivă, fragmentul de
una de cealaltă (rezultând astfel o tip sălbatic și standardele in-ternale competitive care conțin schimburi de nucleotide
ștergere) și un al doilea primer specific pot fi identificate în urma hibridizării diferențiale cu sonde specifice pentru tipul
pentru firul opus (14,33,48, 61,77). sălbatic și competitor
Amplificarea șabloanelor de tip sălbatic
cu astfel de primeri are ca rezultat un
produs PCR care este mai scurt decât
șablonul de tip sălbatic și poate fi astfel
ușor identificat (de exemplu, după
separarea electroforetică sau HPLC).
Alternativ, standardele interne alungite
pot fi construite folosind o metodă
„oligo în buclă” prin amplificarea ADNc
cu un primer care conține o inserție nu-
cleotidică neșantionată între secvențele
șablon (80).
Atunci când ștergerile sau inserțiile
în centrul standardului intern sunt
dezirate, se poate utiliza o extensie PCR
de suprapunere de îmbinare
(39,72,82,92). În primul rând, două părți
ale unei gene sau gene diferite sunt
amplificate în PCR separate. Deoarece
primerul din aval al primului șablon și
primerul din amonte al celui de-al doilea
șablon sunt proiectate să conțină
secvențe complementare, cele două părți
ale genei sau diferitele gene pot fi legate
împreună amplificând ulterior cele două
produse PCR diferite în un tub de
reacție. În abordări similare, standardele
interne pot fi, de asemenea, construite
prin amplificarea PCR a unui amestec de
produse PCR religioase (1,37). În cele
din urmă, dacă secvența șablonului
specific conține unul sau două site-uri de
restricție interne, aceste site-uri pot fi
utilizate pentru a obține o construcție cu
o inserție sau o ștergere
(3,11,70,72,104).
Diferențele dintre tipul sălbatic și
standard pot fi obținute și prin
încorporarea siturilor de restricție
(2,6,35,38, 59,68,88). După PCR,

secvențe.
O abordare practic diferită de
construcția competitivității
intern
standardele este de a utiliza un distanțier
nespecific
gena sau ADN-ul distanțier. Aceste
competiții
torii au secvențe de nucleotide în
totalitate
diferit de tipul sălbatic, cu excepția
secvențe de amorsare de tip sălbatic
atașate la
lor 5¢se termină. Astfel de abordări au
fost utilizat pentru cuantificarea cito-
crom P450 utilizând glutationul
transferază m gena ca distanțier se-
pentru un standard intern (96) sau
pentru cuantificarea glicerinaldehidei
3-
fosfat dehidrogenază cu un
standard ternal bazat pe v-erb B
oncogen (85). Separator nespecific se-
se folosesc frecvent și referințe
construi standarde de concurență
multiplă
conținând site-uri de amorsare pentru
diverse
gene de interes. Un astfel de
multicompetitor
standardele pot fi construite prin
legând împreună mai multe site-uri de
grund
Vol. 21, nr. 2 (1996)
și apoi atașându-le la un distanțier
de aici (4,7,52,86,99).
În cele din urmă, generație de competitiv
standarde prin amplificarea multiplelor
Fragmente de ADN din material celular
într-un PCR cu recurență redusă
sunt descrise condiții
(34,94). Această procedură are ca rezultat o
varietatea produselor PCR de dimensiuni diferite,
dintre care cel mai potrivit este purificat
și utilizat ca standard intern într-o cantitate
test concurențial PCR competitiv.
Modelele de concurență sunt
structurat într-unul din modurile descrise
de mai sus sunt încărcate de obicei pe un gel, separat
evaluat, excizat și extras. Ei pot
apoi să fie utilizate direct într-un competitiv
Test PCR (14,48,85), dar mai des,
sunt clonate în plasmide, de preferință
cu ajutorul unor introduceri suplimentare
site-uri de restricție reduse (de exemplu, Referințe
9, 61, 72, 104 și 110).
Clonarea standardelor competitive
în plasmide implică de obicei enzime-
reacții matice precum digestia cu
enzime de restricție specifice, generare
capetelor contondente și ligaturii (de exemplu,
61, 70, 88 și 92). Pe lângă
aceste strategii convenționale, altele
au fost dezvoltate proceduri mai simple
deschis. Dacă o plasmidă care conține
secvența de tip sălbatic să fie disponibilă, aceasta
plasmida poate fi utilizată direct ca
standard ternal după introducerea unui dele-
în secvența de tip sălbatic ca
descris de Zarlenga și colab. (108). Blană-
269
Revizuire
în plus, produsele PCR pot fi concepute
pentru a conține secvențe terminale
identice cu secvențele celor două capete
ale unui vector liniarizat. Acești doi
ADN pot fi co-transfectați pur și simplu
în E coli, ceea ce duce la încorporarea
inserției în vector (49,67). În final,
produsele PCR și plasmul liniarizat pot
fi, de asemenea, ligate împreună într-o
PCR prin extinderea suprapusă a
capetelor complementare (50,83). După
denaturare, re-recoacere heterologă și
ciclizare, se formează o plasmidă
recombinantă care este apoi utilizată
pentru a transforma E. coli competent.
În plus, trebuie să se asigure că
concentrația standardului intern este
determinată cu acuratețe. Se recomandă
astfel nu numai să se cuantifice plasmida
competitivă pentru a fi utilizată ca
standard intern spectrofotometric, ci și
să se verifice cantitatea și calitatea sa
electroforetic. În plus, concentrația
standardelor interne ar trebui verificată
prin PCR în combinație cu diluarea
punctului final, luând în considerare
distribuția Poisson a probelor pozitive
(61).
ANALIZA AMPLIFICĂRII
COMPARABILE A PLĂCILOR
DE TIP SĂLBATIC ȘI A
STANDARDULUI INTERN
O condiție prealabilă pentru
performanța adecvată a PCR competitiv
cantitativ este o eficiență comparabilă de
amplificare a standardelor interne
competitive și a șabloanelor de tip
sălbatic și este deosebit de important să
controlați cu atenție acest lucru atunci
când stabiliți o nouă procedură de
cuantificare bazată pe PCR. Cel mai
simplu mod de control este de a cantifica
în mod repetat mai multe cantități
cunoscute de șablon specific de tip
sălbatic, cu ajutorul standardului intern
nou construit. Dacă aceste analize au ca
rezultat numărul copiilor calculate, se
pot presupune eficiențe de amplificare
comparabile între șablonul standard și
tipul sălbatic, iar standardul intern nou
construit poate fi utilizat în siguranță
pentru cuantificare. Dacă rezultatele
unor astfel de experimente de
cuantificare indică diferențe minore în
eficiența amplificării între tipul sălbatic
și standard, acest lucru poate fi
compensat prin utilizarea unui factor de
corecție (60). O altă procedură frecvent
utilizată pentru determinarea am-
eficiența de plificare este o analiză a
cantităților cunoscute de șablon de tip
sălbatic și a standardului intern
competitiv într-un protocol PCR care
utilizează primerii etichetați
fluorescent sau radioactiv. După
diferite numere de cicluri, produsele
PCR sunt separate și cuantificate prin
măsurarea radioactivității sau
fluorescenței acestora (19,81).
