2/8/2010

 Fiziologia bacteriană
bacteriană studiază viaţa şi
activităţile bacteriilor – nutriţia, respiraţia,
creşterea şi multiplicarea, condiţiile de
cultivare a bacteriilor.
FIZIOLOGIA BACTERIILOR.  Metabolismul bacterian reprezintă
ansamblul de reacţii biochimice care au loc
METABOLISMUL în celula vie.
MICROBIAN. - Catabolism – reacţii chimice de
descompunere a substanţelor complexe în
elemente simple, însoţită de degajarea
NUTRIŢIA
NUTRI ŢIA ŞI RESPIRAŢIA energiei (metabolism energetic)
BACTERIILOR - Anabolism – reacţii chimice de sinteză a
substanţelor complexe din elemente simple,
necesită energie (metabolism constructiv, de
sinteză)

Particularităţile metabolismului bacterian:

bacterian:  Enzimele bacteriene.
bacteriene. Caractere generale:
1. Este un metabolism necompartimentat , toate
procesele metabolice se desfăşoară intr- intr-o singură - Substanţe proteice
celulă - Active în limite largi de temperaturi (0-
(0-65 C)
2. Este foarte flexibil, realizându-
realizându-se prin diverse căi şi de pH (2-
(2-9)
metabolice (bacteriile se adaptează rapid la
condiţiile mediului) - Specificitate de substrat şi de acţiune
3. Este foarte intens (viteza reacţiilor este mare) (reacţionează cu un substrat catalizând un
4. Produsele intermediare din procesele catabolice tip de reacţie)
pot fi utilizate direct în calitate de precursori
pentru reacţ
reacţiile anabolice (amfibolism) - Specificitatea este determinată de centrul
În toate reacţiile
reacţiile metabolice intervin catalizatori activ al enzimei, complementar cu
proteici specifici - enzimele receptorul de pe substrat
- Nu se modifică în cursul reacţiei

Clasificarea enz
en zimelor Importanţa practică a studierii enzimelor
I. Constitutive (permanente
permanente))
II. Inductive (adaptive
adaptive)), se sintetizează în prezenţa
1. Rol în identificarea şi clasificarea
substratului (ex.: lactaza) bacteriilor (enzimele determină activitatea
Represive, sinteza lor este inhibată de acumularea în
III.
exces a prod
produsului reacţiei catalizate
biochimică specifică a bacteriilor)
 După locul de acţiune (exoenzime, endoenzime)
endoenzime) 2. Unele substanţe chimice, antibiotice
După tipul reacţiei catalizate (oxido
oxido--reductaze, hidrolaze,

transferaze, liaze, izomeraze, ligaze)
ligaze )
interferează cu activitatea unor enzime,
 După impactul asupra ma/o inhibând creşterea bacteriilor (tratament)
Enzime metabolice
-
- Enzime de patogenitate,
patogenitate, responsabile de modificări
3. Determinarea mecanismelor patogenezei
patologice ale ţesuturilor, celulelor ma/o : hialuronidaza, infecţiilor (unele enzime sunt responsabile
colagenaza, plasmocoagulaza, hemolizina, fibrinolizina,
lecitinaza, proteaze, etc.
de producerea leziunilor în ţesutul gazdei)
4. Aplicarea industrială a enzimelor

1
 2/8/2010

NUTRIŢIA BACTERIANĂ
 Nutrienţii servesc în calitate de material
 Nutriţia – modalităţile prin care bacteriile de construcţie şi sursă de energie
asimilează din mediu substanţele necesare
pentru metabolism. pentru sinteza compuşilor şi menţinerea
 Modul (tipul) de nutriţie la bacterii este absorbtiv
absorbtiv.. vieţii bacteriei.
 Nutrienţi – substanţe, soluţiile cărora pot  Transportul transmembranar
traversa MCP pentru a fi antrenate în
1. Difuzie simplă (conform gradientului de
metabolismul celulei. Se obţin din alimente prin
solvire (săruri minerale, CO2, O2) sau după o concentraţie, fără utilizarea energiei):
digestie prealabilă (proteine, polizaharide, lipide). O2, CO2, acizi graşi, nutrienţi liposolubili
 La bacterii digestia este extracelulară (la
bacteriile G-
G- în spaţiul periplasmic)

2. Difuzie facilitată (conform gradientului de

concentraţie) – permite transportul
transmembranar al moleculelor mari prin
intermediul proteinelor de transport
specifice - permeaze
permeaze..
3. Transport activ (contra gradientului de
concentraţie, necesită energie). Participă
permeazele şi alte proteine de transport
specifice. Nutrienţii nu suportă modificări.
4. Translocaţie – substratul este modificat
(ex.: fosforilat) în timpul transportului
membranar; necesită energie

