Universitatea Tehnică Gheorghe Asachi,

Facultate de Inginerie Chimică și Protecția

Mediului – Iași

BIOTEHNOLOGII INDUSTRIALE

Coordonator: STUDENT:

Munteanu Madalina

Grupa 2404

2015-2016

Facultate de Inginerie Chimică și Protecția Mediului

1
 Acidul Glutamic

Coordonator: STUDENT:

Munteanu Madalina

2015-2016

Cuprins
Capitolul I....................................................................................................................................4
Memoriu tehnic........................................................................................................................4
Capitolul 2. Tehnologia de fabricaţie.........................................................................................5
2.1 Domeniile de utilizare şi proprietaţile produsului............................................................5
2.2 Variante tehnologice........................................................................................................11
2.3 Alegerea variante optime.................................................................................................14

2
 2.4 Descrierea procesului tehnologic adoptat........................................................................16
2.5 Materii prime,materii intermediare şi materii auxiluare..................................................28
2.6 Mecanismul reacţiilor chimice........................................................................................37
2.6.1 Cinetica procesului de fermentatie...........................................................................38
2.6.2 Modele cinetice pentru viteza de crestere a masei celulare......................................41
2.6.3 Modele cinetice pentru viteza de formare a produsului............................................42
2.6.4 Modelul Gaden.........................................................................................................50
2.6.5 Termodinamica proceselor de fermentație...............................................................51
Capitolul 3. Controlul fabricaţiei..............................................................................................56
3.1 Controlul, reglarea şi automatizarea procesului tehnologic.............................................56
3.1.1 Reglarea automată a temperaturii.............................................................................57
3.1.2 Reglarea automată a pH-ului....................................................................................60
3.1.3Reglarea automată a concentraţiei.............................................................................64
3.1.4 Reglarea concentraţiei oxigenului............................................................................66
3.1.5 Reglarea nivelului spumei........................................................................................73
3.2 Controlul de calitate.........................................................................................................77
3.2.1 Metode de analiza a materiilor prime si a materialelor intermediare.......................77

Capitolul I

Memoriu tehnic

Aminoacizii sunt combinaţii organice care conţin în moleculă una sau mai multe
grupări amino şi carboxilice. Aminoacizii sunt folosiţi de către organism pentru obţinerea
proteinelor.

3
 Acidul glutamic (abreviat Glu sau E) este un alfa monoaminoacid dicarboxilic alifatic,
neesenţial (deoarece poate fi sintetizat şi de către organism). Este codificat de codonii
GAA/GAG din lanţul peptidic. Are un pH de 4,1.
L-aminoacizii pot fi obţinuţi, industrial, din hidrolizate proteice (ex. L-cisteină din
hidrolizat de păr), dar în urma unor procese laborioase şi poluante; sinteza chimică e o altă
cale de producere a aminoacizilor, dar în formă racemică (rezultă ambele forme D,L).
În prezent, majoritatea aminoacizilor se produc prin biosinteză cu ajutorul bacteriilor
sau al enzimelor, cu avantajul obţinerii selective numai a izomerului asimilabil de către
organismul uman: L-aminoacid.
Acidul glutamic a fost descoperit şi identificat pentru prima dată în gluten de dr. Karl
Ritthausen (Germania, 1866). În 1883 Schultze şi Bosshard i-au descris proprietăţile, după ce
l-au separat din sucul de sfeclă.
Profesorul Kikunae Ikeda (1864-1936) a întreprins încă din 1907 cercetări privind
corelaţia între conţinutul în acid glutamic natural al unor produse alimentare japoneze şi gustul
specific al acestora. Reuşeste să identifice prezenţa unui conţinut de peste 1% glutamat în
unele tipuri de combu (condiment utilizat în Japonia). Concomitent vizează aspectele practice,
înregistrându-şi descoperirea ca patent industrial (14805 din 1907).

Ikeda fundamentează trei aspecte: conţinutul natural de acid glutamic din alimente,
determinarea unui gust specific (numit de el umami- după cuvântul japonez gustos sau
delicios) şi stabilirea compusului glutamic cel mai solubil în apă, respectiv cel mai stabil,
anume glutamatul de sodiu.

În 1917, la iniţiativa sa, firma Ajinomoto Co. Inc. condusă de Saburosuke Suzuki
asimilează şi pune la punct până în 1920 o producţie industrială de glutamat de sodiu de
biosinteză obţinut prin fermentarea melasei, separat şi purificat. Până în prezent, această
companie încă mai produce o treime din cele 1,5 milioane tone ale producţiei mondiale de
MSG (glutamat monosodic). În anii 1920 deţinea însă monopolul absolut al acestui produs,
care s-a răspândit în perioada interbelică în toată Asia şi a devenit un ingredient de bază al
preparatelor culinare japoneze şi chinezeşti.

După cel de-al doilea război mondial MSG este tot mai mult utilizat şi în SUA, ca
urmare a răspândirii restaurantelor chinezeşti, afluxului de populaţie asiatică pe coasta de est şi
deprinderilor alimentare ale militarilor americani care şi-au efectuat serviciul în Extremul
Orient.

4
 Începută cu acidul L-glutamic, biosinteza microbiană de Corynebacterium glutamicum
a realizat, cu mutanţi ai acestei bacterii, alţi aminoacizi importanţi, ca L-lizină şi L-treonină.
În prezent, utilizând tehnica RMN cu 13C, s-a reuşit descifrarea căilor metabolice ale
biosintezei bacteriene, cunoscând, astfel, punctele cheie asupra cărora s-ar interveni prin
recombinare genetică, supraexprimând genele relevante (inginerie metabolică).
Dezvoltarea în ultimii ani a metodelor de secvenţiere completă a genomului bacterian a
permis cunoaşterea genomului Corynebacterium glutamicum.

Capitolul 2. Tehnologia de fabricaţie

2.1 Domeniile de utilizare şi proprietaţile produsului

Acidul glutamic se utilizează în industria alimentară fiind un potenţiator de aromă

(glutamatul monosodic MSG, sarea acidului glutamic), obţinut prin biosinteză din materii
prime vegetale sau animale.

La nivel mondial au avut loc nenumărate discuţii în contradictoriu cu privire la

efectele consumului de MSG , adăugat ca aditiv în diverse alimente. S-a afirmat că acest
adaos, devenit aproape universal mai ales în conservele de carne şi peşte, sosuri, dressinguri,
în unele condimente complexe ( tip Vegeta, Delikat ), are drept scop să atenueze şi să
mascheze gustul natural şi adesea mai puţin savuros al unor preparate. Aceeiaşi acuzaţie s-a
adus patronilor de restaurante cu profil asiatic care funcţionează pretutindeni în lume, bănuiţi
că exagerează în folosirea MSG.

Profesorul Ikeda a emis ideea că ansamblul de compuşi glutamici, în cantitate mai

mare sau mai mică, imprimă şi conferă un gust specific distinct alimentelor în care se află.
Treptat s-a confirmat că acesta este un gust distinct, la fel de relevant precum sunt celelalte
patru gusturi de bază, dulce, sărat, amar şi acru, fiind considerat în prezent al cincilea gust de
bază. Este totuşi un gust relativ greu de definit, mulţi caracterizându-l prin calificativele bogat,
plin, corpolent, consistent, asociat cu aroma de carne, intensiv, într-un cuvânt-delicios
(umami).

Ikeda a făcut o paralelă între sare, care este produsul specific pentru gustul sărat şi
glutamatul de sodiu- produsul specific pentru gustul delicios. În prezent s-a stabilit că doar
configuraţia L a acidului glutamic liber determină proprietăţile legate de gust.

5
 În urma unor studii aprofundate privind fiziologia şi biochimia intimă a formării
gusturilor de bază în cavitatea bucală, continuată prin reflectarea lor la nivel cerebral, s-a
confirmat că gustul umami, alături de celelalte gusturi de bază, are proprii receptori specifici.

Cercetătorii Nirupa Chaudhari and Stephen Roper de la Universitatea din Miami

(1997) şi-au bazat cercetările lor asupra receptorului umami pe un cunoscut receptor proteic
din creier: mGluR4- special pentru glutamat, care joacă un rol important ca neuro-
transmiţător. Într-adevăr, au reuşit să găsească o proteină foarte asemănătoare pe limbă, cu
singura diferenţă că este mult mai puţin senzitivă decât cea din creier. Ei au numit receptorul
“taste-mGluR4”. Marea sensibilitate a acestui receptor neural este explicabilă, deoarece
concentraţia glutamatului în sistemul nervos este mult mai redusă decât în cavitatea bucală,
atunci când consumăm un produs specific mai bogat în glutamaţi.

Doi oameni de ştiinţă din SUA, dr. Ch. S. Zuker şi dr. N. J. P. Ryba, au abordat de
câţiva ani un studiu mai general, de identificare a receptorilor celulari care permit
recunoaşterea gustului la fiinţele umane. Zuker a stabilit că aceşti receptori pot fi deschişi (pot
opera) pe baza anumitor coduri sau chei, fiecare corespunzătoare unui anumit gust. Împreună,
cei doi au identificat receptorii pentru gusturile dulce şi amar. În continuare, au identificat şi
un receptor numit T1 R1+3considerat că este deschis de gustul aminoacizilor.

Gustul amar ne permite să recunoaştem eventuale substanţe toxice. Gustul prea acru ne
pune în gardă asupra consumului de fructe încă nemature, necoapte. Gustul sărat ne ajută să

recunoaştem prezenţa cationilor de Na+, care prezintă o mare importanţă pentru organism.

Gustul dulce este în mod evident asociat cu senzaţia de plăcere şi cu secreţia de

endorfine în creier, situaţie care apare şi atunci când consumăm alimente cu gust “delicios”.
Ambele clase de substanţe, glucidele solubile şi aminoacizii sunt deosebit de importante
pentru metabolism. Bernd Lindemann, un cercetător de la Universitatea Saarland din
Germania consideră că gustul umami caracteristic aminoacizilor ne călăuzeşte spre proteine,
care nu au un gust propriu.

Glutamatul se foloseşte cel mai mult în alimentele fabricate artificial şi în

semipreparate gen: supe concentrate, sosuri, condimente, mezeluri, îngheţată, budinci. Rolul
lui este de a da impresia creierului că acel aliment este foarte gustos.Acidul glutamic este

6
prezent în alimente ca:peşte,ouă,carne şi este responsabil pentru cele 5 gusturi principale ale
omului.În Australia glutamatul este interzis, însă este tolerat în Statele Unite. Majoritatea
persoanelor sunt sensibile la glutamat invocând simptome ca greaţă, dureri de cap, ameţeli,
palpitaţii, slăbiciune şi oboseală. Toate acestea sunt cunoscute sub denumirea generică de
“simptomul mâncării chinezeşti”.

Acidul glutamic este un valoros medicament utilizat în tratamentul unor afectiuni ale
sistemului nervos central. Acidul glutamic este necesar pentru dezvoltarea lactobacililor,
amestecul acestui acid şi 'asparagin' înlocuiesc amida nicotinei în dezvoltarea Bacteriei
dysenteriae şi celelalte organisme. Acidul glutamic are 10 celule diferenţiale, acestea activează
metoda de 'învaţare' pentru şobolani, face parte din reacţiile de transaminare. Este benefică în
tratamentul 'petit mal' şi atacuri nervoase. Sarea din acidul glutamic este unică, aroma din
carne este perceptibilă în 3000 părţi higroscopice.

În concluzie acidul glutamic este folosit în industria alimentară şi farmaceutică sub

formă de săruri de sodiu, pentru aromatizarea supelor concentrate, stimularea secreţiei
gastrice, ameliorarea activităţii sistemului nervos central şi a ficatului cirotic.

Proprietăţi fizice

Denumire chimică : - IUPAC: -acid 2-aminopentadioic ;

- acid α-aminoglutaric;

Denumire commercială: :   acid glutamic;

Formula moleculară: C5H9NO4 ;

Masa molară:M= 147.13 g mol−1 ;

Densitatea:ρ= 1.4601 (20 ºC);

Punctul de topire: 225-227°C;

 Constante de disociere :   pKa :  2,16              

7
 Acidul glutamic,ca toţi aminoacizii,este o substanţă amfoteră care dizolvată în apă
poate forma anioni sau cationi alături de ioni H + sau OH- eliberaţi simultan.Grupările
aminice şi carboxilice,formează ioni bipolari prin neutralizare internă,iar punctul izoelectric
este la pH 3,2.

Conform datelor din literatură, principalele proprietăţi ale acidului glutamic sunt: 

 -  rotaţia specifică în apă :    [ α ]tD = 11.5;

             -  solubilitatea în apă( g/100ml apă):  0.864.

Solubilitatea acidului glutamic creşte odată cu deplasarea pH-ului în mediu acid sau
bazic;în mediu acid este solubil în apă sub formă de clorhidrat,iar în mediu bazic este solubil
sub formă de sare. 

      Solubilitatea în alcool etilic:insolubil în alcool etilic absolut şi în eter.

În stare pură acidul glutamic,se prezintă sub formă de pulbere albă, cristalină, cu gust
acru şi fără miros,având următoarea structură chimică:

HO-CO-CH2-CH2-CH-COOH

NH2

Proprietăţi chimice

Proprietăţile chimice ale acidului glutamic:

8
Glutamina+H2O→ Glu + NH3

NAcGlu + H2O→ Glu + Acetat

Acid α-cetoglutaric + NADPH + NH4+→ Glu + NADP+ + H2O

Acid α-cetoglutaric + α-amino acid→ Glu + α-oxo-acid

Acid N-formimino-L-glutamic + FH4→ Glu + 5-formimino-FH4

unde:

NAcGlu – acid N-acetil glutamic (C7N11NO5);

Acetat – sarea acidului acetic ([CH3COO]−);

Acid α-cetoglutaric – COOH-C-CH2-CH2-COOH;

Acid N-formimino-L-glutamic – (C6H10N2O4);

FH4 – acidul folic (C19H19N7O6);

Proprietăţi biologice

Acidul glutamic (glutamat) este un aminoacid folosit de organism pentru a construi

proteine. Glutamatul este cel mai frecvent excitator (neurotransmiţător) în sistemul nervos
central. Are rol în metabolismul celular.

9
 Creierul foloseşte drept combustibil glucoza. Hipoglicemia (scăderea cantităţii de
glucoză din sânge) duce la utilizarea aminoacizilor ca substraturi energetice alternative. Exită
peste o sută de aminoacizi cerebrali, dintre care doar trei: glutamatul, acidul γ-aminobutiric
(GABA) şi glicina întrunesc criteriile necesare pentru a fi consideraţi neurotransmiţători.
Glutamatul este principalul neurotransmiţător excitator, prevalent la mamifere, în timp ce
GABA şi glicina sunt neurotransmiţătorii inhibitori.

Acidul glutamic are capacitatea de a colecta excesul de amoniac din organism, care
poate inhiba activitatea cerebrală, convertindu-l în glutamină. Dat fiind faptul că glutamina
produce o sporire considerabilă a nivelului de acid glutamic, un deficit al acesteia poate
determina carenţa celui de-al dolilea.

Acidul glutamic este un transmiţător excitator major de la nivelul creierului. Aproape

toate celulele cerebrale au receptori care îi răspund.

Ca neurotransmiţător, glutamatul este sintetizat în mitocondria neuronului presinaptic

cu ajutorul glutaminazei mitocondriale din glutamină. După sinteză, este stocat în vezicule
sinaptice, pentru a fi eliberat în sinapsă în timpul neurotransmisiei. Acţiunea sinaptică a
glutamatului este oprită prin recaptare, cu ajutorul pompelor transportoare de glutamat, care se
găsesc atât presinaptic pe neuron, cât şi pe glia vecină. În glie, glutamatul este convertit în
glutamină şi la nevoie, neuronul va prelua glutamina de aici şi o va reconverti în glutamat.

2.2Variante tehnologice

Obţinut în anul 1866 de către Ritthansen prin hidroliza glutenului, iar în 1890 Wolff
realizează sinteza acidului d,l-glutamic din acid levulinic. Mai târziu(1908), Ikeda obţine acid
l-glutamic prin hidroliza la cald a unor alge(laminaria) şi constată că acestui acid i se
datorează gustul plăcut al algei. Această observaţie a constitiut punctul de plecare al
cercetărilor privind dezvoltarea producţiei de acid l-glutamic în Japonia,principala
producătoare a acestui acid.