Atunci când se controlează eficiența
amplificării șabloanelor standard de tip
sălbatic și intern, este de asemenea
important să rețineți că posibilele
diferențe pot deveni mai pronunțate
atunci când reacția de amplificare este
condusă la faza post-exponențială
(platou) (6,60 ). Pentru a asigura o
cantitate adecvată, sa sugerat, prin
urmare, că eficiența de amplificare a
produselor PCR standard de tip sălbatic
și intern să fie măsurată în timpul
fazelor exponențiale, post-exponențiale
și de platou (10,19). În general, se poate
concluziona că diferențele în secvențe de
tip sălbatic și standard, precum și
diferențele mici de mărime nu afectează
substanțial eficiența amplificării. Cu
toate acestea, întrucât a fost respectată o
relație exponențială inversă între
dimensiunea șablonului și eficiența
amplificării (60),
O altă problemă care trebuie
abordată se referă la posibila formare
a het-eroduplexelor, care poate apărea
atunci când plăcile tematice standard
de tip sălbatic și intern diferă doar
într-una sau câteva baze (fie mici
diferențe de mărime, fie mici
diversități în nucleotidele cote)
(6,60,70). Deoarece heterodu-plexurile
ar interfera cu procedurile de
cuantificare ulterioare, ar trebui să se
acorde mare atenție pentru a evita
formarea lor (2,24,42).
Toate considerațiile menționate mai
sus sunt la fel de importante pentru
construcția și analiza standardelor
interne care vor fi utilizate pentru
cuantificarea ADN-ului prin PCR
competitivă sau a ARN-ului prin RT-
PCR competitivă. Cu toate acestea,
pentru construirea standardelor de ARN,
trebuie luate măsuri de precauție
suplimentare. Pentru sinteza ARN-ului
intern competitiv, constructele ADN
competitive sunt plasate în vectori
plasmidici sub controlul unui promotor
ARN polimerază (de exemplu, T7, SP6
sau T3).
După liniarizarea vectorului, se transcriu
cantități mari de ARN (61,70). ARN-ul
este apoi purificat prin digestie DNase I,
extracție și precipitare. Ulterior, calitatea
și numărul de copii ale standardului
ARN competitiv (comparativ cu
numărul de copii ale ADN-ului rezidual
contaminant) ar trebui determinate atât
spectrofotometric, cât și prin
electroforeză pe gel (61). Mai mulți
cercetători au descris o scurtătură
interesantă către această metodologie
comună pentru sintetizarea ARN-ului
standard competitiv intern. Ei au folosit
un primer compozit pentru a construi un
ADNc concurent recombinant care
poartă secvența de recunoaștere a ARN
polimerazei T7 la 5¢final (39,77,96).
După amplificare cu acest primer
compozit și un al doilea primer specific,
produsul PCR rezultat este utilizat în
mod direct pentru transcrierea prin ARN
polimerază T7.
PCR ȘI RT-PCR
Extracția acizilor nucleici
Pentru a asigura performanța corectă
a testului PCR cantitativ, metodele
utilizate pentru prepararea acizilor
nucleici care trebuie cuantificați trebuie
alese cu grijă și, dacă este necesar,
optimizate. Acest lucru este esențial mai
ales pentru pregătirea ARN-ului.
Pregătirea ADN, pe de altă parte, poate
urma proceduri mai simple. În ceea ce
privește cuantificarea ADN-ului, s-a
demonstrat că lizatele celulare brute pot
fi utilizate cu aceeași reproductibilitate
ca ADN-ul purificat (88,110). Mai mult,
utilizarea lizatelor de celule brute
implică mai puțină muncă și evită
pierderea eșantionului specific, care
poate apărea în timpul purificării ADN-
ului. Dacă, dintr-un motiv sau altul,
utilizarea ADN-ului purificat pentru
cuantificare pare preferabilă, pierderea
eșantionului specific sau degradarea
ADN-ului ar trebui controlată, de
exemplu, prin cuantificarea unei gene de
control într-o a doua PCR competitivă,
așa cum este descris de Deng și colab.
(25).
Înainte de cuantificarea ARN-ului,
este esențial important să se optimizeze
procedurile de ex-tracțiune a ARN-ului
și să se efectueze un control atent al
calității ARN-ului extras. ADN-ul
genomic poate fi fie eliminat prin
digestie cu DNază I, fie, mai elegant, pot
fi proiectați primerii RT-PCR care
acoperă unul sau mai mulți introni (38). Cel mai simplu mijloc de
270 BioTechniques Vol. 21, nr. 2 (1996)
Revizuire
controlul calității ARN este atât o
densitate optică măsurată, cât și un gel
de ARN denaturat capabil să detecteze
degradarea ARN posibilă. S-a sugerat că
eficiența extracției poate fi estimată prin
efectuarea unei a doua extracții și
determinarea pierderii medii de ARN
(61). Pentru a asigura o extracție
comparabilă într-o serie de probe, genele
de menaj sunt de obicei cuantificate în
plus, iar numărul de copii ale genei de
interes este calculat cu respectarea
numărului de copii ale genei de menaj
(7,86) . Cu toate acestea, nu se poate lua
de la sine înțeles că așa-numitele gene
de menaj vor menține un nivel constant
de exprimare în toate circumstanțele.
Expresia genelor menajere este adesea
crescută, în special în celulele activate.
Adăugarea de molecule de ARN
competitor înainte de extracție este, de
asemenea, un mijloc simplu de control
al eficienței extracției. La detectarea
ARN-ului
se dorește viruși, acest lucru putând fi
efectuat cel mai bine prin utilizarea mu-
tantelor virale ca concurenți, cu condiția
ca acești mutanți să difere de tipul
sălbatic din secțiunea genomului
amplificat de cei doi primeri (66). Pentru
a realiza o cuantificare semnificativă,
mai multe concentrații cunoscute ale
ARN-ului intern competitiv trebuie
adăugate separat la aceeași concentrație
de ARN de tip sălbatic în flacoane
diferite (70), urmată de transcrierea
versurilor și amplificarea PCR. Înainte
de cuantificarea ARN-ului folosind
amplificația pe bază de secvență a
acidului nucleic (NASBAÔ) a fost
sugerată metodologia, adăugarea a două
sau mai multe concentrații cunoscute de
standarde ARN competitive de
dimensiuni diferite la același flacon
(97).
Transcriere inversă
După ce ați selectat cea mai
adecvată metodă de preparare a ARN-
ului, trebuie acordată o atenție
deosebită optimizării
RT de ARN. De obicei, enzimele de la
virusul leucemiei murinice Moloney
(MMLV) sau virusul mieloblastozei
aviare (AMV) sunt utilizate pentru RT,
dar procesul RT-PCR poate fi
simplificat prin utilizarea Tth ADN
polimerază care posedă atât RT cât și
activitate polimerazică (64). Unii autori
au raportat că Tth a avut o reactivitate
RT mai mică decât RT de la MMLV și,
prin urmare, s-ar putea să nu fie cea mai
potrivită enzimă pentru detectarea
numărului mic de copii (23). Cu toate
acestea, dacă condițiile pentru Tth sunt
foarte atent optimizate, pot fi detectate și
numere reduse de copii cu această
enzimă (105).