 Substanţele care au pătruns în citoplasmă

sunt descompuse de către enzimele
bacteriene conform căilor metabolice proprii
fiecărei specii bacteriene (ex.: Embden-
Embden-
Meyerhof, Entner-
Entner-Doudoroff, ciclul
pentozelor, ciclul Krebs, etc). Celula obţine
energie şi precursori care vor fi antrenaţi în
biosinteză (anabolism).
 Excreţia metaboliţilor – difuzie, proteine de
transport, liza bacteriei

2
 2/8/2010

Clasificarea bacteriilor după sursa de carbon

 Necesităţile nutritive ale bacteriilor  Bacterii autotrofe – utilizează CO2 ca unică
- Necesităţi elementare,
elementare , de bază: C, H, O, N în sursă de carbon (nepatogene)
cantităţi importante;
importante; S, P, Fe, Ca, Mg, K în  Bacterii heterotrofe – utilizează carbonul din
cantităţi mici şi urme de Co, Cu, Zn, Mo.
Mo. compuşii organici (glucide, acizi graşi, alcooli,
etc)
Bacteriile prototrofe sunt capabile a- a-şi realiza - Bacteriile care utilizează materia organică
integral sinteza metaboliţilor esenţiali. moa
mo artă sunt saprofite (reciclarea materiei
- Necesităţi specifice.
specifice. Bac
Bacterii
teriile
le auxotrofe organice)
solicită suplimentar compuşi organici - Bacteriile
Bacterii le parazite (obligate, facultative) trăiesc
preformaţi (factori de creştere)
creştere), care nu pot fi pe contul organismelor vii, aducându-
aducându-le
prejudicii
sintetizaţi de bacterie (ex.: AA, baze purinice,
- Bacteriile patogen
patogenee reprezint
reprezintăă parazite
parazite care
pirimidinice, vitamine). Prezenţa lor în mediul afectează grav gazda, provocând maladie sau
de cultură este indispensabilă creşterii acestor moarte..
moarte
bacterii.

 Surse de azot Clasificarea bacteriilor după sursa de energie

 Bacterii fototrofe – utilizează energia solară
- AA sau acizi nucleici (fotosint)
- Săruri de amoniu, nitriţi, azot atmosferic  Bacterii chemotrofe – folosesc energia degajată din
reacţiile chimice de oxido-
oxido-reducere. Ele necesită un
substrat donor de hidrogen (e- şi H+) şi un substrat
 Surse de substanţe minerale:
minerale: acceptor de hidrogen.
hidrogen. În transfer participă
- S - din AA, sulfuri, sulfaţi; transportori intermediari de electroni (lanţul
respirator, NAD, NADH, FAD, etc.)
- P - din fosfaţi;
fosfaţi; - Bacteriile chemolitotrofe – donorul de H este o
- K, Mg, Ca, Na - din săruri minerale; substanţă anorganică
- Bacteriile chemoorganotrofe – donorul de H este o
- Zn, Cu, Mn, Mo – din apă
substanţă organică (glucoza, lipide...)
Bacteriile patogene sunt chemoorganotrofe

Mecanismele de obţinere a energiei la  Fermentaţie. Substratul organic este

Fermentaţie.
chemoorganotrofe în funcţie de acceptorul metabolizat fără intervenţia unui agent
final de H : oxidant extern. Constă în procese de ox-
ox-red
 Respiraţie aerobă.
aerobă. Acceptorul final este care realizează numai o oxidare parţială a
oxigenul gazos. Implică lanţul respirator de substratului, donorul şi acceptorul de H+ fiind
transport al electronilor asociat MCP. Produs substanţe organice. Astfel se ajunge de la un
final – H2O sau H2O2 . substrat mai redus la o moleculă mai oxidată
 Respiraţie anaerobă.
anaerobă. Acceptori finali – (ex.: fermentare lactică, fermentare
compuşi anorganici (nitrat, sulfat,
sulfat, S).
S). alcoolică, acidă mixtă, acetoinică, etc).
Transportul de electroni prin lanţul respirator. Fermentaţia se poate desfăşura în prezenţa
Produse finale – nitritul, amoniacul, sulfura O2, dar fără intervenţia acestuia.
(în prezenţ
prezenţa O – H2O2).

3
 2/8/2010

Conservarea energiei
 O parte din energia eliberată se pierde sub Clasificarea bacteriilor după
formă de căldură sau poate fi utilizată direct
sub formă de energie electro-
electro-chimică (fpm) la sursele de energie şi carbon
nivelul MCP (ex.: rotaţia flagelilor, transport I. Bacterii fotoautotrofe (energie solară,
transmembranar) sau stocată în compuşi
chimici macroergici “bogaţi în energie”: ATP CO2)
(sintetizat prin fosforilare oxidativă sau II. Bacterii fotoheterotrofe (en. sol.,
fosforilare la substrat),
substrat), fosfoenol
fosfoenol--piruvat,
acetilfosfat şi acetil-
acetil-CoA. subst.org)
 În procesele de respiraţie se elimină mai multă III. Bacterii chemoautotrofe
energie decât din fermentaţie (în glicoliză dintr-
dintr-un
mol de glucoz
glucoză ă - 38 moli
moli ATP
ATP,, prin fermentaţie - 2 IV. Bacterii chemoheterotrofe
moli ATP)
ATP).. În procese de fermentare se formează (chemolitoheterotrofe,
deşeuri rejetate de către celulă.
chemoorganoheterotrofe))
chemoorganoheterotrofe