10
 Pentru obţinerea acidului l-glutamic se folosesc trei grupe de metode :

a)extracţia din surse naturale ;

b)sinteze chimice ;

c)biosinteza.

a)Extracţia din surse naturale foloseşte leşiile de la fabricile de zahar, deşeurile de la

fabricile de amidon din grâu sau porumb şi deşeurile de origine animală ( caseina ), care se
supun hidrolizei în vederea eliberării acidului glutamic şi apoi separarea lui.

             Hidroliza acidă a proteinelor( caseina, gluten) se realizează prin fierbere îndelungată

cu acid sulfuric( H2SO4) sau clorhidric (HCl) urmată de neutralizare cu hidroxid de calciu
Ca(OH)2 pentru îndepartarea acidului sulfuric sub formă de sulfat, iar după filtrarea sulfatului
se îndepartează ionii de calciu cu acid oxalic. Soluţia apoasă se concentrează la vid, iar după
răcire cristalizează acidul l-glutamic care se purifică prin recristalizari repetate.

Un alt procedeu de fabricare care foloseşte ca materie primă deşeurile de la fabricile de

zahăr prin hidroliza alcalină duce la obţinerea acestui aminoacid. Prin acest procedeu se
fabrică în Franţa, anual, peste 3000 tone acid glutamic.

b)Urmatoarea metodă este cea de obţinere prin sinteză a acidului l-glutamic (aminarea
acidului α-clor-glutaric,adiţia esterului acetamidomalonic la acroleină,utilizarea
acrilonitrilului.Prin sinteză,plecand de la acrilonitril,s-au obţinut,în anul 1963,4800 t/an,iar
1970 12 000 t/an acid l-glutamic.

Schema de principiu a acestui procedeu este:

Acrilonitril CH2=CH-CH Aer+CH4+NH3
Sinteza oxo Combustie parţială
Β-cian-OCH-CH2-CH2-CNCNNH4 Cianura de amoniu
propional aldehida
α-aminoglu-tarodinitril CN-CH2-CH2-CH-CN
NH2 Hidroliza alcalina
d,l-glutamat NH3

11
 Acid d,l glutamic cristalizat

În metodele de sinteză rezultă totdeuna un racemic,iar separarea izomerilor ridică

multe probleme tehnologice care au ca efect scumpirea produsului sintetizat.

c)Procedeul de biosinteză foloseşte ca surse de

carbon:glucoza,zahăr,amidon,hidrolizate de amidon,surse de azot( uree sau săruri de amoniu)
şi microelemente.Pe aceste medii se cultivă microorganismul Micrococcus glutamicus,
principalul producător al acidului l-glutamic.

Deasemenea s-au studiat şi alte surse de carbon: acidul acetic, esteri organici şi
hidrocarburi alifatice, la care se adaugă surse de azot şi săruri minerale,obţinându-se medii de
cultură pe care se cultivă M. glutamicus. Cele mai bune rezultate s-au obţinut la utilizarea n-
parafinelor cu 12-17 atomi de carbon. S-a plecat de la acidul α-ceto-glutaric, intermediar în
ciclul Krebs, produs prin conversia zaharului şi s-a supus procesului de transaminare. Enzima
care catalizează aceastăreacţie este mult răspândită în ţesuturile animale, vegetale şi
microorganisme [Corneliu Oniscu,1978].

Fermentaţia este procesul de creştere a microorganismelor pe medii de cultură,cu

scopul de a biosintetiza diverşi produşi .

Adoptarea unui anumit procedeu de fermentaţie este condiţionată de asigurarea celor

mai bune condiţii de dezvoltare a microorganismelor,fără a fi neglijate caracteristicile tipurilor
de microorganisme cultivate (aerobe sau anaerobe,cultivabile în sistem septic sau aseptic).

Procedeele de fermentaţie pot fi clasificate în funcţie de:

1. modul de realizare a culturilor microbiene:

-culturi în suprafaţă
-culturi în profunzime
2. necesarul de oxigen:
-sisteme de fermentaţie aerobe
-sisteme de fermentaţie anaerobe
3. modul de funcţionare a instalaţiei de fermantaţie:

12
 -fermentaţii discontinue
-fermentaţii continue.
1) Procedeul culturii în suprafaţă a fost folosit la începutul fabricării pe scară
industrială a producţiei de antibiotice.El s-a realizat prin cultivarea microorganismelor la
suprafaţa unui mediu nutritiv lichid cu grosimea stratului de 1-2 cm într-un mare număr de
aparate cu mărimi şi forme diferite.Procedeul are productivitate mică,motiv pentru care cultura
în suprafaţă a fost abandonată în practica industrială[Corneliu Oniscu,1978].Fermentaţiile în
suprafaţă se practică mai rar şi,de obicei,pentru microorganisme anaerobe[Corneliu Oniscu şi
Dan Caşcaval,2002].

Procedeul culturii în profunzime constă în cultivarea microorganismelor în

fermentatoare din oţel V2A,în care mediul supus unei aeratii şi agitări continue.În aceste
condiţii,procedeul culturii în profunzime oferă o serie de avantaje, faţă de cultura în
suprafaţă,printre care : randament mai mare,produs omogen,economie de spaţiu,economie de
muncă[Corneliu Oniscu,1978].Fermentaţia în profunzime se utilizează în majoritatea
proceselor de creştere a ,microorganismelor.Industrial,acest tip de fermentaţie poate fi realizat
prin procedee de fermentaţie discontinuă şi procedee de fermentaţie continuă[Corneliu Oniscu
și Dan Cașcaval,2002].

2) Fermentaţia discontinuă, este întalnită în literatura de specialitate şi sub denumirea

de “ sistem de cultivare batch”,se caracterizează prin aceea că microorganismele parcurg într-
un singur bioreactor toate etapele de dezvoltare ,după care procesul se reia de la capăt.Acest
mod de operare conduce la consumuri sporite de utilităţi,deoarece de fiecare dată este necesară
stabilirea întregii înstalaţii.

Fermentaţia continuă oferă o serie de avantaje comparative cu procedeul discontinuu:

 utilizarea bioreactoarelor de capacitate mai redusă

 realizarea mai eficientă a proceselor de transfer de masă,căldură,impuls
 productivitate sporită
 epuizare mai avansată a componentelor mediului de cultură.

Procesul de fermentaţie continuă poate fi realizat într-un bioreactor sau într-o baterie de
bioreactoare,cu un debit constant(viteza de diluţie constantă) ,caz în care acest sistem mai este

13
întalnit în literatura sub denumirea”cultivare continuă tip turbidistat sau chemostat” în funcţie
de stadiul de dezvoltare al microorganismului[Corneliu Oniscu și Dan Cașcaval,2002l].

2.3 Alegerea variante optime

Se alege procedeul discontinuu de fermentaţie în profunzime deoarece prezintă

următoarele avantaje:
-costuri reduse;
-flexibilitate ridicată;
-un pericol de contaminare al culturii redus;
-volumul bioreactorului relativ mare oferă posibilitatea obţinerii unor randamente ridicate;
-puritatea produsului finit cât şi activitatea biologică ridicată.
Comparativ cu celelalte procedee cel mai economic procedeu de obţinere a acidului l-
glutamic este procedeul de biosinteză care permite obţinerea produsului la un preţ de cost mult
mai mic fiind deosebit de rentabil.

Producţia acidului l-glutamic prin procedeul de biosinteză a crescut mereu, ajungând în

anul 1966 să reprezinte 84% din producţia totală,iar în anul 1970 peste 88 %.Odată cu
creşterea acestei producţii au scăzut costurile acidului l-glutamic cu peste 60 % faţă de anul
1952 considerat ca bază.

Dintre cele două procedee care au fost propuse plecând de la

mecanismuldebiosinteză ,fermentaţia directă este aplicată la scară industrială,iar mediul de
cultură utilizat trebuie să conţină surse de carbon,surse de azot,săruri minerale,factori de
creştere.Randamentele obţinute în procesele de fermentaţie directă variază între 24 si 54% faţă
de conţinutul de zahăr,iar concenraţia finală a acidului l-glutamic în biomasă este cuprinsă
între 5 şi 80 g/l ,funcţie de compoziţia mediului de cultură utilizat şi parametrii procesului de
biosinteză.

Deasemenea sursele de azot necesare în procesul de fermentaţie(etapă de obţinere a

acidului glutamic) sunt asigurate prin adăugarea de uree şi sulfat de amoniu.Utilizarea numai a
sulfatului de amoniu are un efect nefavorabil şi se manifestă prin productivitate mică în
acid.Folosirea sulfatului de amoniu sau a amoniacului ca agent de corectare a pH-ului la

14
valoarea 7,6-8,5 ,pH optim pentru fermentaţia acidului l-glutamic ,conduce la randamente mai
mici.Folosind ureea ca sursa de azot şi ca agent de corectare a pH-ului se obţin randamente
mari în acid l-glutamic. Creşterea se explică prin faptul că ureea este descompusă uşor, în
prezenţa bacteriilor , în CO2 şi NH3 care sunt utilizate apoi în formarea moleculei de acid l-
glutamic.

Celelalte două metode nu sunt economice deoarece prima metodă(extracţia din surse
naturale ) prezintă un randament scăzut(se consumă 12 t de gluten din grâu sau 18 t gluten din
soia pentru 1 t acid) utilizează intalaţii mari care fac acest procedeu scump şi puţin utilizat,cea
de-a doua metodă pare a fi cea mai economică întrucăt foloseşte ca materie primă
acrilonitrilul.

Pe plan mondial se produc, prin cele trei metode,peste 100 000 t/an acid l-glutamic ,din
care 65 800 t/an se produc în Japonia[Corneliu Oniscu,1978].

15
 2.4 Descrierea procesului tehnologic adoptat

Schema tehnologică de obţinere a acidului glutamic

16
 Mediu de cultură

Sterilizarea mediului de cultură

Aer Inocul
Micrococcus glutamicus Inocularea mediului de cultură

H2SO4

Sterilizare aer Aer steril Fermentaţia Cărbune activ

Filtrare biomasă Biomasă celulară

Concentrare Apă

Substanţă tensioactivă Cristalizare HCl

Centrifugare primară Soluţie impură

Apă
NaOH Dizolvare Cărbune activ

Reziduu
Filtrare

Cristalizare avansată

Apă
Spălare

Uscare

Ambalare Apă evaporată

Acid glutamic, pulbere pură

17
 *Pregătirea mediului de cultură şi selecţionarea microorganismelor

Mediile de cultură sunt formate din soluţii apoase care conţin componentele necesare
creşterii microorganismelor şi elaborării produselor dorite pentru metabolismul celulei, si
anume:

-surse de carbon;

-azot;

-substanţe minerale;

-factori de creştere;

-la o concentraţie a substanţelor dizolvate corespunzatoare presiunii osmotice celulare;

-cu valori de pH optime creşterii şi multiplicării microorganismelor de cultivat.

Mediu de cultură standardizat, special pentru sinteza acidului glutamic, format din :

-glucoză 10-12%;

-extract de porumb 0,3% ca substanţă uscată;

-uree 2-3%;

-fosfat mono- şi bipotasic câte 0,1 respectiv 0,15%;

-sulfat de Mg 0,05%;

-apă 84,5-87,55%.

Mediile se folosesc pentru izolarea, multiplicarea şi conservarea microorganismelor

sau pentru obţinerea prin cultivare a produselor de biosinteză microbiană. Mediile pot fi
procurate de la firme producătoare sau pot fi preparate în laborator.

Cultura microorganismelor este utilizată pentru a creşte numărul de celule care se

doreşte a fi studiate. Microorganismele sunt adăugate în mediul de cultură care conţine
nutrienţi pentru creştere.

Cultura este incubată una sau mai multe zile, la temperatura optimă a fiecărui
organism. În multe cazuri microorganismele sunt crescute pe plăci cu agar. Microorganismele

18
se multiplică formând colonii. O colonie creşte în locul în care o singură celulă a fost
inoculată. O colonie este ca o clonă. Ea poate fi pură dacă nu există în jurul ei alte tipuri de
microorganisme în colonii care o pot contamina.

În funcţie de natura şi sursa componentelor care intră în alcătuirea lor ,mediile de

cultură sunt:sintetice,semisintetice si naturale.

Mediile de cultură selective sunt medii definite sau complexe, cu o compoziţie chimică
bine definită, care permit dezvoltarea unui număr restrâns de microorganisme sau chiar a unei
specii. Aceste medii conţin pe lângă substanţe nutritive şi inhibitori ai altor microorganisme
însoţitoare din microbiota din care se face izolarea culturii care se doreşte a fi selecţionată.

În prezent, în locul glucozei tehnice se foloseşte melasa ca sursă de carbon sau un

amestec deglucoză şi zaharoză, care dau rezultate mai bune decât glucoza pură. Aceasta se
datorează prezenţei în melasă a acizilor organici.

Pentru sinteza acidului L-glutamic se vor utiliza bacterii aparţinând genului

Brevibacterium lactofermentum.

*Sterilizarea mediului de cultură

Procesele de creştere a biomasei microbiene impun, în marea lor majoritate, absenţa

totală a sporilor de microorganisme străine, provenite din apă, aer sau materii prime, care s-ar
putea dezvolta în faza de fermentaţie, infectând cultura unică a microorganismului util.
Această cerinţă tehnologică se poate realiza prin sterilizare şi, mai rar, prin pasteurizare.

Sterilizarea este,procesul prin care are loc distrugerea sau îndepărtarea

microorganismelor patogene sau apatogene (atât a formelor vegetative, cât şi a sporilor) din
substanţe, preparate, spaţii închise, obiecte[Corneliu Oniscu  și Dan Cașcaval2002]..

Sterilizarea termică prezintă o serie de inconveniente generate în special, de reacţiile

secundare de degradare care au loc în timpul procesului de sterilizare:

- denaturarea proteinelor şi inactivarea lor;

- denaturarea vitaminelor şi a unor factori de creştere;

19
- supraîncălziri care iniţiază reacţii de oxidare a fenolilor şi a acidului ascorbic, de
polimerizare a aldehidelor nesaturate, de caramelizare a hidraţilor de carbon şi brunificare a
mediului.

De asemenea, în timpul sterilizării termice, se produc reacţii de condensare a grupărilor

aldehidice, din zaharuri reducătoare, cu grupările aminice libere, din aminoacizi sau proteine,
cu formare de produşi asemănători bazelor Schiff (reacţia Maillard), produşi toxici pentru
majoritatea microorganismelor. Pentru a fi evitată apariţia acestor compuşi, este recomandată
sterilizarea separată a hidraţilor de carbon şi a compuşilor cu azot.

*Sterilizarea la 120ºC

Sterilizarea directă în fermentator ,prin procedeu discontinuu la 120°C, necesită un

timp mai mare,iar degradarea mediului este mai avansată.

Pentru sterilizarea unor cantităţi mari de medii de cultură se recomandă utilizarea

proceselor continue de sterilizare care prezintă o serie de avantaje,printre care:

-conservarea mai bună a proprietăţilor nutritive ale mediului,ca rezultat al expunerii limitate la
temperaturi ridicate;

-controlul superior al calităţii;

-utilizarea mai raţională şi nivelarea consumului de abur;

-productivitate şi eficacitate sporită;

-control automat.
Realizarea în condiţii optime a procesului de sterilizare prin procedeu continuu impune
un control riguros al spumării mediului şi o vascozitate mică a acestuia.
Pentru sterilizarea continuă a mediilor de cultură se folosec instalaţii industriale care
lucrează la 120°C instalaţii care lucrează la temperaturi mai mari ( 140°C ),dar care permit o
răcire rapidă mediului supraincălzit.

20
 Fig.2.4.2 Instalația de sterilizare la 120ºC

1-coloană de sterilizare; 2-menținător; 3-răcitor țeavă în teavă

Instalaţia pentru sterilizarea continuă a mediului de cultură la 120°C ,este compusă din
trei parţi distincte: coloana de sterilizare,mentinator si racitor.