Pentru a controla etapa RT,
eșantionul trebuie întotdeauna transcris
invers în prezența unor cantități variabile
de ARN standard intern competitiv
urmat de amplificarea PCR. În literatura
științifică, există mai multe protocoale în
care ARN-ul este mai întâi transcris
invers, iar ADNc rezultat este apoi
cuantificat cu concurență
Revizuire
șabloane de ADN itive (de exemplu,
Referința 4). Cu toate acestea, acest
lucru nu ia în considerare variabilitatea
etapei RT și, prin urmare, o astfel de
procedură nu este adecvată atunci când
se dorește cuantificarea exactă. Mai
mult, eficiența amplificării între
șabloanele de ADN cu o singură sau
dublă strană poate varia (13).
Amplificare
Enzime polimerază, cum ar fi Taq
ADN polimeraza folosită pe scară largă
sau enzime alternative, cum ar fi Dyna-
ZymeÔ(Finnzymes Oy, Espoo, Fin-land)
și Tth funcționează de obicei foarte bine
în tampoanele furnizate împreună cu
enzima atunci când sunt utilizate
conform instrucțiunilor producătorilor.
După cum a fost revizuit de Erlich și
colab. (28), concentrarea enzimei,
primerilor și nu-cleotidelor, numărul de
cicluri și de-naturare, de recoacere și de
extindere afectează specificitatea și
sensibilitatea PCR. Din moment ce
MgCl2concentrările și temperatura de
recoacere influențează în special
specificitatea reacției, ar trebui să se
acorde o atenție deosebită optimizării
acestor parametri. Începerea reacției la o
temperatură ridicată („pornire la cald”)
poate îmbunătăți performanța PCR prin
eliminarea evenimentelor nedorite de
hibridizare (65).
Majoritatea protocoalelor PCR
cantitative descrise sugerează utilizarea
a 30-50 cicluri PCR, care în majoritatea
cazurilor conduc PCR dincolo de faza
exponențială. Din când în când, apar
publicații (27,78,101) care recomandă
restrângerea analizei concurențiale
cantitative la faza exponențială a
acumulării produsului. Această fază
exponențială ar trebui să fie determinată
cu atenție și ar putea diferi nu numai
datorită naturii șablonului specific care
urmează să fie cuantificat, ci și în ceea
ce privește echipamentul utilizat; prin
urmare, ar complica foarte mult
cuantificarea acizilor nucleici pe bază de
PCR și, prin urmare, ar fi un dezavantaj
major în aplicarea de rutină a acestei
tehnici. Cu toate acestea, studii recente
au abordat această problemă (10,19,63,
Considerații generale pentru
performanța optimă a PCR cantitativ
competitiv sau RT-PCR
În teorie, o singură concentrație de
standard intern competitiv co-amplificat
cu șablonul specific poate fi suficientă
pentru cuantificare, mai ales dacă
raportul standard intern / șablon specific
este comparat cu o curbă de calibrare
obținută prin compararea cantităților
constante de standard intern cu sev
-concentrații generale cunoscute de
șablon de tip sălbatic (46.107). Cu toate
acestea, din moment ce s-a demonstrat
că măsurătorile cantitative ale
produselor amplificate cu PCR sunt cele
mai exacte atunci când raporturile
șabloanelor standard de tip sălbatic și
competitiv sunt egale sau similare
(3,73), performanța protocoalelor PCR
cantitative utilizând co- este preferată
amplificarea unei concentrații a plăcii
tem tematice cu mai multe diluții ale
standardului intern.
O concentrație de plăci tem tematice
este, de asemenea, comparată cu o
singură concentrație de standard atunci
când ADN-ul este cuantificat prin
efectuarea PCR în condiții de stringență
redusă (12). Cu această metodă, nu este
necesar să construim un standard intern
competitiv și să-l adăugăm la tubul de
amplificare. Standardul este generat în
schimb din materialul celular co-
amplificat în timpul PCR cu stringență
redusă. Cu toate acestea, deoarece
raportul dintre materialul celular și
ADN-ul specific nu poate fi modificat,
această metodă nu permite titrarea cu
concentrații diferite de șablon standard
competitiv și, prin urmare, nu permite
cuantificarea pre-ciză.
Acuratețea RT-PCR cantitativă
competitivă poate fi potențată prin
determinarea simultană a unei gene de
interes și a unei gene raportoare într-un
singur tub de reacție (PCR multiplex)
(2,24,27,30). Expresia genei titrate de
interes este apoi calculată cu referire la
nivelul titrat al genei raportoare.
Utilizarea șabloanelor competitive cu
mai multe standarde interne organizate
în tandem poate fi preferabilă pentru o
astfel de abordare (62,76,98), deoarece
acest lucru poate reduce posibilele erori
care ar putea apărea atunci când trebuie
amestecate șabloane specifice cu mai
multe standarde diferite. pregătit. Cu
toate acestea, deoarece amplificările
respective într-un PCR multiplex
competitiv nu ar trebui să interfereze
reciproc și toate șabloanele și perechile
de grund utilizate trebuie amplificate cu
o eficiență similară, nu mai mult de
câteva sisteme diferite de grund-șablon
pot fi incluse într-o singură analiză.
Un alt parametru important care
trebuie luat în considerare atunci când se
efectuează analize PCR cantitative se
referă la limita de detecție pentru plăci
tematice ADN specifice. Cu o singură
rundă de amplificare, această limită de
detecție a fost reportată la 10 exemplare
pe tub de PCR (70). Cu toate acestea,
pot apărea probleme atunci când un
număr mic de copii specifice trebuie
detectate într-un fundal înalt de ADN
celular nespecific. Pentru a depăși
această problemă și a crește
sensibilitatea și specificitatea testului
PCR cantitativ competitiv, cuibărit
(11,41,42,106) sau hemi-cuibărit (62,95,
110) Protocoalele PCR au fost
dezvoltate și utilizate cu succes pentru
cantitarea șabloanelor de ADN și
ARN.
De asemenea, este important să nu
supraestimăm acuratețea PCR
cantitativă cantitativă. Cu teste bine
stabilite de acest tip efectuate de
oameni de știință experimentați,
abateri standard între 10% și 20%
(2,9,24,71,104,
110) au fost raportate pentru analiza
porțiunilor replicate ale aceluiași
eșantion în diferite ocazii. Prin
urmare, pentru discriminarea fiabilă a
diferențelor duble în numărul de copii
între două eșantioane, este de preferat
să se calculeze o medie a replicării
determinărilor aceluiași eșantion.
DETECTAREA ȘI ANALIZA
PRODUSELOR PCR
Pentru detectarea și analiza
produselor amplificate, sunt disponibile
o mare varietate de procedee (revizuite
în Referința 47). În general, trebuie avut
în vedere faptul că metoda de detectare
aleasă ar trebui, ori de câte ori este
posibil, să evite manipulări
suplimentare, care nu numai că necesită
mai mult timp, dar cresc și posibilitatea
de cuantificare inexactă.
