12/11/2009

Metode de
analiză a genelor

Expresia genelor Expresia genelor

ADN  ARNm  Proteină  Caracter ADNmut ARNmmut  Proteinăan  Caracteran

5’-ATTGCAAGATTACCATGT
5’- ATTGCAAGATTACCATGT--3’ Catena codogenă (netranscrisă) 5’-ATT
5’- ATTA
ACAAGATTACCATGT
CAAGATTACCATGT--3’ mutaţie G4→A
3’--TAACGTTCTAATGGTACA
3’ TAACGTTCTAATGGTACA--5’ Catena anticodogenă (transcrisă) 3’--TAA
3’ TAAT
TGTTCTAATGGTACA
GTTCTAATGGTACA--5’
Transcripţie Transcripţie
5’--AUUGCAAGAUUACCAUGU
5’ AUUGCAAGAUUACCAUGU--3’ ARNm 5’--AUU
5’ AUUAACAAGAUUACCAUGU
CAAGAUUACCAUGU--3’ ARNmmut

Translaţie Translaţie
Leu – Ala – Arg – Leu – Pro – Cys polipeptid Leu – Thr – Arg – Leu – Pro – Cys polipeptidan
Maturizare
Caracter fenotipic normal Caracter fenotipic anormal

Utilizarea tehnicilor de analiză a

Analiza genelor
acizilor nucleici în medicină
Analiza ADN:
ADN ARN Proteine depistarea mutaţiilor genice → diagnostic precis al bolilor
genetice (prenatal, postnatal precoce);
Secvenţiere Northern-blot Western-blot
identificarea polimorfismului individual → dactiloscopie
PCR RT–PCR Secvenţiere genomică (analiza filiaţiei);
depistarea ADN străin (bacterian, viral) → diagnosticul
Southern-blot Hibridare in situ Analiza funcţiei
bolilor infecţioase şi gradului de infectare.

Hibridare in situ Analiza Analiza ARNm:

histochimică analiza expresiei genice ţesut-specifică;
evaluarea gradului de expresie a genei normale /
patologice.

1
 12/11/2009

Obţinerea FR – fragmentelor de restricţie prin

acţiunea specifică a ER (enzimelor de restricţie)

RFLPs – polimorfismul FR la două persoane X şi Z

-
12 kb

10 kb 10 kb

8 kb

6 kb 6 kb
2,5 kb

10 kb 5 kb
6 kb 4 kb
5 kb
2,5 kb
2 kb

+
M

PCR
Tehnici de analiză a genelor reacţia ciclică de polimerizare
 PCR Principiile PCR  clonarea in vitro = amplificare
 Southern - blot  Replicare semiconservativă, repetată
 Secvenţierea ADN  Specificitatea primerilor sintetici pentru gena–
gena–
ţintă
 Hibridizarea ADN-
ADN-ţintă – primer ←
 Principii de bază complementar:
 Denaturare termică a ADN - de cercetat
 Etapele principale
 Modificarea ciclică a temperaturii:
 Componente necesare (la general)  Denaturare
 Indicaţii şi limite  Renaturare
 Sinteză

2
 12/11/2009

Clonarea in vitro – PCR

(reacţia ciclică de polimerizare a noilor
copii de ADN)

Componentele necesare pentru Etapele tehnicii PCR

clonarea in vitro (PCR): A. Pregătirea amestecului cu toate componentele reactante
- ADN de cercetat
B. Repetarea automată a procedurilor de denaturare-
- Primeri specifici secvenţei de clonat – renaturare-elongare de 30-35 ori
complimentari secvenţelor flancante
•Denaturarea ADN la 96oC
- Taq-polimeraza – ADN-polimerază termostabilă •Răcirea până la temperatura de renaturare a primerilor
•Elongarea catenelor ADN la 72oC
- Dezoxiribonucleozidtrifosfaţi (dNTP)
- Instalaţie de modificare ciclică a temperaturii: C. Analiza produşilor PCR
- tº de denaturare ADN - electroforeza
- tº de renaturare (ADN+primer) - colorarea
- interpretarea rezultatelor
- tº de polimerizare (elongarea catenelor noi de
ADN)