4
 2/8/2010

CREŞTEREA ŞI MULTIPLICAREA BACTERIILOR

 Creşterea – mărirea coordonată a masei şi

volumului structurilor bacteriene ca rezultat al
proceselor de sinteză
 Multiplicarea – creşterea numărului de celule pe
o unitate de suprafaţă sau de volum
- Diviziu
Diviziune binară
- Înmugurire (levuri, ciuperci levuriforme)
- Autoreproducere (virusuri)
- Spori (micete)
- Fragmentare (actinomicete)

 Ciclul celular – procesele care au loc de

la formarea celul
celulei
ei pâ
pâna la urmă
următoarea
diviziune
diviziun e
1. Faza C – replicarea ADN

2. Faza G – de latenţă, segregarea

cromozomilor
3. Faza D – de diviziune, formarea septului

Replicarea ADN depinde de masa critică a

celulei, iar separarea cromozomilor şi
diviziunea intervin în momentul când
celula atinge o lungime - limită

 Perioada dintre 2 diviziuni reprezintă timpul

(perioada) de generaţie (TG).
 Durata TG depinde de specie şi de condiţiile de
creştere (condiţii optime – viteză maximă)

Bacteria TG in vitro TG in vivo

(min) (ore)

Escherichia coli 20-40 5

Staphylococcus aureus 40 3-5

Vibrio cholerae 10 2-3

Mycobacterium 120-240 24-48
tuberculosis

5
 2/8/2010

Pentru creştere bacteriile au nevoie de

Creşterea bacteriilor în laborator – cultivare
cultivare.. nutrienţi şi condiţii fizico-
fizico-chimice adecvate.
Se cultivă bacteriile pentru izolarea lor din Condiţiile (principiile) de cultivare
medii naturale (prelevate patologice, - Sursă nutritivă adecvată
alimente, apă, etc).
- Sursă de energie
Izolarea bacteriilor se realizează pentru:
- Apă
1. Identificarea mi/o (scop de diagnostic)
- Temperatura potrivită
2. Testa
Testarrea sensibilităţii lor faţă de antibiotice
- pH adecvat
3. Obţinerea unor produşi de biosinteză
- Concentraţie optimă a oxigenului şi a CO2
(antibiotice, AA), bioconversie (hormoni
- Presiune osmotică adecvată
steroizi), fermentare (alcooli, acizi organici,
etc), producerea vaccinurilor, probioticelor...

 Temperatura de creştere  pH
1. Bacterii neutrofile (majoritatea, inclusiv cele
Există temperaturi minime, maxime şi optime patogene) – pH 6- 6-7,5
de dezvoltare a bacteriilor. În raport cu 2. Bacterii acidofile – pH 2-
2-6 (Lactobacillus)
temperatura optimă deosebim: 3. Bacterii alcalofile – pH >8 (Pseudomonas,
1. Bacterii psichrofile – tº optimă 10-
10-20
20ºº C. Vibrio)
Cresc şi la 0º
0º C.  Presiunea osmotică
2. Bacterii mezofile – optimum 30-30-37
37ºº C 1. Bacterii halotolerante (osmotolerante) – cresc
(limite 15-
15-45
45ºº C) în concentraţii reduse de NaCl (mediu
izotonic cu mediul intern al gazdei) – mi/o
3. Bacterii termofile – optimum 50-
50-60
60ºº C patogene
(până la 95º
95º C) 2. Bacterii halofile – preferă concentraţii mari de
4. Bacterii hipertermofile (cresc la 70–
70–110
110ºº C) NaCl (1-
(1-30%) – stafilococi, vibrioni (V
(Vibrio
parahaemolyticus))
parahaemolyticus

 Oxigenul
1. Bacterii strict aerobe – cresc doar în prezenţa O2.
Obţin energia prin respiraţie aerobă
2. Bacterii microaerofile – necesită concentraţii reduse
de O2 şi 2-
2-10% CO2. Obţin energia prin respiraţie
sau fermentaţie (Neisseria, Brucella,
Campylobacter))
Campylobacter
3. Bacterii strict anaerobe – cresc doar în absenţa O2.
Obţin energia prin fermentaţie sau uneori respiraţie
anaerobă. Toxicitatea O2 – formarea H2O2, a
radicalilor superoxizi O2-, sau peroxizi O22- pe care
anaerobii nu le pot descompune (absenţa catalazei,
superoxid dismutazei, peroxidazei) – Clostridium,
Bacteroides
4. Bacterii anaerobe aerotolerante – pot creşte în
prezenţa O2, obţin energia prin fermentaţie, posedă
peroxidază (Lactobacillus, streptococi)
5. Bacterii facultativ anaerobe – cresc în orice condiţii,
obţin energia prin respiraţie sau fermentaţie

