TP de Microbiologie Dr. MESSIS A.

Introduction au Laboratoire de Microbiologie

Règles à suivre lors des séances de TP

Port de la blouse de rigueur. La blouse en coton doit être boutonnée ;

Nouer les cheveux longs. S’asseoir pour manipuler et pour observer au microscope ;
Se laver les mains. Désinfecter la paillasse ;
Éviter les courants d'air ; limiter les déplacements ; éviter de parler ;
Aucun pipetage à la bouche ;
Ne pas porter ses doigts ou tout objet à sa bouche. Ne pas manger, boire, fumer ;
Eviter de mettre tout objet personnel en contact avec les bactéries ;
Marquer soigneusement les lames, tubes, boîtes, etc... avec un feutre indélébile ;
Les manipulations seront faites dans un rayon de 20 cm autour de la flamme du bec
Bunsen ;
Ne pas éteindre la flamme sans couper l'arrivée du gaz ;
Ne pas laisser à proximité de la flamme des objets ou liquides inflammables (papiers,
alcool, etc...).

La désinfection

paillasse : alcool 70° (ou eau de Javel à 3° chlorométriques) à l'aide d'un papier jetable ;
peau contaminée : savon et alcool 60° ;
Aucun instrument (pipette, anse) ni objet contaminé ne doit être posé directement sur la
paillasse ;
Flambage des instruments et de l’orifice des tubes : sert à stériliser localement tout objet
métallique ou en verre. Le flambage se fait dans le cône bleu de la flamme.
Orifice des tubes : flamber 1 à 2 secondes. A faire après chaque ouverture et avant chaque
fermeture de tube ;
Anse de platine : tenir l’anse verticalement ; placer la boucle métallique dans la flamme ;
attendre qu’elle devienne rouge. La maintenir 5 secondes. A faire avant et après chaque
utilisation
Pipette Pasteur : La pipette est utilisée soit boutonnée (fermée) pour prendre une colonie,
soit ouverte pour prélever un liquide. Il faut l’ouvrir avant le flambage. Tenir la pipette
horizontalement et passer lentement la partie effilée de la pipette 5 à 6 fois dans la flamme.
Laisser refroidir anses et pipettes environ 10 secondes avant tout contact avec un liquide,
une colonie bactérienne…
Ne jamais passé du plastique ou la pince en bois dans la flamme.

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TP n° 01 : Les différents procédés de stérilisation

Il est bon de rappeler que la stérilisation est communément considérée comme la destruction
de tous les microorganismes d’un milieu et ce, quelles que soient leurs structures ou leurs
propriétés. En microbiologie, le but de la stérilisation est d'une part de maîtriser les micro-
organismes introduits dans le milieu d'étude, et d'autre part d'éviter la contamination du milieu
extérieur et des personnes. Il existe plusieurs moyens de stérilisation (la chaleur, la filtration,
les radiations et les agents chimiques). Pour ce, il est indispensable de disposer d’un certain
nombre d’équipements et de matériels tels que : l’autoclave, le four Pasteur, les systèmes de
micro ou ultra filtration à membrane, lampes UV, bec Bunsen …).

I. Les systèmes de stérilisation

I.1. La stérilisation par la chaleur

La stérilisation par la chaleur correspond à un traitement thermique permettant, au plan
microbiologique d’éliminer tous les microorganismes pathogènes, y compris ceux qui sont
sous forme sporulée. On distingue deux procédés de stérilisation à la chaleur :

1. Chaleur sèche :
Pour certains matériels ou objets résistants à la chaleur (verrerie par exemple) et dont
l’hydratation n’est pas souhaitable, la chaleur sèche est utilisée pour obtenir la stérilisation.

Bec Bunsen : Le passage dans la flamme du bec Bunsen de la surface du matériel non
inflammable assure une parfaite stérilisation. On stérilise de cette façon les fils de platine et
les pipettes Pasteur.

Le four Pasteur est un four-étuve à air chaud et sec, permet la stérilisation du matériel en
verre ou en métal et doit pouvoir atteindre une température de 170 - 180°C.