Extragerea ADN Pregătirea Amplificarea

componentelor pentru
ADN-ţintă
PCR

Electroforeza Colorarea şi Interpretarea

produşilor PCR vizualizarea produşilor rezultatelor
PCR

3
 12/11/2009

Avantajele PCR
Utilizarea PCR
Metodă rapidă
•Metodă ieftină •Identificarea inserţiilor/deleţiilor nucleotidice
•Utilizarea cantităţilor mici de material analizat •Identificarea mutaţiilor punctiforme (substituţiile
•Nu necesită izotopi radioactivi nucleotidice)
•Interpretarea uşoară a rezultatelor •Identificarea expresiei genice (RT(RT--PCR
PCR))
•Dactiloscopia genomică (filiaţie)
Dezavantajele PCR •Identificarea agenţilor infecţioşi
•Identificarea gradului de infecţie (quantitative
(quantitative PCR)
PCR)
•Necesitatea cunoaşterii secvenţei nucleotidice
amplificate
•Necesitatea primerilor sintetici, specifici
secvenţei analizate

Identificarea inserţiilor / deleţiilor Identificarea mutaţiilor punctiforme

Identificarea agenţilor infecţioşi

4
 12/11/2009

Stabilirea paternităţii (filiaţiei) Tehnica

Southern-blot
 Bazată pe RFLPs
 Hibridizare cu sonde marcate
 Cu transferul FR din gel-electroforeză pe un
suport solid (pe membrane de nitroceluloză)

Hibridarea acizilor nucleici

Tehnica Southern-
Southern-blot
•Unirea complementară a fragmentelor
(moleculelor) de acizi nucleici:
•ADN de cercetat cu
•sonda oligonucleotidică Extragerea ADN Restriţia ADN Electroforeza ADN

•În reacţie participă molecule monocatenare

•Moleculele ADN-
ADN-ţintă sunt fixate
•Moleculele
Moleculele--sonde sunt marcate radioactiv sau
fluorescent Denaturarea şi Hibridare cu sonda Autoradiografia
•Identificarea complexelor hibride se realizează transferul ADN
pe membrane Vizualizarea şi
prin intermediul autoradiografiei interpretarea
rezultatelor

Utilizarea tehnicii RFLPs şi analiza genotipului

Southern--blot
Southern
Alela Normală cu 3 SR Alela mutantă cu 2 SR, mutaţie în SR2

• Identificarea inserţiilor / deleţiilor mari

• Identificarea mutaţiilor punctiforme ce C (mm)
afectează SR
• Dactiloscopia genomică RFLPs B (Nm)

A (NN)

Electroforeza FR a 3 persoane A,B şi C

5
 12/11/2009

Tehnica
Northern-blot
Northern-
•Extragerea ARN din ţesutul ţintă

•Electroforeza ARN în condiţii de

denaturare

•Transfer pe membrană de
nailon

•Hibridarea cu sonda marcată

•Autoradiografia

Tehnica Northern-
Northern-blot Utilizarea tehnicii
Northern--blot
Northern
•Identificarea expresiei genice în anumite
Extragerea ARN Electroforeza ARN ţesuturi, anumite condiţii

•Identificarea variantei de splicing a proARNm

•Identificarea nivelului de expresie

Hibridare cu sonda Autoradiografia
Transferul ARN •Identificarea agenţilor infecţioşi (ribovirusuri)
pe membrane Vizualizarea şi
interpretarea
rezultatelor

Identificarea nivelului
de expresie şi a variantei
de splicing

6
 12/11/2009

Secvenţierea ADN ADNmutARNmmut  Proteinăan  Caracteran

Stabilirea secvenţei de nucleotide

5’-ATT
ATTA
ACA
CAA
AGATTACCATGT
GATTACCATGT--3’ mutaţie G4→A
3’--TAA
3’ TAAT
TGTTCTAATGGTACA
GTTCTAATGGTACA--5’
Metoda chimică (tehnica Maxam-
Maxam-Gilbert, 1973
1973)
Transcripţie

Metoda dideoxi (tehnica Sa

Sanger, 1975
1975) 5’-AUU
AUUAACA
CAA
AGAUUACCAUGU
GAUUACCAUGU--3’ ARNmmut

Translaţie
Metoda automată (cu utilizarea agenţilor fluorescenţi) Leu – Thr – Arg – Leu – Pro – Cys polipeptidan