6
 2/8/2010

 Mediile de cultură – soluţii sau substrate solide

care asigură nutrienţii şi condiţiile fizico-
fizico-chimice CLASIFICAREA MEDIILOR DE CULTURĂ
necesare cultivării bacteriilor. Ele pot fi utilizate
pentru cultiva
cultivarea
rea (izolarea) bacteriilor, testarea  După provenienţă
sensibilităţii la antibiotice, stocarea sau transportul 1. Empirice, naturale.
naturale. Au la bază produse de
culturilor bacte
bacteriene.
riene.
origine animală sau vegetală (sânge, ser,
 Cerinţele faţă de mediile de cultură
lapte, ouă, cartof, extracte din carne, cord,
- Să asigure necesităţile nutritive şi energetice ale
bacteriilor creier, ficat, peşte, levuri, etc).
etc). Compoziţia
Compoziţia
- Umiditate optimală lor chimică precisă nu poate fi controlată
- pH optimal (7,2-
(7,2-7,4) şi constant (caracter de 2. Sintetice – includ ingrediente chimice
chimice pure,
tampon) compoziţia chimică este cunoscută cu
- Potenţial de oxido-
oxido-reducere optimal (anaerobi - exactitate
rH2<5, aerobi – rH2>10)
3. Semisintetice
- Să fie izotonice (0,5% NaCl)
- Să fie sterile şi transparente

 După compoziţia chimică (complexitate) şi

 După consistenţă
destinaţie
1. Medii lichide (bulion)
(bulion)–– utilizate pentru
A. Medii uzuale (universale, simple)
obţinerea biomasei bacteriene şi a
produselor lor (antibiotice, enzime, toxine) 1. Apă peptonată (apă+1% peptonă+0,5%
NaCl)
2. Medii solide – conţin 10-
10-15% gelatină sau 2- 2-3%
agar--agar (polizaharid extras din alge roşii, t
agar 2. Bulion peptonat – BP (extract apos din carne
topire 80-
80-100 C, solidificare 42 C). Placa de + 1% peptonă+0,5% NaCl)
geloză în cutii Petri este utilizată
utilizată pentru 3. Geloza nutritivă (BP + 2-
2-3% agar-
agar-agar)
izolarea culturilor pure,
pure, geloza înclinată (în 4. Gelatina nutritivă (BP + 10-
10-15% gelatină)
pantă) – pentru acumularea culturilor pure Sunt utilizate pentru creşterea bacteriilor
3. Medii semisolide – 0,2 – 0,5 % agar-
agar-agar. Se nepretenţioase la cultivare
utilizează pentru studierea activităţii Sterilizarea prin autoclavare: 120 C, 20 min
biochimice sau a mobilităţii bacteriilor.

B. Medii complexe
I. Medii elective – formate din medii simple cu adaos
de componente care permit creşterea mi/o
exigente nutritiv (bulion
(bulion--ser, bulion glucozat,
geloză--sânge – streptococi, neisserii
geloză neisserii;; ser
coagulat – corinebacterii
corinebacterii,, etc)
II. Medii selective – medii solide cu adaos de
componente sau cu condiţii fizico-
fizico-chimice
particulare care stimulează creşterea unor specii
şi inhibă creşterea altor specii (geloza
(geloza salină -
stafilococi,, geloza alcalină - vibrioni
stafilococi vibrioni,, mediul
Ploskirev - Salmonella, Shigella, etc)

7
 2/8/2010

III. Medii diferenţial-

Mediile de îmbogăţire reprezintă medii selective
lichide, utilizate pentru îmbogăţirea florei
patogene şi inhibarea florei de asociaţie dintr-
dintr-
un prelevat plurimicrobian (ex: materii fecale).
fecale).
Etapă
Etap ă premergătoare însămânţării pe medii
selective.
- Mediul Muller (BP+Lugol+CaCO3+hiposulfit )
- Mediul Kauffmann (mediul Muller+bilă+verde de
briliant) – Salmonella
- Bulion cu selenit – Shigella, Salmonella
- Apă peptonată alcalină (pH (pH=
=8) –Vibrio cholerae
- Kitt
Kitt--Tar
Tarrrozzi (BP+0,5% glucoză+bucăţi de ficat)
– pentru anaerobi
diferenţial-diagnostice (DD) – permit
diferenţierea speciilor bacteriene în baza
activităţii lor biochimice (zaharolitice,
proteolitice, lipolitice, de oxido-
oxido-reducere
reducere… …)
Sunt construite după următoarea schemă:
Bază nutritivă+substrat+indicator (la necesitate)
Medii DD pentru izolarea culturii pure
Studierea proprietăţilor zaharolitice
Endo (geloză+lactoză+fucsină+hiposulfit de Na) Na)
Levin (geloză+lactoză+eozină+albastru metilen)
Ploskirev (geloză+lactoză+roşu neutru+săruri de
acizi biliari+verde de briliant)
Coloniile lactozo
lactozo--pozitive vor fi colorate (roş
roşiiii pe
Endo, Ploskirev, albastru
albastru--violete pe Levin
Levin))

