Sunteți pe pagina 1din 170

Colectia BIOINGINERIE MEDICALA

Rodica M. Isac Florin Topoliceanu Dorina E.Creanga

INTRODUCERE IN BIOFIZICA MOLECULARA SI CITOTISULARA •

ISBN 973-9333-38-9

Editura Apollonia Iasi - 2002

CUPRINS
('

in.memoria lui Mihail

Cuvant inainte

Prefata
CAPITOLULI Apa biostructurala ~i interactiuni moleculare

13
14

1.1. Structura ~iproprietatile apei 1.2. Principalele compartimente lichidiene din organism 1.3. Interactiuni intermoleculare

20 24 25
27 29

18

CAPITOLUL2 Lipidele ~iproprietatile lor fizico-chimlce


2.1. Structura lipidelor ~iinteractiunile lor intermoleculare 2.2. Organizarea sistemelor lipide-apa 2.3. Teaca de mielina a axonului neuronal

CAPITOLUL3 Proteine, interactiuni moleculare si proteine enzimatice catalitice


3.1. 3.2. 3.3. 3.4. Legatura peptidica Proprietatile semiconductoare ale proteinelor Proprietati enzimatice Proprietatile structurale ~ide mediatori ai reactiilor autoimune

34 34
37

41 44 48 54 55

CAPITOLUL4 Proteinele contractile CAPITOLUL5 Elemente de biofizica hemoglobinei


5.]. Structura ~i functiile hemoglobinei

CAPITOLUL6

Molecule macroergice Enzimele lantului respirator Modelarea matematica a proceselor enzimatice Acizii nucleici si interactiunile intermoleculare Elemente de biofizica membranelor celulare
10.1. Structura membranei celulare 10.2. Proteine canal si canale ionice 10.2.1. Tipuri de canale ionice 10.3. Permeabilitatea ~i transportul transmembranar lOA. Transportul pasiv 10.4.1. Difusia simpla 10.4.2. DijuziaJacilitata 10.5. Transportul activ 10.5.1. Tipuri de transport activ 10.5.2. Pompele ionice 10.6. Bcuatii drterentiale pentru descrierea cantitativaa bilantului transportului activ ~i pasiv 10.7. Structurile membranare semipermeabile si percolare

65 69 79 92 97 97 103 104 112 115 115 120 125 125 127 130 137 140 142 145 151

1104. Potentialul de actiune neuronal 11.4.1. Propagarea.potentialuluide

actiune

11.5. Fluxuri ion ice ~i electrogeneza


In fibra musculara 11.5.1. Potentialul de actiune in fibra muscularii cardiacd .# netedii

153 158 166 166

CAPITOLUL7

CAPITOLUL8

CAPITOLUL

CAPITOLUL9 CAPITOLUL

Elemente biofizice de interactiune si comunicare celulara 12.1. Semnalizarea intercelulara: hormoni ~i proteine
receptoare 12.1.1.lonii de calciu - mesageri secundari 12.1.2. Dinamica reeeptorilor 12.1.3. Cinetica interactiunii ligand - receptor 12.2. Interactiuni antigen - anticorp 12.2.1. Antigenii 12.2.2. Anticorpii 12.2.3. Natura fortelor implicate In interactiunile elementare antigen - anticorp 12.2.4. Reactiile secundare 12.2 .5. Cinetica formiirii imunocomplexului antigen-anticorp 12.2.6. Cinetica desfacerii complexului ' imunologic 12.2.7. Determinarea constantei de echilibru a procesului imunologic pe baza difuziei prin membrana dializantd

12

174 174 182 184 185 188 189 190 194 195 196 199 201 206

10

CAPITOLUL

Biofizica bioelectrogenezei celulare


11.1.Modele electrice pentru membrana excitabila 11.2. Potentialul de difuzie 11.3. Echilibrul Donnan

11

CAPITOLUL

Elemente de biofizica eritrocitara ~i hemoreologie l3.1. Modelul structural ~imodelul fizic al sangelui

13

membranei eritrocitare . 206 13.2. Proprietati plasto-vasco-elastice ~ireolo~ice ale

215

13.3. Legea lui Bernoulli ~i nurnarul lui Reynolds pentru eurgerea sangvina. .., . 13.4. Sernnificatia fizica a presnmn hidrostatice a sangelui. Tensiunea arterial a 13.5. Proprietati reologiee ale peretilor vaselor sangvine 13.6. Anastomoza artero-venoasa 13.7. Elastieitatea ~i histerezis 13.8. Impedanta vasculara la eurgerea sangvina 13.9. Modelul analogie al circulatiei sangvine 13.1O. Studiul circulatiei sangvine eu ajutoml trasorilor CAPITOLUL

217 220 222 223 224 228 231 234

J 6.4. Potentiale de actiune

~icurenti ionici
295

de excitatie CAPITOLUL 17

Elemente de biofizidi auditiva


17.1. Structura ~i functiile celulelor ciliate din urechea interna 17.2. Hidrodinamica urechii interne 17.3. Bioelectrogeneza celulelor ciliate 17.4. Procesarea informatiei auditive In sistemul nervos central CAPITOLUL 18

301
~304

301 307

309
311

Aspecte biofizice ale schimburilor de gaze respiratorii

14

Biofizica contractiei musculare


241 243 249 18.1. Structura fibrei musculare striate 18.2. Mecanismul contractiei musculare 18.2.1. Controlul sinaptic al contractiei musculare 18.2.2. Cuplul excitatie-contractie 18.3. Notiuni de termodinamica contractiei musculare 18.4. Modelul fizic al musculaturii cardiace 18.5. Elemente de biomecanica tendonulor ~i ligamentelor musculaturii striate 18.5.1. Proprietdti de elasticitate 18.5.2. Proprietdti de vdscoelasticitate 18.5.3.Elemente de biomecanica tendonului si ligamentului BIBLIOGRAFIE

14.1. Parametrii sehimbului pulmonar de gaze 14.2 Modelul matematie at sehimburilor de gaze 15

312 316 316


317 322

CAPITOLUL

Bioflzica fotonidi

15.1.Biofiziea pigmentilor fotosintetizatori 15.2. Speetrele pigmentilor fotosintetizatori In domeniul vizibil 15.3. Interactiunea clorofilei eu apa 15.4. Fotosinteza 15.5. Fotoluminiseenta . .. 15.6. Elemente de biofizica pigmentilor fotosensibili 16

252 252 254 259 263

326 330 331 333 335


341

270
276

CAPITOLUL

Biofizica fotoreceptiei celulare


16.1. Struetura eelulei fotoreeeptoare 16.2. Struetura retinei 16.3. Cuplarea rransformarilor rodopsinei eu modificarile potcntialului de membrana

284 284

287
289

Cuvfint inainte Ca specialitate de granita a stiintelor fiziologice, care studiazaprocesele biologice din punct de vedere fizic, Biofizica a devenit in ultimele decenii una din "disciplinele de baza ale inviitiimantului biomedical si tehnic. Coborand de la nivel de organism intreg la nivel celular ~i subcelular, aceasta noua disciplina contribuie substantial Ja descifrarea si intelegerea multora din manifestarile electro-chimice ~i proprietatile biologice ale materiei vii. Aparitia unor materiale elaborate de specialisti ai domeniului este mai mult decat binevenita, Ea acopera un gol resimtit inca, in tara noastrii aUltpe plan cognitiv dit ~i din punct de vedere aplicativ. "Introducere in biofizica . moleculara si "citotieulara", editata de Rodica Maria Isac, Florin fTopoliceanu ~i Dorina Emilia Creanga, reprezinta un astfel de material util instruirii studentilor in bioinginerie, medicina si-biologie. Cele 18 capitole care .... compun volumul, contin principalele cunostinte clasice ~i noi, referitoare la bazele morfo-chimice si electrofiziologice ale diverselor forme de activitate celulara.Rand pe rand suntexpuse particularitatile structurale si electrochimice ale principalilor constituienti celulari si subcelulari, insistandu-se asupra rolului lor in realizarea diverselor forme de activitate celulara ~i tisulara,

atentie deosebita este acordata fenomenelor blo~zlce. care stau la baza electrogenezei si s~hlmbufl.lor ionice membranare generatoare de !aspunsufl celulare specifice. ~atele de biofizica celulara ~i moleculara sunt ~ntreglte.de elemente de biomecanica ~i biocibemeticii mformatlOnala.
A

.?

~n ~ansamblu,' materialul eleborat de autori reprez~ntii 0 realizare didactica utila fundamentiiri· cuno~tmt.elorbiomedicale si tehnice pe baze biofizic~ corecte ~l actuale.

Iasi, aprilie 2000

_, Academician Ioan Haulica

Prefata ,
Acest volum deschide seria problematicilor actuale din domeni~~ de ~i~fiz~ca .~i se ~dreseaza in special studentilor Fac~Witll de Bioinginerie medicala, dar si celor interesati prin specificul formarii lor interdisciplinare, sa aiba acces la avalansa informationala din domeniul stiintelor bio- si tehnicomedicale, in care aceasta disciplina de granita si-a capatat un loc privilegiat. Elementele de Biofizica sunt structurate pe tematici care rara sa aiba pretentia de a fi exhaustive, yin sa completeze c~no~t~n!ele"dobandite prin integratele de biologie generala si sistemica, III cadrul module lor de biologie celulara ~i ~ol.e~ulara, citohi.stologie, biochimie, fiziologie,biometrologie ~1 bioinstrumentatie medicala. Abordarea biofizica prin prisma stiintelor exacte ale unor p:obl:m~ ca .cele de. modelare matematica, termodinamica, bIOChl~.lC~, ~lO~~camc.a. sa~ electrochimie sunt facile pentru studentii ~1 vntorn practicieni in bioingineria medicala.dat fiind accesul acestora la 0 curricula interdisciplinara complexa, De altfel, in aceasta seregasesc inserate in mod coerentalaturi de stiintele biomedicale ~i umaniste, cele de matematica informat~ca, fizi~a - chimie, teoria sistemelor, stiinta si tehnologia matenalelor, electronica medical a si alte discipline cu caracter tehnico-rnedical. . Preze~tarea. fenomenelor de transfer, bioelectrogeneza, microreologia, biomecanica citotisulara, modelare-simulare comunicare celulara ~i control senzitivo-senzorial, c~ fenon:ene fundamentale ale biofizicii celuulare si sistemice, deschide 0 fereastra spre intelegerea unor directii prioritare ale

unui invatamdnt medical cu un grad accentuat de tehnologizare. Dintre acestea, retin In mod deosebit atentia descrierea si elucidarea unor procese complexe bioenergetice celulare la nivel infra- si supra molecular cu largi aplicatii in biotelmologie, biorobotica protetica, biocibernetica controlului si reglarii biosistemelor, biomateriale inteligente si biomecanica sistemelor protetice, telemedicina, inteligenta artificiala, sau in tehnologiile de informatizare a sistemelor de sanatate. In sprijinul formarii inter- si . transdisciplinare a specialistilor in bioingineria medicala s-aavut in vedere ca structurarea capitolelor de Biofizica generala sa permita studentilor accesul direct la problematica biostructurala, moleculara ~i citotisulara, ca baza ulterioara a intelegerii biofizicii sistemice, privind implicatiile unor componente moleculare, infracelulare si citotisulare, la realizarea principalelor dispozitive functionale ale biosistemului uman. Speram ca efortul nostru, finalizat In editarea unui prim volum din ciclul dedicat problemelor actuale ale disciplinelor de granita biomedicale si tehnico-rnedicale, reprezinta un inceput in formarea cornplexa bio- si tehnico-medicala, a viitorilor specialisti in profesiunea de bioinginer medical. Extinderea cunostintelor abordate prin prisma moleculara, celulara si sistemica a Biofizicii, devine utila ~i pentru cei interesati in domeniile conexe (fizicieni, chimisti, biologi, ingineri cu preocupari in electronic a medical a, biomecanica, biotehnologie si protetica medicala, biomatematica-informatica medicala), care sunt preocupati de realizarea unor colaborari in echipa, alaturi de medici si bioingineri, In serviciile de asistenta medicala, cercetare si invatamant superior medical.

