Obtención y Caracterización de una Preparación Microencapsulada de

Hemisfericina Refinada utilizando goma arábiga

AUTORES:

Luis A. Reyes-Nava, Jorge Yáñez-Fernández, Isabel Cortés-Vázquez, Roberto Briones-Martínez, Carmen

Oliver S.

Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología-IPN. Av. Acueducto s/n, Barrio la Laguna, Col.
Ticoman, México, DF., C.P. 07340. Laboratorio de Enzimas Vegetales, Centro de Desarrollo de
Productos Bióticos-IPN, Km 6.5 Yautepec-Jojutla, C.P. 62731, Yautepec, Morelos.

Correspondencia del autor: Tel. 55 578 79933

E-mail: alberto_lafe@hotmail.com.

RESUMEN

Bromelia hemisphaerica es una especie mexicana productora del complejo polimórfico de proteasas

cisteínicas denominado hemisfericina. En este trabajo se establecen las condiciones para encapsular

mediante secado por aspersión una preparación refinada de proteasas de B. hemisphaerica. El

encapsulado se llevó a cabo utilizando goma arábiga como material pared en un secador de laboratorio

(Mini Spray Dryer, modelo B-290, Büchi). Para la caracterización se determinó concentración de proteína,

actividad proteolítica y electroforesis. Se realizó Microscopía Electrónica de Barrido (MEB) para ver la

morfología de las capsulas. Los resultados muestran la estabilidad de la actividad proteolítica de las

cápsulas para las corridas 7, 8 y 9, con 10 y 15% de concentración de Goma Arábiga, manteniendose

entre el 90 y 99% de actividad enzimática. La concentración de proteína no tiene cambios. En los

microencapsulados, se hacen presente las bandas correspondientes a HR con respecto a dos meses de

almacenamientoa. Aunado a esto las microfotos obtenidas por MEB muestran la aparición característica

de capsulas que ya han sido reportadas en otros trabajos en donde se utiliza el secado por aspersión con

goma arábiga. La Microencapsulación descrita en este estudio es de gran interes, ya que, como esta

enzima, muchas otras que tienen potencial industrial se ven afectadas por condiciones del ambiente o

agentes externos.

Palabras clave:

Goma Arábiga, Hemisfericina Refinada, Actividad proteolítica, Microencapsulación

Introducción.

Bromelia hemisphaerica (timbirichi o timbiriche) es una planta herbácea perenne que crece de manera

silvestre en las regiones tropicales y subtropicales de México, pertenece a la familia Bromeliaceae

(Briones et al., 1987) y es productora del complejo polimórfico de proteasas cisteínicas denominado

hemisfericina. La importancia de esta enzima se ve reflejada en las investigaciones que se han realizado

acerca de su modo de acción en la transformación de sustratos macromoleculares de interés alimentario

(Briones-Martínez y Cortés-Vázquez, 2000). Aunado a esto, se han realizado diversos estudios

tecnológicos en los que se ha demostrado compite satisfactoriamente con fitoproteasas comerciales en

diferentes aplicaciones industriales, entre las cuales se encuentran: la solubilización de proteínas de

pescado, estabilización coloidal de la cerveza, hidrólisis de la fracción proteínica de los adjuntos de la

malta (Briones et al., 1994) y el refinamiento de propiedades funcionales de proteínas vegetales de

interés alimentario.

La literatura reporta pocos trabajos enfocados a investigaciones sobre la obtención de preparaciones

refinadas de hemisfericina y más aun del mantenimiento de su estabilidad por periodos prolongados. La

estabilidad de esta enzima, cuando se encuentra en solución, es afectada por el pH, actividad de agua,

cambios de temperatura, entre otros factores del ambiente. La estabilidad es un aspecto importante a

considerar en una enzima para su uso en la industria alimentaria.

La estabilización de hemisfericina refinada puede ser obtenida utilizando tecnologías de

microencapsulación, tales como el secado por aspersión para propósitos de uso industrial. La

microencapsulación se define como como una técnica en donde un compuesto o producto activo es

encapsulado con ciertos polímeros para proporcionarle protección frente radicales libres, humedad u

otras condiciones que son desfavorables para su estabilidad (Desai y Park, 2005).