Studierea proprietăţilor de oxido-

oxido-reducere
Mediul cu sulfit de Bi – pentru Salmonella
(colonii
(c olonii negre – reducerea sulfitului în
sulfura de Bi)

8
 2/8/2010

Mediul Klauberg (geloză

(geloză--sânge cu telurit de Studierea proprietăţilor hemolitice
K) –pentru Corynebacterium diphtheriae Geloza--sânge (geloza+5
Geloza (geloza+5--15% sânge
(colonii negre) defibrinat)
Studierea proprietăţilor lipolitice În cazul hemolizei în jurul coloniilor apare o
Geloza cu gălbenuş de ou – bacteriile cu zonă clară
lecitinază formează un halou opac în jurul
coloniei

Medii DD multitest pentru acumularea culturii pure

şi identificare preliminară
Russel –geloză+1% lactoză, 0,1% glucoză, indicator
Kligler – identic Russel+sulfat de Fe (detectarea H 2S)
Olkeniţki – identic Kligler+1% zaharoză+uree
Indicatorul Andrede – fucsină+NaOH
Scindarea glucidelor (acid - A, acid şi gaz - AG) duce la
modificarea pH şi virajul culorii mediului din roşu în
galben.
În pantă se apreciază
apreciază lactoza/zaharoza
lactoza/zaharoza (oxidare), în
coloană--glucoza (fermentare).
coloană
Producerea H2S – în înn
negrirea mediului

V. Medii de transport – destinate transportării sau

Medii DD pentru identificarea finalfinalăă stocării unui material (prelevat), care va fi
a culturii pure examinat ulterior.
- Şirul pestriţ Hiss (lichid sau semi-
semi-solid)
solid)–
– un şir Menţine în viaţă bacteriile, fără a favoriza
de tuburi ce conţin soluţii 0,5% de diferite
glucide şi indicator. multiplicarea lor.
Aprecierea – după modificarea culorii (acid - A) - Mediul cu glicerină 30%
şi apariţia bulelor de gaz (acid şi gaz - AG) - Soluţie tampon-
tampon-fosfat
- Medii cu AA (lizină, arginină, ornitină) şi - Soluţie NaCl 3%
indicatori
- Mediul Cary-
Cary-Blair
IV. Medii speciale – pentru izolarea unor
anumite bacterii (Finn,
(Finn, Popescu, - Mediul Stuart (NaCl, 0,5% agar, tioglicolat de
Loe
Lo ewenstein
wenstein--Jensen –pentru agenţii Na, albastru de metilen) – pentru anaerobi,
tuberculozei,, Sabouraud – fungi
tuberculozei fungi)) neisserii, etc

9
 2/8/2010

 Pentru cultivarea bacteriilor o cantitate mică  Cultură pură – formată din bacterii de
de material ce conţine bacterii (inoculum
(inoculum)) se
aceeaşi specie (indispensabilă identificării)
întroduce într-
într-un mediu de cultură
(însămânţare, inoculare),
inoculare), care ulterior va fi  Cultură mixtă – compusă din bacterii de
incubat în termostat (pentru asigurarea specii diferite
temperaturii optime).  Tulpină – populaţie microbiană constituită
 În timpul incubării (18-
(18-24
24--48 ore…..
ore…..)) bacteriile din descendenţii unei singure izolări în
cresc şi se divid, formând o cultură
cultură pură, care va fi studiată ulterior.
bacteriană (totalitatea bacteriilor acumulate
prin multiplicare intr-
intr-un mediu).
mediu).  Clonă – populaţie care rezultă din
M.tuberculosis – 3-5 săptămâni multiplicarea unei singure celule
V.cholerae – 6-12 ore

Manifestarea creşterii şi multiplicării

bacteriilor  În mediu solid – formarea coloniilor
 În mediu lichid
Colonie – o aglomerare de bacterii care
- Turbiditate uniformă se dezvoltă dintr-
dintr-o singură celulă sau
- Formarea unei pelicule la suprafaţa un grup de celule (UFC - unitate
mediului (vibrioni, yersinia) formatoare de colonii)
colonii) pe suprafaţa unui
- Formarea unui sediment mediu solid
la fundul tubului sau pe pereţi  Fiecare specie bacteriană formează
colonii specifice (caracter util în
(streptococi, Bacillus anthracis)
anthracis)
identificare)