Iasi, aprilie 2000

Autorii

INTRODUCERE

iN BIOFIZICA

MOLECULARA

1>1 CITOTISULARA

')
'I,
CAPITOLUL 1

Apa biostructurala si interactiuni moleculare


In mod exceptional apa, una din cele mai ' raspandite substante de pe globul pamantesc este singurullichid din organismul uman, tara de care niciun anorganic

proces vital nu este

posibil. Proportiile de apa sunt variabile In raport eu varsta ~i eu eantitatea de tesut adipos, aeestea fiind mai reduse laobezi ~i varstnici (Tabelul 1).
Tabelull. Procentajul de apa din diferite tesuturt
(dupa F. Grerny ~i J. Perrin 1975)

Tipul de tesut

Tesut adipes

Spori de ciuperci

Organism uman adult 65-70%

Tesut

Tesut

hepatic

Continut
in apa

30%

45-50%

73%

nervos

Organismul meduzelor

84%

95%

11

R.M.ISAC

F. TOPOLICEANU

D.E.CREANGA

INTRODUCERE iN BIOFIZICA MOLECULARA $1 CITOTlSULARA

1.1. Structura ~i proprietatile apei

confera

remarcabile

proprietati

solubilizatoare
0

mai ales ca mare afinitate etc.)

multe molecule organice sunt polare si au pentru

apa (glucidele,

majoritatea

aminoacizilor,

si

Structura chimica a apei este deosebit de simp la, iar proprietatile in sale fizico-chimice alcatuirii Ii confera un rol fundamental si functionarii edificiilor

antreneaza disocierea cristalelor ionice (saruri minerale). La randul lor moleculele de apa disociaza in anioni de

mentinerea

oxidril HO- ~i cationi H+, acestia din urma asociindu-se,

macromoleculare nucleici).

celulare (indeosebi ale proteinelor si acizilor

regula cu molecule de apa nedisociate pentru a forma ionul

H30+.

,
f
I

H
H

Intre moleculele de apa vecine se formeaza legiiturt de

hidrogen, deoarece protonii unei molecule sunt atrasi de atomii


de oxigen ai moleculelor vecine (Figura 1b). Caracterul dipolar electric si existenta legaturilor de

-q

----

__ l+Q

,
I I
I I I

IS

)1= I,B40

...

hidrogen stau la baza celor mai multe dintre proprietatile apei

~i comportarii sale in mediile biologice. Legaturile de hidrogen


H

reprezinta un tip de interactiuni slabe intermoleculare destul de


raspandite in structurile macromoleculelor asa cum se -va

Gremy, 1982).

Figura I. (a). - Structura plana a moleculei de apa si orientarea momentului dipolar electric; (b) - Asocierea prin legaturi de hidrogen a moleculelor de apa ( dupa F.

mentiona ~i in paragrafele urmatoare. Lasand la


0

parte detaliile

legate de interactiunile

Constanta

dielectrica

foarte mare (cr=80 la 20 °C) a caracterului dipolar

intermoleculare accentul pe de

ale apei in stare lichida sau solida vom pune


0

reprezinta

reflectarea

macroscopica

parte, pe caracteristicile sale macroscopice in

electric pronuruat a moleculelor de apa, valoarea acestuia fiind


de 1,84 Debye (Figura la). Constanta dielectrica mare a apei Ii
14

comparatie cu alte structuri similare si pe de alta parte pe


variatiile densitatii apei (0,91 g/cnr') cu temperatura care atinge un maximum de 1 g/cm la 4 C.
15
·30

R.M.ISAC

F.TOPOLICEANU

D.E.CREANGA

INTRODUCERE iN BIOFIZICA MOLECULARA ~I CITOTISULARA

astfel depozitele de gheata de pe fundul apelor ar fi permanente

wem3
a
l'OOOO~_

~i climatul ar fi total diferit.


b
~

Dintre proprietalile fizico-chimice cele mai importante pentru rolul jucat in organism
t

8,9". 0,'"0

mentionam punctele

de

solidificare (ts) ~i vaporizare (tv), ele fiind sensibil mai ridicate


o
4

decat la alte substante cu structura asemanatoars (H2S, H2Se, HeTe, etc.) sau cu acelasi numar de opt electroni moleculari periferici(Ne, HF, NH3, CRt, etc.) (Figura 3).
Ciildura de topire a ghetii este de 80 keel/mol, iar cea

Figura 2. (a) - Structura cristalina a ghetii es~ebaza~llpe 0 ~eteahexago~a~ll de molecule legate intre ele prin legaturi de hidrogen; (b) - Variatia densitatii apei eu temperatura (dupa F. Gremy, 1982)

Alaturi de densitatea mai midi a ghetei, fata de apa lichidiana se reline ~i structura de retea hexagonala a moleculelor de apa transformate in gheata, concomitent cu marirea volumului acesteia (Figura 2a - 2b). Datele mentionate atr~g atentia asupra problemelor de criobiologie, inghetarea ~i dezghetarea biostructurilor fiind in centrul unor cercetari complexe interdisciplinare, privind conservarea non-distructiva ~i functionala a acestora. Se avanseaza idea ca daca, la fel ca la alte substante, densitatea starii solide ar fi mai mare decat a celei lichide, gheata fermata in anotimpul .rece,ar cadea la fund~llacurilor, raurilor ~i marilor ~i numai
0

de vaporizare a apei este de 537 kcal/mol. Eliminarea .din organism prin vaporizare a unei cantitati semnificative de energie (537 kcal), la fel ca si valoarea ridicata a caldurii
speciflce (18 cal/mo1.grad), evidenfiaza rolul esential pe care

apa il indeplineste in cadrul mecanismelor de termoreglare.

o
-100

-200 -213

mica parte din aceasta gheata de


Figura 3. Punctele de solidificare ~i de vaporizare ale apei in comparatie eu alte molecule (modificat, dupa F. Gremy ~i J. Perrin, 1975)

adancime s-ar putea topi la caldura soarelui in anotimpul cald;


16

17

R.M.ISAC

F.TOPOLICEANU

D.E.CREANGA

INTRODUCERE iN BlOFIZICA MOLECULAR4.

SI CITOTISULARA Obezitatea scade

Vdscozitatea apei, .reflecta nivelul interactiunilor dintre moleculele de apa din straturile invecinate intimpul curgerii ~i este relativ redusa, la 10. Poise la 20°C fata de glicerina, la care
2

noi

nascuti

din

greutatea

corporala),

procentajul de apa corporala sub 45% din greutatea corporala.

Exista doua mari compartimente lichidiene in organism


reprezentate de sectorul intracelular

aceasta

ajunge

parra la

15 Poise

la temperatura

si eel extracelular,

echivalenta, fapt datorat legaturilor de hidrogen care se-rup ~i se refae cu mare frecventa in apa lichida.
Tabel 2. Variati~ v3scQzitatii apei cu temperatura
(dupaF. Gremy ~i J. Perrin, 1975)

subdivizat In sectoarele: interstitial si intravascular - plasmatic. Delimitarea sectorului intracelular de eel extracelular

este realizata de membranele celulare care asigura totodata si comunicarea dintre acestea, prin microtransportul
mIC!,

ionilor si

Temperatura (0 C) Vascozitatea (centiPoise)

10 1,30

20 1,00

30 0,80

40 0,65

moleculelor
/"

ca

pnn

macrotransportul

macromoleculelor

si a diferitelor particule. intracelular contine aproximativ 25 de extracelular sunt (12

Compartimentul

Tensiunea superflciala a apei este relativ mare, de 73 erg/cnr',' datorita existentei unui m~e numar de interactiuni inte~oleculare, care' pentru a le rupe ~i a scoate
0 0

litri de apa, in timp ce in compartimentul

stocate 15 litri de apa, distribuite intre sectorul interstitial litri) ~i intravascular

molecula la

(3 litri In componenta plasmatica ~i 2 litri

suprafata Iichidului, este nevoie de

energie considerabila,

la nivelul celulelor sangvine). Aceste doua subcompartimente sunt separate de membranele endoteliale sau capilare care sunt membrane dializante permitand circulatia pasiva a ionilor si' moleculelor mici. In plasmatic, afara lichidului interstitial si al celui vascular se pot de cele

1.2. Principalele compartimente lichidiene din organism


La un individ cu greutatea medie de 70 Kg, cantitatea

la niveluI spatiului

lichidian

extracelular

totala de ap~ ajunge pana la 70 de litri (57% la adult ~i 75% la

adauga si lichidele asa zis transcelulare reprezentate

din cavitatile seroase (pleura, pericard, peritoneu, articulatii),

lichidul
18

cefalorahidian

~i al 'diverselor
19

secretii

(digestive.';

R.M.ISAC

F.TOPOLICEANU

D.E.CREANGA

INTRODUCEUE iN BIOFIZICA MOLECULAR.{ ~I CITonSULARA 2

lacrimale,

oculare

etc.) care ajung la 1-3% din greutatea

De-a

lungul

evolutiei

filogenetice

$i ontogenetice,

orpului . l' .f: C Ca. lichid extracelular este consi.derata adesea si lmIa,1 .. vasele limfatice dreneaza spatiul interstitial (volumu deoarece !• . t) limfatic fiind insa insuficient de precis determina .

acestea se gasesc Intr-o continua restructurare In cadrul unui turnover metabolic $i In prezenta unor permanente interactiuni la nivel molecular. Dintre interactiunile la nivel molecular de mica energie menfionam:

legaturile de hidrogen, legalu~ile hidrojobe,

'

T rocentuala a apei . in compartimentele Tabelul 3. Repartitia p (du 1\ F Gremy ~i J. Perrin, 1975) lichidiene ale organismulul uman p.

inlerac/iunile dipol - dipol $ijor/ele ionice (Tabelu14) . Legaturile hidrojobe sunt cele existente Intre' molecule

Com...I!.artiment Extracelular Interst~al . Extracelular Intravascular Intracelular Total

Procente din _greutatea co~~rala Barb~ Feme! 10,9 10,7 4,1 45 60


/

sau grupfu-i de atomi care, nu au caracter moleculelor de apa

polar de tipul

Interac/iunile dipol - dipol se grupeaz,a, dupa natura dipoliIor imp1ieati, In mod permanent (interactiuni Keeson) sau indus (interaetiuni Debye).

'

4,3 40 55

In

contrast cu interacPunile de mica energle, {ega/urile


_ sute de kJ/kmol, moleculare. /' Pentru stabilitatea structurilor

covalente sum legaturi de energiemare


1.3. Inter~ctiuni intermoleeulare asigurand . reprezentarea ~i dezvoltarii . ~l organismului

lor, In cadrul unor relatii si legi tizice sau


~, cu q §i }.L sarcina electrica §i respectiv

In dinamica

structurarii

chimice, s-aunotat momentul dipolar

de la nivelul embriogenezei .

pana la varsta adulta .

electric,

iar eu cx§l

k au ,fost notate

uman i macromoleculare (in special proteice, edificiile moleculare ~ fib ilar) iau . d e tiip globular sau 1 n ..' , . . 0 roteice sau lipoproteice glic pla morfogeneza ~1 la rea li . parte izarea a rhitecturii sistemului viu.

polaritatea electrica si respectiv constanta care exprima gama proprietatilor eJectrice ale mediului prin care se transmit

interactiunile (invers proportional~ cu pennitivitatea electrica).

KB este constanta lui Boltzman, T include T ca


I •

21

R.M.ISAC

F.TOPOLICEANU

D.E.CREANGA

"

Tabelul 4. Principalele tipuri de lnteractiuni moleculare


( modificat, dupa F. Gremy, 1982) Tipul legliturii

temperatura

absoluta

~~ r

este

distanta

dintre

centrele

particulelor ce interactioneaza, Interactiunile slabe, de natura fizica, intervin 'in


.

ltelatii cautitatlve

Valoarea
energiei kJ/kmol 400-800. Exemple Structuri moleculare la molecule mici, structuri primare la proteine ~i acizi nucleici Solubilizarea ~i hidratarea ionilor

Covalente lonice (intre grupari incarcate cu sarcina electrica) Sarcina-dipol permanent

I~

cuplarea enzima - substrat, in interactiunea antigen - anticorp, . in stabilitatea structurilor biomembranare, catre receptorii membranari a in recunoasterea de
~l

neurotransmitatorilor

kqj92
r k 3KnTr3 kr3

5-20

honnonilor,

precum si a medicamentelor,

asigurand schimbul

J.12q2

de informatie intercelular. Interactiunile intennoleeulare ale apei eu substantele

1-5

Proprietatile polielectrolitilor

dizolvate sau suspendate printre moleeulele sale, determina In


Sarcina-dipol indus

aq2

0,5-2 2-10.

Solubilizarea ~i hidratarea ionilor Mecanismul de stabilire al legaturii de hidrogen

mare masura proprietatile

solutiilor ~i suspensiilorapoase

Interactiuni Keesom (dipol permanent - dipol permanent) lnteractiuni Debye (dipol permanent -dipol indus)

J.1;J.1~ k
3KnTr6

I:
1-5 Interactiuni stereospecifice la distants mica la to ate tipurile de grupari chimice Interactiuni stereospecifice la distanta midi la toate tipurile de grupari chimice Interactiuni secundare ale proteinelor, imperecherea bazelor acizilor nucleici Interactiuni lipidelipide, structuri tertiare ale proteinelor

~. ~.

organism, adica ale lichidelor din marile compartimente hidrice din care am amintit mai sus. Importanta protonilor hidrici din structurile celulare si de la nivelul transconfonnare, si compartimentelor penneabiIitate, au hidrice in fenomenele de

din

kr6

aJ.12

lnteractiuni London (dipol instantaneu-

dipol instantaneu)

kr6
8-40

a2

1-5

II:
,W

i!

electrogeneza, obieetul

contractilitate unor studii

vasomotricitate ale si

constituit

preferentiale biofizicieni Topoliceanu

cercetatorilor biochimisti (F.

resent

biologi,

fiziologi, 1974, F.