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2. Chaleur humide

La stérilisation par la chaleur humide, reconnaît trois modalités :

La stérilisation à l’autoclave : Le chauffage a lieu sous pression de vapeur d’eau, les trois
paramètres essentiels pour assurer l’efficacité de la stérilisation à l’autoclave sont le temps
d’exposition à la vapeur, la température et le niveau de pression. Chaque cycle d’utilisation
est contrôlé pour assurer que la pression adéquate, la température et la durée du cycle ont été
atteints.

La pasteurisation : la pasteurisation est un traitement à chaud de liquides, tuant des

pathogènes mais pas forcément toutes les bactéries. Les températures de la pasteurisation
basse se situent entre 75 à 80°C (10 à 30 min) et haute pasteurisation (UHT ; 75 à 90°C
pendant quelques secondes).

Tyndallisation : C’est un traitement thermique équivalent à des pasteurisations répétitives

séparées par des passages à des températures voisines de 30 à 40°C de l’ordre de 10 à 24 h à
intervalles réguliers. Au cours de la pasteurisation, seules les formes végétatives sont
inactivées tandis qu’au cours des incubations à 30-40°C pendant 10 à 24 h successives à la
pasteurisation, la plupart des spores thermo-résistantes sont à même de germer en formant des
cellules végétatives qui sont alors inactives par la pasteurisation suivante.

II. La filtration
La filtration est une technique qui consiste à faire passer un liquide à travers un
filtre dont les pores ont un diamètre de 0,2 μm. Cette technique est intéressante lors
d'utilisation de produits thermolabiles comme certains acides aminés aromatiques, vitamines,
hormones de croissance, acides nucléiques et la majorité des antibiotiques.
III. Radiations

La stérilisation par les U.V. est utilisée au laboratoire pour la décontamination de l’air
et des paillasses situées sous la hotte de protection. D’autres radiations peuvent servir pour la
stérilisation industrielle des matières plastique et de produit pharmaceutiques, tel que les
rayons X et γ sont considérés comme des moyens de stérilisation à froid des conserves
alimentaires ou autres produits.

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IV. Agents chimiques

Ils sont utilisés en général pour la désinfection des salles de travail et pour la destruction des
germes portés par des instruments souillés. Ce mode de stérilisation doit être
systématiquement pratiqué dans le laboratoire pour les lames et pour la verrerie qui ne passe
pas en autoclave. Tous les composés chimiques possédant un effet antimicrobien ne sont pas
utilisables comme antiseptiques ou désinfectants. Certains, comme les fluorures ou les
cyanures sont de puissants poisons cellulaires dont la toxicité interdit l’emploi. D’autres, tels
que les antibiotiques et les sulfamides sont traités à part en raison de leur rôle thérapeutique.

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TP n° 02 : Examen Microscopique « Etat frais »

BUT :

Il permet l’étude microscopique des bactéries vivantes, en l'absence de toute fixation ou

coloration.

Cette méthode permet d'observer :

- la MORPHOLOGIE des bactéries

- le MODE de GROUPEMENT
- la MOBILITE
- la DENSITE ou PROPORTION de chaque microorganisme en cas de mélange

 MATERIEL NECESSAIRE :

- lames

- lamelles

- microscope photonique : objectif x 10 et x 40

 TECHNIQUE :

En microbiologie, une préparation à l’état frais consiste à enfermer entre lame et lamelle une
suspension de micro-organismes vivants.
L’ancienne technique du lutage est actuellement abandonnée (sauf exception lors de l’étude
des bactéries anaérobie strictes). Il convient donc de réaliser une préparation correcte (sans
déborder) afin de limiter la diffusion des micro-organismes dans l’environnement du
laboratoire.

1. Prélèvement :

 A partir d’une culture liquide : Prélever un aliquote de suspension à l’anse (ou à la pipette
stérile)

 A partir d’un milieu solide : réaliser une suspension en eau physiologique à partir d’une
culture jeune et prélever un aliquote de suspension à l’anse de platine (ou à la pipette
stérile)

 A partir de produits alimentaires ou biologiques : selon le cas l’examen sera direct ou

nécessitera une dilution (milieu solide) ou une concentration (urines)

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2. Dépôt de la goutte de suspension sur la lame : la lame doit être propre et sèche

3. Dépôt de la lamelle : Déposer délicatement une la lamelle selon la technique

décrite ci-dessous :

avancer la lamelle lorsque la goutte laisser tomber

vers la préparation adhère à la lamelle la lamelle

4. Si la préparation est incorrecte, modifier comme ci-dessous :

Préparation
Préparation correcte. incorrecte.
Présence de beaucoup de bulle d’air.
Le liquide est bien Elles ne doivent pas apparaître sur le Recommencer
réparti champ montrer.