Tipurile de colonii
Colonii S (smouth) – rotunde, netede, umede,
 Caracteristica coloniilor
Dimensiuni – colonii mici (0,1-
(0,1-1mm), medii (1-
(1-
lucioase
2mm), mari (2-
(2-3mm) Colonii R (rough) – margini neregulate, suprafaţa
Contur (margini) – neted, ondulat, zimţat, lobat, uscată, rugoasă
etc
Suprafaţă – plată, bombată, convexă, ombilicată,
etc
Formă – punctiformă, circulară, filamentoasă,
neregulată
Culoare (pigmentaţie) – albă, galbenă, aurie, etc
Densitate – opacă, transparentă, etc
Consistenţă – cremoasă, untoasă, uscată,
mucoidă

10
 2/8/2010

Caracterele de cultură ale bacteriilor

reprezintă exigenţele nutritive (medii,
temperatură, pH, aerare, etc), timpul
apariţiei
apariţiei culturii şi manifestarea
creşterii pe medii lichide şi solide

 Dinamica multiplicării bacteriilor în culturi

În funcţie de modul de dezvoltare a culturilor
bacteriene se disting:
- Culturi discontinue/periodice
- Culturi continue
- Culturi sincrone
Culturile discontinue se obţin la cultivarea
bacteriilor în volum limitat de mediu. Astfel de
culturi sunt obţinute şi utilizate în laboratorul
microbiologic
Fazele dezvoltării unei culturi discontinue
I. Faza de lag – faza de adaptare la condiţiile
mediului, bacteriile sunt active metabolic, cresc
în dimensiuni, dar nu se divid.
Durata este variabilă (2- (2-4 ore); depinde de starea
bacteriei, condiţiile mediului, etc
II. Faza logaritmică – bacteriile cresc şi se divid cu
viteză maximală constantă, curba evoluează
exponenţial. Bacteriile sunt foarte sensibile la
agenţi antimicrobieni (culturi
(culturi utile pentru testarea
sensibilităţii la antibiotice).
Durata – 8-10 ore

III. Faza staţionară – rata celulelor care se multiplică

scade treptat, numărul celulelor vii rămâne
constant mai multe ore.
Cauza – consumarea nutrienţilor, acumularea
metaboliţilor toxici.
Morfologia bacteriilor este tipică speciei, apar
incluziuni, spori (culturi utile pentru identificare).
Sensibilitatea la agenţii
agenţii antimicrobieni scade.
Durata – 10
10--12 ore
IV. Faza de declin (letalitate) – bacteriile mor
progresiv

11
 2/8/2010

EXAMENUL BACTERIOLOGIC
Cultura continuă – se realizează când mediul
Cultura
de cultură este continuu reînnoit şi Examen
xamenul ul bacteriologi
bacteriologic c const
constă ă în inocular
inoculareaea
îmbogăţit cu oxigen cu evacuarea unei (însămânţarea) prelevpreleva atelor pe me
medii
dii de
cantităţi de cultură. Se realizează în cultură
cultur ă pentru izolarea cultur
culturilor
ilor pure de
chemostate sau turbidostate
turbidostate,, cultura bacterii (tulpinilor) care vor fi ulterior
aflându--se permanent în faza exponenţială.
aflându identificate
identifi cate,, test
testate
ate la sensibilitate visvis--a-vis
Se utilizează în microbiologia industrială. de antibiotice
antibiotice,, eventua
eventual conservat
conservate. e.
În intestin – culturi continue. Examen
xamenul ul bacteriologi
bacteriologicc constă din câteva
Culturi sincrone – culturi în care bacteriile se etape succesive,
succesive, de la prelev
prelevarea
area
divid în acelaşi timp (recoltarea) probelor biologi
biologicece până la
remiterea
remi terea rerezzultat
ultatelor
elor..

Materiale de examinat (prelevate) de la pacienţi:

pacienţi:
- Secreţii rino-
rino-faringiene, bronşice
Faza pre-
pre-analitică (responsabilitatea medicului)
- Spută
 Prescrierea investigaţiei (în funcţie de datele
- Puroi
examenului clinic şi paraclinic). În ordonanţă se
fixează identitatea medicului, a pacientului, - Exsudate, transsudate
scopul analizei, manifestările patologice, locul, - Sânge
data apariţiei, alte date: imunosupresie, - LCR
tratament cu antibiotice,
antibiotice, graviditate, etc.
- Urină, secreţii genitale
 Prelevarea probelor
- Mase fecale, bilă, suc duodenal
- Alegerea prelevatului (de la poarta de intrare,
- Bioptate, punctate
locul multiplicării sau/şi din căile de eliminare ale
- Material cadave
cadavericic,, etc
agentului patogen) şi momentul prelevării

Modul de prelevare (recoltare)

- În recipiente sterile
Materiale de examinat din mediul extern:
extern : - Respectând regulile de autoprotecţie
- Apă - La debutul bolii
- Până la administrarea antibioticelor
- Alimente
- Cantitate suficientă
- Sol
Transportarea
- Aer - Imediată sau utilizând medii de transport, cu

- Lavaje respectarea
respect area condiţiilor speciale după necesitate
- În ambalaj special (cutii metalice, pungi din plastic...)
- Vectori, etc
- În fişa de însoţire să fie indicată identitatea
pacientului, vârsta, sexul, natura prelevatului, data,
ora prelevării, scopul investigaţiei, ş.a.)