II,'
It'

Topoliceanu

Interactiuni de hidrogen

'll

si I. Haulica 1984, F. Topoliceanu

si I.•Haulica

Ii

.1989, M. Isac ~i R. M. Isac 1985, M. Isac si R. M. Isac 1989, M. Isac si R. M. Isac 1990, M. Isac si R. M. Isac 1991, M. Isac si R. M. Isac 1992).

lnteractiuni hidrofobe

4-30

II
J
t

22

R.M.ISAC

F.TOPOLICEANU

D.E.CREANGA

INTRODUCERE iN BIOFIZICA MOLECULARA ~I CITOTISULARA

CAPITOLUL2

Lipidele si proprietatile lorfizieo-ehimice


Lipidele reprezinta una din componentele importante a1e~tructurilor vii, fiind constituienti de baza ai tesutului adipos ~i ai sistemului de membrane celulare (plasmalema, me~branelemitocondriilor, reticulul endoplasmic, etc.). Ded~ece asupra aspectelor de biofizica membranelor ne vom refen maiin detaliu in capitolele urmatoare, precizam ca cele mal I importante tipuri
fosfolipidele

de lipide

din membrana

sunt:
Figura 4. Structura unei molecule lipid ice (dupa J. Darnell, 1970)

(fosofgliceride ~i sfingolipide) ~i glicolipidele

.(Fighra 4). Alcoolul cu care se asociaza acizii grasi din compozitia fosfolipidelor putand fi glicerol sau sfingozina, rezulta ca deci avem de-a face cu fosfogliceride ~i sfingolipide. Dintre mentionam cele mai cunoscute (lecitina), lipide membranare Structura acestor molecule lipidice contine In principal un pol hidrofil (un cap polar) ~i doua laruuri de acizt grasi
saturati sau nesaturatt (hidrofobe), In functie de natura acizilor

2.1. Structura lipidelor ~i interacliunile lor intermoleculare

fosfatidilcolina

fosfatidiletolamina,

fosfatidilserina, fosfatidilinozitolul. Unii autori, includ In randul lipidelor ~i moleculele de colesterol.

grasi din straturile bilipidice din biomembrane acestea pot avea o fluiditate mai mare sau mai mica. Organizarea tn bistrat lipidic din membrane este consecinta caracterului dipolar electric pe CareII prezinta polul

24

25

R.M.ISAC

F.TOPOLICEANU

D.E~CREANGA

INTRODlJCERE iN BlOFIZICA MOLEClJLARA ~I CITOTlSlJLARA

hidrofil - tendinta acestuia de a interactiona

cu moleculele

compartimente, In care orice bresa reprezinta un inconvenient din punct de vedere energetic (G. Benga, 1976).

polare de apa din mediile intracelular si extracelular. Orientarea polilor polari catre exterior si respectiv catre interiorul celulei are drept conseeinta orientarea lanturilor de acizi grasi unul

2.2. Organizarea

sistemelor lipide-apa

catre celalalt - se spune ca intre ele se manifesta forte de


interactiune de tip hidroJob. Aite compozitia forte ce stabilizeaza (unde bistraturile aceste lipidice din Una fosfolipidelor intermediare din proprietatile fizice remarcabile _,ie starilor

este mezomorjismul, intre cca solida

adica existenta ~i lichida

membranei

molecule

coexista

(mezomorfism mezomorfism i
!

impreuna cu diverse tipuri de molecule proteice cu pronuntar caracter dipolar electric), sunt fortele

termotropic) ca si intre cea de cristal si solutie liotropic. termotropic, apa, Fazele liotrope prezinta si ele

van der Waals si

mezomorjism

legtiturile de hidrogen, In mediile apoase in vitro, Iipidele se organizeaza sub forma de micele globulare.Ele pot elimina apa din interiorul mice lei unde se grupeaza lanturile hidrofobe de acizi grasi. Capetele polare raman catre exteriorul micelei interactionand prin legaturi electrice de tip dipol - dipol cu moleculele polare de apa, Eliberarea moleculeleor micelei, duce la
0

in functie de temperatura

si de concentratia de

Luzzatti si col. (1968) au descris mai multe faze: Jaza lamelara, faza de gel, faza hexagonala J si faza hexagonalii 11.

Faza lamelara (Figura

5), se caracterizeaza

prin

dispunerea bistratului lipidic cu lanturile de acizi grasi orientate perpendicular pe axa determinata de polii hidrofili.

de apa din spatiul interior al

Faza de gel se caracterizeaza prin orientarea la un unghi de circa 30 de grade a lanturilor de acizi grasi fata de axa polilor hidrofili (Figura 6).

crestere a entropiei sistemului, iar asocierea


0

spatial a simetrica a lipidelor, duce la

scadere a acesteia.

~stfel de caracteristice energetice determina tendinta de autoinchidere a acestor structuri cu delimitarea unor

Faza hexagonala J este data de micele globulare, situate


In colturile ~i centrul unui hexagon, moleculele polare din
>,'

26

27

/
R.M.ISAC (F. TOPOLlCEANU

D.E.CREANGA

INTRODUCERE iN BIOFIZICA MOLECULARA $1 CITOTISULARA

mediul de dispersie fiind eliminate din interiorul micelelor (Figura 7a)

orientate spre interiorul micelei, iar lanturile de acizi grasi, hidrofobe, spre exterior. Organizarea lipidelor membranare se bazeaza, In cazul celor mai multe din membranele organismelor superioare, pe forma de bistrat in faza lamelara, dar In cazul microorganismelor sau a membranei interne a mitocondriei, alaturi de portiuni de bistrat lipidic lamelar apar si micele de lipide.

Figura 5. - Dublu strat lipidic organizatinJaza alcatuit din molecule polare

lamelarii in mediul exterior

a.

b.

•• ,G•• GG:'

I!IJ

G.el!lJ$

'el!lJ'
.

"

, el , G'

"

Figura 6. - Dublu strat lipidic organizat inJaza de gel in me diu 1exterior alcatuit din molecule polare

,/Figura 7. (a) - Lipide organizate In faza hexagonala I, in mediu alcatuit din imolecule polare; (b) • Lipide organizate in faza hexagonala II, in me diu .alcatult din molecule polare

Faza hexagonala II (Figura 7b) difera prin aceea ca,

2.3. Teaca de mielina a axonului neuronal La nivelul neuronului teaca de mielina a axonului are 0 pondere maxirnala a lipidelor
29

micelele prind in interior moleculele polare ale mediului de dispersie,in timp ce capetele polare ale lipidelor din micele sunt
28

inc1use intr-o

structure

R.M.ISAC.

F.TOPOLICEANlJ

D.E.CREANGA
0

INTRODUCERE iN BIOFIZICA MOLECULARA

SI CITOTlSULARA

membranara,

din care, circa 70 - 80% din greutatea uscata lipidele, sub forma de colesterol,

reprezinta

fosfolipide,

Acesta

relevat

asimetria

bistratului,

data

de

glicolipide si doar 30% proteine (Figura 8). Excluderea apei si ionilor din compozitia mielinei explica si principala functie a acestei membrane, de izolator electric ~i de bariera de permeabilitate pentru ioni. Transportul ionilor prin membrana axonala se realizeaza la nivelul nodurilor Ranvler, unde teacade mielina se intrerupe (iar intre doua noduri Ranvier consecutive celula Schwann) (Figura 9). Primele studii de microscopie electronics (inainte de anii , 60), realizate pe acest tip de membrana, au fost efectuate de Robertson.
a
nodRmler

compozitia chimica diferita a stratului lipidic intern fata de eel extern, contribuind in mare masura la perfectionarea modelului structural propus anterior de Danielli si Davson pe baza

studiilor de tensiune superficiala ~i a celor de permeabilitate. Glicolipidele constituie


0

parte semnificativa a lipidelor

mielinice (30%), si sunt reprezentate in special de:

se delimiteaza

V galactocerebrozide
derivatul

(ex.:

galactozil-ceramida in interactiuni

~i celule

sau sulfatide

- implicate

Schwann - axon);

paraglobulinele

(ex.:

sialozil-paraglobozide,

implicate ca anticorpi anti LM1);


b

V sulfat de glucoronil paraglobozidd

cu

rol

in

interactiunea anticorp - anti SOPO, a carer perturbatii stau la


tIBet

de

mleJlnl uoplasma

originea neuropatiilor senzitivo - motorii demielinizate. Prezenta glicolipidelor galactocerebrozide (glicosfingolipide, gangliozide,

~i pataglobozide)

~i incastrarea asimetrica

in membrana plasmatica ~i dublul strat lipidic prin componenta ceramidica,


dopb!llll

odata cu expunerea extracelulara constituie alterari tinta pentru autoanticorpi ale canalelor ionice

a componentei ce determina

glucidice nwneroase

Figura 8. a - Reprezentare schematics a celulelor Schwann si nodului Ranvier; b - Imagine obtinuta la microscopul electronic (dupa J. Darnell ~i col. 1990)

sau demielinizari

mediate imunitar.
31

30

R.M.ISAC

F.TOPOLICEANU

D.E.CREANGA

INTRODUCERE IN BIOFIZICA MOLECULARA. $1 CITOTISULARA

Distributia particulara a gangliozidelor (GM), GDla si b si GQlb) in membranele axonale cu precadere la nivelul nodulilor Ranvier, in regiunile paranodale sau sinaptice, cat si in celulele Schwann, ale fibrelor motorii ~i senzitive determina o larga varietate de afectiuni clinice autoimune. Acestea pot fi explicate prin implicarea lor in reglarea diverselor procese fiziologice cat ~i prin interactiunile lor cu receptorii factorilor de crestere, canale ionice, molecule de contractilitate ~irecunostere celulara (E. Fournier, 1998).

'In celelalte tipuri de membrane, lipidele au ponderi de numai 45 - 50% (modelul mozaicului fluid) coborand chiar la 30% in membranele care sunt bogate in proteine (modele bazate pe subunitat; Iipoproteice sau pe micele de lipide) ~i indcplinesc functii celulare mai complexe.

celula

Schwann nod Ranvier

Figura 9. - Celula neuronala cu noduri Ranvier ~i celule Schwann care sunt de-a lungul axonului mielinizat (dupa J. Dame 111990)

32

33

R.M.ISAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

_!NTRODUCERE

iN .BIOFIZICA MOLECULAR'\' ~l ClTOTISULARA

au valori apropiate de 120", iar lungi::~;~~:i CAPITOLUL3 cadrul gruparii peptidice

di;

este mai mica (1,32 A) decat a

legaturii C-N simple (1,47

A).

Legaturile carbon - azot ~i carbon - oxigen au un ordin

Proteine, interacfhmi moleculare ~i proteine enzimatice catalitice.


Proteinele din polimerizarea sunt macromolecule biologice
0

intermediar intre unu si doi, ca urmare a deplasarii unei parti din densitatea electronica a legaturii duble O=O catre legatura simpla C-N. Caracterul partial de legatura dubla a legaturii C-N din gruparea peptidica impiedeca rotirea libera in jurul acestei legaturi ceea ce nu este valabil si pentru legatura simpla C-N. Legaturile peptidice asigura structura primard a

care provin

unui numar mare (peste

suta) de molecule

de aminoacizi. Cei douazeci de aminoacizi existenti in natura se caracterizeaza prin structuri de tipul H2N.CHR.COOH care

proteinelor ~i inlantuirea moleculelor de aminoacizi. Caracterul de donor de pro toni al gruparii NH si caracterul de acceptor de protoni al gruparii C=O favorizeaza formarea de legaturi de hidrogen intre portiuni vecine ale lantului de aminoacizi, ceea ce reprezinta structura secundarii a proteinelor . Aceasta structura se optimizeaza din punct de vedere

difera prin structura radicalului R. Aminoacizii sunt amfoliti - putand sa disocieze in mediu apos atat ca acizi cat ~i ca baze. Legarea intre moleculele de aminoac(zi se realizeaza prin intermediul legiiturii peptidice sau aminice, care apare prin redistribuirea electronic al gruparilor atomice C=O si NH. densitatii norului

energetic (energie minima) ~i entropic (entropie minima) pentru un numar maxim de astfel de legaturi de hidrogen. Unele dintre

3.1. Legatura peptidica


Toti eei patru atomi ai gruparii peptidice sunt coplanari iar caracterul dipolar electric este semnificativ pentru gruparea peptidica (Figura 10). Unghiurile dintre legaturile interatomice
34

aceste

legaturi

sunt

intre

catene

peptidice

diferite

(intercatenare), in timp ce altele sunt intre portiuni diferite ale aceleiasi catene peptidice (intracatenare). Configuratia ~patiala

conferita proteinelor de existenta structurii secundare poate fi de "a-helix", de "foate pliata", de "ghem randomic", etc."
35

R.M.ISAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE

iN BIOFIZICA MOLECULARA SI CITOTISULARA

, . modificarea

compozitiei

chimice

a mediului

de: solvire

proteinelor respective. Sub actiunea unor factori fizici sau chhnici proteinele pot suferi modificari de amploare mai redusa, partial sau 'total . rev~rsibilede~uniite mare ,am~.I?are denaturari. - transconformatii sau modificari de mai sub numele de -

si ireversibile

cunoscute

De remarcat, ca la actiunea unor agenti fizico - chimici

denaturanti ca: teinperatura(55-60


tonica, presiunea,
Figura 10. _ Legatura peptidica si caracteristicile sale conflgurationale (modiflcat dupa S. Badilescu ~iC. Badilescu 1981)

DC) , pH -u, concentratia I .

radiatiile electromagnetice majoritatea legaturilor

# corpusc~lare,
de hidrogen care

se dezorganizeaza

Multe proteineau
" •chiar
~1 0

si

structurd tertiarii, iar unele au (Figura 11), ca urmare a

asigura structura tertiara a multor enzime. In cazul ribonucleazei, uncle structura tertiara este este

structura

cuatemard

formarii de legaturi disulfurtce sulfhidril din moleculele covalente difosJoesterice

(prin interactiunea

grupelor

asigurata de legaturi disulfurice,

activitatea .enzimatica

aminoacizilor (intre

sulfurati), de legiituri de serina), a

afectata abia la temperatura de 90 DC.