Briones-Martínez et al., (1994) y Yáñez-Fernández et al., (2001) realizaron estudios preliminares de

planta piloto, utilizando secado por aspersión como una técnica para estabilizar, mediante coloides

protectores, una preparación de hemisfericina refinada obtenida por Ultrafiltración con membrana de 10

kDa.
Diferentes tipos de agentes encapsulantes han sido utilizados para el secado por aspersión; estos

incluyen polisacaridos (almidones modificados, maltodextrinas, goma arábiga, etc.), lípidos y proteínas.

Sin embargo, por sus características de baja viscosidad, solubilidad y formación de emulsiones, un

posible agente encapsulante puede ser la goma arábiga. La goma arábiga es un polisacárido complejo,

con una estructura altamente ramificada, con una cadena principal formada por unidades de D-

galactopiranosa (Bemiller and Whistler, 1996). Ha sido muy utilizada como agente encapsulante en

microencapsulación por secado por aspersión debido a las características antes mencionadas.

El objetivo de esta investigación fue obtener y caracterizar preparaciones encapsuladas del complejo

proteolítico hemisfericina refinada mediante secado por aspersión, utilizando como agente encapsulante

goma arábiga.

2. Materiales y métodos

2.1. Materiales

Los frutos de Bromelia hemisphaerica fueron obtenidos de una plantación del Centro de desarrollo de

Productos Bióticos-IPN, localizado en Yautepec, Morelos. La Goma Arábiga (GA) se compró de

REASOLMR. El reactivo de Bradford fue preparado en laboratorio utilizando: Azul Brillante de Coomassie®

G, Sigma, No. B-1131, etanol y ácido fosfórico de grado analítico. La Albúmina de Huevo fue comprada

de J. T. Baker. La Caseína, Tirosina y Cisteína se compraron de Sigma. Para Electroforesis en Geles de

Poliacrilamida-SDS se utilizó un Marcador de Peso Molecular de Fermentas LIFE SCIENCE de 20 a 120

kDa. El resto de los reactivos que se utilizaron fueron de grado analítico.

2.2. Obtención de hemisfericina refinada.

El fluido enzimático fue obtenido de los frutos de B. hemisphaerica mediante prensado en un extractor de

jugos de acero inoxidable, prototipo de diseño especial (Briones et al., 2000). Mediante congelación-

descongelación al 50% se obtuvieron dos tipos de fluidos enzimáticos, uno concentrado (fracción

descongelada) y otro diluído (fracción congelada). Se midió porcentaje de azúcares con un refractómetro
portátil (Atago N-1E). Con base a facilidad de procesamiento en Ultrafiltración y porcentaje de azúcares

en °Brix, se seleccionó la fracción diluída. Esta fracción fue preparada 1:1 con regulador de fosfatos 0.05

M pH 7.6 y llevada a pH neutro con NaOH, posteriormente fue procesada al 50% del volumen total (50%

en el retenido y 50% en el permeado respectivamente) en Ultrafiltro Lab Scale TM TFF System millipore

utilizando una membrana de 30 kDa. A la parte del retenido se le denominó hemisfericina refinada (HR).

2.3. Microencapsulación por Secado por Aspersión de HR.

La HR obtenida, fue microencapsulada ensayando diferentes concentraciones de goma arábiga ( 7-22%

p/v) y secando por aspersión ( Mini Spray Dryer, modelo B-290, Büchi), con temperaturas de entrada de

105-135 °C (Cuadro 1), un flujo de alimentación de 2.77 mL/min, flujo de aire del 100 % y aire de

aspersión en rotámetro del 30 %. La preparación de la mezcla Goma Arábiga-HR se llevó acabo de la

siguiente manera: se disolvió la goma (en sus diferentes concentraciones) en 20 mL de agua destilada a

70°C, posteriormente se dejo enfriar y se mezcló con HR. La mezcla fue procesada por secado por

aspersión.

Cuadro 1. Diseño de experimentos para

microencapsulación de HR.
Corridas Temperatura °C Concentración de GA (%).
1 105 15
2 110 10
3 120 22
4 130 20
5 110 20
6 120 15
7 130 10
8 120 15
9 135 15

Abreviaciones: HR, hemisfericina refinada; GA, goma

arábiga.