Produsele PCR de diferite dimensiuni
sunt de obicei separate prin electroforeză
convențională pe gel (de exemplu,
referințele 61,70, 110), electroforeză pe
gel capilar (30,87) sau HPLC (24). Cea
mai ușoară și cea mai frecvent utilizată
metodă este utilizarea electroforezei pe
gel pentru separarea produselor PCR și
274 BioTehnici
benzi de bromură de etidiu sau un
colorant fluorescent echivalent
(2,7,39,61, 70,77,86,110). Materialele
gel care trebuie utilizate sunt fie agaroze
special concepute pentru separarea
fragmentelor mici de ADN, fie geluri de
poliacrilamidă. Pentru cuantificarea
benzilor ADN respective, poate fi
utilizat un sistem de analiză a imaginii
video. Gelurile pot fi scanate direct pe
transiluminator (61,70) sau scanate după
fotografie (2,15,77,84,89). Procedând
astfel, rețineți că cantitatea de colorant
încorporat și emisia fluorescentă
rezultată depind de lungimea acizilor
nucleici. Deoarece determinarea
punctului de echivalență a celor două
fragmente diferite se bazează pe cantități
molare, trebuie utilizat un factor de
corecție care ia în considerare
fluorescența diversă emisă de fragmente
de dimensiuni diferite (de exemplu,
Referința 70) pentru a asigura
cuantificarea corectă.
vizualizarea ADN-ului
concentrațiile standard concurențiale
cunoscute sunt apoi utilizate pentru a
genera un diagram care poate fi utilizat
pentru a cuantifica cu precizie cantitatea
de tematică de tip sălbatic. Numărul de
copii de șabloane specifice din eșantion
este de obicei calculat prin determinarea
punctului de echivalență a competiției
într-un grafic de regresie, așa cum este
descris de Piatak și colab. (70). Pe scurt,
jurnalul10 raportul intensității
semnalului standardului competitiv
intern asupra fragmentului de tip
sălbatic, de obicei înmulțit cu un factor
de corecție, este reprezentat în funcție de
log10a concentrației șablonului standard
intern competitiv. Aceasta produce un
grafic liniar, iar interpolare pe grafic
pentru o valoare Y de 0 dă numărul de
copii prezente în eșantionul de testare.
O procedură mai sensibilă decât
colorarea cu bromură de etidiu, care
este, de asemenea, utilizată frecvent
pentru cuantificarea produselor PCR
competitive, se bazează pe
Vol. 21, nr. 2 (1996)
utilizarea de dNTP-uri marcate
radioactiv sau fluorescente
(27,36,38,48,
104) sau oligonucleotide (3,99). După
separarea electroforetică, benzile
marcate radioactiv pot fi excizate din
geluri și cpm numărate (36,81,
99). Cu toate acestea, uscarea gelurilor
și autoradiografia directă și scanarea
(27) sau imaginea radio a gelurilor
uscate (3,48,
109) este mai simplu și, deoarece
aceasta implică mai puțină manipulare,
posibil și mai precisă. Un dezavantaj al
etichetării directe este că vizualizează și
toate benzile nespecifice. Pentru a evita
acest lucru, produsele PCR sunt separate
electroforetic, transferate la o membrană
și cantitate după hibridizare cu sonde de
ADN marcate radioactiv (92) sau non-
radioactiv. Alternativ, produsele PCR
compatibile pot fi hy-bridizate cu o
oligonucleotidă marcată înainte de
separare (hibridizare lichidă) și
autoradiografiate după elec-troforeză pe
gel (66,88).
Revizuire
Produsele PCR generate prin
utilizarea primerilor marcați fluorescent
pot fi separați pe geluri de
poliacrilamidă și cuantificați elegant
folosind un secvențiator de ADN
fluorescent cu laser automat (19,62,72).
Această fluorescență (LIF) indusă de
laser este o metodologie extrem de
sensibilă și, în combinație cu software-ul
computerului, oferă un mijloc de
automatizare a analizei post-PCR. LIF
poate fi, de asemenea, aplicat pentru
cuantificarea produselor PCR
concomitente după electroforeză
capilară (30,87).
În cele din urmă, HPLC a fost
recent utilizată pentru separarea și
determinarea cantitativă a produselor
competitive PCR (24).
Pentru a realiza o cantitate mai
automată, au fost raportate metode
care implică captarea produselor PCR
pe suporturi solide (de exemplu,
microplăci sau margele magnetice),
urmate de cuantificarea materialului
capturat. Cea mai frecvent utilizată
procedură implică amplificarea
standardelor interne
Eficiența țării specifice și a standardului
intern rămân egale pe parcursul
întregului proces PCR. Prin urmare,
PCR competitiv nu trebuie oprit în
timpul fazei exponențiale de amplificare,
care este unul dintre cele mai mari
avantaje ale acestei metodologii.
Majoritatea protocoalelor descrise
pentru cuantificarea precisă a unui
șablon specific necesită mai multe
reacții de amplificare pe probă și în
prezent se fac tentative pentru
simplificarea cuantificării prin
introducerea mai multor plăci temetice
competitive de dimensiuni diferite în
același tub de reacție. O altă modalitate
de a simplifica și accelera PCR
competitiv implică detectarea simultană
a mai multor șabloane specifice
specifice dintr-un eșantion, utilizând un
protocol PCR multiplex.
Un mare potențial pentru PCR
competitiv constă, evident, în analiza
automată a produselor PCR separate.
Pentru aplicații de cercetare,
dard și șablon specific în prezența
primerilor biotinilați urmată de captarea
produselor PCR pe microplăci acoperite
cu streptavidină (46,56,91). Alternativ,
5¢produsele PCR aminate pot fi
capturate pe godeurile carboxilate de
microplăci (54), sau produsele PCR sunt
capturate de sonde atașate covalent la
plăcile organosilan activate pe suprafață
(8). Produsele PCR captate într-unul din
modurile descrise mai sus sunt
hibridizate cu sonde specifice pentru
secvențe standard de tip sălbatic sau
interne. Aceste sonde conțin, de obicei,
etichete radioactive sau au capacitatea
de a interacționa cu enzimele. Titrarea
Quan se realizează prin măsurarea
conținutului de radioactivitate
încorporată (46) sau a conținutului de
dig-oxigenină (9,54) sau prin detectarea
imuno-enzimatică (56,91,106).
Testele competitive RT-PCR au fost,
de asemenea, dezvoltate pentru un
sistem automat care utilizează
electrochemi-luminiscența (QPCR
System 5000Ô, Perkin-Elmer, Norwalk,
CT, SUA) pentru
metodologiile ușor de realizat (cum ar
fi separarea electrosforetică pe geluri
colorate cu broidă de etidiu și
măsurarea produselor PCR prin analiza
imaginilor video) care nu utilizează
instrumente sofisticate și costisitoare să
fie utilizat pe scară largă. Cu toate
acestea, viitorul acestei proceduri
constă în aplicații clinice și de
diagnostic de rutină.
REFERINȚE
1. Ali, SA și A. Steinkasserer. 1995. PCR-
ligagen-mutageneză PCR: un protocol
pentru
crearea de definiții și mutații.
BioTechniques 18: 746-750.
2. Apostolakos, MJ, WHT Schuermann,
MW Frampton, MJ Utell și JC Wil-ley.
1993. Măsurarea expresiei genelor prin
reacție în lanț polimerază competitivă
multiplexă. Anal. Biochimie. 213: 277-284.
3. Arnold, BL, K. Itakura și JJ Rossi.
1992. Cuantificarea PCR a nivelurilor scăzute
de ADN HIV-1 prin utilizarea unui standard
extern. Genet. Anal. Tehnologie. Aplic. 9:
113-116.
4. Babu, JS, S. Kanangat și BT Rouse.
cuantificarea produselor PCR (45.102).