-,

molecule

interacliunilor

ionice, a interacfiunilor

hidrofobe

si a noi

3.2. Proprietatlle semiconductoare ale proteinelor


Dintre pozitie particulars
0

legaturi de hidrogen. Caracterul enzimatic al multor clase de proteine este consecinta directa a existentei structurilor terti are, iar energia de legatura redusa a puntilor de hidrogen, face ca enzimele sa fie user de gradate termic, pnn expunere la radiatii sau prin
36
'.,',

proprietatile

fizice

ale proteinelor,

detine caracterul lor de semiconductor

determinat de electronii moleculari de tip

n.

37

R. M. ISAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE iN BIOFIZICA MOLECULARA ~I CITOTISULARA

Adsorbtia

apei la suprafata

unor proteine

modi fica

largimea benzii interzise, de exemplu de Ia 2,2 eV la 1,7 eV in cazul albuminei plasmatice. prisma a doua ipoteze: Acest fapt poate fi explicat prin prima se bazeaza pe efectul de

modificare, de catre apa, a constantei dielectrice a proteinei, iar a doua presupune ca adsorbtia apei are efectul unei impuritati.

Figura 11. _ Structura cuaternara a hemoglobinei (dupa M.F. Perutz citat de W. Hope ~icol. 1983)

din patru lanturi peptidice

benzi ocup ate eu alectroni Rezistenta electrica a proteinelor in stare uscata variaza cu temperaturaconformlegii: (1)
Figura 12. - Benzile energetice in proteine (Z. Simon ~iC. Nicolau 1976)

unde: kB este constanta electrica extrapolata

lui Boltzmann,

Ro este rezistenta

In

orice

caz,

mecanismul

semiconductibilitatii

pentru liT tinzand la zero, iar AE este

proteinelor este eel mai probabil, unul electronic ~i nu unul protonic. S-a calculat ca la nivelul gruparilor peptidice se

Hirgimea benzii interzise ce separa banda de valenta de banda de conductie (de ordinul a cativa eV) (Figura 12).

C=O •••HN legate intre

ele prin Iegaturi de hidrogen

genereaza trei benzi de energie cu Iargimea de 0,2 eV, dintre


38 39

R.M.1SAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANG.:\.

JNTRODUCERE

iN BIOFIZICA

MOLECULAR.:\. ~l ClTOTlSULARA

care cele doua inferioare sunt complet ocupate de electroni, iar cea superioara este libera. Distanta dintre banda a doua ocupata de electroni si banda libera este apreciata Ia 3,05 eV. S-a evidentiat efectul gruparilor prostetice din proteine asupra largimii benzii interzise, aratandu-se atat cresterca

enzimatice

a carer exisrenra este determinata

de informatia

genetica stocara in acizii nucleici.

3.3. Proprietafi enzimatice

acesteia cat si diminuarea ei, ca urmare a cuplarii acestor grupe de atomi. Astfel, hemul (gruparea prostetica a hemoglobinei) cuplat la globina produce scaderea valorii lui AE (de la 2,97 eV la 2,95 eV), sugerand ca moleculele semiconductoare sunt "ingropate" de hem poate

Rolul enzimelor de catalizatori ai reactiilor metabolice


fi ilustrat pe baza unui concept termodinamic fundamental pentru bioenergetica celulei cunoscuta sub numele de energie de activare. Prin aceasta moleculele reactante trebuie sa aiba
0

se inte1ege faptul ca

In cele relativ izolatoare de globin a, ca si 'ill

energie minima pentru a

cazul cuplarii moleculelor de la acidul nucleic ADN, in parte a proteica a nuc1eoproteinei izolate din timus. La rodopsina, .prezenta retlnalului (gruparea prostetica a rodopsinei) duce Ia cresterea Iargimii benzii interzise a opsinei, ceea ce ar presupune ca electronii 1t ai retinalului patrund 111 banda de \<;onductie a proteinei, invers dedit in cazul

putea intra in reactia respectiva. Aceasta energie, E, delimitata de doua nivele energetice A ~i B, este necesara
0

pentru reactie

declan~area reacfiei, care decurge apoi spontan ca

exoenergetica (proces exergonic, intre nivelele A §i C separate de energia interna AG) sau endoenergetica (proces endergonic). Astfel este necesara depa§irea unei ·anumite bariere ce se

hemoglobinei. . Proteinele sunt molecule dipolare ~i amfolitice, ceea ce


\

energetice pentru declan~area unei reacp! biochimice

poate reaIiza, fie prin preluare temporara de energie (sub forma calorica, radianta, s.a.) din exterior, fie prin intervenfia biocatalizatorilor ( . I) ex.: enznne e, care reusesc tocmai diminuarea barierei energice, de Ia
0

face ca in structurile membranare, de exemplu, sa participe la interactiuni electrostatice ~i ionice multiple. Sinteza proteinelor d~ constitutie ca si, de fapt, orice alt proces biochimic din celule,
40

valoare E, prea mare

este controlata

de proteinele

41

R. M. ISAC

F. TOPOLICEANU
0

D. E. CREANGA

INTRODUCERE iN BlOFIZICA MOLECULARA Sf CITOTISULARA

pentru intrarea in reactie, la posibila (Figura 13).

valoare E' care face reactia

transformarii.

Fiecare etapa este caracterizata

de

anume

energie de activare. In decursul proceselor metabolice din celula se produce

nu numai eliberare de energie din moleculele care


A

stocheaza

dar si acumulare de energie chimica prin reactii in care starea


E'<E

energetica final a este un nivel energetic superior celui initial. Declansarea acestor procese endergonice se realizeaza

6G

pe baza cup/aju/ui cu

reactie exergonica, ceea ce face posibila

existenta fenomenelor biologice antientropice (cons'..__atoare de a entropie, prin care se trece de la


Figura 13. - Diminuarea energiei de activare de la E la EI' lao exergonica eu energia de reactie AG* (dupa M. Isac 1987)
0

stare cu entropie mare intr-o de evolutie a existenta pentru unui

reactie

stare cu entropie mai mica, contrar tendintei sistemelor fizice). Cuplajul presupune de reactie

Prima cale este adesea neconvenabila, caci necesarul de energie poate sa fie prea mare, energizarea sa nu fie economica sau sa nu fie suportata de celula. Actiunea unor enzime

intermediar

cu rol de produs

unul din

procesele cup late si cu rol de reactant pentru celalalt proces. Aproape catalizata de
0

fiecare

reactie

chimica

dintr-o

celula este

specifice modificarii substraturilor biomoleculare poate inlatura aceste neajunsuri, astfel ca celula sa nu fie suprasolicitata

enzima. Numarul reactiilor enzimatice dintr-o

celula este foarte mare. De exemplu, intr-o celula animal a exista 1.000-4.000 de tipuri diferite de enzime (dupa J. Darnell, H. Lodish §i D. Baltimore, 1990) fiecare catalizand
0

energetic (Warren T.,1995) Daca energia unei reactii, ca de exemplu eliberareade energie din compusii organici care sunt specializati in stocarea ei (cum ar fi degradarea glucozei paua la dioxid de carbon si apa) este ridicata, atunci este necesar ca ea sa decurga in etape (Figura 14) pentru a asigura protectia
42

singura

reactie sau un set de reactii chimice. Anumite enzime seigasesc in majoritatea tipurilor de celule, 'deoarece celulare comune: sinteza proteinelor, catalizeaza, reactii a

a acizilor nucleici,

celulei

§i eficienta
43

·. . R.I\1.· ISAC '

F. TOPOLICEA~U

.. J.)~E. CREANGA

INTRODUCERE iN BlOFIZICA MOLECULAR:{ ~I CITOTISULARA

. fosfolipidelor, conversia glucozei isi oxigenului in dioxid de carbon si apa, etc.

Microtubulii, ca polimeri de tubulina sunt implicati in transportul axonal anterograd rapid, iar microfilamentele ca elemente de incastrare a constituentilor membranari sunt de fapt polimeri de actina, atasati membranar prin intermediul unor proteine submembranare (spectrina , ankirina, vinculina)

A
AG -AG +AG2+AG3+ 1 +AG4+ .... AGn AG

sau transmembranare din familia integrinelor. Proteinele transmembranare sunt asociate structurilor jonctionale celulare "stranse" sau a celor de "ancorare". Proteinele transmembranare suprafata din din familia receptorilor de

grupul integrinelor

intervin

in _acrosarea

Figura 14. _ Reactie exergonica derulata In etape, fiecare stare energetica tnrermedtara fiind caracterizata de 0 energie de activare (modificat dupa M. Isac 1987)

membranelor din reteaua actina - spectrina. 0 astfel de configuratie permite legarea, pe de proteinele membranare
0

parte a citoscheletului la

(canale ionice, pompele Na +/K+,

3.4. Proprietatile structurale autoimune

si de mediatori ai reactitlor

molecule de adeziune de tipul alfa -actininei ~i vinculinei, etc.)


~i pe de alta parte, la interactiunea filamentelor de actina cu

Componentele glicoproteice, dar si cele glicolipidice (mentionate In capitolul anterior), fac obiectul unei largi patologii autoimune (demielinizari mediate imunitar). Implicarea prot€inelor fibrilare citoscheletice (microtubuli, microfilamente si neurofilamente) 'in structurarea formei si integritatii fibrelor nervoase, fac obiectul a numeroase
studii.
44

proteinele matricei extracelulare de tipul colagenului de tip IV, laminina, proteoglicanul heparan sulfat - ~er1ecanul, entactina, fibrina etc. (Cruce M. and all., 1997) La nivelul jonctiunilor de aderenta (intercelulare sau de tip celula - matrice) s-au identificat proteine care apartm . moleculelor de adeziune calciu dependente intercelulare (caderine) sau intracelulara (alfa, beta, gamma-catenine,

45

R. M.ISAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE iN BIOFIZICA MOLECULARA ~I CITOTISULARA

vinculina, all.,1999) .

alfa-actinina

si plakoglobulina

(Isac C.M. and

Proteina

P22 (PMP-22) sau proteina mielinei periferice,

se gaseste intr-o concentratie de 2 - 5 % din totalul proteinelor mielinice ~i ar putea juca un rol ca molecula de adeziune intre celula Schwann ~i axon, dar si In reglarea multiplicarii eelulare. In mielina noncompacta au fost identifieate citeva

In plus, reteaua de actina - spectrina din membrana axolemica, formeaza


0

structura elastica deformabila temporar

constituind un sistem de protectie a fibrelor nervoase fata de diverse solicitari mecanice (intinderi sau compresiile produse de miscarea membrelor). Structura mielinei compacte este dictata de
0

proteine ca glicoproteina asociatd mielinei (MAG) eu rol de adeziune in compactarea mielinei si in declansarea unor

arhitectura
22,

neuropatii demielinizante autoimune prin anticorpi anti - MAG. Conexina


32

proteica complexa, bogata in proteine (Po, PI, P2, PMP

etc.) a

din regiunea

paranodala

$i incizurile

carer organizare si ro1 este inca incomplet elucidata, mai ales in patologia nervoasa . Proteina Po este
0

Schmidt - Lanterman ar juca un rol important in mielinizarea normala si schimburile axon - celula Schwann, precum $i 'in

glicoproteina

transmembranara

formarea jonctiunilor comunicante (gap) celulare mielinice. De obicei, denumirea enzimei indica functia sa: sufixul

reprezent,and 50% din proteinele mielinei si se pare ca are un rol esential in structurarea si stabilitatea mielinei conecta la

-aza - este adaugat denumirii tipului de molecula asupra careia


actioneaza enzima. Astfel, proteazele fosfatazele inlatura reziduurile degradeaza proteinele, fosfat, ribonucIeazele

straturile infra - si extracelulare. Protein a PI (MBP) sau proteina bazica a mielinei, desi este
0

cliveaza-

componenta In

'in concentratie straturilor

redusa (2 - 16%) este intracelulare la cele

moleculelelde ARN (acid ribonucleic). Exista si enzime care se pot gasi numai intr-un anumit tip de celula, deoarece catalizeaza anumite tipuri de reactii

implicata mielinice.

conectarea

Proteina P2 prezenta intr-o concentratie de 1 - 15 %, pare sa aiba un rol predominant structural.