5. Mise au point :

 Repérer la bordure d’une bulle d’air à l’objectif x10.

 Faire la mise au point en faible luminosité ( condensateur baissé et diaphragme légèrement
fermé) objectif x40.
 Attendre 1 minute pour ne pas confondre une mobilité positive et un simple mouvements
liquidiens
 L’observation ne doit pas excéder 3 minutes (bactéries sensibles à la chaleur)
 Eliminer les lames dans le bac de 3 en 1

6. Observations :

 Rechercher la motilité des bactéries aérobies à partir d'Etat Frais en bordure d'une bulle
d'air.
 Rechercher la motilité des bactéries anaérobies strictes à partir de préparations lutées

Une bactérie MOBILE doit se déplacer dans le champ microscopique avec un

mouvement qui lui est propre, les autres bactéries restant immobiles.

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Les bactéries mobiles peuvent laisser deviner leurs ciliatures :

- un déplacement rapide linéaire : ciliature susceptible d'être polaire

- un déplacement lent, circulaire et sinueux : ciliature susceptible d'être péritriche

 Présentation des résultats d’observation :

ETAT FRAIS objectif x 40 (grossissement 400)

FORME MOBILITE GROUPEMENT DENSITE

Bacilles ou - ou + vraisemblablement Paire ou Isolé ou Evaluation de la

coque Chaînettes ou amas proportion de
péritriche ou polaire selon le cas chaque germe
dans un mélange
et préciser la vitalité

7. Causes d’erreur :

 Mobilité faussement négative :

- nature du milieu : milieux sélectifs, milieux trop secs, milieux trop âgés

- température de croissance : en fonction de l'espèce

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- rapport avec l'O2 : bactérie mobile aérobie observée dans une préparation sans air
(ou inversement pour les anaérobies)

- fautes techniques : observations trop tardives, utilisation d'instruments non refroidis...

 Mobilité faussement positive :

- mouvements transmis par les courants du liquide, qui entraînent toutes les bactéries
dans le même sens.

- mouvements browniens : mouvements désordonnés autour d'un axe, sans

déplacement véritable.

- mouvements pendulaires : mouvements de certaines espèces, prenant comme axe une

de leurs extrémités (Shigella) ce n'est pas une motilité.

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TP n° 03 : Coloration de GRAM

 BUT : Il permet l’étude microscopique des bactéries mortes après fixation et coloration.
La coloration de GRAM permet de différencier des bactéries dites Gram + de bactéries dites
Gram -.

Cette méthode permet d'observer :

- la MORPHOLOGIE des bactéries

- le MODE de GROUPEMENT
- la COULEUR : Gram + ou -
- la DENSITE ou PROPORTION de chaque microorganisme en cas de mélange

 MATERIEL NECESSAIRE :

- une lame

- du Violet de Gentiane (ou Violet Cristal sous forme sèche)

- du lugol

- de l'alcool (éthanol à 95°) très peu dilué

- de la Fuschine fraîchement préparée

- de l'eau déminéralisée

- du papier filtre

- microscope photonique : objectif x 40 et x100

 TECHNIQUE :

8. Prélèvement :

 A partir d’une culture liquide : prélever un aliquote de suspension à l’anse (ou à la pipette
stérile) après avoir homogénéisée le milieu

 A partir d’un milieu solide : réaliser une suspension en eau physiologique à partir d’une
culture jeune et prélever un aliquote de suspension à l’anse de platine (ou à la pipette
stérile)

 A partir de produits alimentaires ou biologiques : prélever un aliquote du produit (dilué ou

non) à l’anse (ou à la pipette stérile) après avoir homogénéisée le milieu.

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9. Réalisation du frottis:

Etaler sur 1 à 2 cm par un mouvement circulaire en partant du centre de

la lame

Le frottis réalisé doit être :

- MINCE et HOMOGENE, étendu sur la lame sans toucher les bords

- Réalisé sur une lame PROPRE et DEGRAISSEE, une goutte d'eau

déposée en surface doit s'y étaler complètement.