Unul dintre primerii utilizați pentru
amplificare este biotinilat pentru a
permite captarea produselor PCR de
margele magnetice acoperite cu
streptavidină. Produsele PCR pot fi
cuantificate separat prin hibridizare cu
TBR (tris (2,2¢-bipiridin) ruteniu (II)
chelat) -sondele specifice cu specificații
pentru plăci tem tematice de tip sălbatic
sau competitive, sau, în mod alternativ,
grunduri marcate cu TBR sunt utilizate
pentru cuantificarea directă a produselor
amplificate.
CONCLUZII
Controlul competitiv PCR și RT-
PCR pentru variații tub-tub în eficiența
amplificării prin adăugarea de standarde
interne competitive sunt una dintre cele
mai utilizate abordări pentru
cuantificarea acizilor nucleici. Dacă
șablonul competitiv este ales și construit
în mod corespunzător, amplificarea
1993. Limitări și modificări ale reacției în
lanț cantitative a polimerazei. Aplicarea la
măsurarea mai multor ARNm prezenți în
cantități mici de probă de ARN. J.
Immunol. Metode 165: 207-216.
5. Bagnarelli, P., S. Menzo, A. Valenza, A.
Manzin, M. Giacca, F. Ancarani, G. Sca-
lise, PE Varaldo și M. Clementi. 1992.
Profilul molecular al infecției cu virusul
imunodeficienței umane de tip 1 la
pacienții fără simp și la pacienții cu SIDA.
J. Virol. 66: 7328-7335.
6. Becker-André, M. și K.Hahlbrock.
1989. Cuantificarea absolută a mARN-ului
folosind
 20. Coutlée, F., Y. He, P. Saint-Antoine, C.
Olivier și A. Kessous. 1995. Coamplifica-

reacția în lanț a polimerazei (PCR). O de HIV tip 1 și b- secvențe de ADN ale

abordare nouă printr-un test de titrare a genei globinei într-un test de reacție în lanț
transcrierii asistat de PCR (PATTY). Acizi a polimerazei neizotopice pentru a controla
nucleici Res. 17: 9437-9446. eficiența de amplificare. SIDA Res.
7. Benavides, GR, B. Hubby, WM Grosse, RA Zumzet. Retrovirusuri 11: 363-371.
McGraw și RL Tarleton. 1995. Construcția 21.Cross, NCP 1995. Tehnici și aplicații PCR
și utilizarea unei gene multiconcurențiale cantitative. Fr. J. Haematol. 89: 693-697.
pentru RT-PCR cantitativă folosind seturi de 22. Cross, NCP, L. Feng, A. Chase, J. Bun-gey,
grunduri existente. J. Immunol. Metode 181: TP Hughes și JM Goldman. 1993. Reacție
145-156. în lanț competitivă a polimerazei pentru a
8. Berndt, C., M. Bebenroth, K. Oehlschle-gel, evalua numărul de transcrieri BCR-ABL la
F. Hiepe și N. Schößler. 1995. Reacția în pacienții cu leucemie mieloidă cronică după
lanț a polimerazei Quan-titative utilizând un transplantul de măduvă osoasă. Sângele 82:
test de hibridizare a ADN bazat pe 1929-1936.
microplăci activate la suprafață. Anal. 23.Cusi, MG, M. Valassina și PE Valen-sin.
Biochimie. 225: 252-257. 1994. Comparația activității de transcriptază
9. Besnard, NC și premierul Andre. 1994. inversă M-MLV și a activității polimerazei
Determinarea cantitativă automată a viremiei Tth în RT-PCR a probelor cu sarcină redusă
virusului C hepati-tis prin transcripție inversă- a virusului. BioTechniques 17: 1034-1036.
PCR. J. Clin. Microbiol. 32: 1887-1893. 24.de Kant, E., CF Rochlitz și R. Herr-mann.
10. Bouaboula, M., P. Legoux, B. Pességué, B. 1994. Analiza expresiei genelor printr-o
Delpech, X. Dumont, M. Piechaczyk, P. PCR competitivă și diferențială cu
Casellas și D. Shire. 1992. Standardizarea concurenți antisens. BioTechniques 17:
titrării ARNm utilizând o metodă de reacție 934-942.
în lanț a polimerazei care implică co- 25. Deng, G., M. Yu și HS Smith. 1993. O
amplificare cu un control intern metodă îmbunătățită de PCR competitivă
multispecific. J. Biol. Chem. 267: 21830- pentru cuantificarea numărului de copii
21838. genetice. Acizi nucleici Res. 21: 4848-
11. Ascultă, SM, MHGM 4849.
Koppelman 26. Dieffenbach, CW, TMJ Lowe și GS
MTL Roos, AE Loeliger, P. Reiss, CAB Dveksler. 1993. Concepte generale pentru
Boucher și HG Huisman. 1993. Utilizarea proiectarea primerului PCR. Metode PCR
reacției în lanț a polimerazei competitive Aplic. 3: S30-S37.
pentru a determina nivelurile HIV-1 ca 27. Dostal, DE, KN Rothblum și KM Baker.
răspuns la tratamentele antivirale. SIDA 7 1994. O metodă îmbunătățită pentru
(supl. 2): S15-S20. cuantificarea ab-solut a ARNm utilizând
12. Caballero, OL, LL Villa și AJG Simpson. reacția în lanț a polimerazei multi-plex:
1995. PCR cu stringență scăzută (LS-PCR) determinarea nivelurilor de ARNm de
permite cuantificarea ADN-ului standardizat renină și angiotensinogen în diferite
în întregime. Acizi nucleici Res. 23: 192- țesuturi. Anal. Biochimie. 223: 239-250.
193. 28. Erlich, HA, D. Gelfand și JJ Sninsky.
13. Carding, SR, D. Lu și K. Bottomly. 1991. Progrese recente în reacția în lanț a
1992. Un test de reacție în lanț a polimerazei polimerazei. Știința 252: 1643-1651.
pentru detectarea și cuantificarea expresiei 29. Fandrey, J. și HF Bunn. 1993. Reglarea in vivo
genei citokinelor în număr mic de celule. J. și in vitro a ARN-ului eritropoietinei: măsurare
Immunol. Metode 151: 277-287. prin reacție în lanț competitivă polimerază.
14. Celi, FS, ME Zenilman și AR Shuldi-ner. 1993. Sânge 81: 617-623.
O metodă rapidă și versatilă de sintetizare a 30. Fasco, MJ, CP Treanor, S. Spivack, HL
standardelor interne pentru PCR competitivă. Figge și LS Kaminsky. 1995. Analiza
Acizi nucleici Res. 21: 1047. ADN-ului cu reacție în lanț cantitativă a
15. Chehadeh, HE, G. Zerlauth și JW ARN-polimerazei prin electroforeză
Mannhalter. 1995. Analiza imaginii video a capilară și fluorescență indusă de laser.
produselor PCR cantitative competitive: Anal. Biochimie. 224: 140-147.
compararea diferitelor metode de evaluare. 31. Ferre, F. 1992. PCR cantitativă sau semi-
BioTechniques 18: 26-28. cantitativă: realitate versus mit. PCR
16. Clementi, M., P. Bagnarelli, A. Manzin și S. Metodologie Aplic. 2: 1-9.
Menzo. 1994. Reacția în lanț competitivă a 32. Foley, KP, MW Leonard și JD Engel.
polimerazei și analiza activității virale la 1993. Cuantificarea ARN utilizând reacția
nivel molecular. Genet. Anal. Tehnologie. în lanț a polimerazei. Trends Genet. 9: 380-
Aplic. 11: 1-6. 385.