2.4. Caracterización de HR.

La caracterización de HR se llevó a cabo antes y despues de la microencapsulación. Se determinó la

actividad proteolítica por el método de Kunitz (1947) modificado por Ortega y del Castillo (1966). La

concentración de proteína se determinó por el método de Bradford (1976). Se utilizó albúmina de huevo

como proteína estandar. Para ambos métodos las absorbancias fueron medidas en un espectrofotómetro

GENESIS 10 uv, Thermo Electro Corporation. Se realizó electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS

por el método de Schägger (1987) utilizando un equipo de electroforesis Amersham Biosciences

(HoeferTM Dual Gel Caster), con fuente de poder modelo EPS 301, de la misma marca. La estabilidad fue

evaluada por dos meses, repitiendo todas las determinaciones correspondientes a Caracterización. El

almacenamiento se hizo a temperatura ambiente, en un desecador con vacío. La morfología de las

cápsulas se determinó por Microscopía Electrónica de Barrido (MEB) con montaje en cinta de carbon

ionizada con recubrimiento con oro en un Microscópio JSEM-5800LV.

3. Resultados y discusión.

3.1. Obtención de HR por Ultrafiltración.

Se obtuvo un total de 4 Litros de fluído enzimático diluído. Este fluído se seleccionó para Ultrafiltración

debido a su bajo porcentaje de azúcares y otros sólidos presentes en el fluido, ya que, en los procesos de

Ultrafiltración, las membranas suelen saturarse cuando la muestra a procesar tiene altas concentraciones

de diversos compuesto, entre ellos los azúcares. Por otro lado, no podemos eliminar los azúcares y otros

compuestos que no son enzima en su totalidad. Sin embargo, el proceso de Ultrafiltración por membrana

de 30 kDa ayudó a limpiar más finamente el fluido enzimático reduciendo el porcentaje de azúcares y

sólidos disueltos de 8.5% a 5% °Brix. Este punto es muy importante ya que estudios demuestran que los

azúcares que contiene el fluido afectan en el secado por aspersión (Yáñez, et al., 2001), formandose una

especie de hilos que evitan que se tenga una aspersión uniforme.

Por lo tanto, de las fracciones obtenidas por Ultrafiltración, se tomó la de mayor concentración de

proteína y menor porcentaje de azúcares en °Brix (5% para retenido y 6.17% para permeado). Se

seleccionó el retenido de 30 kDa y se le denominó Hemisfericina refinada.

3.2. Obtención de Microcápsulas de HR por Secado por aspersión.

Siguiendo el cuadro 1, se obtuvieron preparaciones encapsuladas de HR por Secado por Aspersión,

utilizando Goma Arábiga como agente encapsulante. Los rendimientos superiores en cuanto a producto

secado fueron de 85.6, 77.85 y 72%, obtenidos con las corridas 2, 7 y 1 respectivamente, mientras que

los rendimientos más bajos fueron de 55.7, 58.3 y 57.7% para las corridas 4, 3 y 5 respectivamente. Las

temperaturas de salida alcanzadas fueron de 70-90 °C, según las temperaturas de entrada de cada

corrida. Cabe señalar que existe una relación entre la concentración de Goma Arábiga y el rendimiento

del producto obtenido, ya que, las corridas 3, 4 y 5, que son las mas bajas en rendimiento, tienen

concentraciones de Goma Arábiga de 22 y 20%. Mientras que las corridas 1, 2 y 7, que son las de mayor

rendimiento, tienen concentraciones de Goma Arábiga de 15 y 10 %. Sin embargo estas variaciones

tambien se pueden atribuír a las diferentes temperaturas manejadas, por ejemplo, las corridas 2 y 7

tienen la misma concentración de Goma Arábiga (10%), pero difieren en temperaturas, 110°C para la

corrida 2 y 130°C para la corrida 7. Esto nos hace pensar que a menor concentración de Goma Arábiga y

menor temperatura se obtiene un rendimiento mayor.