10. Séchage :

- à la température du laboratoire, si possible

- ou bien à chaleur douce : platine chauffante à 37° ou au-dessus de la veilleuse du bec

bunsen, à hauteur suffisante. NE JAMAIS CHAUFFER BRUTALEMENT

11. Fixation :

But : tuer les bactéries, fixer leur structure cytologique, et les faire adhérer à la lame.

 Fixation par la chaleur :

- à utiliser seulement pour les frottis effectués à partir de cultures bactériennes

- passer la lame -frottis situé sur le dessus- dans la flamme chauffante,

LENTEMENT et 3 à 4 fois de suite (attention de bien tenir la lame avec une pince) et
laisser refroidir.

 Fixation par l'alcool : employé quel que soit le produit traité.

- recouvrir la lame pendant 5 min avec de l’alcool puis rincer à l’eau déminéralisé et
égoutter le frottis avant coloration.

12. Coloration :

Principe : Cette coloration est une coloration complexe qui permet de différencier les
bactéries d'après leur forme et leur affinité pour les colorants.

La coloration permet de distinguer les bactéries GRAM + des GRAM – grâce à leurs
différences de nature de paroi. Les bactéries à Gram négatif ont une paroi plus fine et riche en
lipides, alors que les bactéries Gram positifs ont une paroi épaisse et pauvre en lipide.

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MODE OPERATOIRE
ETAPES TEMPS PRINCIPE

Le colorant violet pénètre dans les

- Recouvrir la lame de cristal cellules bactériennes
violet ou violet de gentiane

COLORATION
1 minute
PRIMAIRE - Rincer à l’eau distillée et
récupérer le cristal violet dans
un bêcher (ne pas le jeter dans
le bac à coloration)

- Recouvrir de Lugol Il se forme un complexe chimique entre

le violet et le Lugol qui fixe le violet et
MORDANÇAGE 1 minute colore le cytoplasme de toutes les
- Rincer à l’eau distillée et bactéries en violet.
l’égoutter

L'alcool dissout le violet de gentiane, si

- Tenir la lame inclinée et
faire couler pendant quelques
secondes de l'alcool à 95°
jusqu'à écoulement incolore.
DECOLORATION
- Rincer immédiatement à
l’eau distillée et égoutter
la paroi bactérienne est perméable à
l'alcool (les lipides sont dissous par
l’alcool), celui-ci pénètre dans les
5 bactéries et décolore leur cytoplasme :
secondes les bactéries deviennent incolores.
environ
Si les bactéries ont une paroi
imperméable à l'alcool (épaisse et sans
lipides), elles restent colorées en violet et
elles sont dites GRAM + ou positif.

La fuschine recolore en rose les bactéries

- Recouvrir la lame de précédemment décolorées : les bactéries
fuschine Gram – ou négatif.
COLORATION
1 minute
SECONDAIRE
- Rincer à l’eau distillée

- Egoutter entre 2 morceaux

SECHAGE de papier-filtre et laisser
sécher

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13. Mise au point :

 Repérer les bactéries à l’objectif x40.

 Déposer une goutte d’huile à immersion sur le frottis
 Faire la mise au point en forte luminosité ( condensateur levé et diaphragme ouvert) objectif x100.
 Se placer dans un endroit où la répartition des bactéries est homogène et la coloration nette
 Eliminer les lames dans le bocal déchets non infectieux

14. Observations :

On peut noter la morphologie des bactéries et la coloration de celles-ci : les bactéries violettes sont
dites Gram positives, celles qui sont roses sont dites Gram négatives. On peut également noter
l'homogénéité de coloration de la bactérie.

 Présentation des résultats d’observation :

COLORATION DE GRAM objectif x 100 (grossissement 1000) + huile à immersion

FORME TAILLE GRAM GROUPEMENT POLYMORPHISME

-
Taille moyenne et fin Paires - ou + de taille ou de coloration
Bacilles homogène
3 µm x 1 µm Isolés
Bouts arrondis
et d’autres plus petits Chaînettes
Bords parallèles
2µm x 1µm amas

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