17. Clementi, M., S. Menzo, P. Bagnarelli, A. 33. Förster, E. 1994. O metodă generală
Manzin, A. Valenza și PE Varaldo. 1993. îmbunătățită pentru a genera standarde interne
PCR cantitativă și RT-PCR în viologie. pentru PCR competitivă. BioTechniques 16:
Metode PCR Aplic. 2: 191-196. 18-20.
18. Clementi, M., S. Menzo, A. Manzin și P. 34. Förster, E. 1994. Generarea rapidă de
Bagnarelli. 1995. Metode moleculare standarde internaționale pentru PCR
cantitative în virologie. Arc. Virol. 140: competitivă prin recoacere a grundului cu
1523-1539. severitate redusă. BioTechniques 16: 1006-
19. Cottrez, F., C. Auriault, A. Capron și H. Groux. 1008.
1994. PCR cantitativă: validarea utilizării unui 35. Fox, JC, PD Griffiths și VC Emery.
control intern multispecific. Acizi nucleici Res. 1992. Cuantificarea ADN-ului citomegalo-
22: 2712-2713. virus uman utilizând reacția în lanț a
polimerazei. J. Gen. Virol. 73: 2405-2408.
36. Furtado, MR, R. Murphy și SM Wo-
Vol. 21, nr. 2 (1996) BioTechniques 277
Revizuire
Linsky. 1993. Cuantificarea virusului im-
munodeficienței umane de tip 1 tat mARN ca
marker pentru evaluarea eficacității terapiei
antiretro-virale. J. Infectează. Dis. 167: 213-
216.
37. Galea, E. și DL Feinstein. 1992. Sinteza
rapidă a construcțiilor de ștergere a ADN-
ului pentru cuantificarea ARNm: analiza
ARNm-urilor astrocitelor. Metode PCR
Aplic. 2: 66-69.
38. Gilliland, G., S. Perrin, K. Blanchard și HF
Bunn. 1990. Analiza ARNm și ADN de
citokine: detectarea și cuantificarea prin reacție
în lanț competitivă a polimerazei. Proc. Natl.
Acad. Știință. SUA 87: 2725-2729.
39. Grassi, G., L. Zentilin, S. Tafuro, S. Divi-
acco, A. Ventura, A. Falaschi și M. Gi-
acca. 1994. O procedură rapidă pentru
cantitarea ARN-urilor cu abundență scăzută
prin reacție în lanț competitivă cu
transcripție inversă-polimerază. Acizi
nucleici Res. 22: 4547-4549.
40. Gretch, D., L. Corey, J. Wilson, C. dela
Rosa, R. Willson, R. Carithers, Jr., M.
Busch, J. Hart, M. Sayers și J. Han. 1994.
Evaluarea nivelurilor de ARN ale virusului
hepatitei C prin reacția în lanț cantitativă
ARN polimerază competitivă: viremia cu
titlu înalt se corelează cu stadiul avansat al
bolii. J. In-fect. Dis. 169: 1219-1225.
41. Grünebach, F., E.-U. Griese și K. Schu -
macher. 1994. Reacție în lanț competitivă
cu poli-merază imbricată pentru
cuantificarea expresiei genei MDR1 umane.
J. Cancer Res. Clin. Oncol. 120: 539-544.
42. Hahn, M., V. Dörsam, P. Friedhoff, A. Fritz și
A. Pingoud. 1995. Reacția în lanț cantitativă a
polimerazei cu testarea imunosorbentă legată
de enzime detectarea probei amplificate
digerate selectiv și a ADN-ului controlat.
Anal. Biochimie. 229: 236-248.
43. Hanspal, M., JS Hanspal, KE Sahr, E.
Fibach, J. Nachman și J. Palek. 1993. Baza
moleculară a deficitului de spectrină în
piropoikilocitoza ereditară. Sânge 82: 1652-
1660.
44. El, Q., M. Marjamäki, H. Soini, J. Mert -
sola și MK Viljanen. 1994. Grundele sunt
decisive pentru sensibilitatea PCR.
BioTech-niques 17: 82-87.
45. Heroux, JA și AM Szczepanik. 1995.
Analiza cantitativă a tran-scripturilor
specifice de ARNm utilizând un test PCR
competitiv cu detecție
electrochiluminiscentă. Metode PCR Aplic.
4: 327-330.
46. Jalava, T., P. Lehtovaara, A. Kallio, M. Ranki
și H. Söderlund. 1993. Cuantificarea ADN-
ului virusului hepatitei B prin amplificare
competitivă și hibridizare pe mi-croplate.
BioTechniques 15: 134-139.
47. Jenkins, FJ 1994. Metode de bază pentru
detecția produselor PCR. Metode PCR
Aplic. 3: S77-S82.
48. Jin, C.-F., M. Mata și DJ Fink. 1994.
Construcția rapidă a fragmentelor de ADN
șterse pentru utilizare ca standarde interne
în PCR concurențială. Metode PCR Aplic.
3: 252-255.
49. Jones, DH și BH Howard. 1991. O metodă
rapidă de recombinare și mutageneză specifică
sitului prin plasarea capetelor omoloage pe
ADN utilizând reacția în lanț a polimerazei.
BioTechniques 10: 62-66.
50. Jones, DH, K. Sakamoto, RL Vorce și
278 BioTehnici
BH Howard. l990. Mutageneza și
recombinarea ADN-ului. Natura 344: 793-
794.
51. Jurriaans, S., JT Dekker și A. de Ronde.
1992. Încărcarea ADN-ului viral HIV-1 în
celulele mononucleare din sângele pe-
ripheral de la seroconvertitori și indivizi
infectați pe termen lung. SIDA 6: 635-641.
52. Kanangat, S., A. Solomon și BT Rouse.
1992. Utilizarea reacției în lanț cantitative a
polimerazei pentru a cuantifica moleculele
de ARN mesager de citokine. Mol.
Immunol. 29: 1229-1236.
53. Kaneko, S., S. Murakami, M. Unoura și K.
Kobayashi. 1992. Cuantificarea ARN-ului
virusului C hepati-tis prin reacție în lanț
competitivă a polimerazei. J. Med. Virol. 37:
278-282.
54. Kohsaka, H., A. Tanigushi, DD Richman și
DA Carson. 1993. Cuantificarea genei în
format Microtiter prin captarea covalentă a
produselor competitive PCR: aplicare la
detectarea HIV-1. Acizi nucleici Res. 21:
3469-3472.
55. Kolk, AHJ, GT Noordhoek, O. de Lee-uw,
S. Kuijper și JDA van Embden. 1994.
Tulpina Mycobacterium smegmatis pentru
detectarea Mycobacterium tuberculosis prin
PCR utilizată ca control intern pentru
inhibarea amplificării și pentru
cuantificarea bacteriei. J. Clin. Microbiol.
32: 1354-1356.
56. Lehtovaara, P., M. Uusi-Oukari, P. Bu-
chert, M. Laaksonen, M. Bengtström și M.
Ranki. 1993. PCR cantitativă pentru virusul
hepatitei B cu detecție colorimetrică.
Metode PCR Aplic. 3: 169-175.