Caracter fenotipic anormal

5’-ATTACA
ATTACAA
3’--TAA
3’ TAAT
AGATTACCATGT
GATTACCATGT--3’ catena codogenă
TGTTCTAATGGTACA
codogenă
GTTCTAATGGTACA--5’ catena anticodogenă (matriţă)
Tehnica dideoxi
3’-TAA
3’-TAAT
TGTTCTAATGGTACA
GTTCTAATGGTACA--5’ •Sinteza enzimatică a
5’-ATTA
ATTACC-3’
5’-ATTA -- primer marcat P32 ADN
3’-TAA
3’-TAAT
TGTTCTAATGGTACA
GTTCTAATGGTACA--5’
5’-ATTA
ATTACCA-3’ pentru ADN-polimerază •Utilizarea în paralel a
3’-TAA
3’-TAAT
TGTTCTAATGGTACA
GTTCTAATGGTACA--5’ A, T, C, T – dNTP (2’
(2’-dNTP)
5’-ATTA
ATTACA
CAA
A-3’ nucleotidelor ce
pentru sinteza noilor catene
3’-TAA
3’-TAAT
TGTTCTAATGGTACA
GTTCTAATGGTACA--5’ conţin deoxiriboză şi
5’-ATTA
ATTACA
CAA
AG-3’ A, T, C, T – ddNTP (2
(2’’,3
,3’’-ddNTP
dNTP))
pentru stoparea sintezei
dideoxiriboză
3’-TAA
3’-TAAT
TGTTCTAATGGTACA
GTTCTAATGGTACA--5’
5’-ATTA
ATTACA
CAA
AGA-3’ •Stoparea sintezei în
3’-TAA
3’-TAAT
TGTTCTAATGGTACA
GTTCTAATGGTACA--5’
5’-ATTA
ATTACA
CAA
AGA
GAT
T-3’ cazul incorporării
ddNTP
3’-TAA
3’-TAAT
TGTTCTAATGGTACA
GTTCTAATGGTACA--5’
5’-ATTA
ATTACA
CAA
AGAT
GATTT-3’

5’-ATTA
ATTAC
CA-3’
5’-ATTA
ATTACA
CAA
A-3’ Tehnica dideoxi
A 5’-ATTA
ATTACA
CAA
AGA-3’
•Extragerea ADN
5’-ATTA
ATTACA
CAA
AGATT
GATTA
A-3’ •Denaturarea ADN
5’-ATTA
ATTACA
CAA
AGATTACC
GATTACCA
A-3’
A T C G •Sinteza catenelor
5’-ATTA
ATTACA
CAA
AGA
GAT
T-3’ - complementare utilizând
5’-ATTA
ATTACA
CAA
AGAT
GATTT-3’ primeri marcaţi cu 32P în
T prezenţa dNTP şi ddNTP
5’-ATTA
ATTACA
CAA
AGATTACCA
GATTACCAT
T-3’
•Electroforeza în condiţii
5’-ATTA
ATTACA
CAA
AGATTACCATG
GATTACCATGTT-3’
de denaturare
5’-ATTA
ATTACA
CAA
AG-3’ •Vizualizarea fragmentelor
G
5’-ATTA
ATTACA
CAA
AGATTACCAT
GATTACCATGG-3’ marcate prin
5’-ATTA
ATTAC
C-3’ autoradiografie
C 5’-ATTA +
ATTACA
CAA
AGATTA
GATTAC
C-3’
5’-ATTA
ATTACA
CAA
AGATTAC
GATTACC
C-3’ 5’-ATTA
ATTACA
CAA
AGATTACCATGT
GATTACCATGT--3’

7
 12/11/2009

-
Metoda automată

(+) 5' TAAATGGCTA

TAAATGGCTA.......3'(-)

Hibridarea in situ Hibridarea in situ pentru

depistarea secvenţelor ADN
•Pregătirea
preparatelor de
cromozomi

•Denaturarea ADN

•Hibridarea cu sonda
marcată

•Vizualizarea la
Hibridarea in situ cu Hibridarea in situ cu
microscopul optic
utilizarea preparatelor utilizarea preparatelor
de cromozomi metafazici cu nuclei interfazici

Hibridarea in situ
pentru depistarea
secvenţelor ARN

Hibridarea in situ cu Analiza

utilizarea probei sens (stânga) histochimică –
şi antisens (dreapta) identificarea
proteinelor în ţesut

8
 12/11/2009

Rolul practic al tehnicilor de analiză a acizilor

nucleici:
1. Cercetare – secvenţierea ADN, formarea bibliotecilor de
gene, studiul expresiei genice, studiul mecanismelor de
reglare, studiul consecinţelor mutaţiilor.
2. Depistarea persoanelor purtătoare de mutaţii patologice
- prenatal sau postnatal, cu scop de prevenire a naşterii
copiilor cu anomalii genetice sau manifestării unor
patologii severe.
3. Terapie genică (alegerea genei ţintă, construirea
vectorilor de gene etc.).
4. Depistarea ADN străin (viral sau bacterian) în
diagnosticul bolilor infecţioase.
5. Identificarea polimorfismelor individuale în analiza
filiaţiei, în criminalistică.