Coloana de sterilizare 1 este formată din două ţevi concentrice: prin ţeava interioară
circulă aburul de 5 ata,iar prin spaţiul inelar circulămediul supus sterilizării.În coloana de
sterilizare are loc încălzirea mediului până la 120°C,după care acesta este trecut prin
menţinătorul 2 şi răcitorul ţeavă în ţeavă 3,pentru desăvârşirea procesului de sterilizare şi
răcire până la 35-40°C.

Din diagrama timp-temperatură pentru sterilizarea continuă la 120°C rezultă că

încălzirea mediului cu abur direct de 5 ata în coloana de sterilizare se face în 4-5 s,iar timpul
de menţinere (de 15-20 min) permite o distrugere a tuturor microorgamismelor patogene
capabile de multiplicare în condiţiile din fermentator.În acest procedeu ,contribuţia perioadei
de încălzire şi răcire fiind mai mică (5-6 %) decât în sterilizarea discontinuă ,se poate
considera că procesul de sterilizare are loc numai în menţinător.

21
 Fig.2.4.3 Diagrama timp-timp temperatură pentru sterilizarea continuă la 120°C

*Sterilizarea aerului

Sterilizarea aerului tehnologic necesar în fermentația aerobă constitue una din

problemele de importanță majoră în industria biochimică,de rezolvarea căreia depinde buna
desfășurare a procesului de biosinteza.Dificultățile de sterilizare a aerului sunt generate de
varietatea mare de microorganisme conținute (bacterii,spori bacterieni,fungi,viruși), de
rezistența lor la temperaturi uscateși de limitele largi ale dimensiunilor acestora.

Pentru sterilizarea aerului au fost propuse urmatoarele metode:

-sterilizarea termica

-sterilizarea cu raze ionizate sau ultra-violete

-sterilizare cu agenți chimici

-sterilizare prin filtare.

La sterilizarea aerului prin utilizarea procesului termic se cer temperaturi ridicate

deoarece microorganismele au rezistență mare la temperaturi uscate.Astfel ,dupa Decker,sporii
din aer sunt distruși în 24 s la 218-220°C.Această temperatură poate fi obținută fie prin
încălzirea aerului într- un schimbător de caldură,fie prin comprimarea aerului în compresor
adiabatic.

22
 Sterilizarea aerului prin metoda filtrării se realizează pe filtre mecanice prevăzute cu
un strat de material fibros.La început s-au folosit fibre din bumbc,dar,odată cu dezvoltarea
producției industriale de antibiotice,fibrele de bumbac au fost înlocuite cu fibre de sticlă.

Fig.2.4.4 Filtru cu fibre de sticlă pentru sterilizarea aerlui

Pentru sterilizarea aerului prin filtrare, în principiu, există trei tipuri de filtre cu
aplicabilitate practică. Filtrul cu fibre de sticlă este alcătuit dintr-un strat de material filtrant
fixat între două site, susţinute de două plăci perforate (diametrul perforaţiilor este de 0,7 – 0,8
cm). Filtrul este prevazut cu manta de încalzire, care permite uscarea materilului filtrant
sterilizat cu abur direct. Acest tip de filtru, indicat pentru industria de biosinteză, oferă
posibilitatea sterilizarii unor debite ridicate de aer, realizarea unui grad avansat de purificare şi
durata îndelungată de funcţionare. Dezavantajele filtrului cu fibre sunt ;operaţii complicate la
schimbarea  fibrelor de sticlă (durata 2,5 – 3 ore), manipularea neplacută a fibrelor de sticlă şi
anularea efectului de sterilizare după umezirea materialului filtrant fibros.

23
 Studiind procesul de purificare a aerului de microorganisme,prin filtrare pe fibre de
sticlă,Gaden și Humphrey au stabilit eficacitatea separării sporilor de Bacillus subtilisfuncție
de viteza aerului,iar Aiba a măsurat distribuția microorganismului Serroria marcescens.

Cea mai largă utilizare în industria de sinteză microbiologică o are procedeul de

strerilizare a aerulului bazat pe principiul combinat cu efectul termic.

După acest procedeu,aerul tehnologic,supus procesului de sterilizare,trece prin filtru cu

saci pentru separarea particulelor solide,apoi este încălzit,în schimbator de căldură sau în
compressor,la 150º-160ºC.Aerul încălzit este trecut în continuare printr-un răcitor de
aer,separator de picături,filtrul principal cu material fibros (prima treapta de filtrare),filtrul
individual cu material fibros (treapta a doua de purificare),după care pătrunde în fermentator.

Schema de principiu a liniei de purificare si sterilizare a aerului tehnologic este redată

în figura 2.4.5

Fig.2.4.5Schema de purificare şi sterilizare a aerului

1-filtru; 2-compresor;3-răcitor;4-separator picături;5-filtru principal;6-filtru individual;7-

fermentator.

Conform acestei scheme, aerul, separat de impurităţi în filtrul (1), trece prin
compresorul (2), unde este comprimat adiabatic la 3 - 3,5 at, temperatura crescând la 150 -
160°C. După răcire în (3), aerul este introdus în separatorul de picături (4), filtrul principal cu
material fibros (5) (prima treaptă de sterilizare), filtrul individual cu material fibros (a doua
treaptă de sterilizare), după care pătrunde în fermentator.

24
 Răcirea aerului în răcitorul (3) se face până la apariţia condensului, iar, după separarea
lui, aerul saturat se preîncălzeşte cu aer fierbinte până când temperatura de ieşire din filtrul
individual (6) depăşeşte cu cel puţin 12°C temperatura punctului de rouă. Stabilirea
parametrilor de funcţionare ai instalaţiei de sterilizare se face numai în funcţie de parametrii
termodinamici ai aerului.

Pentru explicarea mecanismului de sterilizare a aerului prin filtrare pe material fibros

și stabilirea ecuațiilor de proiectare a filtrelor,este necesar să se cunoască modelul de curgere a
aerului în jurul unei fibre cilindrice și modul de separerea particulelor solide.

Fig.2.4.6 Modelul de curgere a aerului prin filtru cu matrial fibros

Modelul curgerii aerului prin filtru cu material fibros se analizează în următoarele

ipoteze:1) fibra individuală este perpendiculară pe direcția de curgere;2) curgerea aerului este
laminară;3) particulele ce se separă au formă sferică[Corneliu Oniscu,1978].

După sterilizare mediul de cultură este supus răcirii în vederea inoculării cu bacteriile
producătoare de acid glutamic. Răcirea mediului se face până la temperatura de 29-31 0C,
temperatura optimă la care are loc şi însămânţarea.

Procesul de inoculare are loc în inoculator, durata acestui proces fiind de 10-15h.
Mediul de cultură se inoculează într-un raport de 5-10% inocul faţă de cantitatea mediului.

În cursul desfăşurării procesului, temperatura se menţine la 30 0C, cu o bună aerare, iar

pH-ul se menţine între 6,0-7,5 cu NH4OH.

25
 * Fermentaţia

Bioreactorul pentru producerea acidului glutamic este de tipul, acelaşi cu inoculatorul.

Fermentaţia are loc în două etape: în prima etapă are loc multiplicarea
microorganismului şi durează între 18 şi 24 ore, în inoculator; iar în cea dea doua etapă are loc
acumularea acidului L-glutamic şi are loc în intermediar. Durata fazei finale este de 12-16 ore,
procesul fiind încheiat în 30-40 ore.

În ambele faze fermentaţia se consideră terminată atunci când conţinutul de zahăr este
consumat până la aproximativ 0,8-0,9% din valoarea iniţială. pH-ul se menţine constant la
valoarea de 7,5-8,5, iar temperatura trebuie să fie de 29-310C.

Aeraţia bună reprezintă un factor foarte important în desfăşurarea procesului cu

randament de transformare ridicat. Debitul de aer steril administrat este de aproximativ 1 litru
aer/litru mediu de cultură/minut, sub o intensă agitare.

Procesele industriale de fermentaţie sunt, aproape în totalitate, procese aerobe şi, în

marea lor majoritate, aseptice. Necesarul orar de aer steril variază între 60 şi 120 m 3 aer/m3
mediu de cultură. În sterilizarea acestor debite mari de aer apar dificultăţi generate, pe de o
parte, de varietatea microorganismelor prezente (viruşi, bacterii, spori bacterieni, fungi), iar pe
de altă parte, de rezistenţa lor la temperaturi uscate.

*Filtrarea biomasei

În procesul de biosinteză ,procesul de sterilizare a masei celulare este legat ,în

majoritatea cazurilor ,de dificultăţi tehnologice considerabile,datorită naturii miceliului care
poate fi fibros ,mucilaginos sau sub formă de pastă.Alegerea utilajului pentru filtare este
determinată de următorii factori :caracterul suspensiei,productivitate,rezultatele cerute şi
materialul de construcţie.

26
 Fig 2.4.7 Filtru rotativ cu strat adjucvant

1-tambur; 2-capul distribuitorului; 3-cuţit micrometric; 4-buncăr; 5-cuvă suspensie; 6-duză de

spălare; 7-strat depus; 8-strat filtrant; I-zona filtrării; II-IV-zone de uscare; III-zonă de
spălare;V-zonă de îndepartare a stratului depus.

Amestecul obţinut în urma fermentării trebuie filtrat pentru recuperarea produsului

important- acidul glutamic şi îndepărtarea biomasei.

*Concentrarea soluţiei

Lichidul filtrat ajunge în evaporator, unde se concentrează, în vedereaeliminării apei,

sub vid. Temperatura la care are loc procesul este de 50-55 0C, iar pH-ul se menţine la valoarea
de 6,5. Procesul este terminat când se atinge o densitate a mediului de cultură de 1,20 g/cm 3, în
urma acestuia rezultă o soluţie concentrată de acid glutamic. Apa evaporată este preluată de un
condensator şi răcită.

*Cristalizarea soluţiei

Soluţia concentrată ajunge în cristalizator, unde se acidulează cu HCl, până la punctul

izoelectric al acidului glutamic şi se adaugă o substanţă tensioactivă care favorizează
cristalizarea. Apoi soluţia se răceşte lent la 10-120C.

*Filtrarea cristalelor de acid

Masa cristalină obţinută se filtrează pe centrifugă şi se îndepărtează soluţia impură. În

urma cristalizării şi filtrării acidul glutamic, sub formă de cristale, nu are puritatea necesară
utilizării în scop farmaceutic sau alimentar. De aceea cristalele obţinute sunt supuse unor noi
metode de purificare.

27
 *Dizolvarea cristalelor şi refiltrarea acestora

Cristalele obţinute se dizolvă în apă, se adaugă o soluţie de NaOH până la pH de 6,5 şi

cărbune activ. Soluţia se încălzeşte ulerior la 700C. Masa cristalină purificată se filtrează pe
filtru de presă. Soluţia purificată rezultată se trimite în cristalizator.

*Recristalizarea, filtarea şi spălarea noilor cristale de acid

Soluţia purificată este acidulată până la pH de 3,2 (punctul izoelectric al acidul

glutamic) şi se răceşte la 10-120C timp de 24 h.

Cristalele de acid L-glutamic pur se separă prin centrifugare şi se spală cu apă rece,
pentru îndepărtarea totală a ionilor de Cl-.

*Uscarea şi ambalarea

Cristalele pure de acid gluamic, fiind ude, trebuiesc uscate foarte bine, apa trebuia
îndepărtată în totalitate. Uscarea se poate face în uscător dulap sau uscător în pat fluidizat.
Temperatura aerului la intrarea în uscător este cuprinsă între 100 şi105 0C [Corneliu Oniscu ,
1978].

2.5 Materii prime,materii intermediare şi materii auxiluare

Materiile prime care sunt introduse în procesul tehnologic sunt:

Glucoza este o sursa excelentă de carbon şi energie ,foarte mult utilizată pentru
stimularea creşterii microbiene,uneori constituind chiar precursorul în biosinteză (obţinerea
glicozidelor ,a macrolidelor şi glicoproteinelor) [ Dan Caşcaval şi Corneliu Oniscu,2002].

Aspect : este o substanţă solidă, cristalizată, incoloră şi  solubilă în  apă. Are un gust
dulce. Punctul său de topire este foarte ridicat, deoarece între numeroasele sale grupărihidroxil
se formează multe legături de hidrogen. Când sunt încălzite, toate monozaharidele (nu numai
glucoza) se descompun înainte de a se topi, în carbon şi apă, reacţie numită carbonizare.
Glucoza are 75% din puterea de îndulcire a fructozei (care este luată ca unitate)
[https://ro.wikipedia.org/wiki/Glucoz%C4%83].

28
 Extract de porumb

Se obţine din apele de înmuiere a cerealelor (mai ales porumb) din procesul de obţinere
a amidonului industrial şi a fungilor de porumb, prin concentrare la cald, filtrare şi sterilizare
cu bioxid de sulf. Este o sursă foarte echilibrată de C,N,S, săruri minerale.

            Utilizarea sa a produs o spectaculoasă mărire de randament în biosinteza penicilinei

(1943) şi s-a impus apoi în întreaga industrie de biosinteză, ca ingredient principal al mediilor
de cultură. Este un lichid vâscos, brun, cu un conţinut de circa 4% azot aminic, corespunde
unei cantităţi de 40-42% proteine, formată din 25% alanină, arginină şi acid glutamic, fiecare
cu câte 8%, leucină 6%, fenil-alanina 2%, prolina 5%, izoleucina, valina si treonina cate 3,5%
metionina si cistina cate 1%.
 
            Mai conţine 15-30% acid lactic, 3% fosfor, 1% calciu şi 15% potasiu, vitaminele B 2,
B6, biotina, gume polizaharidice.

Prezintă aspect lichid cremos de culoare galben închis.Mirosul este caracteristic unei
fermentaţii lactice. Sedimentarea are loc după 24 ore într-un cilindru de 100 ml de 100 %.În
frotiu colorat prezintă o masă bacteriană tipică bacililor lactici,în proporţie de peste 90
%.Substanţa uscată este de minim 50 %.Extractul de porumb prezintă un pH de 3,5-
4.Conţinutul în acid lactic este de minim 20 g la 100g substanţă uscată.Cantitatea de zahăr
conţinută este de maxim 2,5 %.

Uree

Ureea este acel  compusul organic cu formula moleculară CO(NH2)2. De fap ureea este,

diamida acidului carbonic, deci o amidă. Se numeşte aşa deoarece se obţine din acidul
carbonic (sifon), printr-o dublă reacţie a acidului cu amoniacul.

Aspect:este o substanţă solidă, cristalizată, solubilă în H2O. Chimic vorbind, ea se

comportă ca amidele.Ureea prezintă culoare albă având :umiditate maximă:  0,2 % şi masa
moleculară relativă: 60,05. Se foloseşte, de obicei, ca îngrăşământ agricol, datorită
conţinutului ridicat de N, în industria medicamentelor şi la obţinerea de produşi
macromoleculari de policondensare cu aldehida formic [https://ro.wikipedia.org/wiki/Uree].

29
 Micrococcus glutamicus-face parte din categoria bacteriilor.

Bacteriile sunt organisme unicelulare cu o structură  complexă care au un metobolism

propriu datorită unui aparat enzimatic complex ce le asigură desfăşurarea proceselor vitale.

Structura celulei bacteriene

            Celula bacteriană este o entitate morfologică şi funcţională echivalentă cu celulele

organismelor superioare, cu o structură complexă formată din urmatoarele componente, de la
exterior catre interior, luând ca reper peretele celular:

           Structura extraparietală formată din: capsula; cilii sau flagelii; aparatul fimbrial şi pilii
de sex.

              Peretele celular.

            Structura intraparietală compusă din: membrana citoplasmatică, mezozomii,

citoplasma, aparatul nuclear, incluziunile, ribozomii, vacuolele, sporul bacterian.

            Capsula este o secreţie care apare la unele bacterii, ce se fixează la exteriorul celulei şi

constituie un înveliş în jurul acesteia. În funcţie de raportul faţă de celula bacteriană capsula
este de mai multe feluri:

-microcapsula, cu grosimea fină de 0,2 mm, ce se pune în evidenţă prin metode imunologice;

-capsula propriu-zisă, cu grosimea cuprinsă intre 0,2-2 mm;

-stratul mucos caracterizat prin prezenţa unei mase amorfe neorganizate în jurul celulei;

-zooglea   ce se prezintă ca un strat mucos neorganizat care înglobează mai multe celule
microbiene.