46

specifice (de exemplu, cea neuronala). Modul competitivitatea de actiune al enzime1or, specificitatea,

metabolic

si mai putin

~i caracterul

de saturatie

al interactiunilor

enzima - substrat pot fi cunoscute din cursurile de biochimie ~i 47

R.'M.ISAC

F. TOPOLlCEANU

D. E. CREANGA

I~::!.~~UCERE

iN BlOFIZICA MOLECULARA ~I CITOTISULARA

enzimologie, ceea ce vom aduce noi In atentia cititorului In cele ce urmeaza, fiind doar un punct de vedere cantitativ asupra cineticii Menten. reactiilor enzimatice, respectiv relatia Michaelis-

nivelul

fusului

de diviziune

sau a scurtari;

dimensiunilor

citotisularc in cursu] contracfiei musculaturii striate sau netede. In celulele musculaturii striate (fibrele striate) se gasesc miofibrilele, organite intracelulare specifice aldituite dintr-o succesiune de unit.1ti contractile numite sarcomere.

CAPITOLUL4

Sarcomerut

coniine

proteine

contractile

structurate

reprezentatc de miozillii (filamente groase, cu diametruI de 110

Proteinele contractile
Un aspect deosebit de interesant In biofizica moleculara si celulara

A ~ Figurile
\\'i

I 5 ~i 16) si actina (filamcnte subtiri, cu diametrul

de 50 A), precum ~iproteine reglatoare de tipul tropomiozinei tropollillei care la mu~chiul netcd este reprezentara ell/mol/nUllii. de

n reprezinta

mobilitatea celulara ~i contractilitatea, d~ ~o

lvfoleculele de miozind sunt formate din doua elemente infasurate In spirala si care se termina cu un cap globular. Miozina are forma unei baghete bifurcata la unul din capete, cu

a.caror suporturi generatoare de forta sunt repr,ze~tate intreaga gama de structuri infracelulare,
grupate in doua sisteme moleculare: de ~ura
• /~ ••

proteica,
¥

ac!ma, nuozma
de

~l

o lungime total a de 15 - 19 nrn,

greutate moleculara

de

dineina, tubulina. Astfel de structuri intra in componenta


citoscheletului sub forma de microfilamente actina, microtubi si centrioli. In raport cu tipul ~i interactiunea diverselor proteine

480.000 Da ~i0 structura formata din sase lanturi din care doua

lanturi grele (MHC), de meromiozina

grea, la care se

ata~eazil cate doua Ianturi de meromiozina u~oare (MLC). Miozina prezinta capacitatea de a hidroliza molecula de A TP pana la' ADP §i fosfat (P), precum si de a lega actina, la nivelul extremitafilor bifurcatie]. Extremitatea jitcratura
48

contractile asistam la producerea unei largi game de fenomene motrice de la miscarea amoeboidala, flagelara sau ciliara, pana la cele de endo - ~i exocitoza, rnigrarea cromozomilor la

activa

enzimaticg

este

denumita

in

de specialitate segmentul 81 (greutatea moleculara de


49

R.M.ISAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE iN B10FIZICA MOLECULAR;\' $1 CITOTISULARA

120.000 Da) continuata cu segmentul S2 (greutatea moleculara 60.000 Da), 'ce impreuna formeaza asa numita meromiozinii
grea.

actina (Figura 17). Monomerul stabil numai in apa distilata, polimerizarea declansandu-se la cresterea concentratiei ionice , cand se constituie doua lanturi dublu spiralate - F actina, cu pasul elicei de 72 nm. Restul cornpozitiei filamentelor subtiri
r::: ' -.-.-- -lan~ ulI'or al miozinei - ---~

Restul

moleculei
usoard

(forma

fibrilara)

reprezinta

meromiozina

(greutatea moleculara de 150.000 Da)

(Figura 15).
lantul greu al meromlozlnel S-1 (120,000) (150.000) Iant user al meromlozlnel S-2 (60,000)

lantul greu al miozinei

~------------------325nm------------~--~ 1"---160 nm----l


./

,/'

./

Figura 15. - Structura miozineirlantul greu (segmente laterale SI si S2) ~i usor de merorniozina, (dupa W. Hope ~i col. 1983)

·miozlna

-140 nm (480,000)

/'

/'

/'

/'

10.7m n

Filamentul gros, de miozina este alcatuit din circa 400 molecule de miozina care i~i "impletesc" impreuna portiunile fibrilare nebifurcate, in timp ce segmentele S1 raman in pozitii excentrice, disponibile pentru cuplarea filamentelor subtiri in timpul contractiei (Figura 16).
Actina constituie 60 % din masa filamentelor subtiri si

Figura 16. - Structura filamentului de miozina (dupa J. Darnell si col. 1990)

este reprezentat de tropomiozina proteine reglatoare.

~i troponina.cii

ro1 de

Tropomiozina insoteste lanturile de actina, ca un Ian] spiralat paralel, iar troponina cu mare afinitate pentru calciu este atasata tropomiozinei la fiecare 38 nm lungime. Complexul
51

este fermata prin polimerizarea unor monomeri globulari - G


50

R. M. ISAC

F. TOPOLlCEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE IN BIOFIZICA MOLECULARA 1>1 CITOTISULARA

tropomiozina

- troponina are rol reglator al contractiei, In fibra

unghiului dintre segmentul

S 1 si segmentul

82 al actinei,

musculara striata, in timp ce in fibra musculara neteda, rolul troponinei este suplinit de calmodulina . " Transformarea moleculei de ADP (prin fosforilare) in

(conform modelului lui Huxley si Simmon, 1971),(M. Isac si R. M. Isac 1983, 1985, 1986, 1987,1.988, Haulica si F. Topoliceanu, 1989) 1990, 1991, 1992; I.

ATP este controlata de situsul ATP-azic al miozinei - la nivelul caruia are loc hidroliza ATP-Iui si cuplarea miozinei cu actina in timpul, contractiei (Figura 18). Actina este intalnita si In molecular (vezi In capitolul dedicat
2

constitutia citoscheletului celulei eritrocitare).

5.46 nm Actina

Troponina

Figura 17. - Structura filamentului de actina presupune prezenta si interactiunea actinei cu troponina ~itropomiozina (W. Hope ~icol. 1983)

Dupa cumse

va vedea In capitolul dedicat structurii

citotisulare musculare, contractia consta din scurtarea lungimii sarcomerilor printre glisante (Figura 18), prin alunecarea filamentelor groase (conform Huxley, 1957). modelului Singura subtiri

filamentele al lui

filamentelor modificare

Figura 18. (1) - Formarea complexului actomiozinic presupune transformari ale sistemului ADP - ATP; (2) - Cuplarea miozinei cu actina; (3) _ Modificarea cu circa 45° a unghiului dintre segmentele SI ~i 82, concomitent cu scindarea ATP - ului In ADP ~i fosfat (sub controlul situsului ATP - azic al segmentului 82); (4) - Decuplarea presupune interventia altei molecule de ATP (J. Darnell 1-990)

conformationala In timpul contractiei, fiind cea corespunzatoare


52

53

R.M.ISAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE iN BIOFIZICA MOLECtJLARA

sr CITOTISULARA (albumina,

Substantele

organice

sunt:

proteine

CAPITOLUL5

globulinele, fibrinogenul s.a.), lipide (colesterol, fosfolipide, s.a.), glucide (glucoza, s.a.), acizi organici (acid lactic,' acid citric, s.a.), pigmenti serici (bilirubina, urobilinogenul, s.a.), enzime (amilaza, lipaza, fosfataza alcalina, s.a.), vitamine (A, D, E, PP, Bl, B2, B6, B12, C, s.a.) si hormoni (estrogeni, corticoizi, s.a.). Substantele anorganice suntrsodiul, ,Potasiul, calciul, magneziul, fierul, cuprul, zincul, manganul, cloruI, acidul carbonic, ionul sulfat, bromul, iodul, fluorul, etc. 5.1. Structura ~ifunctiile hemoglobinei In situatiile fiziologice normale hemoglobina, prezenta in citoplasma celulelor rosii ale sangelui (eritrocite - hematii) reprezinta
0

Elemente de biofizica hemoglobinei


Hemoglobina este un eonstituient major al hematiilor, .celulele care detin ponderea principal a in cornpozitia sangelui asupra caruia cateva referinte le consideram utile.
Sflngele constituit din doua faze, plasma si elementele

figurate, este un fluid complex, care impreuna eu limfa $i lichidul interstitial formeaza mediul intern al organismului. Sangele reprezinta 6 - 8% din greutatea corporala si contine elemente figurate in proportie de 40 - 45%. Principalele elemente figurate sunt: o eritrocitele (99%) o
leucocitele (celulele albe)

v granulocite (65%);
./ limfocite (30%); ./ monocite (5%);

treime din greutatea celulei. La fiecare 194 de zile

toata cantitatea de hemoglobina se reinnoieste, fiind sinteiizata la nivelul maduvei osoase si in ficat (in organismul adult,rolul ficatului este mult mai putin important decat pentru embrion). In procesul de hemoliza, hemoglobina este degradata pana la: bilirubina, care se excreta in caile biliare si se eliminavdin. organism sub forma de stercobilinogen si urobilinogen.

'" 0

plachete (trombocite).

Plasma sangvina este alcatuita din 90% apa ~i 10% reziduuri uscate, din care 9% substante organice si 1% substante anorganice).
54

55

R.'M.JSAC

F. TOI'OLICEANU

D. E:. CREANGA

INTRODUCERE

..

iN BIOFIZICA

MOLECULARA

~I CITOTISULARA

/gComparativ cu alte componente ale sangelui, greutatea

Arhitectura

spatiala

a acestei

molecule

a fost deja de

moleculara, marimea ~i forma moleculei de hemoglobina pot f urmarite In Tabelul 5 si Figura 19.
Tabelul 5. Greutatile moleculare ~i dimensiunile maxime ale hemoglobinei ~i ale altor biomolecule (rnodificat, dupa F. Gremy ~iJ. Perrin, 1975)
:

elucidata intr-o mare masura prin analiza tridimensinala

difractie eu raze X.
Hemoglobinele izolate de la diferite specii de animale

contin globine diferite (partea proteica), dar aceeasi grupare prostetica - hemul,
Structura hemoglobinei, asemanatoare cu a clorofilei, se

Molecula Uree Hemoglobina

Grcutatea
moleculara (da) 60 68.000 10.000.000

Dirnensiunea

maxima

(angstrom) 4 42
10.000.000 (1 micron)

bazeaza pe un nucleu porfirinic, tetrapirolic, centrat pe un atom de fier(hemul), la care se leaga partea proteica, globina, care poate sa difere de la Globina
0

ADN

specie la alta (Figura 20). la atomul de fier din centrul


0

se ataseaza

Hemoglobina cromoproteina, cu
0

este

din

punct

de

vedere

chimic

hernului, aproximativ perpendicular

pe planul hemului de

greutate moleculara de 64.500 Da, fermata

parte, iar de cealalta parte legandu-se

oxigenul, dioxidul de

din patru lanturi polipeptidice, fiecare din acestea continand un component de tip pigment denumit Item. Fiecare din cele patru grupe ale hemuluisunt protoporfirine cu ioni bivalenti de fier se compune la

carbon, etc. Nucleul porfirinic contine 20 de atomi de carbon ~i 4 atomi de azot; la hemoglobina (hemoglohina,

oxihemoglobina, carboxihemoglobina,

etc.) In centrul nuc1e;l~i

plasati central. Fiecare structura protoporfirinica

molecular profirinic este legat un atom de fier; jar la moleculele de clorofila (clorofila a, clorofila b, clorofila c) in centrul

randul ei, din patru inele pirolice legate prin punti metinice. Componenta proteica este fermata din patru lanturi

acestui nucleu este plasat un atom de magneziu iar In cazul vitaminei BI2 (cian - cobalamina) se afla un atom de cobalt , dupa cum au confirmat studiile bazate pe difractia raze lor X.

polipeptidice individuale care contin mai mult de 140 resturi de aminoacizi.

56

57

R. M.ISAC lipoproteina

F. TOPOLJCEANU (1.300.000 da)

D. E. CREANGA fibrinogen (400.000 da)

INTRODUCEHE

iN BlOFIZICA

MOLECULARA

~I CITOTISULARAi

hem fiind prezenta ~iIn unele enzime ale Iantului respirator din mitocondrii, cum sunt citocromii). . Caracteristicile spectrului Mossbauer sunt sensibile la pe care Ie realizeaza fierul si pot da

globulina (90.000 da)

~
albumina (69.000 da)

~:~:::=~~
lipoproteina

colagen (330.000 da)

legaturile interatomice

informatii despre structurile electronice ~i de ligand din jurul atomului de fier (Figura 21).