12
 2/8/2010

I etapă – IZOLAREA CULTURILOR PURE

 EXAMENUL BACTERIOLOGIC Scopul izolării - de a obţ obţine o cultur
cultură
ă pur
pură ă dintr
dintr--
PENTRU CULTURILE AEROBE un melan
melanjj de celule bacteriene sa sauu dintr
dintr--un
- Prelev
relevaatul est
este
e su
supu
puss examen
examenului
ului produss patologi
produ patologicc. O colonie separată
macroscopicc (modifica
macroscopi modificarea
rea aspect
aspectului
ului,, a constituie o cultur
cultură
ă pur
pură
ă.
mirosului,, etc) - orientare în diagnostic
mirosului Tehni
ehnici
ci utilizate:
- După necesitate, probele sunt supuse 1. Prin epui
epuizarea
zarea inoculului pe suprafaţa gelozei
din cutia Petri (însămânţare în striuri
striuri paralele,
paralele,
pregătirii pentru investigaţie (diluare, îns
nsăămânţare în cadran
adranee, etalarea
etalarea consecutiv
consecutivă ă
omogenizare, centrifugare, etc) pe tr
trei
ei cutii
cutii).
).
- Examinarea microscopică (preparate 2. Metoda diluţiilor logaritmice a inoculului în
native, Gram, Ziehl-
Ziehl-Neelsen, Burri-
Burri- geloză topită şi răcită la 50º
50º C (10-1, 10-2,...),
Hinsss...) – prezenţa mi/o, forma,
Hins apoi turnate în cutii Petri sau eprubete.
cantitatea, G+/-
G+/-. Incubare în termostat la 37º 37º C, 18-
18-24 h (în funcţie
de TG).

13
 2/8/2010

Metode speciale de izolare în culturi pure:

- A bacteriilor sporulate: încălzirea prealabilă a
prelevatului 80º
80º C – 20 min
- A bacteriilor acido-
acido-rezistente: tratarea prealabilă
cu acid a prelevatului şi neutralizarea ulterioară
cu o bază
- A mi/o patogene din prelevate plurimicrobiene:
îmbogăţirea prealabilă a florei patogene utilizând
medii de îmbogăţire
- A bacteriilor cu virulenţă înaltă şi pretenţioase la
cultivare: inocularea la animalel
animalele e de laborator
sensibile

III etapă – IDENTIFICAREA CULTURII PURE

- Verificarea purităţii culturii (frotiu Gram)

II etapă – ACUMULAREA CULTURII PURE - Identificarea culturii pure constă în evidenţierea unor
- Examinarea macroscopică a coloniilor crescute caractere specifice ale acestei culturi pentru a o include într-
într-o
familie, gen, specie, variantă
(formă, culoare, dimensiuni, etc)
Se studiază caracterele:
- Examinarea microscopică (frotiu Gram) a - Morfologice
coloniilor suspecte, confirmarea purităţii culturii - Tinctoriale
- Repicarea coloniilor suspecte pe geloză în - De cultură
- Biochimice
pantă (înclinată) pentru acumularea culturii
- Antigenice (seroidentificarea)
pure - De patogenitate
- Termostat, 37º37º C, 18-
18-24 ore - Sensibilitatea la bacteriofagi (fago-
(fago-identificarea)
- Sensibilitatea la antibiotice

14
 2/8/2010

STUDIEREA ACTIVITĂŢII Depistarea producerii H2S: formarea sulfurii

BIOCHIMICE A BACTERIILOR de fer de culoare neagră în mediile
1. Activitatea zaharolitică (şirul Hiss, coagularea multitest – Kligler, Olkeniţki, etc; plasarea
laptelui,, etc)
laptelui etc) unei benzi de hârtie de filtru îmbibată cu
2. Activitatea proteolitică acetat de Pb deasupra BP în care creşte
- Degradarea proteinelor native (lichefierea cultura studiată (formarea sulfurii de Pb
gelatinei sau a serului coagulat, peptonizarea înnegreşte hârtia)
laptelui,, etc)
laptelui etc)
- Evidenţierea enzimelor ce intervin în Depistarea indolului (produs al hidrolizei
degradarea AA (decarboxilaze, dezaminaze, triptofanului) – benzi de hârtie îmbibate cu
desulfhidraze, etc) cu detectarea produsele acid oxalic.
oxalic. În prezenţa indolului indicatorul
finale ale descompunerii AA: H2S, NH3, indol, virează în roz.
etc…
etc … Depistarea amoniacului (ureaza) – hârtia de
turnesol se colorează în albastru.