            Compoziţia chimică a capsulei diferă în funcţie de specia bacteriană la care apare şi de

condiţiile de mediu, fiind formată din 98 % apă, alţi constituienţi ca polizaharidele şi
polipeptide.

            Funcţiile biologice ale capsulei sunt urmatoarele:

            - funcţia de protecţie împotriva fagocitelor la bacteriile patogene;

30
            - funcţia de virulenţă;

            - funcţia de protecţie împotriva desicaţiei.

            Cilii sau flagelii

            Cilii sau flagelii sunt formaţiuni filamentoase, cilindrice, lungi, subţiri, situate la
suprafaţa celulei bacteriene şi reprezintă organite de mişcare ale acesteia. Prezenţa cililor este
caracteristică numai anumitor specii de bacterii, mobile.

            Numărul cililor este variabil, funcţie de specie, de la unu pana la o suta.

            În funcţie de inserţia pe corpul bacteriei cilii pot avea urmatoarele poziţii:

            - monotriha, un cil la un singur pol;

            - amfitricha, cu cate un cil la ambii poli ai celulei;

            - peritricha, cu cili dispuşi în jurul bacteriei;

            - lophotricha, cu cili dispuşi la un pol sub forma de mănunchi.

            Cilii sunt organite lungi de 16-18 mm şi subţiri, cu diametrul de 0,01-0,02 mm pe toata

lungimea, de obicei ondulaţi. Implantarea lor se face în citoplasma printr-un corp bazal situat
între peretele celular şi membrana citoplasmatica.

            La bacteriile Gram-pozitive corpusculul bazal este format din douădiscuri (inele),
angrenate împreună sub forma butonilor de manseta.

            Lungimea cililor depaşeste pe cea a celulei, în mod excepţional până la de 10 ori. Cu

ajutorul cililor, bacteriile se pot deplasa linear sau se pot rostogoli. Viteza de înaintare este
mare,  parcurgând într-o secundă o distanţă de la 10 până la 40 ori mai mare decât diametrul
longitudinal al bacteriei.

            Aparatul fimbrial. Fimbriile sunt formatiuni filamentoase prezente pe suprafaţa

bacteriilor imobile sau mobile, în numar mare, de ordinul sutelor (100-400). Ele au o poziţie
radială şi sunt mai scurte ca cilii; nu servesc la mişcare ci au rol de fixare pe diferite substrate
solide sau pe hematii, pe care le aglutinează.

            Fimbriile sunt de natura intracelulara deoarece după îndepărtarea peretelui celular,

rămân fixate pe protoplaşti.

31
            Pilii sunt, dupa Ottow, apendice filamentoase care au un canal prin care se face
transferul cromozomului bacterian de la celula mascula (F+) la celula femela (F-), fiind
denumite si 'pili de sex'.

                 Peretele celular

            Este invizibil sau foarte greu vizibil la microscopul fotonic şi reprezintă aproximativ
20 % din greutatea uscată a celulei si 25 % din volumul ei.

            Peretele celular are rol:

            - de sustinere mecanica;

            - asigura individualitatea morfologica;

            - ofera protectie fata de socul osmotic;

            - participa la procesul de diviziune celulara;

            - contine receptori de virus;

            - mediaza schimbul de substante cu mediu.

            Peretele celular este absent la micoplasmatale.

            Membrana citoplasmatica, acopera citoplasma bacteriilor si o separa de fata interna a

peretelui celular. Are o grosime de 7,5 nm si este constituita din doua straturi fosfolipidice.

            Analiza chimica a membranei evidentiaza trei tipuri de molecule:  lipide, proteine si

glucide. Proteinele reprezinta peste 50 % din total.

            Membrana citoplasmatica este o bariera osmotica de permeabilitate care regleaza

patrunderea in celula si eliminarea selectiva a diferitelor substante.

            Ea mentine in celula o concentratie ridicata de macromolecule, molecule mici si chiar

ioni impedicandu-le difuzarea in mediu desi concentratia extracelulara este mai mica. Contine
permeazele care asigura transportul activ in interiorul celulei a unor substante organice polare
din mediu.

            Membrana citoplasmatica are rol in cresterea si diviziunea celulara; la nivelul sau ia

nastere semnalul care declanseaza initierea replicarii cromozomului bacterian.

32
            In sfarsit, membrana citoplasmatica este suportul enzimelor care participa la sinteza
ATP (la eucariote aceste enzime se afla in mitocondrii).

            Mezozomii sunt formatiuni care deriva din membrana citoplasmatica sub forma unor
invaginari, legate de ADN celular. Aceste organite celulare joaca un rol important in
diviziunea nucleului si in formarea septului care separa cele doua celule fiice.

            La bacteriile purpurii mezozomii contin pigmenti clorofilieni. 

            La bacteriile fixatoare de N2, nitrogenaza care este inhibata de O2, este protejata de
mezozomi.

            La bacteriile nitrificatoare numeroasele invaginari ale membranei citoplasmatice

maresc suprafata de schimb enzimatic.

            Citoplasma, este un sistem coloidal constituit din saruri minerale, compusi solubili de

natura lipoproteica, nucleoproteine, lipide si apa. Are un pH cuprins intre 7-7,2.

            Citoplasma poate fi caracterizata ca un complex de stari fizice intr-o continua

transformare, in functie de starea fiziologica si varsta celulei.

            Ribozomii sunt formatiuni citoplasmatice, sferice. O celula bacteriana contine in

medie 18.000 ribozomi de tip 70 S, cu un diametru de 10-30 nm. Fiecare ribozom se disociaza
in doua subunitati, 30 S si 50 S. Fiecare subunitate 50 S este legata de o subunitate 30 S prin
intermediul legaturilor ARN - proteina si proteina-proteina.

            Ribozomii 70 S joaca un rol precis in cursul traducerii lanturilor de ARN in proteine.

            Materialul nuclear ('nucleul') este constituit dintr-un cromozom format de o bucla de

ADN aflat in suspensie, in citoplasma. Lungimea acestuia este mare, ajungand
la Escherichia   coli la 1 mm, ceea ce implica o rasucire foarte accentuata.

            Plasmidele sunt considerate material genetic extracromozomial, fiind independente de

nucleu.

Plasmidele nu sunt indispensabile pentru viata celulara dar pot aduce un avantaj
selectiv. Ele poarta informatia pentru degradarea unor substraturi si pentru rezistenta la
antibiotice.

33
 Replicarea plasmidelor se produce in doua momente diferite: atunci cand celula se
divide si atunci cand se produce procesul de conjugare.

Bacteriile pot contine mai multe plasmide. Escherichia coli, de exemplu, poseda pe

cromozom 1 sau 2 plasmide conjugate si 10-15 plasmide neconjugate.

Vacuolele sunt formatiuni sferice care apar in citoplasma in faza de crestere activa a

celulelor bacteriene. In interiorul lor se gaseste apa sau gaz.

Cele cu apa au rol in mentinerea presiunii osmotice in raport cu mediul extern, iar cele
cu gaz au rol de flotatie.

Incluziunile sunt formatiuni inerte care apar in citoplasma la sfarsitul periodei

exponentiale de crestere a celulei. Ele pot fi formate din glicogen, amidon, carbonat de calciu
si fosfat anorganic.

Sporul bacterian este o formatiune care deriva din celula vegetativa a bacteriilor, in

anumite conditii de viata. Sporul este o forma de conservare a speciei la conditiile
nefavorabile de mediu si concentreaza intr-un volum redus toate componentele esentiale ale
celulei din care provine.

Practic toate microorganismele produc acid glutamic, dar puţine în cantităţi suficient
de mari şi în condiţii selective. Mai productive sunt Brevibacterium amynophylum, diverse
varietăţi de Micrococcus glutamicus şi Carynebacteryum glutamicum, dar şi Esteria Coli,
Bacillus subtilis.

Cultivarea Micrococcus glutamicus pe un mediu de glucoză 10% necesită o

concentraţie optimă de biotină de 2,53%.

Mărirea şi reducerea acestei concentraţii face ca raportul între cantitatea de aminoacizi

conţinuţi intra şi extra celular să varieze de la 12 la 0,3.

Pe medii naturale sărace în biotină cantitatea de aminoacizi trecuţi în mediu este şi de

200 de ori mai mare decât cele bogate în această vitamină.

Componentele naturale şi vegetale ale mediilor de cultură conţin mari cantităţi de

biotină. Se impune folosirea unui mediu de cultură sintetic şi folosirea inhibitorului natural al
biotinei-alcoolul palmitic.

34
 MICROCOCCUS GLUTAMICUS

 Săruri minerale 

KH2 P04-solubil în apă, insolubil în acool.

(NH4)2 S04-se prezintă sub formă de cristale de culoare alb-gălbuie până la portocaliu.

ZnCl2-este o sare a zincului cu acidului clorhidric cu formula chimică ZnCl2. Substanţa este

incoloră sau albă şi este foarte solubilă în apă.Totodată, ea este higroscopică, şi
delicvescentă.Prezintă masa molară: 136,315 g/mol şi densitate: 2,91 g/cm³.

Acidul sulfuric

Acidul sulfuric (H2SO4) este un lichid vâscos şi incolor ce se solidifică la o temperatură

de 3 °C atunci când este de concentraţie 100%. În rest, punctul de îngheţare depinde de
concentraţie: la 93% acesta este de -32 °C, la 78% este -38 °C şi la 65% este de -64 °C. Acidul
sulfuric tehnic poate avea adesea o culoare maronie  datorată impurităţilor organice. Încălzit
deasupra punctului de fierbere de 279,6 °C, acidul sulfuric se vaporizează, iar în forma acesta
de vapori există trioxid de sulf în exces. La o temperatură de 338 °C, vaporii au un conţinut de
98,3% acid şi corespund unui amestec azeotropic de apă şi acid sulfuric. Încălzit mai mult, la
450 °C, acidul sulfuric se disociază în apă şi trioxid de sulf complet.Căldura specifică a
soluţiilor apoase de acid sulfuric scade odată cu creşterea conţinutului de mare de acid şi se
măreşte odată cu ridicarea temperaturii. Vâscozitatea acidului este de 24,6
mPa·S[https://ro.wikipedia.org/wiki/Acid_sulfuric].

35
 Acidul sulfuric se utilizează după terminarea fermentaţiei,biomasa este acidulată cu
acid sulfuric la un pH de 6,5 adăugându-se cărbune activ şi un adjucvant pentru mărirea
vitezei de filtrare[Corneliu Oniscu,1978].

Carbunele activ este folosit ca material de umplutură pentru a reţine mai uşor
catalizatorul de filtrare.Se obţine din mangal sau turbă prin tratarea la cald cu vapori de apă
sau rumegus de lemn prin impregnare cu ZnCl 2 sau H2 P04 si calcinare ulterioara [Corneliu
Oniscu,1978].

Acidul clorhidric

Acidul clorhidric este un gaz incolor, cu miros puternic, iritant. Densitatea sa relativă

este de 1,12601 şi greutatea unui litru de 1,6394 g. Gazul fumegă la aer cu formare de picături
hidratate de HCl. Răcit la 10 °C şi la o presiune de 40 atm se condensează sub forma unui
lichid incolor. Punctul de fierbere este de -83,7 °C, iar cel de topire este de -112 °C.

În stare solidă se prezintă ca o masă albă cristalină. Cristalizează într-o reţea cubică

moleculară. Temperatura şi presiunea critică au valorile 51,46 °C şi, respectiv, 81,6 atm. În
stare lichidă nu conduce curentul electric[https://ro.wikipedia.org/wiki/Acid_clorhidric].

Solutia care este trecută în cristalizator se acidulează cu HCl până la punctul izoelectic
al acidului L-glutamic ,apoi se adaugă o substanţă tensioactivă ce are rolul de a favoriza
cristalizarea[Corneliu Oniscu,1978].

NaOH

Hidroxidul de sodiu, cunoscut şi drept sodă caustică sau leşie, are formula

chimică NaOH. Ca formă de agregare este un corp solid, higroscopic, de culoare albă.Este un
puternic elctrolit favorizând electroliza apei.Se dizolvă în substanţele polare degajându-se
căldură de diluare.Neutralizează acizii formând sărurile corespunzătoare radicalului nemetalic
şi apă.Proprietăţi:masa molară 39,997 g/mol, densitate 2,130 g/cm3, punct de topire 322°C,
punct de fierbere 1.388°C.Masa cristalină care se obţine se filtrează pe centrifugă ,după care se
dizolvă în apă ,se adaugă o soluţie de NaOH până la pH 6,5 şi carbune activ[Corneliu
Oniscu 1978].

36
 2.6 Mecanismul reacţiilor chimice

Pentru elucidarea mecanismului de biosinteză a acidului l-glutamic s-a plecat de la α-

ceto-glutaric ,intermediar în ciclul Krebs ,produs prin conversia zahărului în proporţie de 50-
60 % şi s-a supus procesului de transaminare.

Enzima care catalizează această recţie (transaminoza) este mult răspândită în ţesuturile
animale, vegetale şi microorganism.Procesul de transaminare poate fi reprezentat astfel:

HOCO-CHl-2-
Transaminaza HOCO-CH2-CH2-C-COOH NH3
glutamica O

HOCO-CH2-CH2-CH-COOH
NH3 Dehidrataza l-
NH2 glutamica

Acidul glutamic este unul dintre cei mai importanţi donori de grupe aminice în
procesul de transaminare la nivel celular, favorizând apariţia altor aminoacizi.

În mecanismul de biosinteză rolul biotinei este stabilit şi constă în orietarea

metabolismului microorganismelor M.glutamicus pe calea acumulării anormale a acidului
glutamic, favorizând deci creşterea randamentului în faza de biosinteză.

Plecând de la mecanismul de biosinteză au fost propuse două procedee de biosinteză:

1) procedeul într-un singur stadiu, în care acidulglutamic este produs direct în biomasă
de către un singur tip de microorganism.

2) procedeul în doua stadii, în care se obţine mai întâi acidul α-ceto-glutaric care este
mai apoi tramsformat în acid glutamic, fie cu ajutorul altui microorganism, fie prin metode
enzimatice[ Cornelui Oniscu,1978].

2.6.1 Cinetica procesului de fermentatie

37
 Studiul mecanismului reacţiilor enzimatice, a proceselor metabolice şi a vitezei de
trasformare a substratului în produs se face prin metoda cinetică. Metodă reprezintă singura
posibilitate de studio a proceselor enzimatice, deoarece numărul de enzime pure separate până
în present este redus.

În tratarea problemelor de cinetică enzimatică privind viteza de formare a produsului

sau de creştere a masei celulare, se vor folosi definiţiile date de Gaden pentru viteza de
fermentaţie ,viteză volumetrică şi viteză specific

Gaden defineşteviteza de fermentaţie ca fiind variaţia momentană a concentraţiei

produsului, a intensităţii respiraţiei sau a concentraţiei masei celulare, iar viteza volumetrică
este definită prin unitatea de produs obţinută,cantitatea de zahăr utilizată,cantitatea de celule
produsesau prin consumul de oxigen, toate fiind raportate la litru mediu de cultură şi la oră.

Viteza specifică se defineşte prin raportul dintre viteza volumetrică şi densitatea

bacteriană şi se exprimă în grame de produs obţinut pe oră şi gram masă celulară.

Procesele metabolice ce au loc în interiorul celulelor vii sunt reacţiifizico-chimice

foarte complexe care se petrec cu viteze mari şi sunt catalizate de enzime.Gaden defineşte
fermentaţia ca reprezentând “reacţiile chimice catalizate de sisteme enzimatice care, la rândul
lor, sunt produse de către microorganisme în timpul creşterii”.

Enzimele sunt macromolecule organice care catalizează procesele biochimice.Din

punct de vedere structural, enzimele sunt compuşi de natură heteroproteică cu sensibilitate
deosebită la toţi factorii care afectează proteinele.