~
hemoglobina (68.000 da)

_;~:~7t~
~~~~

(200.000 da)

Atomul de fier din centrul hernului este hexacoordinat, patru dintre valentele sale de coordinatie fiind satisfacute de cele patru inele pirolice, a cincea putand lega iar a sasea r
0 0

globulina (156.000 da)

molecula de apa

molecule de gaz (oxigen, dioxid de carbon). ale hemului sunt rezultatul sa. Fierul

100

200

300

400

500

600

A
~i

Proprietatile feromagnetice configuratiei eleetroniee

Figura 19. - Greutati molecularesi dimensiuni maxime ale hemoglobinei ale altor biomolecule (modificat dupa F. Gremy si J. Perrin 1975)

a fierului din compozitia

atomic are urmatoarea configuratie electronica:

o alta

refleetare a strueturilor similare ale hemoglobinei


0

si clorofilei (desi aeeasta din urma nu este de asemanarile proprietatilor optiee

proteins) este data lor de

18 electroni pe straturile interne

8 electroni periferici

ale produsilor

degradare, respeetiv hematoporfirina

si etioporfirina.

In schimb, fiend dublu ionizat are configuratia:

Caraeterul feromagnetic al atomului de fier favorizeaza observarea fenomenului Mossbauer (absorbtia

~i emisia
Aceasta inseamna ca ii raman trei orbitali electronici 4p liberi p,eultimul strat, impreuna cu doi orbitali 3d si cu un orbital 4s.
59

rezonanta a radiatiilor gamma) fapt ee a constituit obiectul a numeroase studii efectuate in anii 1970 - 1980 de May, Lang ~i Marshall, atat pe hemoglobina cat si pe citocromi (structura de
58

R.M.lSAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE

IN

BIOFIZICA MOLECULARA ~I CITOTISULARA

vizibil, ~n domeniul verde - galbui (eomplementar rosu pe care II reemite),

domeniului

Alte eromoproteide eu functii respiratorii si eu structura porfirinica eatalazele, (continand peroxidazcle, de asemenea, fier), sunt eitoeromii, neporfirinice sunt, de

s.a.,

iar

exemplu, enzimele f1aviniee si hemocianinele melcilor ~i molustelor (continand cupru).

din organismul

Cromoproteide lara functie respiratorie sunt clorofilele, ficocianinele ~i ficoeritrinele din algele rosii ~i albastre (cu ca purpurul retinian,

structura porfirinica) ~i carotenproteidele rodopsina, s.a. (tara structura porfirinica).


. I d fier dublu ionizat In Figura. 20. : Structura .he:~~U1a~~ ~:~:~e s:tisfiicute de atomii de centrul planului, av~nd pat:u 1~1I1 . ~doua valente Iibere pentru cuplarea azot din cele patru me le piro Ice ~I .cu globinei ~i a unui ligand (dupa Schmidt 1989)

Hematiile hemoglobina deosebire de

mature

nu au capacitatea

de a sintetiza

si-au pierdut mitoeondriile hematiile foarte tinere

~i ARN -ul, spre care pot sintetiza

Fieeare din acestia poate fi oeupat cu cate doi eleetroni pe care fierul ii acceptadc la alti atomi sau grupe de atomi, deci valenta ~ si se realizcaza eu fierului atornizat este ega la eu sase y .. 12 eleetroni de la aromii inveeinati eu fierul. partle1parea a . Hemoglobina poate fi analizata spectral (FIgura 21) in
A

hemoglobina din preeursorii proteici ai globinei concomitent

captarii fierului prin intermediul unei proteine de Iegatura (0


proteina specifica, transferina sau siderofilina, care transports fierul prin membrana hematiilor imature). In mod normal, legarea moleculelor de oxigen, monoxid de carbon, dioxid de carbon, la confere
0

mod direct, eu aparatura spectral a pentru domeniul vizibil (care . ibila decat cea pentru ultraviolet, care necesita este mal accesi 1 fibra optica din cuart): speetroseoape sau speetrofotometre eu . . ibil caci hel11ul absoarbe In speetrul echi pament pentru VIZI I,
60

atomul de fier trebuie sa

stabilitatea suficienta noului compus pentru a putea fi

61

R. M. ISAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE IN BIOFIZICA MOLECULARA ~I CITOTISULARA

adsorbantilor:

fhO, D20 (apa deuterata), CI-l)OH confirmand de impuritatc aI acestor molecule asupra

ipoteza efectului semiconductorului

CAPITOLUL6

pe care 11constituie hemoglobina.

De un interes deosebit pentru functia rcspiratorie si rolul hemoglobinei In transportul gazelor respiratorii la capacitatea (02 si C02), de fixare ~i

Molecule macroergice
Moleculele macroergice din celulele organismelorvii au

sunt studiile si datelc rcferitoare

disociere a acesteia, in conditii de efort hipo - ~i hiperbaric (F.Topoliceanu si col., 1972) si rolul de sistem tampon at

rolul de stocare a energiei provenita din procese metabolice de internalizare a energiei din exteriorul organismului (din

acestuia in homeostazia bazica a mediului intern. Aceste cercetarilor respiratorie de aspecte biofizica, sunt dezvoltate si fac obiectul sistemica cardio-

degradarca alimentelor sau din fluxul energetic solar cum. este cazul ATP la plantele autotrofe). Aceste tipuri de molecule au si capacitatea de a elibera energia inmagazinata cand procesele metabolice consumatoare de energie
0

biochimie, si recuperarii

fiziologie functionale

ale efortului

cer.

respiratorii (Apostol Ion ~i col., G. Pandele ~i col.; Avram ~i F. Topoliceanu, 1995).

In Iumea vie se cunosc mai multe tipuri de compusi macroergici (Tabelul 6), care inmagazineaza energie chinrlcala nivelul unor legaturi interatomice cum sunt: o legaturile hidrolizabile de tip P-O, care sunt ~i c~li~ru
,.:,

des intalnite, (legaturilc P-O apar in cadrul gruparilor pirofosfat, acil-fosfat ;;i fosfofenol); o lcgaturile hidrolizabile S-C, intalnite mai rar,de

exemplu in cadrul gruparii tioester, prezenta .la unul din metabolitii cei mai importanti - acetilcoenzima A. ,

64

65

R. M.JSAC
Cl

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA . INTRODUCERE iN BIOF'IZICA MOLECULARA ~I CITOTISULARA

legaturile hidrolizabile P-N, destul de rare, prezente in molecula de fosfagen (sau fosfocreatina).

n,.., =patru grupar] fosfat fiind disociate In conditiile pH-ului neutru (7,0) din citoplasma celulara, Stabilitatea eompusului macroergic ATP este data ~ide interactiunile intre doua grupari fosfat negative monovalente eu un ion bivalent de ealciu sau magneziu.

eel

mai

caracteristic

compus

. macroergic

este

acidul

adenozintrifosforic

- ATP care prin hidroliza unei grupari fosfat

trece in ADP - acid adenozindifosforic.


Tabelul 6. Energiile aG degajate (dupa M, Isac 1987)
',I

prin hidroliza

unor eompusi cu fosfor

Din punct stocate in aceasta

de vedere molecula

electrostatic

masura

energiei

este data de cea a energlel de sarcini electricenegative,

Compus

P - enolpiruvat 12800 1,3-di- P-glicerat 11800

Glucozo-I-fosfat 5000 Fructozo-S- fosfat 3800 Glucozo-S- fosfat 3300 3-P -glicerat 3100 Glicerol-1-P 2300 electrica (patru toate cele

electrostatice

a complexului

fosforilat
h.G(cal/mol) Compus fosforilat ·h.G(cal/mol)

energie de respingere care este compensata la nivelul energiei interne a compusului stabiIizat, In care cele patru sarcini sunt menlinute In apropiere una de alta (Figura 22).

Compus
fosforilat AG(cal/mol) Compus

Pvcreatina
10500 Acetil- P 10100 ATP 7000

fosforilat
AG(cal/mol) Compus fosforilat AG(cal/mol)
R

OR

OR

Mole~ula de ATP prezinta incarcare

sarcini negative localizate pe legatura fosforica),

Figura 22. - Structura ~dell'ozintrifosforic )

moleculei

macroergice

de

ATP

(acid

66
67

R.M.ISAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE iN BIOFIZICA MOLECULARA $1 CITOTISULARA

Reactia reversibiHl ATP<=:>ADP joaca rolul unei baterii energetice celulare care se incarca prin fosforilarea ADP si se descarca prin hidroliza ATP: ATp4- +H20 <=> ADp3- +HP04 +H+ ATP este direct implicat in multe procese energetice din celula, cum sunt: glicoliza, fosforilarea oxidativa,

CAPITOLUL7

Enzimele lantului.respirator

-,

Majoritatea covarsitoare a celulelor sunt dotate icu


mitocondrii, organite celulare care asigura conversia energiei in

fotofosforilarea. Acesta este prezent in toate tipurile de celule animale ~i vegetale din scara filogenetica. ATP se poate transforma in AMP ciclic (cAMP) avand rol in semnalizarea si deci in comunicarea celulara, Guanozintrifosfatul (GTP) are un rol asemanator ATPului (de stocare de energie celulara), iar cGMF este intalnit in semnalizarea celulara la nivelul suitei mesagerilor secundari. Transportul activ transmembranar, contractia musculara ~i bioelectrogeneza sunt doar cateva din fenomenele biofizice in care astfel de biomolecule sunt evident, indispensabile (F. Topoliceanu ~i col. 1971; F. Topoliceanu si col. 1972; F. Topoliceanu ~i col. 1974; M. Isac ~i R. M. Isac 1984; M. Isac si R. M. Isac 1985; M. Isac ~i R. M. Isac 1988).

forme care pot fi utilizate pentru desfasurarea reactiilor chimice din celula. La nivelul membranei interne mitocondriale exista un procentaj sernnificativ de proteine (circa 70%) cu proprietiiti
enzimatice.

Acestea sunt baza moleculara a proceselor de

transport de electroni prin care se converteste energia eliberata . .

in reactiile de oxido-reducere spre forme convenabile de stocare, mai ales In molecule macroergice de tip ATP
tfosforilarea oxidativii). Tot la acest nivel este localizat un

numar insemnat de enzime, care catalizeaza diverse alte reactii celulare.


Enzimele lantului respirator

cum mal sunt denumite

proteinele implicate direct in reactiile de oxido - reducere=

rn~i

ales a glucidelor si acizilor grasi, asigura degradarea totala a piruvatului ~i acizilor grasi, in prezenta oxigenului, J§ri~I§la. bioxid de carbon ~iapa.
68 69

· R. M. ISAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE iN mOFlZICA MOLECULARA ~I CITOTISULARA

In lipsa acestora,

energia

provenita

din degradarea

electroni, avand ca rezultat pomparea protoni/or

din interior

glicolitica (cum se mtampla, de exemplu in celulele eritrocitare adulte si in celulele maligne) este caracterizata de un randament mult mai coborat: numai 2 molecule de ATP se pot sintetiza pentru fiecare molecuUi de glucoza ~i nu 36, cain fosforilarilor oxidative. Preccupari ale biofizicienilor experimentale asupra unor ieseni pentru investi~alii bioenergetice din induse procese cazul

spre exteriorul membranei interne (in matrix) ~i generarea unui gradient electrochimic transmembranar de protoni (Figura 23).

(lntr-unul din capitolele urmatoare se va vedea ca un astfeI de gradient, presupune


0

componenta

chimica

.,. diferenta

de

concentratie, precum ~i 0 components

electrica - diferenta de
0

potential electric). Inbaza acestei energii sunt catalizate de reactii controlate de catre enzimele membranare, La mitocondrii ~i cloroplaste
0

serie

organismele anirnale, s-au axat pe modlflcari e~imatice

parte semnificativa

din

de unele sub stante toxice administrate sobolanilor de laborator (R. M. Isac ~i M. Isac, 1982) ca ~i pe actiunea unor campuri magnetice asupra fosforilarilor oxidative din creierul acestor

energia interna din celula este destinata fosforilarii ADP-ului parra la ATP (sub controlul aspecte bioenergetice procariote. Procariotele proteine oxidarea enzimatice substantelor sunt prevazute cu membrane energia din bogate in din unei ATP - sintetaze). Aceste

se intaInesc amt la eucariote cat si la

organisme (P. Jitariu ~i M. Isac 1968). In mod analog, la nivelul proteinelor din membranele cloroplastelor (organite celulare specifice plantelor verzi) se din

~i internalizeaza
hranitoare luate

eliberata mediul

realizeaza conversia energiei, initial cea electromagnetica

extern

spectrul vizibil al radiatiei solare, apoi cea din degradarea glucidelor ~i acizilor grasi, in formele utilizabile pentru

stocand-o insa in mod preferential,

in gradientul de potential

electrochimic protonic, convertita ulterior, intre altele ~i pentru locomotia in mediul ambiental. Mecanismul fosforilarii oxidative (Figura 24) este