3.3. Caracterización y Evaluación de la Estabilidad de HR.

La actividad proteolítica inicial de HR antes de ser encapsulada fue de 818 UT/mg de proteína. Mientras

que, los niveles más altos de actividad proteolítica residual inicial se obtuvieron en las muestras

encapsuladas a temperatura de 130 y 120 °C, concentraciones de GA de 10 y 15 % (muestras 7 y 8), es

decir, 816 y 738 UT/mg de proteína, respectivamente. Sin embargo con respecto al almacenamiento por

2 meses, se observó un cambio positivo para las muestras 1-6 reflejado en la recuperación de más del

50% en la actividad proteolítica, la muestra 9 también aumento su actividad en un 17% resultando en la

muestra de mayor estabilidad al almacenamiento (Figura 1).

Figura 1. Comparación de Actividad Proteolítica de Inicial y a 2 meses de almacenamiento.

La concentración de proteína con respecto al almacenamiento tuvo un ligero cambio en algunos casos,

como en las corridas 1 y 4, con 0.65 y 0.6 mg/mL de proteína inicial, y despues de 2 meses de

almacenamiento con 0.55 y 0.4 mg/mL respectivamente (Cuadro 2).

Cuadro 2. Concentración de Proteína de las

Muestras Microencapsuladas de HR, antes y
después del almacenamiento.
Corridas CP (mg/mL) CP (mg/mL)
(t=0) (t=2 meses)
HR 0.473 0.473
1 0.655 0.554
2 0.499 0.510
3 0.565 0.571
4 0.6 0.409
5 0.572 0.518
6 0.540 0.423
7 0.396 0.426
8 0.462 0.459
9 0.513 0.434

Abreviaciones: HR, hemisfericina refinada; CP,

concentración de proteína; t, tiempo.
El patrón electroforético muestra la presencia de HR, antes y después del encapsulado con un peso

molecular de 24 kDa (Fig. 2). Al parecer las bandas observadas de los microencapsulados se muestran

con degradaciones, que hacen presente otras bandas pequeñas por debajo de los 24 kDa. Estas

degradaciones observadas, podrian ser las responsables de la pérdida de actividad proteolítica en

algunas corridas del microencapsulado.

Figura 2. Electroforesis en Gel de Poliacrilamida-SDS de las corridas Microencapsuladas de HR.

Carril 1, marcador de peso molecular; carril 2, HR; Carril 3-9, Corridas 1-7 respectivamente.

Las microfotos de las cápsulas obtenidas por MEB muestran una forma característica reportada en otros

trabajos de microencapsulación por secado por aspersión con goma arábiga. Se observan, en su

mayoría, cápsulas colapsadas hacia adentro, es decir, hacia el nucleo de esta misma. Sin embargo en

articulos reportados se ha observado la misma morfología de cápsulas obtenidas con Goma Arábiga

(Anandaraman y Reineccius, 1987) (Fig. 3).

Figura 3. Microfotos de las Cápsulas de HR, obtenidas por MEB a diferente resolución: X1000
(izquierda), x5000 (Superior derecha) y X3000 (inferior derecha).

4. Conclusiones

Se establecieron condiciones para la microencapsulación de hemisfericina refinada por ultrafiltración con

membrana de 30 kDa. Los niveles de actividad proteolítica residual más alta después del proceso fueron

de aproximadamente 99 y 90% en las concentraciones de 10 y 15% de goma arábiga respectivamente

(para las muestras 7 y 8) y después de 2 meses de almacenamiento la más alta fue del 99% para la

muestra 9 (con concentración de goma del 15 % y temperatura de entrada de 134 °C) y la más baja del

75% para la muestra 6. Mediante la electroforesis se identificaron, en 7 muestras encapsuladas, las

bandas correspondientes a HR de 24 kDa respectivamente. Se obtuvieron microfotos de las cápsulas por

MEB a diferente resolución (X1000, X3000 y X5000).

Agradecimientos

Estes estudio fue apoyado por: Proyecto SIP 2009-276. Sistema EDI y SIBE del IPN. Proyecto SIP 2009-

1092. Laboratorio de Microscopía de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas-IPN.

REFERENCIAS

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