Activitatea enzimelor este influenţată de temperatură (intervalul optim de temperatură

este între 10 şi 70°C ),Ph, presiune osmotică, concentraţia substratului, concentraţia produşilor
rezultaţi în reacţie.Activitatea enzimatică este inhibată de anumiţi agenţi specifici printre
care:sulfamide,antibiotice,narcitice,coloranţi,H2O,CO2,dezinfectante.

Substanţa asupra căreia se exercită reacţiile chimice, datorită acţiunii enzimelor, se

numeşte substrat.Prezenţa enzimelor permite transformarea substratului la temperatura
normală a materiei vii, oferind în acest fel energia necesară desfăşurării procesului de
biosinteză.

Funcţiunea esenţială a enzimelor constă în accelerarea vitezei reacţiilor metabolice la

temperatura normală a organismelor.Având activitate catalitică foarte mare,enzimele reduc

38
considerabil barierele de potenţial ale reacţiilor de transformare a substratului şi facilitează în
acest fel deplasarea echilibrului spre formarea de produs.

Mecanismul prin care enzimele transformă substratul în produs poate fi explicat prin
teoria stării de tranziţie.Această teorie presupune că substratul se combină cu enzime formând
un complex activat, instabil, care se descompune apoi în produs şi enzimă.Enzima eliberată
este utilizată într-un nou proces de transformare a substratului după schema :

k+1 k2
*
E+S E+S P+E
k-1

În care: E-este enzima liberă;

E-S*-complexul activat enzimă-substrat;

S-substrat;

P-produs;

k+1-constanta de viteză la formarea produsului;

k-1-constanta de viteză la formarea enzimei şi a substratului din complexul enzimă-substrat;

k2-constanta de viteză la formarea produsului din complexul enzimă-substrat.

Procesul de creştere a microorganismelor se urmăreşte prin determinarea masei

celulare sau a densităţii celulare şi prin determinarea numărului de microorganisme sau a
concentraţiei celulare.Măsurarea creşterii se face prin metoda turbidimetrică sau cu analizor
continuu infraroşu (prin determinarea CO2 din gazele care părăsesc cultura aerată).

În practică, este foarte comod să se urmărească ciclul de creştere prin determinarea

numărului de miroorganisme sau a acumulării acestora în timp.Dacă se reprezintă grafic
creşterea în timp a numărului de microorganisme se obţin curbe,alura acestora fiind
influenţată de metoda de măsurare utilizată.

39
 Fig. 2.6.1.1Curba de creştere a microorganismelor

Curba de creştere a microorganismelor cuprinde mai multe faze corespunzătoare

diferitelor viteze de creştere din ciclu.Astfel , după Stell, curba de creştere cuprinde patru
faze , şi anume:faza de inoculare sau de adaptare la mediu (de la a la b), faza creşterii
logaritmice a numărului de microorganisme (de la b la c), faza creşterii încetinite (de la c la d )
şi faza de descreştere a numărului de microorganisme (de la d la e ).După Monod, curba de
creştere cuprinde următoarele faze: faza lag sau faza creşterii staţionare, faza de creştere
accelerată, faza de creştere logaritmică sau faza exponenţială, faza de retardare, faza
staţionară, faza distrucţiei accelerate a microorganismelor prin liză şi faza distrucţiei
logaritmice.

Faza lag corespunde perioadei de timp în care are loc aclimatizarea microorganismelor
la noile condiţii oferite de cultivarea la scară industrială.Durata fazei lag este determinată de
compoziţia mediului folosit pentru cultivare la scară industrială şi de specia
microorganismului.După perioada de aclimatizare urmează o accelerare a creşterii,
caracterizată prin faptul că multiplele reacţii ale metabolismului microorganismelor se
deşfăsoară cu viteză ridicată.În faza creşterii logaritmice are loc un intens proces de diviziune
celulară,iar numărul microorganismelor viabile în această fază este de peste 99 %. Creşterea
logaritmică se caracterizează şi printr-un consum intens al elementelor nutitive din mediu.Pe
măsură ce mediul se epuizează , viteza procesului de creştere începe să scadă, iar acest
fenomen este tradus, pe curba propusă de Monod, prin apariţia fazei de retardare.Această etapă
se caracterizează prin acumularea de produşi metabolici, scăderea vitezei de creştere a
biomasei şi a viabilităţii microorgamismelor.Urmează o perioadă relativ scurtă în care

40
populaţia microbiană pare să rămână constantă, după care apare o pronunţată tendinţă de
reducere a viabilităţii, etapă care corespunde fazelor morţii accelerate şi a morţii
logaritmice[Corneliu Oniscu şi Dan Caşcaval,2002].

2.6.2 Modele cinetice pentru viteza de crestere a masei celulare

Cinetica proceselor de biosinteză poate fi studiată şi sub aspectul creşterii masei

celulare funcţie de concentraţia substratului. Astfel, Monod, analizand procesul de creştere
bacteriană în corelatie cu variaţia concentraţiei unui singur substrat, a stabilit pentru faza de
crestere logaritmică a masei celulare urmatoarea expresie de calcul a vitezei specifice:

μmax∗C S
μ= (1)
K S +C S

μ−¿viteza specifică de creştere a masei celulare când substratul este limitat;

μmax -viteza maximă de creştere a masei celulare când substratul  nu este limitat;

KS-constanta de saturatie (corespunde concentraţiei substratului la care viteza specifică de

creştere este jumătate din viteza maximă).

Dependenţa dintre viteza specifică de creştere a masei celulare şi concentraţia

substratului limitativ este redata în figura, din care se constată că viteza specifică de creştere
tinde asimptotic către valoarea maximă.

41
 Figura 2.6.2.1 Dependenţa dintre viteza specifică de creştere şi concentraţia substratului
limitativ

Substratul limitativ poate fi sursă de carbon şi energie, un aminoacid essential,

oxigenul, fosforul sau azotul anorganic.

Ţinând cont de faptul că viteza specifică de creştere este definită prin relaţia:

1
∗dC x
Cx (2)
μ=
dτ

Şi combinănd această relaţie cu expresia de mai sus , se obţine ecuaţia de creştere a

masei celulare în funcţie de concentraţia substratului limitativ, CS :

dC x μ max∗C s
= *C x (3)
dτ K s+ C s

Ultima relaţie este cunoscută în literatura de specialitate sub denumirea de ecuaţia

Monod.

Prezintă omare importanţă, pentru industrie faptul că primele două faze din modelul
Monod, respectiv prima fază din modelul Stell, să dureze puţin.În acest scop, se recomandă
folosirea unei culturi care creşte activ, folosirea în inocul a unui mediu de aceeaşi compoziţie
cu cel folosit în industrie şi utilizarea de inocule mari[Corneliu Oniscu şi Dan
Caşcaval,2002].

2.6.3 Modele cinetice pentru viteza de formare a produsului

Michaelis şi Menten dezvoltă modelul cinetic al vitezei de formare a produsului în

funcţie de concentraţia substratului şi a enzimei.Reacţia dintre enzimă şi substrat se desfăşoară

42
în două etape.În prima etapă, viteza de reacţie este dependentă direct cantitatea de substrat, iar
în a doua, în care are loc formarea produsului şi eliberarea enzimei, care este capabilă să reia
ciclul descris de sistemul de reacţie,viteza kdepinde
+1
de concentraţia complexului enzimă-
substrat:

E+S E-S
k-1
k2
E-S P+E

Viteza de formare în procesul enzimatic descries de sistemul de mai sus este:

dCp
Vp¿ =k 2∗Cc (4)
dτ

Pentru determinarea concentraţiei complexului enzimă-substrat,Cc, se utilizează

expresia vitezei de formare a acestuia, pentru cazul în care CS >>CE:

dC c
=k +1∗( C E −C c )∗C s−k−1∗C c −k 2∗C c (5)
dτ

În regim staţionar , concentraţia complexului nu variază în timp, iar expresia anterioară

devine:

k +1∗( C E −Cc )∗C s−k −1∗C c −k 2∗Cc =0 (6)

Prin explicitarea ecuaţiei de mai sus funcţie de CC , se obţine:

C E∗C s
C c=
k −1+ k 2 (7)
+C s
k +1

43
 Combinând ultimele două ecuaţii obţinem:

d CP k ∗C ∗C V∗C s
vp = =k 2∗C c = 2 E s =
dτ k −1+ k 2 k (9)
+ Cs K s + 2 +C s
k +1 k +1

În care : V¿ k 2∗C E –viteza maximă de formare a produsului şi corespunde stadiului în

care întreaga cantitate de enzimă formează complexul enzimă-substrat

k−1
Ks= -constanta de echilibru la disocierea complexului enzimă- substrat
k+ 1

k2
K M =K s+ -constanta Michaelis-Menten.
k +1

Constanta KM este egala cu constanta de echilibru Ks numai atunci când k2<<k+1.Cu

cât valoarea lui KM este mai mică, cu atât este mai mare afinitatea enzimei pentru
substrat.Introducând constanta KM în ultima ecuaţie se obţine:

d C p V∗C S
vp = = (10)
dτ K M +C S

Această ecuaţie este denumită ecuaţia Michaelis-Menten şi descrie viteza de formare a

produsului într-un proces enzimatic, reprentând modelul ideal pentru viteza proceselor
enzimatice în regim staţionar, lipsite de procese secundare de inhibiţie.

Ecuaţia Michaelis-Menten a fost stabilită în ipoteza că Cs>>CE .Creşterea concentraţiei

enzimei în mediul de fermentaţie peste o anumită limită atrage după sine anularea acestei
ipoteze şi, în consecinţă, viteza recţiei enzimatice nu va mai fi direct proporţională cu
concentraţia enzimei.

44
 KM
Fig. 2.6.3.1Reprezentarea grafică a ecuaţiei Michaelis-Menten

Din reprezentarea grafică se observă că KM este acea valoare a concentraţiei

substratului CS pentru care reacţia porneşte cu jumătate din viteza maximă ,V.

Pentru determinarea constantei KM şi a vitezei maxime V, se utilizează metodele de

liniarizare. Una dintre acestea este metoda Lineweaver-Burk, care foloseăte inversul ecuatiei
(10):                                                  

1 KM 1 + 1
=  *                                                  (11)
v p V CS V

1 1
Prin reprezentarea grafică a ecuaţiei (11) în coordinatele  şi   se obţine dia-grama
v p Cs
Lineweaver-Burk (figura 2.6.3.1 ), care permite determinarea constantelor V şi KM în funcţie
de variaţia concentraţiei substratului şi de valorile experimentale ale vitezei de formare a
produsului.

45
 Figura 2.6.3.1.2 Reprezentarea grafică a ecuaţiei Lineweaver-Burk.

În literartura de specialitate se întâlnesc şi alte reprezentări ale ecuaţiei Michaelis-

Menten. Astfel, Eadie-Hofsee obţin prin împărţirea ecuaţiei (10) la Cs:

v
sau v p =V −K
V
p=
KM
+1
M∗v p
Cs
(12)
Cs

VP
Reprezentarea grafică a acestei ecuaţii în coordinate  VP şi   este o dreaptă, redată în
CS
figura 2.6.3.1.3

Figura 2.6.3.1.4 Reprezentarea grafică a vitezei reacţiei enzimatice după metoda Eadie-
Hofsee.

O altă reprezentare a ecuaţieie Michaelis-Menten a fost propusă de Woolf. Autorul

porneşte de la ecuaţia Lineweaver-Burk pe care o înmulţeşte cu C S,obţinând ecuaţia (13),
redată în figura 2.6.3.1.4

Cs K M 1
= + ∗C s                                                          (13)
vp V V

46
 Figura 2.6.3.1.5 Reprezentarea grafică a ecuaţiei Michaelis-Menten după metoda lui Woolf.

Modelul Michaelis-Menten a fost conceput ca un model ideal şi descrie viteza de

formare a produselor în procese de fermentatie perfecte. Însă, acest model, care abordează
cinetica enzimatică în regim staţionar, poate fi extins şi la procesele în care, alături de
transformarea enzimatică a substratului în produs, intervin reacţii de inhibiţie competitivă sau
necompetitivă a enzimelor. Prezenţa inhibitorilor nu se poate evita, deoarece ei apar ca urmare
a degradării mediului nutritiv în timpul sterilizării, a unor reacţii secundare şi nu numai.

Principalele tipuri de inhibiţii întâlnite curent în procesele fermentative sunt:

- inhibiţia competitivă;

- inhibiţia necompetitivă;

- inhibiţie de substrat;

- inhibiţie de produs.

Procesul  de transformare enzimatică a substratului în produs însoţit de inhibiţie

competitive este descries prin reacţiile:

(14)

Caracteristic pentru procesul de transformare enzimatică însoţit de inhibiţie

competitivă este faptul că enzima pusă în libertate prin disocierea complexului enzimă-
inhibitor, E-I, îsi pierde capacitatea de a cataliza transformarea substratului în
produs.                              

47
 Viteza de formare a produsului este proporţională cu concentraţia complexului enzimă-
substrat, de aceea este necesară cunoaşterea valorii acesteia, în regim staţionar. În acest scop,
se scriu constantele de echilibru, pentru situaţia în care :

K s =(C ¿ ¿ E ¿¿−C c−C D ¿ ¿C c ¿ )∗C s ¿¿¿ ¿ (15)

K I =¿ ¿ ¿            (16)

unde: CI - concentraţia inhibitorului;

           CD-  concentraţia complexului enzimă-inhibitor.

Se reduce termenul CD din ecuaţiile (15) şi (16) şi se explicitează în funcţie de Cc,

obţinându-se:

C C E ×C s × K I
C=
K I × K s+ K s × C + K
(17)
I I ×C
s

Ecuaţia vitezei de formare a produsului devenind:

v k 2× C E × C × K I V × Cs
p =k 2× C c = s
=
K s × K I + K × C ×C s K K
(18)
s I +K M
I M+ C s + ×C I
KI

în care: KM=KS deoarece k2<<k+1

Ecuaţia (18) descrie viteza de formare a produsului într-un proces de fermentaţie

însoţit de inhibiţie competitivăa enzimei. Diferenţa dintre această ecuaţie şi ecuaţia
KM
Michaelis- constă în prezenţa la numitor a termenului ( )×C I datorat efectului
KI
generat de inhibitor. În concluzie, viteza de formare a produsului fiind invers
proporţională cu concentraţia inhibitorului, se impune ca la sterilizarea mediului să se
evite, pe cât posibil, degradarea acestuia, degradare care conduce la apariţia
inhibitorilor. De asemenea, trebuiesc evitate toate reacţiile chimice generatoare de
inhibitori enzimatici în procesul de fermentaţie.

48
 Figura 2.6.3.1.6 Reprezentarea grafică a vitezei reacţiei enzimatice însoţită de inhibiţie
competitivă  după metoda Lineweaver-Burk.

Determinarea constantelor KI,KM,V se face prin aplicarea metodei Lineweaver-Burk. În acest

scop, se scrie inversul ecuatiei (18):

1 KM CI 1 1
= ×(1+ )× + (19)
vp V KI CS V

1 1
Şi se reprezintă grafic în coordonatele    şi  ( figura 2.6.7), valorile constantelor
v p Cs
calculându-se din panta dreptei obţinute şi din intersecţia cu ordonata.                            

În cazul în care inhibitorul nu acţionează competitiv, afinitatea enzimei pentru substrat sau
inhibitor rămâne neschimbată, indifferent dacă enzima este liberă sau fixă în complex.
Reacţiile care au loc în sistemul cu inhibiţie necompetitivă sunt:

Pentru cazul în care Cs>>CE şi CI>>CD*CF constantele de echilibru ale sistemului (18) se

calculează cu expresiile urmatoare:      

K s =¿ ¿             (19),

49
 K I =¿ ¿(20),

Cc ×C I
K I=   (21),
CF

K
s=
C D ×C s
(22)
CF

în care : CF- concentraţia complexului enzimă-substrat-inhibitor.

Admiţându-se că KS=KS’ şi KI=KI’ prin combinarea ecuaţiilor anterioare se obţine

concentraţia complexului enzimă-substrat:

C E ×C s × K I
C c=                                                     (23)
(K ¿ ¿ s +C s )×( K I + C I )¿

Iar ecuaţia vitezei de formare a produsului devine:

v k 2 ×C E ×C × K I
p =k 2× C c = s
¿
(K ¿ ¿ s+C s )×(K I +C I )=
V × Cs
                     (24)
CI
( K M +C s ) ×1+
KI

în care: KM=KS deoarece k2<<k+1.