desIa~urarea celorlalte reactii celulare. Avern de-a face cu un cuplaj chemo - osmotic, in cadrul caruia donori de electroni bogati in energie (rezultata degradarea transfera alimentelor, treptat unui sau utilizarea radiatiei solare), din
0

sustinut de trei complexe enzimatice (trei ansamble de proteine respiratorii - Figura 25).

Ian] de molecule
70

transportoare

de
71

R.M.lSAC

F. TOPOLlCEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE iN BIOFIZICA MOLECULARA $1 CITOTISULARA

Cel mal remarcabil colector de eleetroni de mare energie proveniti din degradarea oxidativa a alimentelor este NADH. Fiecare astfel de molecula capteaza cate un ion negativ de hidrogen, adica un atom neutru de hidrogen la care se ataseaza un electron. Intr-o prima etapa a transportului de electroni, NADH revine la forma de NAD+ prin eliberarea unui proton ~i a doi electroni. NADH - dehidrogenaza este principalul component al primului §i celui mai mare complex enzimatic al lantului respirator. Electronii eliberati de el, tree la un centru flavinic de dezenergizare si apoi sunt dirijati catre cinci centre cu fier. si sulf spre 0 molecula mica de ubiquinona (sau CoA) unde pierd treptat, alte diferite cantitati din energie initiala. Aceasta moleculaeste membrana. In al doilea complex enzimatic respirator (complexul de citocromi b-Cl), electronii eliberati de ubiquinona tree la citocromul c din dimerul b-e, (fiecare monomer contine trei grupari de tipul hemului legate la citocromi si 0 proteina eu fier si sulf), Citocromulc este a1 membranei.
0

H+

membrana

mrema

Jtlitoco:ndriei

H+ H+ H+
acid to$. proton-JIlOtoare

H+

de mici dimensiuni si are mare mobilitate in

datoraft gradientului
de cOltCentratie a protollilor

H+

proteinamica din planul periferie


Figura 23. - Cele doua componente ale gradientului electrochimic protonic (dupa Alberts ~icol. 1989) ,

72

73

R. M. ISAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE

IN BIOFIZICA

MOLECULARA $1 CITOTISULARA

ca un dimer, fiecare din eei doi monomeri


memhrana

continand

doi

citoeromi si doi atomi de cupru.

externa

Figura 25. Cele trei complexe enzimatice constituente ale lantului respirator: Q = ubiquinona iar CI = citocromul CI (modificat dupa Alberts ~i col. ] 989)
..I

Cele trei complexe enzimatice pot fi considerate ca niste


ATP-lin:tetaza

entitati separate ale membranei interne lara a Ii se atribui

structurare ordonata care sa explice transportul electronilor caci acest transport ubiquinonei
Figura 24. - Mecanismul Alberts ~i col. 1989) general al fosforilarii oxidative (modificat dupa

se poate

explica
CI

prin marea

mobilitate

si citocromului

ce difuzeaza cu rapiditate In

planul membranei. Coliziunile acestor componente de mare mobilitate cu

In al treilea complex enzimatic - (Figura 25) complexul citocrom-oxidativ de citocromul - bazat pe citocromi aa-, electronii eliberati c sunt dirijati, in final, spre oxigen. Acest

componentele adiacente din complexele enzimatice ale lantului respirator pot explica vitezele mari cu care sunt transportati electronii (la fiecare 5-20 milisecunde un electron este trecut de la un complex enzimatic la urmatorul),
75

complex enzimatic este si eel mai bine cunoscut. EI se prezinta 74

R. M. ISAC

. F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

Investigatiile

cantitative au ararat ca enzimele lantului

respirator sunt prezente in proportii diferite atat, in cele trei complexe respiratorii dlt ~i in membranele mitocondriale
nH+
complexul NADH

interne la diferite tipuri de celule avand un rol privilegiat in geneza gradientelor electriochimice ~i surselor energetice

complexul

implicate in transportul activ transmembranar (F. Topoliceanu • 1974; F. Topoliceanu ~i col. 1977; F. Topoliceanu si col. 1984; F. Topoliceanu 1988; M. Isac ~i R. M. Isac 1985; M. Isac ~i R.

citocrom b_c

M. Isac 1986; R. M. Isac si col. 1997).


Astfel, in celulele musculaturii col. 1990), la fiecare molecula cardiace (B. Alberts si dehidrogenaza de NADH

cO""Plexul citocrom oxidaza

corespund trei molecule de complex b-c I, sapte molecule de citocromoxidaza, de ubiquinona. Directia prestabilita
(~

noua molecule de citocrom c I ~i 50 molecule


Figura 26. - Variatia potentialului redox (mY) in lungul lan~lui respirator. Ubiquinona este notata cu Q iar citocromul Cl cu ci (Alberts ~I col., 1989).

pentru transportul este determinata

electronilor

in

lungul lantului de transportori potentialului

de cresterea

redox dinspre NADH catre oxigen - cele doua

extremitati ale lantului respirator (Figura 26). Potentialul redox este


0

masura a afinitatii pentru electroni a fiecarei perechi

conjugate redox: cum este NADH cu NAD+ sau H20 ~i 1/2 02

~i care se poate evalua practic - in principiu - utilizand


pereche de electrozi imersati in solutiile ce componentele unei perechi redox.
76

contin

77

INTRODUCERE iN BIOFIZICA MOLECULARA

sr CITOTISULARA

CAPITOLUL8

Modelarea matematica a proeeselor enzimatice


Importanta majora a enzimelor In procesele celulare

implica cunoasterea de eatre bioinginerulrnedieal

!?ibiofizician

a principiilor fundamentale ale reactiilor enzimatice. si mai ales a aspectelor cantitative, Reprezentarea atat de utile In

aplicatiile

biotehnologice.

schematica

a celei mai simple

reactii enzimatice este de forma:

(2)

unde: prin E !?iS se noteaza enzima ~i substratul, iar prin ES ~i P se noteaza complexul enzima - substrat ~i produsul de reactie, Constantele de, viteza pentru prima si cea de-a doua faza a reactiei se noteaza cu k, primind .semnul plus pentru sensul direct al reactiei si semnul minus pentru sensul invers.

De-regula, constanta de viteza a reconversiei produsului


final In complex enzima - substrat este foarte mica, practic
79

R.M.ISAC

F. TOPOLICEANU

I).

E. CREANGA

INTRODUCERE iN BlOFIZICA MOLECULAR:\' ~I CITOTISULARA

neglijabila,

Considerandu-se

neglijabili

gradientii

de

Se observa ca prin sumarea celei de-a doua si celei 'de-a

concentratie din reactor (concentratie constanta in toate zonele


bioreactorului) si notandu-se valorile initiale cu So, Eo, (ES)o=O

treia din ecuatiile de mai sus se obtine conditia de conservare cuplata cu substratul cat si cantitatea de enzima libera:

cantitatii de enzima din reactor, adica atat cantitatea de enzima

~i Po=O se pot scrie ecuatiile diferentiale care ofera imaginea


cantitativa a transformarilor suferite de enzima si substrat. Forma general a a ecuatiilor este: dx i _ ---fj dt
(

xJ"",xn

(3)

d (E., [ES]) dt

= 0 ¢::> E + [ES]

= const . = Eo

(5)

Rezulta ca se poate inlocuiE+[ES]


Din sistemul de mai sus rezulta:

~i cu Eo precum si E cu Eo.

ceea ce conduce la sistemul de mai jos. dS dt dE dt d[ES dt dP dt

= _ k + 1 SE

+ k _ t [ES ] + 'Y +k
1

= -k+1SE
]=
k+ISE ]

[ES]+
1 [ES]-

k+2 [ES] (4) k+2 [ES] Sistemul sepoate adimensionaliza

(6)

-k

= k +2 [ES

prin intermediul valorilor de

Constantele de viteza k asigura ~i omogenizarea dimensionala.

referinta ale concentratiei de substrat ~i respectiv de complex


enzima-substrat.alese ca Hind valorile de echilibru adica cele pentru care valorile vitezelor de variatie respective se anul~aza~

Daca prin S se desemneaza cantitatea de substrat din


reactor, cu v se noteaza fluxul de substrat care intra in reactor

~i care, are aceleasi dimensiuni ca ~i dS ~i se exprima in


dt molillitru - secunda in conditiile 1n care S, E si ES se exprima

dS -=O~ dt

S= constant

in moli/litru.
80

d [ES] -= 0 ~.·lES= dt
.?

r----]

(7)

cons tan t
81

R..~ISAC
_,';k;\;'{;S't,'·c" ";,'!Xt0~;ij~,

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

Sist~91ul de ecuatii diferentiale de la care am pomit conduce astfel la:

..

INTRODUCERE iN BIOFIZICA MOLECULARA ~I CITOTISULARA

kill

k_t

-1 k+l

k+2

(11)

- k+l S[Eo - [ES]+ k_l [ES]+ 'Y = 0 k+l SEo - [Eslk_1

Astfel ca se poate scrie: (8)

+ k+2 + k+l S)= 0

S=
De aici se pot determina valorile de echilibru ale concentratiilor de complex enzima-substrat ~i respectiv substrat. ' Din prima ecuatie rezulta valoarea de echilibru pentru concentratia de complex enzima-substrat:

1{+2Eo

'Ykm

-'Y

(12)

k+lEoS E S :::::-__;__:___;_---= k_l +k+2 +k+1S

Inlocuind prima relatie In cea de-a doua rezulta si expresia de echilibru a lui [ES] : (9) (13)

.tjpoi~e obtine concentratia de echilibru a substratului:

(10)

. Se introduce km:

variabile adimensionale se definesc astfel:

82

83

R. M. ISAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE iN BlOFIZICA MOLECULARA $1 CITOTISULARA

ES ES S
S In apropierea starii .stabile aeeste variabile adimensionale catre valoarea

(14) (19) tind

unitara, .iar noul sistem se poate serie sub Pentru generalizare se introdue notatiile:

urmatoarea forma, eare seoate in evidenta noile variabile:

(15) (16)

==a=-k+2
ES

Eo

Eo

(20)

adica:

Prima ecuatie din sistem se transforma astfel ea sa se puna in evidenta atat noire variabile eat si parametrul km
:

.'

(l7)

~i deei:

Inloeuind expresia lui avem: (18)

S si

folosind notatiile introduse mai sus

dX1=_!_[ax2 -Xl(W'f-r]+X2] =_!_[ax2-Xl (a-l+~2)]


dt

Tl

84

'Y

Tl

(22)

85

R.M.ISAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE iN BIOFIZICAMOLECULARA

1>1 CITOTISULARA

Din ecuatia a doua, procedand In mod analog, se obtine:

astfel ca sistemul de doua ecuatii diferentiale ia forma:

E --

dx) = ax z - x) ( a-I dt'


Xl)

+Xz )
(28)

dx z = _ X 2 (a dt'
Introducand notatia:

+ bx 1 + a - b - 1

b = k -I
k_l

(a -

in practica raportul E este foarte mic, de ordinul lui 10-4. Din 1) (24) prima ecuatie se deduce:

+ k+2

se ajunge la forma:

(29)

I It
';.;,

(25)

(30)

adica:
Se introduce raportul E ~i variabila adimensionala t' :
.,

E=-

Tl t

a= 8
(26)

,,8

as

T2 (27)

8 a-l+= 8

( a-lp+8

K5.

<=> E8J (

[~as."ES

a-lp+8

K5

Eo8

8+kM

(31)

t'=Tz
86

unde s-a introdus notatia kM- constanta lui Michaelis:

87

R.M.ISAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE iN BIOFIZICA MOLEcULAR..\. ~I ClTOTISULARA

(32)

(34)

De unde rezulta si formula Michaelis - Menten:

unde:

avem

egalitate

intre

constanta

lui

Michaelis

~i

concentratia de substrat la echilibru:

[ES]=

S+kM

EoS

(33) (35) ceea ce da si semnificatia constantei Michaelis. Aceasta constanta se dovedeste a fi inversul constantei de echilibru a primei faze a procesului, enzima - substrat, daca cea de formare a ca avem

Reprezentarea grafica sugerata de figura de maijos (Figura 27):

---------------.En..
1

complexului inegalitatea:

se admite

(36)

Figura 27. - Reprezentarea grafica a relatiei cantitative ce descrie procesul enzimatic

deci:

Se observa complex

ca pentru

valoare

a concentratiei

de

kM

enzima - substrat egala cu jumatate

din valoarea

1 - --= ~ k1 k

(37)
+1

initial a a concentratiei de enzima: Pentru determinari experimentale este foarte utila forma inversa a relatiei Michaelis - Menten:
88 89

F. TOPOLlCEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE iN BlOFIZICA MOLECULARA 1;11 ITOTISULARA C

1 [ES
Intr-adevar,

]= ~+

~·S

kM

11

(38)

microorganismelor biotehnologii

- materialuI de

biologic

principal sau

in multe alimente,

fumizoare

medicamente

trasand dreapta cea mai probabila printre

procesele enzimatice sunt adesea mult mai complexe ~i necesita abordari matematice si experimentale multiple.

punctele date perechile de valori S si lES], se poate determina

Eo .din taietura la ordonata ~ikM din panta dreptei;


patrate (Figura 28).

estimare

mai riguroasa este oferita de aplicarea metodei celor mai mici

1 ES

tga. =(1IEo)~
1

Eo

1 S

Figura 28. - Reprezentarea grafica a relatiei Michaelis - Menten In forma