Depistarea lecitinazei – mediu cu gălbenuş de ou 10% -

Depistarea catalazei (H2O2 .... H2O + O2) formarea unui halou opac în jurul coloniilor
(cultura se amestecă cu o picătură de apă oxigenată –
apariţia bulelor de gaz)

Depistarea oxidazei (detectarea prezenţei citocromoxidazei Depistarea lipazei – mediu cu Twin 80 1%– 1%– halou opac în
din lanţul respirator) jurul coloniilor (precipitarea acizilor graşi)
Reactiv – di (tetra)metil-
(tetra)metil-parafenilen
parafenilen--diamină (benzi sau Depistarea hemolizinei – geloză
geloză--sânge 5-5-10% - zonă clară în
rondele de hârtie îmbibate cu reactiv, creioane, etc) jurul coloniei
Depistarea ADNazei, fosfatazei,
fosfatazei, etc
Oxidarea reactivului – culoare violetă-
violetă-neagră
Probele sunt incubate la 37º37º C, 18-
18-24 h
Oxidazo+ : Neisseria, Vibrio, Pseudomonas
Oxidazo-- : Enterobacteriaceae
Oxidazo

 Identificarea rapidă
Utilizarea galeriilor miniaturizate standarde
(economie de timp, spaţiu, material)
Sistemul API – o galerie din plastic formată
din numeroase alveole care conţin fiecare
un mediu deshidratat diferit (glucide, AA,
etc).. Alveolele sunt inoculate cu o
etc)
suspensie bacteriană testată şi incubate.
incubate.
Ulterior la necesitate se adaugă reactive
pentru detectarea metaboliţilor particulari.
particulari.
Lectura – conform unui cod de cifre sau
computerizat

15
 2/8/2010

EXAMENUL BACTERIOLOGIC PENTRU

CULTURI ANAEROBE
IV etapă – EVALUAREA
(clostridiene, neclostridiene)
REZULTATELOR, FORMULAREA SI Condiţia principală – cultivare în absenţa
ELIBE
ELI BERAREA
RAREA RĂSPUNSULUI oxigenului
- Compararea rezultatelor obţinute cu
1. Utilizarea mediilor anaerobe (Kitt
(Kitt--Tar
Tarrrozzi
regenerat - 100
100ºº C, 20 min, răcit, acoperit cu
caracterele speciilor bacteriene vazelină;; însămânţarea în geloză în coloană)
vazelină
cunoscute pentru a găsi asemănări. 2. Crearea condiţiilor de anaerobioză
- Metoda fizică – utilizarea anaerostatului
- Exemplu de răspuns: Din proba
- Metoda chimică – în exicator se întroduc
examinată a fost izolată tulpina de substanţe ce fixează oxigenul (pirogalol+bază);
Corynebacterium diphtheriae,
diphtheriae, biovar utilizarea gas
gas-pachetelor
gravis,, tox+, sensibilă la ...., rezistentă la
gravis - Metoda biologică Fortner – cultivarea
concomitentă a aerobilor şi anaerobilor
.....

Recoltarea – cu precauţie, evitând contactul

cu aerul (în seringi, utilizând medii
speciale)
I etapă – ÎMBOGĂŢIREA ANAEROBILOR
- Însămânţarea prelevatului în 2 eprubete cu
mediul Kitt-
Kitt-Ta
Tarrrozzi regenerat
- Încălzirea unui tub la 80º
80º C, 20 min –
distrugerea florei nesporogene
- Incubarea la 37º
37º C, 24-
24-48 h (va avea loc
înmulţirea anaerobilor)

16
 2/8/2010

II etapă - IZOLAREA CULTURII PURE - Metoda Weinberg – diluţii succesive ale

DE ANAEROBI
- Studierea caracterelor de cultură – tulburarea
mediului, descompunerea bucăţilor de ficat,
etc
- Izolarea culturii pure de anaerobi prin metoda
Zeissler (însămânţarea a 0,1 ml din mediul
K-T pe 3 cutii cu geloză-
geloză-sânge glucozată
consecutiv). Incubarea în
anaerostat/exicator/gass-pack, 24-
anaerostat/exicator/ga 24-48 h
culturii în geloză glucozată lichefiată şi
aspirarea în tuburi lungi şi înguste, închise
ermetic. Incubarea în termostat, 24 h
III etapă - ACUMULAREA CULTURII PURE
- Studierea macroscopică a coloniilor
- Examinarea microscopică (frotiu Gram) a
coloniilor suspecte
- Repicarea în mediul K- K-T regenerat pentru
acumularea culturii pure
- Incubarea în termostat, 24 h

IV etapă - IDENTIFICAREA CULTURII

PURE DE ANAEROBI
- Verificarea purităţii culturii pure (frotiu
Gram)
- Studierea caracterelor culturii pure izolate
(cu respectarea condiţiilor de
anaerobioză)

V etapă - EVALUAREA REZULTATELOR,

FORMULAREA ŞI ELIBERAREA
RĂSPUNSULUI

17