Din ecuaţia (24) rezultă căviteza de formare a produsului într-un proces de fermentaţie
însoţit de inhibiţie necompetitivă este mai mică decât viteza procesului fară inhibiţie (ecuaţia
Michaelis-Menten) şi a procesului de fermentaţie însoţit de inhibiţie competitivă (ecuatia 25).

Aplicându-se şi acestei expresii metoda de liniarizare Lineweaver-Burk, se obţine

ecuaţia unei drepte:

1 C
=¿ )×(1+ I )                                             (25)
vp KI

1 1
Iar prin reprezentarea în coordonatele  şi   se obţine figura 2.6.7, care permite
V p Cs
determinarea constantelor cu ajutorul pantei şi a intersecţiei cu ordonata.

50
 Figura 2.6.3.1.7 Reprezentarea grafică a vitezei reacţiei enzimatice însoţită de inhibiţie
necompetitivă după metoda Lineweaver-Burk.

2.6.4 Modelul Gaden

În funcţie de modelul de formare a produsului, au fost propuse diferite criterii

de clasificare a proceselor debiosinteză. Astfel, Deindoerfer a realizat, pe baza datelor din
literatură, o clasificare cinetică, în funcţie de tipul reacţiilor care descriu procesul: reacţii
simple, reacţii simultane, consecutive, în trepte şi complexe.

51
 Figura 2.6.4.1Tipuri de fermentatie dupa Gaden (  – formarea produsului;   –
consum de substrat;   – crestere masa celulara).

În acest cadru, Gaden a clasificat procesele de fermentaţie în funcţie de corelaţia dintre

formarea produsului şiconsumul substratului in trei tipuri:

- (figura a )a.formarea produsului este raportată  direct la substratul utilizat;

- (figura b )b.formarea produsului este raportată indirect la substratul utilizat ;

-(figura c ) c.formarea produsului nu are aparent legătură cu substratul utilizat .

Analizând diagramele din figura 2.6.8, se constată că în tipul a de fermentație produsul

se formează în paralel cu creşterea microorganismelor, respectiv viteza de formare a
produsului variază liniar cu viteza de creştere a masei celulare pe parcursul fermentaţiei.
Tipul c indică faptul că formarea produsului are loc după încetarea creşterii biomasei şi
consumul total al substratului (fermentaţia penicilinelor, streptomicinei, tetraciclinei ). Tipul b
este intermediar şi se poate exemplifica prin fermentaţia lactică[Corneliu Oniscu şi Dan
Cașcaval, 2002].

2.6.5 Termodinamica proceselor de fermentație

Procesul de fermentaţie se încadrează, din punct de vedere termodinamic, în categoria

sistemelor termodinamice deschise, sisteme specifice organismelor vii, caracterizate prin
schimb de energie şi de materie cu mediul înconjurator, pe care îl transformă. Sistemelor
deschise le este specific faptul că ele nu sunt în echilibru cu mediul lor. Organismele vii se
află, de obicei, într-o stare staţionară, care reprezintă condiţia de bază a sistemelor deschise, şi
în care viteza transferului de materie şi energie din mediu în sistem este compensată total de
viteza transferului de materie şi energie din sistem în afara lui.

Faptul că celula este un sistem deschis, care nu se află in echilibru cu mediul său, un
mecanism care captează energie liberă din mediu, producându-i simultan o creştere oarecare a
gradului de dezordine, adică a entropiei, face parte din logica moleculară a stării vii.

52
 Sursa de energie a sistemelor termodinamice deschise o reprezintă hidraţii de carbon,
lipidele, alcoolii, proteinele etc, care prin combustie chimică elibereaza o mare cantitate de
energie. O parte din aceasta energie se elimina din sistem, iar o parte este inmagazinata de
sistem in compusi organici macroenergetici, dintre care se remarca acidul adenozintrifosforic
(ATP), compus care asigura, practic, rezerva energetica a celulei. Din structura ATP-ului,
prezentata mai jos, rezulta ca legaturile dintre gruparile fosfat adiacente din ATP si ADP
(acidul adenozindifosforic) sant legaturi de tip anhidrida, notate cu ~, in timp ce legatura
dintre acidul fosforic si riboza din AMP (acidul adenozinmonofosforic) este o legatura
esterica, notata cu linie dreapta.

În acest context, trebuie subliniat faptul că energia liberă standard de hidroliză a

legaturilor tip anhidridăeste mult mai mare comparativ cu cea a legăturilor esterice. Deşi ATP-
ul conţine două legături macroenergice (~), în reacţiile enzimatice intervine, de obicei, numai
fosfatul terminal. De asemenea, este necesar de precizat că ATP-ul nu este numai un rezervor
de energie chimică, ci este în primul rând, un transmiţător de energie chimică în celulele v
transportând energia sa la alte molecule, acest compus pierde gruparea fosfat terminală,
trecând în ADP, care, la rândul său, poate accepta energie chimică şi reface ATP-ul, primind o
grupare fosfat.

Prin reunirea acestor observaţii, ca şi a multor altora, s-a constatat că ATP-ul

funcţionează ciclic ca transportor de energie chimică de la reacţiile de ardere, care furnizează
energia chimică, la diferitele procese celulare care necesită un consum energetic.

53
 Figura 2.6.5.1 Ciclul ATP – ADP şi modalităţile de utilizare  a energiei eliberate de ATP

S-a evidenţiat experimental că, indiferent de natura substratului limitativ considerat ca

sursă de energie sau molecule combustibil (excepţiile fiind foarte rare), raportul dintre
cantitatea în grame a celulelor microbiene obţinute ăn stare uscată şi numărul de molecule de
ATP sintetizate este aproximativ constant şi are valoarea de 10,5. De asemenea, s-a
demonstrat că în procesul de cultivare a bacteriilor în condiţii aerobe 60±5% din cantitatea de
carbon din mediu este asimilată de celule şi numai 40±5% este oxidat la CO 2. Din punct de
vedere energetic, circa 62% din energia liberă de oxidare a substartului reprezintă energia
liberă de ardere a componentelor masei bacteriene, astfel încat ∆Hc=22KJ/g s.u. (masa
bacteriana).

Dacă substratul furnizor de energie este glucoza, care se consumă într-un proces de
fermentaţie aerob prin catabolism, atunci se formeazî, conform reacţiei de mai jos, 38 moli
ATP, care pot înmagazina 1159 kJ din cei 2870 obţinuţi prin combustia unui mol de glucoza:

Glucoza + 6O2  →  6CO2 + 6H2O + 38 moli ATP

Pentru alte sisteme de fermentatie sau alte substraturi utilizate, numarul de moli de ATP
formaţi este diferit, după cum rezultă din tabelul :

54
 Tabel 2.21.Numărul de molecule de ATP formate în procesele de fermentaţie

aerobă si anaerobă cu diverse substraturi.

Substrat Conditii de fermentatie Moli

ATP/moli
substrat

Glucoza Aeroba 38

Anaeroba (cu formare de formiat+acetat) 3

Anaeroba (cu formare de etanol+CO2) 2

Piruvat Aeroba 30

Anaeroba (cu formare de formiat+acetat) 1

Anaeroba (cu formare de etanol+CO2) 0

Palmitat (C16) Aeroba 130

Moleculele de ATP şi ADP fiind puternic ionizate, datorită faptului că pH-ul lichidului
intracelular are valoarea 7, formează în prezeţa ionilor de Mg 2+ (aflat în cantitate ridicată în
lichidul intracelular) complecşi de tipul celui prezentat mai jos, complecşi care constituie, de
altfel, chiar forma activă a ATP-ului:

Mg ATP2-

Pentru analiza termodinamică a sistemelor biochimice şi a reacţiilor pe care le induce

ATP-ul, este necesar să se precizeze câteva convenţii, şi anume:

55
 a) în sistem apos diluat în care apa apare ca produs sau reactant, activitatea sa
termodinamică (sau concentratia) se stabileşte arbitrar la valoarea 1, deşi concentraţia molară a
apei este 55,5 M;                                                                                                                

b) în energetica biochimică, starea de referinţă este pH = 7,0 şi nu pH = 0

(corespunzatoare unei concentraţii de ioni de hidrogen de 1,0 M), cum se consideră în
termodinamica chimică;

c) variaţia energiei libere standard la pH = 7,0 si 25°C se notează cu ΔG o iar cea de la

pH = 0 cu ΔGo

d) deoarece la pH = 7,0 starea standard este un amestec de forme ionizate şi neionizate,

rezultă că valorile lui ΔGo depind de valoarea pH-ului, care influentează direct raportul dintre
formele ionizate şi neionizate ale reactanţilor sau produşilor de reaţie[Corneliu Oniscu și Dan
Cașcaval,2002].

2.6.6 Calculul efectului termic total al procesului biotehnologic

Capitolul 3. Controlul fabricaţiei

3.1 Controlul, reglarea şi automatizarea procesului tehnologic

Obiectivul conducerii automate a unui fermentator este realizarea şi menţinerea

condiţiilor favorabile pentru viaţa şi producerea microorganismelor: temperatură, presiune,
pH, concentraţia diferitelor substanţe chimice.

Principalii parametri reglaţi în proces sunt:

 temperatura, cu precizie ridicată, la o valoare între 25 şi 30°C ; bucla de temperatură

TRC foloseşte, ca mărime de execuţie, debitul de agent termic vehiculat prin mantaua
reactorului;
 presiunea ,cu bucla PIC ce manipulează debitul de evacuare a gazelor;

56
  pH-ul, un parametru ce are puternică influenţă asupra desfăşurării procesului de
fermentaţie, cu bucla pHRC, în care parametrul de reglare este debitul uneia dintre
sunstanţele chimice adăugate (acid sau bază) ; pentru măsurarea pH-ului, electrodul
de pH se montează, de preferinţă, exterior reactorului, într-o celulă plasată pe o
conductă de recirculare. În acest fel, calibrarea şi întreţinerea electrodului în condiţiile
asigurării sterilităţii mediului măsurat sunt mai uşor de realizat.
 concentraţia oxigenului dizolvat, cu bucla de reglare ARC-O2 în care se manipulează
debitul de aer steril introdus în fermentator ; măsurarea acestui parametru se poate face
prin măsurarea presiunii parţiale cu un traductor galvanic de oxigen dizolvat sau cu un
analizor polarografic,steril cu abur;
 nivelul, cu bucla de reglare LICA, în special pentru prevenirea formării spumei; ca
mărime de execuţie se foloseşte debitul de agent antispumant (ulei) ,sterilizat în
prealabil, care se injectează în fermentator. Pentru diminuarea nivelului de spumă
reactorul este prevăzut şi cu dispozitive de distrugere mecanică a spumei.

Alături de reglările de mai sus cu aparate prevăzute,cele mai multe, şi cu funcţiuni de

indicare, înregistrare şi alarmare, pentru monitorizarea procesului de fermentaţie se măsoară
şi\sau se înregistrează, cu aparatură în flux sau prin analiza în laborator a probelor prelevate,
unii dintre urmatorii parametri tehnologici:

 compoziţia gazelor evacuate în O2,CO2,NH3, (uneori) cu analizoare de gaze sau cu

spectrometre de masă;
 compoziţia mediului de fermentare în gazele dizolvate (O2,CO2,CH4 ) şi în compuşii
volatili ca metanol, etanol, butanol şi acetonă prin spectrometrie de masă;
 concentraţia în celule a masei de reacţie, cu sensori fotoelectrici de turbiditate;
menţinerea densităţii populaţiei este realizată prin manipularea debitului de nutrient
introdus în fermentator.
 debitul şi presiunea aerului sterilizat la intrare, a aburului de încălzire, a fluxului de
gaze evacuate, debitul de chimicale pentru corectarea pH-ului şi a turaţiei agitatorului
(cu alarmare pentru cazurile critice).

57
 Figura 3.1.0 Schema de automatizare a unui fermentator cu funcţionare discontinu

SA-alarma viteza

FI-indicator de debit

LICA-indicator control şi alarma pentru nivel

pHRC-regulator de pH

TRC-regulator de temperatură

AR-întregistrator de comportare a CO2 şi O2

ARC-înregistrare şi controlul concentraţiei

3.1.1 Reglarea automată a temperaturii

58
 În procesele din industria chimică, căldura este transferată prin radiaţie, prin
amestecarea fluidelor reci şi calde sau, cel mai frecvent, prin conducţie prin pereţii utilajelor.

Variabila manipulată este, de regulă, debitul de agent termic.

Pentru schimbătoarele de căldură montate orizontal se recomandă plasarea ventilului

de reglare pe conducta de alimentare cu abur (figura 3.1.1 ), iar pentru cele montate vertical,
pe conducta de evacuare a condensului (figura 3.1.2 ).

În primul caz, (figura 3.1.1) la o micşorare a temperaturii lichidului încălzit, sub

valoarea de referinţă, regulatorul comandă creşterea debitului de abur. Această creştere
conduce la ridicarea rapidă a presiunii în spaţiul de abur şi, ca urmare, la o mărire a
temperaturii de condensare şi la un transfer de căldură mai intens către lichidul tehnologic.

În al doilea caz (figura 3.1.2), dacă temperatura lichidului încălzit depăşeşte referinta,
regulatorul comandă închiderea parţială a ventilului de reglare de pe conducta de condens. În
consecinţa, creşte nivelul condensului, acesta acoperind o suprafaţa mai mare a tuburilor
încălzitoare.

3
3
2

2
1
1

Figura 3.1.1                                                      Figura 3.1.2

1-schimbător de căldură

2-ventil de reglare

3-bucla de reglare temperatură TC

59
 Deoarece timpul de retenţie a condensului este apreciabil, răspunsul sistemului de
reglare este mai lent decat al celui din primul caz.

Dacă reglarea automatăa temperaturii trebuie realizată rapid şi schimbatorul de

caldurăeste supradimensionat, se recomandă utilizarea schemei din figura 3.1.3. Aici 10%
până la 30% din fluxul de lichid tehnologic este trimis pe o cale ocolitoare şi amestecat, la
ieşire, cu lichidul încălzit.

3
2

Figura 3.1.3

1-schimbător de căldură

2-ventil de reglare

3-bucla de reglare temperature TC

Stabilizarea temperaturii în vaporizatoare foloseşte o schemă de reglare în cascadă:

temperatura (bucla supraordonată)-debit (bucla subordonată) ca in figura 3.1.4.Bucla de debit
stabilizează debitul de abur (la valoarea de referinţă dată de regulatorul de temperatură) înainte
ca abaterea acestui debit (ca perturbaţie pentru vaporizator) să influenţeze temperatura care
este parametrul reglat principal.
4

60
 3

2 1

Figura 3.1.4

1-vaporizator

2-ventil de reglare

3-bucla de reglare debit FC

4-bucla de reglare temperature TC

Sisteme de reglare evoluată (mai ales în cascadă) sunt curent utilizate şi pentru
stabilizarea temperaturii în reactoare chimice.

3.1.2 Reglarea automată a pH-ului

Pentru obţinerea pH-ului dorit al unei soluţii se recurge la adăugarea, în aceasta, ca

medii de reglare, a unor reactivi sub forma altor soluţii de acizi sau baze, substanţe
pulverizante (CaCO3, CaO), substante gazoase (CO2, SO2, NH3 ) sau a unor soluţii tampon sau
agenţi de precipitare.

Sistemele de reglare pentru pH pot fi împarţite în 2 categorii, după scopul urmărit:

61
 1.       reglarea pH-ului este o acţiune suplimentară, având scop realizarea unei condiţii
necesare pentru buna desfăşurare a procesului; un exemplu bun îl constituie procesul de
fermentaţie discontinuu unde, datorită unui timp îndelungat de staţionare a masei de reacţie în
reactor şi a consumului lent de reactive adăugat pentru stabilizarea pH-ului, reglarea este
destul de uşor de îndeplinit şi un regulator simplu, bipozitional, dă satisfacţie.