57. Luque, F., A. Caruz, JA Pineda, Y. Tor-res,
B. Larder și M. Leal. 1994. Modificări ale
încărcăturii de virus la pacienții infectați cu
virusul imunodeficienței umane de tip 1
netratați și tratați cu zidovudină. J.
Infectează. Dis. 169: 267-273.
58.Manzin, A., P. Bagnarelli, S. Menzo, F.
Giostra, M. Brugia, R. Francesconi, FB
Bianchi și M. Clementi. 1994.
Cuantificarea moleculelor genomului
virusului hepatitei C în probe de plasmă. J.
Clin. Microbiol. 32: 1939-1944.
59. Martin, TA, MJ Sole, LZ Penn, C.-C. Liew
și P. Liu. 1993. Cuantificarea ARN en-
teroviral prin reacție în lanț competitivă a
polimerazei. J. Clin. Microbiol. 31: 2634-
2640.
60. McCulloch, RK, CS Choong și DM Hurley.
1995. O evaluare a tipului și dimensiunii
concurentului pentru utilizare în
determinarea ARNm prin PCR competitivă.
Metode PCR Aplic. 4: 219-226.
61. Menzo, S., P. Bagnarelli, M. Giacca, A.
Manzin, PE Varaldo și M. Clementi.
1992. Cuantificarea absolută a viremiei în
infecția cu virusul imunodeficienței hu-man
prin transcriere inversă competitivă și
reacție în lanț poli-merazică. J. Clin.
Microbiol. 30: 1752-1757.
62. Michael, NL, T. Mo, A. Merzouki, M.
O'Shaughnessy, C. Oster, DS Burke,
R.R. Redfield, DL Birx și SA Cassol. 1995.
Virusul imunodeficienței umane tip 1 de încărcare
de ARN celular și modele de splicing prezice
progresia bolii într-o cohortă studiată longitudinal.
J. Virol. 69: 1868-1877.
63. Morrison, C. și F. Gannon. 1994. Imactul fazei
platoului PCR asupra cantitativ

PCR. Biochim. Biofizi. Acta 1219: 493-498.
64. Mulder, J., N. McKinney, C. Christopher-
son, J. Sninsky, L. Greenfield și S. Kwok.
1994. Testul PCR rapid și simplu pentru
cuantificarea ARN-ului de tip 1 al virusului
imunodeficienței umane în plasmă: aplicare
la infecția retrovirală acută. J. Clin.
Microbiol. 32: 292-300.
65.Mullis, KB 1991. Re-acțiunea lanțului
polimerazei într-un mod anemic: Cum se
evită fuziunea oligodeoxiribonucleară rece.
Metode PCR Aplic. 1: 1-4.
66. Natarajan, V., RJ Plishka, EW Scott, HC
Lane și NP Salzman. 1994. O PCR virion
controlată intern pentru măsurarea ARN-ului
HIV-1 în plasmă. Metode PCR Aplic. 3:
346-350.
67. Oliner, JD, KW Kinzler și B. Vogel-stein.
1993. Clonarea in vivo a produselor PCR în E.
coli. Acizi nucleici Res. 21: 5192-5197.
68. Perrin, S. și G. Gilliland. l990. Mutageneză
specifică site-ului folosind reacție în lanț
18: 70-76.
78. Rüster, B., S. Zeuzem și WK Roth.
1995. Cuantificarea ARN-ului virusului
hepatitei C prin transcripție inversă
competitivă și reacție în lanț a polimerazei
utilizând un transcript modificat de ARN al
virusului hepatitei C. Anal. Biochimie. 224:
597-600.
79. Saiki, RK, S. Scharf, F. Faloona, KB
Mullis, GT Horn, HA Erlich și N.
Arnheim. 1985. Amplificarea enzimatică a
secvențelor genomice de beta-globină și
analiza sitului de restricție pentru
diagnosticarea anemiei cu celule secera.
Știința 230: 1350-1354.
80.Sarkar, G. și ME Bolander. 1994. Metoda
„oligo în buclă” pentru generarea
moleculelor de referință pentru PCR
cantitativă. BioTechniques 17: 864-866.
81. Scadden, DT, Z. Wang și JE Groop-man.
1992. Cuantificarea ARN-ului de tip 1 al
virusului imunodeficienței umane prin
reacție în lanț competitivă a polimerazei. J.
In-fect. Dis. 165: 1119-1123.
82. Schanke, JT, LM Quam și BG Van Ness.
1994. Flip PCR pentru inversarea motivului
secvenței ADN. BioTechniques 16: 414-416.
83. Shuldiner, AR, K. Tanner, LA Scott, CA
Moore și J. Roth. 1991. Subclonare fără ligază:
o metodă versatilă de subclonare a produselor
cu reacție în lanț a polimerazei (PCR) într-o
singură zi. Anal. Biochimie. 194: 9-15.
84. Siebert, PD și JW Larrick. 1992. Com-
petitive PCR. Natura 359: 557-558.
85. Siebert, PD și JW Larrick. 1993. PCR
MIMICS: fragmente de ADN competitive
pentru utilizare ca standarde interne în PCR
cantitativă. BioTechniques 14: 244-249.
86. Siegging, A., M. Lehmann, C. Platzer, F.
Emmrich și H.-D. Volk. 1994. Un nou
fragment de concurent multispecific pentru
analiza cantitativă prin PCR a expresiei
genei citokinelor la șobolani. J. Immunol.
Metode 177: 23-28.
87.Stålbom, B.-M., A. Torvén și LG Lund - berg.
1994. Aplicarea elec-troforezei capilare la
analiza de reacție a lanțului post-polimerază a
+ 1993. PCR cantitativă. (Scrisoare) Na-ture
mARN-ului șobolanului pentru H gastric ,
+ 366: 416.
K -ATPase. Anal. Biochimie. 217: 91-97.
88.Stieger, M., C. Démollière, L. Ahlborn-
Laake și J. Mous. 1991. Analiza
competitivă a reacției în lanț a polimerazei
pentru cuantificarea ADN-ului și ARN-ului
HIV-1. J. Virol. Metodologie 34: 149-160.
polimerazică asimetrică și un primer mutant
unic. Acizi nucleici Res. 18: 7433-7438.
69. Peten, EP, LJ Striker, MA Carome, SJ Elliott,
C.-W. Yang și GE Striker. 1992. Contribuția
creșterii sintezei de colagen la
glomeruloscleroza umană: o analiză cantitativă
aA2IV expresie ARNm colagen prin reacție în
lanț competitivă a polimerazei. J. Exp. Med.
176: 1571-1576.
70. Piatak, M., Jr., K.-C. Luk, B. Williams și
JD Lifson. 1993. Reacție în lanț cantitativă
competitivă a polimerazei pentru cantitarea
exactă a speciilor ADN și ARN HIV.
BioTechniques 14: 70-81.
71. Piatak, M., Jr., MS Saag, LC Yang, SJ
Clark, JC Kappes, K.-C. Luk, BH Hahn,
GM Shaw și JD Lifson.1993. Niveluri
ridicate de HIV-1 în plasmă în toate etapele
infecției determinate de PCR competitivă.
Știința 259: 1749-1754.
72. Porcher, C., M.-C. Malinge, C. Picat și B.
Grandchamp. 1992. O metodă simplificată
pentru determinarea numărului specific de
copii ADN sau ARN utilizând PCR
cantitativă și un secvențiator automat ADN.