2.       stabilizarea pH-ului în reactoarele de neutralizare în care se amestecă soluţia

principală cu un reactiv, cu scopul de a se realiza un anumit pH; exemplul cel mai des întălnit
este cel al tratării continue al unor soluţii sau al neutralizării produselor reziduale.

Reglarea automată a pH-ului este afectată de o serie de dificultăţi specifice, dintre care
remarcăm:

a. spre deosebire de reglarea altor parametri (nivel, debit, presiune ), unde se foloseşte
un singur mediu de “reglare”, în cazul stabilizării pH-ului la o anumită valoare vor fi necesare,
uneori, 2 medii de reglare diferite ; este cazul, de pildă, al neutralizării unor ape reziduale, al
căror pH se poate abate în ambele sensuri, în raport cu valoarea prescrisă care, de regulă, este
6-7; o atare situaţie poate fi rezolvată adăugând fie reactive acid, fie reactive basic în funcţie
de sensul în care se abate, iniţial, pH-ul.

b. precizia cu care se poate reglat pH-ul este dependentă de valoarea de

referintă (figura 3.1.5 ), de faptul dacă mediul reglat este puternic sau slab acid sau basic (fig
3.1.5 ), de valoarea abaterii primare şi, bineînteles, de precizia cu care se adaugă reactivul de
neutralizare, în cm3 [reactiv/l soluţie], la aceeasi valoare prescrisă.

Pentru a ne explica aceasta comportare, să plecam de la forma tipică, neliniară, a

curbelor de titrare care are aspectul unui “S”.

În figura 3.1.5 observăm că, datorită acestui aspect, cu cât este mai departată de
valoarea pH=7, cu atât creşte precizia de reglare; astfel, dacă referinţa este (pH) r1 (punctual 1),
plasata în apropierea punctului de echivalenţă, la o imprecizie de adăugare a reactivului de +/-
(ΔV), abaterea valorii reglate de la cea de referinţă este evident mai mare decât abaterea
corespunzatoare referinţei (pH)r2 (punctual 2), pentru aceeaşi imprecizie de adăugare a
reactivului.

62
 Figura 3.1.5

3. existenţa, în buclă, a unor întârzieri (timp mort şi întârzieri de capacitate)

apreciabile.

Întârzierea pură este dată, în principal, de timpul necesar transmiterii semnalului de la

punctul de adăugare a reactivului de neutralizare (punctual A) până la punctul de măsurare
(punctual B ). Apropierea celor 2 puncte, ca în schema de reglare din figura3.1.6, în scopul
reducerii timpului mort, este limitată de necesitatea de a asigura un timp de reacţie suficient de
lung.

1
2

Figura 3.1.6

1-bucla de reglare pH

2-ventil de reglare

63
A-punct de adăugare a reactivului de neutralizare

B-punct de măsurare

Întârzierea de capacitate este introdusă atât de traductorul de pH cât, mai ales, de

capacitatea rezervorului tampon de amestec, impus de acea necesitate de a asigura timpul de
reacţie, ca în schema de reglare din figura 3.1.7.

3 2

Figura 3.1.7

1-rezervor tampon de amestec

2-bucla de reglare pH

3-ventil de reglare

Dacă timpul de reacţie este tr [s] atunci volumul rezervorului tampon, Vr [m3], se
calculează cu relatia :

Vr=F tr

unde :   F[m3/s]  - este debitul de soluţie ce întră în vas.

Mărind volumul vasului tampon atenuăm oscilaţiile pH-ului soluţiei reglate, având ca
rezultat creşterea preciziei de reglare; în acelaşi timp, însă, creşte întârzierea de capacitate
introdusă de rezervor în bucla de reglare, ceea ce măreşte dificultatea reglării;

64
                O calitate bună a reglării pH-ului este condiţionată de o bună amestecare a soluţiei
cu reactivul de neutralizare şi, în fine, de o curăţire periodică a electrodului de masură a pH-
ului.

Schema de reglare din figura 3.1.8 este utilizabilă, îndeosebi, în situaţiile în care
debitul soluţiei al cărei pH trebuie stabilizat este constant şi reacţia de neutralizare este rapidă.

Dacă reacţia de neutralizare este lentă şi este însoţită de variaţii mari de debit ale
mediului reglat se utilizează schema de reglare în cascadă.

Ambele regulatoare ale cascadei sunt regulatoare de pH; cel din bucla supraordonată,
pHC-1, careeste informat asupra valorii măsurate la punctual final, B, furnizează referinţa
celui din bucla subordonată, pHC-2, care stabilizează pH-ul în punctual A, imediat după
ieşirea din vasul tampon.
4

2
1 3

Figura 3.1.8

1-vas tampon

2-bucla de reglare pH 2

3-bucla de reglare pH 1

4-ventil de reglare

Pentru cazuri mai dificile, cum sunt cele întâlnite în neutralizarea apelor reziduale al
căror pH se poate abate în ambele sensuri, ceea ce impune utilizarea a 2 medii de reglare
diferite se poate folosi schema de reglare din figura 3.1.8 , o combinaţie de reglare în cascada
cu o reglare cu divizarea comenzii.

65
 Regulatorul supraordonat pHC-1, informat asupra pH-ului în punctual final B,
comandă debitul de reactiv bazic, ca variabilă manipulată şi, în acelaşi timp, furnizează
referinţă pentru regulatorul subordonat pHC-2 care stabilizează pH-ul în punctul intermediar
A. Regulatorul subordonat va comanda, în regim de divizare, două mărimi de execuţie-
debitele celor 2 reactivi disponibili.

3.1.3Reglarea automată a concentraţiei

Reglarea automată a concentraţiei în reactoare este realizată de cele mai multe ori
indirect, stabilizând direct alţi parametri care influenţează deşfăşurarea procesului de reacţie:
temperatura, debitele de reactanţi, timpii de staţionare în reactor.Deseori nici nu este nevoie de
o reglare a concentraţiei în reactor deoarece se urmăreşte obţinerea conversiei maxime
posibile.

Reglarea automată directă a concentraţiei este justificată în cazurile în care viteza de

reacţie fluctuează, datorită modificării activităţii catalizatorului, a temperaturii sau a purităţii
fluxurilor de alimentare şi abaterile concentraţiei produsului au efecte economice
semnificative.De exemplu, concentraţia unui produs poate trece printr-un maximum după care,
creşterea conversiei reactanţilor duce la descompunerea acestuia într-o serie de produse
secundare. În acest caz, reactorul trebuie automatizat având ca scop obţinerea unei concentraţii
optime a produsului care, în mod obişnuit, poate fi mai mică decât valoarea maximă.

Utilizarea schemelor de reglare bazate pe măsurarea automată a concentraţiei este,

încă, puţin practicată deoarece:

 analizoarele automate au, de regulă, un domeniu limitat de aplicare; ele pot analiza
numai concentraţia într-un anumit component pe cand aparatele care măsoară
temperaturi, debite, presiuni, funcţionează indiferent de natura mediului masurat;
 analizoarele introduc în bucla de reglare întârzieri mari de transport (timpi necesari
pentru prelevarea probei, analiza ei şi comunicarea rezultatului), chiar dacă sunt
montate “în flux” şi nelinearităţi;
 de regulă, analizoarele sunt aparate puţin robuste cu fiabilitate redusă şi întreţinere
pretenţioasă.

66
 Se preferă reglarea concentraţiei măsurând alţi parametri care descriu, cu aproximaţie,
compoziţia sau gradul de conversie: densitatea, indicele de refracţie, vâscozitatea.

Mai des întâlnim reglarea concentratiei amestecurilor de lichide sau de gaze.Dăm in figura
3.1.9 schema stabilizării concentraţiei soluţiei la iesirea dintr-un amestecator de lichide şi în
figura 3.1.10 schema reglării concentraţiei produsului unui amestecator de gaze.

4
3

1
2

Figura 3.1.9

1-amestecător de lichide

2-bucla de reglare a concentraţiei

3-ventil de reglare

4-bucla de reglare debit

În figura 3.1.9 măsurarea concentraţiei se realizează cu un analizor ca aparat de măsură

pe ramura de reacţie a buclei 1, montat în flux pe o cale ocolitoare variabila manipulată este
debitul de concentrare la intrarea în amestecător.

67
 1 2

Figura 3.1.10

1-ventil de reglare

2-bucla de reglare concentraţie AC

3-bucla de reglare debit FC

În figura 3.1.10 se foloseşte drept aparat de masură un analizor de compoziţie a

amestecurilor de gaze analizor specific tipurilor de componente care se amestecă montat,
deasemenea, pe o derivaţie a conductei de ieşire a produsului; variabila manipulată în bucla I
este debitul unuia dintre componenţi (gaz A).

În ambele situaţii, stabilizarea concentraţiei este uşurată adăugând, la buclele I, circuite

de stabilizare ale debitelor componentelor care nu sunt mărimi de execuţie (diluant, respective
gaz B, buclele II); în acest fel se elimină fluctuaţiile de debit ale acestor componente, fluctuaţii
care se manifestă ca perturbaţii pentru sistem.

3.1.4 Reglarea concentraţiei oxigenului

În cazul măsurătorilor de oxigen dizolvat în lichide biologice ale diferitelor procese

biochimice industriale, moleculele sau monomoleculele deranjează măsurătorile de oxigen ce
utilizează senzori cu membrane permeabile pentru oxigen sau senzori galvanici pentru
determinarea oxigenului în flux (figura3.1.11) . Aceşti senzori de lucru ai celulei izolaţi de
mediul de măsurat prin intermediul unei membrane din material plastic careeste permeabilă

68
pentru oxigen şi impermeabilă pentru marea majoritate a substanţelor care ar putea fi reduse la
catod odată cu oxigenul.

1.-catod

2.-anod

3.-membrana

4.-electrolit

5-proba

Figura 3.1.11 Aparat pentru determinarea oxigenului dizolvat

Membrana întinsă la partea inferioară a senzorului reţine un film de elecrolit la

suprafaţa catodului.

Senzorii galvanici pentru determinarea oxigenului dizolvat sunt diferiţi de cei

amperometrici prin faptul că nu necesită o sursă externă de voltaj (figura 3.1.11). În acest caz
diferenţa de potenţial necesară, se asigură prin alegerea convenabilă a anodului şi a
electrolitului, astfel încât, după scurtcircuitarea electrozilor să se producă o electroliză internă,
este necesar ca tensiunea generată prin dizolvarea anodului să fie suficientă pentru reducerea
spontană a oxigenului la suprafaţa catodului.

Ca anozi se folosesc metale mai active, cum ar fi: Zn, Cd, Pb, iar catozii se constituiesc
din metale mobile cum ar fi: Pt, Au, Ag. Astfel, pentru un senzor galvanic cu catod de argint şi
anod din plumb, reacţiile electrochimice care au loc pe electrozi sunt date de ecuatiile:

Catod: O2 + 2H2O + 4e  → 4HO

Anod: 2Pb → 2Pb2+ + 4e

69
 Iar în soluţia de electrolit se produce reacţia secundară:

2Pb + 4HO → 2Pb (OH)2

Reacţia globală a senzorului se obţine prin însumarea reacţiilor de mai sus:

O2 + 2Pb + 2H2O → 2Pb (OH)2

1.-catod; 2.- anod; 3.-oxigen dizolvat; 4.-electrolit;

5.-ampermetru sensibil

Figura 3.1.12 Principiul de realizare al unui senzor galvanic pentru oxigen

În cazul senzorilor galvanici, se observă că electrolitul nu participă la reacţiile

electrolitice, în schimb suprafaţa anodului oxidează treptat. Variaţia senzorului depinde astfel
de suprafaţa disponibilăa anodului.

Întrucât nu există o sursă externă de voltaj pentru producerea reducerii electrolitice a

oxigenului din soluţie, senzorii galvanici sunt mai simpli în construcţie comparativ cu cei
amperometrici.

În general, senzorii amperometrici sau galvanici pentru determinarea oxigenului,

prezintă un curent rezidual de baza mai mare decât în cazul celulelor polarografice cu electrod
de Hg. Aceasta se datorează depunerii sau desprinderii a diferiţi compusi (ex: oxizi) , pe sau
de pe suprafaţa electrozilor. Din aceste considerente, pentru obţinerea unor rezultate
reproductibile, se impune un pretratament chimic sau mecanic al electrozilor înaintea utilizării
acestora. De asemenea sunt necesare recalibrări periodice ale celulelor respective.

Pe baza principiilor de funcţionare ale senzorilor pentru oxigen acoperiţi cu membrane,

s-au realizat şi comercializat câteva tipuri constructive mai importante.

70
 Unul din acesti senzori este senzorul Clark.

Senzorul Clark, a cărei reprezentare schematicăeste redată în figura 3.1.13, este realizat
dintr-un catod de platină sub forma unui disc plat şi o incintă cu electrolit (soluţie KCl), în
care se găseşte imersat anodul din argint. Membrana, din teflon, cu o grosime de 25μm, se
întinde la partea inferioaă a senzorului prin intermediul unui inel din cauciuc, reţinând astfel
între aceasta şi catod un film de electrolit furnizat din rezervorul cu electrolit al senzorului.

Senzorii de acest tip prezintă adesea, la începutul perioadei de lucru, o variaţie a

curentului de difuzie. Aceste variaţii în funcţionare se datoresc depozitării în timp a AgCl pe
suprafaţa anodului, depunerii de argint pe suprafaţa catodului, sau reducerii până la eliminarea
totală a clorului din electrolit. Curăţând însă din timp în timp electrozii, schimbând electrolitul
şi înlocuind periodic membrana, senzorul poate funcţiona timp îndelungat. Evident, după
fiecare condiţionare în acest fel a senzorului, se impune o
recalibrare a măsurătorilor.

1.-catod

2.-anod

3.-electrolit

4.-membrana

5.-corpul senzorului

6.-inel de cauciuc
Figura 3.1.13 Reprezentarea schematică a unui senzor pentru oxigen tip Clark

Prin utilizarea corectă a unui senzor de tip Clark cu membrană din teflon, cu o grosime
de 25μm, aproximativ 95% din semnalul analitic în regim staţionar se obţine în 15 – 20
secunde.

Acest senzor prezintă însă un răspuns histerezis; răspunsul este mai rapid pentru
măsurători ale unor concentraţii crescătoare faţă de măsurători ale unor concentraţii
descrescătoare în oxigen (figura 3.1.14). Această comportare, care constă în stabilizarea mai
înceată a răspunsului senzorului la efectuarea măsurătorilor unor soluţii cu un conţinut mai
mic de oxigen faţă de proba precedentă, a fost explicată prin difuzia laterală a O 2, către
rezervorul de electrolit, care este foarte aproape de catod. Pentru eliminarea acestui fenomen

71
au fost realizaţi o serie de senzori cu cantităţi mici de electrolit în rezervor, sau prin localizarea
rezervorului într-o poziţie mai departată de catod.

Figura 3.1.14 Răspunsul histerezis al unui senzor O2

1). concentraţii crescătoare

2). concentraţii descrescătoare

Reglarea automată a nivelului

Schemele de reglare a nivelului, precum şi tipul de regulator utilizat, depind de:

  1. obiectivul urmărit prin reglarea automată:

    a) pentru menţinerea, cu precizie ridicată, a unui nivel constant (în reactoare,
tamburele cazanelor de abur) se va folosi un regulator PI;                                                          

    b) pentru reglarea nivelului în limite largi (vase tampon, rezervoare de depozitare,
rezervoare de decantare din instalaţiile de tratare a apelor uzate) se utilizează regulatoare P,
montate ca în figura 3.1.15.

1 3

72
 1-vas tampon

2-ventil de reglare

3-bucla de reglare nivel LC

Figura.3.1.15

Aici, nivelul va fi menţinut între limitele date de poziţiile A şi B; în aceste cazuri, mai
importantă decât stabilizarea nivelului este stabilizarea debitului de ieşire din rezervoare;

2. mărimea manipulată disponibilă: debitul fluxului de intrare, Fi,sau debitul fluxului

de iesire, Fe,din rezervor.

Alegerea variabilei manipulate este dictate de poziţia rezervorului în schema

tehnologică din care face parte. Astfel, dacă principala perturbaţie apare pe calea de evacuare a
lichidului (rezervor intermediar care alimentează alte utilaje), ventilul de reglare se plasează
pe conducta de intrare (fig. 3.1.16) şi invers, dacă variaţia debitului de intrare este perturbaţia
majoră (rezervoare de depozitare, rezervoare tampon în coloane de distilare, reactoare cu
amestec) variabila manipulată va fi debitul de evacuare (fig. 3.1.17).

2 2
3
1
1 3

Figura 3.1.16                                           Figura 3.1.17

1-vas tampon

2-bucla de reglare nivel LC

3-ventil de reglare

73
 La scăderea nivelului sub valoarea de referinţă, de pildă, regulatorul va comanda
deschiderea, în plus, a ventilului de reglare (fig.nr.3.1.16) sau închiderea lui (fig.nr.3.1.17)
până la anularea abaterii.

3.presiunea din rezervor.

În cazul unui rezervor închis, cu secţiune transversală mare şi cu suprapresiune

depăşind considerabil presiunea hidrostatică, variaţii ale suprapresiunii vor induce abateri
relative mici ale nivelului dar modificări înseminate ale debitului de ieşire.

1
2

Figura 3.1.18

1-vas tampon

2-bucla de reglare nivel LC

3-ventil de reglare

Pentru aceste situaţii se recomandă reglarea nivelului cu SRA evaluate, în cascadă şi

“nivel-debit” ca în figura 3.1.18.

Dacă perturbaţia este modificarea debitului Fi, atunci abaterea nivelului este eliminată
prin acţiunea cascadei “nivel-debit” dacă perturbaţia este variaţia suprapresiunii, atunci bucla
de debit reacţionează rapid, modificând debitul Fe, înainte ca perturbaţia să provoace abateri
semnificative ale nivelului;

4. tipul de proces-cu autostabilizare (rezervoare deschise cu evacuare liberă sub

influenţa presiunii hidrostatice) sau fără autostabilizare (rezervoare cu evacuare forţată
asigurată de o pompă cu debit constant sau rezervoare închise cu suprapresiune) nu
modificăschemele de reglare şi este luat în considerare doar la alegerea regulatorului şi la
acordarea acestuia.

74
3.1.5 Reglarea nivelului spumei

Aeraţia şi agitarea internă necesară a se efectua în procesele biochimice industriale, are

ca efect formarea de spume, uneori deosebit de abundente.

În orice biosinteză industrialăeste absolut necesar efectuarea unui control al formării

spumei pe toată durata desfăşurării procesului.

Operaţiile de control şi reglare sunt efectuate automat sau continuu pe toată durata
procesului biochimic respectiv.                                                                                          

Această problemă este rezolvată relativ simplu prin cuplarea controlului analitic al
formării spumei, cu introducerea în bioreactor a agenţilor de antispumare cu o viteza care
trebuie să depindă de nivelul spumei. Senzorii sau electrozii de contact reprezintă cea mai
simplă soluţie pentru controlul formării spumei.

Aceste sisteme (figura3.1.18) sunt constituite din două fire metalice fixate într-un corp
izolant a căror capete sunt plasate la o foarte mică distantă unul de altul (asemanator brejiilor
de la automobile).

Acest tip de senzor se plasează la o anumită înălţime deasupra mediului lichid din
interiorul bioreactorului.

Prin ajungerea spumei la extremităţile capetelor neizolate ale firelor metalice, se

realizează practic un contact electric cu apariţia unui semnal analitic, care după o prealabilă
amplificare poate declanşa un sistem de avertizare optic (un bec luminos), acustic (o sonerie
sau sirenă) sau ambele. Simultan, semnalul dat poate acţiona spărgătorul mecanic de spumăsau
dupăun anumit interval de timp sistemul de adăugare a agentului antispumare.

75
 1.- nivelul lichidului mediu de cultura;2.- spuma;3.- corpul senzorului;4.- sursa electrică;5.-
avertizor optic;6.- avertizor acustic

Figura 3.1.19 Principiul constructiv al unui senzor de contact pentru controlul formării spumei

În cazul sistemelor de contact, de control al formării spumei, au fost descrise şi

dispozitive bazate pe utilizarea unor electrozi capacitivi acoperiţi cu teflon.

La toate aceste sisteme cu electrozi de contact, după scăderea nivelului spumei, prin
acţionarea mecanică, fizică sau chimică, se produce implicit deschiderea circuitului electric şi
întreruperea sistemelor de combatere a formării spumei. În acest mod, ori de câte ori are loc o
creştere a nivelului spumei peste o anumită limită la care este plasat senzorul, are loc
declanşarea sistemelor de avertizare şi combatere a spumei, iar după scăderea nivelului
spumei, sunt deconectate sistemele respective (figura 3.1.20).

Figura 3.1. 20. Reprezentarea schematică a unui sistem automat de control al formării
spumei şi reglare automată a antispumanţilor

1.-senzor

2.-spuma

3.-lichid

76
 4.-sistem de amplificare

5.-electrovalva

6.- rezervor de lichid antispumant

7.-sisteme de egalizare a presiunii

Bazat pe utilizarea electrozilor de contact au fost realizate şi sisteme de control

automat al formării spumei şi conectare gradată a diferitelor dispozitive de combatere a
formării spumei. Un asemenea sistem, utilizabil în procese de culturi microbiene, se prezintă
sub forma unei scheme bloc, în figura 3.1.21.

Figura 3.1.21 Schema unei instalaţii de control al formării spumei

1 – bioreactor; 2 – senzor de contact; 3 – blocul de control; 4 – dispozitiv de conectare

a sistemului mecanic de spargere a spumei; 5, 6 – sisteme finale de introducere a
antispumanţilor; 7, 8, 9 – declanşatoare ale dispozitivelor de combatere a formării spumei; 10,
11 – dispozitive de prevenire a conectării simultane a tuturor sistemelor de reglare şi
combatere a formării spumei;12, 13 – circuite logice; 14, 15 – rezervoare cu antispumanţi

Când în bioreactorul 1 spuma ajunge la nivelul senzorului 2, apare un semnal care

ajunge apoi la blocul de control 3, care pune în funcţiune dispozitivul 7, ce controlează primul

77
mecanism de spargere a spumei 4 (de exemplu un disc rotitor rapid). Dacă formarea spumei la
nivelul senzorului 2 se întrerupe, atunci elementele finale de combatere chimică a spumei 5 şi
6, nu se comută. Dacă sistemul mecanic 4 nu reuşeşte să oprească formarea spumei sau spuma
se formează din nou, atunci prin linia ulterioară 10, semnalul de ieşire ajunge la circuitul logic
12 (de tip AND), când se conectează cu senzorul 2, cea de a două linie de combatere a
formării spumei, prin intermediul dispozitivului 8. Se activează (prin furnizarea unui impuls la
o valva solenoidă) dispozitivul auxiliar 5, de introducere a unor antispumanţi din rezervorul
14. Dacă şi acest caz combaterea spumei nu este eficientă, astfel încât nivelul acesteia să scadă
la o poziţie sub senzorul 2, se activează într-un mod similar sistemul final de reglare 6, care
întroduce în bioreactor un antispumant de mai mare eficienţă. Dispozitivele 10 şi 11 are rolul
de a preveni conectarea simultană a tuturor sistemelor finale de reglare şi combatere a formării
spumei, atunci când spuma intră în contact cu senzorul 2. De asemenea, dispozitivul este
prevăzut şi cu un sistem pentru întreruperea ansamblului 7, după un anumit interval de timp (5
sau 30 minute) după care revine la poziţia iniţială. Părţile operatorii ale sistemelor mecanice
de distrugere a spumei, pot fi bineînţeles diferite [Ştefan Ungureanu şi Corneliu
Pertrilă,2001].

                                                      

3.2 Controlul de calitate

3.2.1 Metode de analiza a materiilor prime

Reactivii folosiţi pentru analiza trebuie să fie de calitatea ”pentru analiza” sau de
calitate echivalentă. Apa trebuie să fie distilată.

78
 Examenul organoleptic

Examenul organoleptic se face asupra probei aduse la temperatura de 20oC.

Pentru verificarea aspectului, culorii şi a corpurilor străine, o parte

din proba de glucoza lichidă se întroduce într-un vas de sticlă incolorăsi a materialelor
intermediare

Glucoza

cu diametrul de 7-12 cm, iar proba de glucoză solidă se secţionează cu un cuţit în

bucăţi de cca. 250 g. Verificările respective se fac la lumina naturală a zilei sau la o sursă de
lumina, pe fondul unei hârtii albe.

Gustul si mirosul se apreciaza asupra probei respective prin degustare si mirosire.

 Determinarea culorii glucozei

Principiul metodei: se adaugă soluţia de iod 0,1 n în apă, în condiţii determinate, pînă
se obţine o culoare identică cu cea a glucozei lichide de analizat.

  Mod de lucru: într-un pahar de laborator se introduc 100 ml din proba de glucoză
lichidă. Într-un alt pahar identic se introduc 100 ml apă, în care se adaugă cu ajutorul unei
biurete, picătură cu picătură, soluţie de iod, până când coloraţia din cele două pahare este
identică. Compararea se face la volume egale de lichid. Coloraţia celor două pahare se
constată  cu ochiul liber la lumina zilei, pe fondul unei hârtii albe.

Exprimarea rezultatelor:Culoarea se exprimă prin volumul soluţiei de iod 0,1 n

folosit pentru egalarea culorii, în ml.

 Determinarea aciditatii

Principiul metodei:proba de analizat, dizolvată în apă, se titrează cu hidroxid de

sodiu, soluţie 0,1 n în prezenţă de fenolftaleină soluţie 1% în alcool etilic 70% vol.

Mod de lucru: se măsoară cu pipeta 100 ml din soluţia de lucru obţinută anterior şi se
introduc într-o capsulă de porţelan. Se titrează cu soluţie de hidroxid de sodiu în prezenţă

79
fenolftaleinei, până la apariţia coloraţiei roz, care persistă timp de 1 minut. Se executăîn
paralel două determinări din aceeaşi soluţie de lucru.

Calcul: aciditatea se exprimă în grade de aciditate. 1 grad de aciditate reprezintă

volumul în ml de solutie de NaOH  n, necesar pentru neutralizarea acizilor liberi din 100 g
produs. Aciditatea se calculeaza cu relatia:

V × 2× 0,1 V
Aciditate¿ ×100= ,[grade ]
40 2

unde : V- volumul soluţiei de NaOH 0,1 n, folosit la titrare,ml.

              Determinarea umidităţii

                Determinarea umidităţii se face prin: metoda picnometrică, obligatorie în caz de

litigiu şi metoda refractometrică, rapidă.

         Metoda picnometrica

Principiul metodei: se determină cu ajutorul picnometrului densitatea soluţiei de

glucoză de 20 g/100 ml şi în funcţie de aceasta se stabileşte conţinutul de substantă uscată şi
respectiv de umiditate.

Mod de lucru: se umple picnometrul cu soluţie de lucru obţinută anterior şi se ţine în

termostat 30 min la temperatura de 20 °C.Se determină densitatea relativă conform STAS
184/2-71, iar din tabel se deduce conţinutul în substanţă uscată, corespunzator densităţii
relative determinate.

Calculul : %s.u.= 100-Su

în care s.u. reprezintă conţinutul de substanţă uscată , în % citit în tabelul din anexa A.

        Metoda refractometrica

Principiul metodei: se citeşte la refractometru conţinutul de substanţă uscată solubilă

(exprimat în zaharoză) din soluţia de glucoză cu concentraţia de 20 g/100 ml şi în funcţie de
acesta se stabileşte conţinutul de substanţa uscată şi respectiv de umiditate.

Mod de lucru: pe prisma fixa a refractometrului se picură cu ajutorul unei baghete  2

sau 3 picături din soluţia de lucru obţinută anterior şi se închid prismele imediat. Se deplasează

80
ocularul pînă la suprapunerea reperului cu linia de separare a celor două câmpuri. Apoi se
citeşte direct conţinutul de substanţa uscată a substanţei de lucru. Se efectuează două
determinări din soluţia de lucru.

Calcul .continutul de substanţă uscată al probei de analizat, exprimat în %, se calculează cu

relaţia:

c ×V
% s.u¿ ×100
m×100

În care: c- conţinutul de substanţă uscată citit la refractometru. %.

             v- volumul soluţiei obţinute, ml.

             m- masa probei de analizat luate pentru pregătirea soluţiei de lucru. G.

Determinarea continutului de dextroza

Principiul metodei: se reduce la cald o soluţie alcalină de sare cuprică, cu ajutorul

zaharurilor reducătoare din proba de analizat. Oxidul cupros rezultat din reacţie se titrează
indirect cu soluţie de tiosulfat de sodiu (metoda Luff-Sghoorl).

Mod de lucru: într-un balon cotat de 1000 ml se introduc circa 5 g glucoză sau circa 3
g glucoză solidă, se dizolvă prin agitare cu apa şi se aduce la semn cu apă. Într-un vas
Erlenmeyer de 200-300 ml se introduc 25 ml soluţie cuprică şi 25 ml din soluţia de
analizat obţinută anterior, măsuraţi cu pipeta, peste care se adaugă câteva bucăţele de
piatră ponce. Vasul se ataşează la un refrigerent cu reflux, se aşează pe o sită de azbest
având o deschidere cu diametrul de 6,5 cm şi se aduce la fierbere în 2-3 minute, după
care se menţine în fierbere moderată exact 10 minute. Se răceşte imediat la temperatura
camerei.

Se adaugă soluţia de KI, apoi 25 ml acid sulfuric în proporţii mici pentru a evita
spumarea, dar cât mai repede posibil şi agitând continuu. Se titrează cu soluţie de tiosulfat de
sodiu până la culoarea slab gălbuie, se adaugă până la 2-3 ml soluţie de amidon şi se continuă
titrarea până la dispariţia culorii violet.

Se execută o determinare martor cu aceeaşi reactivi, înlocuind cei 25 ml de soluţie de

analizat cu apă. Se efectuează două determinări din aceeaşi probă.

81
 Calculul : Conţinutul de dextroză, exprimat în % şi raportat la s.u., se calculează cu
formula:

c × 40 100
%dextroza¿ × ×100
m×1000 100−U

în care: c- cantitatea de dextroza, mg;

            m- masa probei luată pentru determinare, %;

            U- conţinutul de umiditate a probei, %.

 Extractul de porumb

Metoda de analiza a aminoacizilor

α – aminoacizii, în prezenţa ninhidrinei, formează un compus albastru – violet, care

prezintă un maxim de absorbţie la 570 nm sau prin descompunere enzimatică ionii de amoniu
formaţi pot fi dozaţi spectrofotometric, permiţând dozarea directă a azotului din aminoacizi
(metode spectrofotometrice).

Cromatografia cu gradient de pH stă la baza funcţionării unor analizoare automate

pentru aminoacizi (figura 3.2.1).

82
 Figura 3.2.1 Principiul constructiv al unui analizor de aminoacizi cu eluţie în gradient
de pH

1 – coloana cromatografică termostată;

2 – rezervor cu soluţie tampon de pH;

3 – soluţie cu reactiv de culoare pentru determinarea spectrofotometrica a

aminoacizilor (ninhidrina);

4 – camera de amestecare;

5 – serpentina pentru răcire;

6 – spectrofotometru ;

7 – înregistrator;

8 – pompe;

9 – proba de analizat.

Aceste analizoare folosesc în general separarea pe o coloană cromatografică

termostatată (1) umplută cu schimbători de ioni, iar eluarea se face cu soluţie tampon (2), cu
diferite valori ale pH – ului, după un program prestabilit obţinerea unui gradient de pH cu
rezoluţie maxima, într-un timp minim.

Detecţia se efectueazăspectrofotometric, pe baza reacţiei de culoare pe care o dau

aminoacizii eluaţi de pe coloana, cu ninhidrina.

Absorţia optică a compusului dorit se măsoară la 440 şi 570 nm cu un spectrofotometru

cu dublu fascicul (6), iar semnalul analitic obţinut care e direct proporţional cu concentraţiile
diferiţilor aminoacizi din proba de analizat, se înregistrează grafic cu ajutorul unui
înregistrator.

83
84