BioTech-niques 13: l06-113.
89. Sutherland, JC, BM Sutherland, A. Em-
rick, DC Monteleone, EA Ribeiro, J. Trunk,
M. Son, P. Serwer, și colab. 1991.
Imagistica electronică cantitativă a
fluorescenței gelului cu camere CCD:
aplicații în biologia moleculară.
BioTechniques 10: 492-497.
90. Sykes, PJ, SH Neoh, MJ Brisco, E.
Hughes, J. Condon și AA Morley. 1992.
Cuantificarea țintelor pentru PCR prin
utilizarea diluției limitative. BioTechniques
13: 444-449.
91. Taniguchi, A., H. Kohsaka și DA Car-son.
1994. RT-PCR ELISA competitiv: o
metodă rapidă, sensibilă și non-radioactivă
pentru a cuantifica ARNm de citokine. J.
Immunol. Metode 169: 101-109.
92. Telenti, A., P. Imboden și D. Germann.
1992. Reacția în lanț a polimerazei competitive
folosind un standard intern: aplicarea la
73. Raeymaekers, L. 1993. PCR cantitativă:
considerații teoretice cu implicații practice.
Anal. Biochimie. 214: 582-585.
74. Ramakrishnan, R., M. Levine și DJ Fink.
1994. Analiza bazată pe PCR a latenței
virusului herpes simplex tip 1 în ganglionul
tri-geminal de șobolan stabilit cu un mutant
cu deficit de ribonu-cleotid reductază. J.
Virol. 68: 7083-7091.
75. Ravaggi, AZ, C. Mazza, A. Albertini și E.
Cariani. 1995. Cuantificarea ARN-ului
virusului hepatitei C prin amplificarea
competitivă a ARN-ului din ser denaturat și
hibridizare pe plăci de microtitrare. J. Clin.
Microbiol. 33: 265-269.
76. Reiner, SL, S. Zheng, DB Corry și RM
Locksley. 1993. Construirea de ADNc poli-
concurenți pentru PCR cantitativă. J.
Immunol. Metode 165: 37-46; și Corri-
genda, 1994, J. Immunol. Metodele 173:
133 și J. Immunol. Metode 175: 275.
77. Riedy, MC, EA Timm, Jr. și CC Stewart.
1995. RT-PCR cantitativ pentru măsurarea
expresiei genelor. BioTehnici
Vol. 21, nr. 2 (1996)
cuantificarea ADN-ului viral. J. Virol.
Meth-ods 39: 259-268.
93. Thompson, JD, I. Brodsky și JJ Yunis.
1992. Cuantificarea moleculară a bolii
reziduale în leucemia mielogenă cronică
după transplantul de măduvă osoasă. Sânge
79: 1629-1635.
94. Überla, K., C. Platzer, T. Diamantstein și T.
Blankenstein. 1991. Generarea de
fragmente de ADN competitor pentru PCR
cantitativă. Metode PCR Aplic. 1: 136-139.
95. Ulrich, PP, JM Romeo, LJ Daniel și GN
Vyas. 1993. O metodă îmbunătățită pentru
detectarea ARN-ului virusului hepatitei C în
plasmă utilizând primeri heminestați și
ARN de control in-ternal. Metode PCR
Aplic. 2: 241-249.
96. Vanden Heuvel, JP, FL Tyson și DA Bell.
1993. Construcția șabloanelor de ARN
recombinant pentru utilizare ca standarde
interne în RT-PCR cantitativ.
BioTechniques 14: 395-398.
97.van Gemen, B., R. van Beuningen, A.
Nabbe, D. van Strijp, S. Jurriaans, P.
Lens și T. Kievits. 1994. O analiză cu
amplificare a acidului nucleic NASBA
HIV-1 cuantitativ cu un singur tub folosind
sonde marcate cu electrochiluminii cent
(ECL). J. Virol. Metode 49: 157-168.
98. Virdi, AS, S. Krishna și BC Sykes.
1992. Reacția în lanț competitivă în
polimerază tandem (TC-PCR): o metodă
pentru determinarea rapoartelor de șabloane
de ARN și ADN. Mol. Celulă. Sonde 6:
375-380.
99. Wang, AM, MV Doyle și DF Mark.
1989. Cuantificarea ARNm prin reacția în
lanț a polimerazei. Proc. Natl. Acad. Știință.
SUA 86: 9717-9721.
100. Wang, H., L. Fliegel, CE Cass, AMW
Penn, M. Michalak, JH Weiner și BD
Lemire. 1994. Cuantificarea ADN-ului
mitocon-drial în fibroblastele heteroplasmatice
cu PCR competitivă. BioTechniques 17: 76-
82.
101. Wiesner, RJ, B. Beinbrech și JC Rüegg.
102. Wilkinson, ET, S. Cheifetz și SA De
Grandis. 1995. Dezvoltarea PCR competitiv
și a sistemului QPCR 5000 ca ecran bazat
pe transcriere. Metode PCR Aplic. 4: 363-
367.
103. Wolf, SS și A. Cohen. 1992. Exprimarea
citokinelor și a receptorilor acestora de
către timocite umane și celule stromale
timice. Im-munology 77: 362-368.
104. Xia, H.-Z., CL Kepley, K. Sakai, K. Chel-liah,
A.-MA Irani și LB Schwartz. 1995.
Cuantificarea Triptazei, Chimazei, FceRIA și
FceRIgARNm în mastocite și bazofile umane
prin reacție în lanț competitivă cu transcripție
inversă-polimerază. J. Immunol. 154: 5472-
5480.
105. Young, KK, RM Resnick și TW My-ers.
1993. Detectarea ARN-ului virusului
hepatitei C printr-un test combinat de
reacție în lanț cu transcripție inversă-
polimerază. J. Clin. Mi-crobiol. 31: 882-
886.
106. Yun, Z., J. Lundeberg, B. Johansson, A.
Hedrum, O. Weiland, M. Uhlén și A.
Sönnerborg. 1994. Detectarea colorimetrică a
produselor PCR competitive pentru
cuantificarea viremiei hepatitei C. J. Virol.
Metode
Vol. 21, nr. 2 (1996)
47: 1-13.
107. Zachar, V., RA Thomas și AS Gous-tin.
1993. Cuantificarea absolută a ADN-ului
țintă: un PCR competitiv simplu pentru
analiza eficientă a mai multor probe. Acizi
nucleici Res. 21: 2017-2018.
108. Zarlenga, DS, A. Canals și L. Gas-barre.
1995. Metodă de construire a standardelor
interne pentru utilizare în PCR competitivă.
BioTechniques 19: 324-326.
109. Zenilman, ME, W. Graham, K. Tanner și
AR Shuldiner. 1995. Reacție în lanț
competitivă re-verse-transcriptază
polimerază fără un standard intern artificial.
Anal. Biochimie. 224: 339-346.
110. Zimmermann, K., D. Schögl și JW
Mannhalter. 1994. PCR cantitativă semi-
imbricată competitivă a HIV-1.
BioTechniques 17: 440-442.
Primit la 12 februarie 1996; acceptat
pe 7 mai 1996
Adresă corespondență către:
Klaus Zimmermann
Immuno AG
131
A-1221 Viena
Austria
BioTechniques 279