liniara

In celulele esential al

organismului

uman, ca

obiectul
~l

de studiu celulele
91

stiintelor

medicale, 90

in

R.M.ISAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE iN BIOFIZICA MOLECULARA ~I CITOTISULARA

CAPITOLUL 9

H",
C--C

N-H

Acizii nucleici si intcractiunile intermoleculare


Acizii nucleici (localizati in nuc1eul celular) - acidul dezoxiribonuc1eic - ADN si acidul ribonucleic - ARN - sunt biopolimeri direct implicati in procesele de transmitere a
timina

H-C\_I
/N citozina

'\N
C~

Figura 30. Bazele pirimidinice din compozitia acidului nucleic ADN

informatiei genetice caracteristice fiecarei specii.

Din punct de vedere chimic, acizii nucleici sunt molecule polimere constituite din trei componente: acid fosforic, un zaharid (dezoxiriboza -in structura ADN, respectiv riboza - 'in ARN) si haze azotate purinice guanina - Figura 29) ~i pirimidinice respectiv uracil - Figura 30). Elementele structurale de baza (monomerii) ale polimerizate de acizi nucleici sunt moleculelor inalt (adenina ~i (citozina ~i tlmina,

adanina

guanina

nucleotidele. Hotaratoare pentru specificitatea genetica este


Figura 29. - Bazele purinice din compozitia acidului nucleic ADN

ordinea bazelor 'in lantul polinucleotidic. Acidul ribonucleic (ARN) are functia de a d~p()zita informatia genetics. Acesta se caracterizeaza printr-un'singur Ian] de nucleotide ~i are dimensiuni mai mici in compai'~tie'cu
93

92

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE iN BIOFIZICA MOLECULAR..\. ~I CITOTlSULARA

molec~la de ADN. In structura moleculelor de ARN intra tot patru baze azotate, insa in locul timinei din ADN apare baza numita uracil. Ca purtator importanta al informatiei
0

Legdturile de hidrogen se realizeaza numai intre purinica si una pirimidinica.adica exclusiv intre
0

baza

alta
0

citozina si

ereditare,

guanina, respectiv, intre adenina si timina. Imperecherea bazelor complementare prezinta

mult mai mare la scara organismelor (ADN). molecula

vii revine

acidului dezoxiribonucleic La majoritatea

irnportanta nu numai pentru structura intrinseca a ADN, ci ~i in .


de ADN este - ceea ce procesele ereditare, prin faptul

organismelor,

ca favorizeaza replicarea

alcatuita din doua lanturi elicoidale de polinucleotide reprezinta structura primara (Figura 31 si 32).

identica ~i transmiterea informatiei. Ca ~i la ARN, secventa


bazelor reprezinta factoru1 determinant a1 specificitatii genetice aADN.

Aceste lanturi sunt dispuse antiparalel si legate unul de altul, la nivelul bazelor azotate, prin purui de hidrogen ~'i

legaturi disulfurice fiind rasucite in spirala - ceea ce reprezinta structura lor secundara.

Figura 32. - Segment dintr-o molecula ADN in care bazele complementare de pe cele doua lanturi vecine sunt (A - adenina ~i T - timina sau C - citozina ~i G - guanina) unite prin legaturi de hidrogen care pot fi rupte in urma energizarllor cauzate de absorbtia unor radiatii. Pe 0 spira de ADN exista de regula 10 perechi de baze (1. Darnell §i col. 1990)

Ca ~i baze1e azotate din constitutia


Figura 31. - Detaliu structural din molecula d.e acid. d~zoxjribonucJeic. Sun: figurati distinct atomii de fosfor, carbon, oxigen ~l hidrogen (J. Darnell ~l col. 1990)

lor si la fel cu

majoritatea covarsitoare a proteinelor, acizii nucleici absorb in domeniul ultraviolet al radiatiei solare. Expunerea la radiatiile ultraviolete poate produce

reorganizarea legaturilor de hidrogen la fel ca si expunerea la


94
95

R.M.ISAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE iN BIOFIZICA MOLECULARA

1>1 CITOTISULARA

radiatiile ionizante (efectele genetice ale radiatiilor ultraviolete sunt comparabiIe cu cele ale radiatiilor ionizante). Radiobiologia investigate

CAPITOLUL 10
aceste

~i genetic a of era mijloacele adecvate de


de care sunt susceptibile din nucleul celular al eucariotelor sau

a transformarilor

biomolecule complexe

Elemente de bioflzica membranelor celulare


10.1. Structura membranei celulare
Din punet de vedere biochimic principalii constituienti membranari sunt proteinele, lipidele si colesterolul. Cele mai

din plasmidele procariotelor.

importante functii ale proteinelor sunt cele de permeabilizare ~i cele enzimatice. Astfel, unele agregateproteice din membrane

au rol in transportul ionilor si 1~101eculelormici - este verba de proteinele canal, canaleleionice

~i pompele ionice care 'stint

alcatuite din subunitati proteice intrinseci, capabile sa strabata membrana de la 0 fata la cealalta, Alte agregate proteice au rol de receptori membranari pentru diferite tipuri de molecule care nu pot traversa

mesager (hormoni sau neurotransmitatori

membrana). Acestea se gasesc eel mai adesea la fata extema a membranei - sunt proteine extrinseci. Pompele ionice au si functie enzimatica contraian:d)

reactiile biochimice exergonice din care se elibereaza en~~gni) necesara functiilor de transport activ pe care Alte proteineenzimatice 96

Ie

indeplirt~sc9

sunt cele de pe fata internlJ


97

R.l\1.JSAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

m.;~b;;~i au rol efector care


dipoli electrici semnificativi,

INTRODUCERE iN BIOFIZICA MOLECULARA ~I CITOTlSULARA

in raport cu informatia reeeptata

---

de la moleculele me sager captate la fata externa a membranei. Din punct de vedere electric, proteinele sunt adesea

cu atilt mai mult cu cat au

molecula mai alungita ~i de dimensiuni mai mario Proteinele care includ in constitutia lor restifri de molecule glucidice sau lipidice sunt cunoscute sub denumirea de glicoproteine ~i

lipoproteine. Reamintim ca lipidele sunt macromolecule formate colesterol proteina extrinsec-a

dintr-un "cap polar // ~i doua lanturi de acizi grasi, saturati sau nesaturati, care nu sunt polare,. nu au caracterul dipolilor

electrici. In constitutia biomembranelor,

lipidele apar eel mai


Figura 33. - Model structural al membranelor fluid" (dupa J. Darnell) reprezentabile prin "mozaicul

frecvent sub forma unui dublu strat lipidic, dar pot fi prezente ~i sub .forma unor micele sau agregate lipoproteice. Bistratul

lipidic este eel mai raspandit, facand parte din constitutia unui tip. de membrana de larg consens reprezentat prin mode lui

In modelul mozaicului fluid proteinele sunt in proportie de circa 50% din masa total a a membranei ~i sunt inserate 'in dublul strat lipidic, fie sub forma de proteine intrinseci - care strabat membrana de la
0

mozaicului fluid (propus de Singer ~i Nicholson - Figura 33).


Capetele polare ale lipidelor din bistrat sunt orientate spre mediile apoase, polare din exteriorul

~i respectiv interiorul
hidrofobe care sunt

fata la cealalta, fie sub forma de

celulei, in timp ce lanturile nepolare sunt orientate unul spre celalalt, interactionand prin legaturile

proteine extrinseci, care sunt inserate 'in bistratul lipidic numai la nivelul fetei externe sau numai la nivelul fetei interne ale membranei.

principalele tipuri de interactiuni ce asigura stabilitatea acestor structuri. 98

,
99

R. M. ISAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA.

INTRODUCERE IN BIOFIZICA MOLECULARA. $1 CITOTISULARA

- de exemplu hormoni steroizi). In tabelele de mai jos (Tabelele 7 ~i 8) sunt redate continuturile 'in proteine si lipide precum si cateva valori ale unor parametri fizici ai membranelor naturale ~i ai membranelor artificiale bilipidice, asa cum au fost

sintetizati de V. Vasilescu si col. (1977).


Tabelul 7. - Parametrii col. 1977)
I H
+

fizici ai unor biomembrane

(dupa V. Vasilescu ~i

I... I

-' •

I I H,O

I
~I

Membrane

Parametrul
Figura 34. - Membrana cloroplastelor este bogata In proteine enzimatice fiind reprezentata prin modele de subunitatilor structurale (dupa W. Hope ~i col. 1983).

Membrane

naturale

artiflelale bilipidice
60-90 103_109 0,3-1,3
:"

In cazul. altor tipuri de membrane, mai putin raspandite in randul celulelor eucariote, proteinele sunt prezente in

proportie de peste 70% in membrana si sunt structurate conform unor modele bazate pe subunitatile lipoproteice - modele bazate pe subunitiiti lipoproteice sau pe micele de lipide, bistratul

Grosime (A) Rezistenta electrica(O/cm) Capacitate electrica (IlF/cm2) Potential electric de repaus (mV) Indice de refractie Tensiune superficiala (erg/ern') Permeabilitate pentru apa (10-4 cm/s)

40-130

102_105
0,5-1,3 10-88 1,55 0,03-3,0

0-140 1,37 0,2-2,4

lipidic ne mai fiind singura forma de organizare a lipidelor (Figurile 34 ~i 35). Spre deosebire de proteinele care au rol in permeabilizarea membranei, principala functie a lipidelor este

..

cea de bariera de permeabilitate pentru majoritatea tipurilor de ioni ~i molecule implicate in functiile metabolice celulare (cu exceptia unor molecule liposolubile care pot strabate membrana
100

25-28

2,3-24

101

R.M.ISAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA al unor blomembrane (dupa

INTRODUCERE iN BlOFIZICA MOLECULAR/\. ~I CIJOTI8,llliRA

Tabelul 8. Contlnutul de lipide ~i proteine V. Vasilescu ~icol. 1975)

10.2. Proteine canal ~i canale ionice Proteine


(%)

Membrana

Lipide «<Yo)

Transportul biomembrane

moleculelor

mici

si

al

ionilor

pnn

Eritroeit Cloroplast Membrana externa a mitoeondriei Teaea neuronal Bastonas retinian Strueturile membranare proteine sunt intalnite pe de mielina a axonului

60-80 45 55 20

20-40 <55 <45 <80

este efectuat la nivelul proteinelor

canal si al

canalelor ionice. Proteinele pori membranari canal traverseaza membrane le ~i formeaza transversale relativ

- canale de dimensiuni

mari ~i relativ neselectivi - mai ales la nivelul membranelor baeteriilor, mitocondriilor si cloroplastelor.

40-60

20-40

In membranele vegetale sunt prezenti

plasmatice

ale celulelor

animale

~l

eu eel mai mare continut de de


0

"pori" de mare

selectivitate

si de

parte

la

membranele

dimensiuni relativ mici - canale le ionice. Trecerea ionilor prin canale Ie ionice se efectueaza electrochimic, cuplate la nici
0

microorganismelor

si pe de alta parte la celulele eucariote in

nurnai in sensul gradientului complexe proteice nu sunt

membrana interna a mitocondriei (cu ro1 esential in fosforilarea oxidativa). Colesterolul steroizilor, prezenta este
0

deoarece

aceste

sursa de energie (transport pasiv).

molecula

mal mica,

din clasa

Spre deosebire de proteinele canal, canalele ionice nu sunt deschise tot timpul, ci deschiderea lor este activata in

in doar cateva procente

In constitutia

membranelor ,dar avand un rol bine determinat In eontrolarea fluiditatii si, complementar, colesterolului este deosebit a rigiditatii membranei. de importanta pentru Prezenta relativa

anumite conditii, Principalele tip uri de perturbatii de la nivelul membrane lor celulare care sunt capabile sa declanseze

activarea canale lor ionice sunt variatiile de potential electric, stimularea mecanica si legarea unei molecule semnal. Exista asadar, canale ionice dependcnte de voltaj, canale ionice controlate mecanic si canale
103

stabilitate a formei membranei ~i implicit a formei ansamblului perete celular - membrana - citoschclet.
102

ionice

controlate

de ligand.

R. M. ISAC

E. TOPOLICEANll
0

D. E. CREANGA

INTRODllCERE iN BlOFIZICA MOLECULARA ~I CITOTISULARA

Acestea din urma pot fi controlate de

molecula semnal din de un ligand din de


0

canale de c/or voltaj dependente; canale cation ice de acetilcolina;


Canalele de potasiu (Figura 35) sunt direct implicate in electrogeneza potentialului de mmbrana ~i de actiune

exteriorul celulei - un neurotransmitator, interiorul celulei - un mediator intracelular, (cAMP sau cGMP) sau de Importante electrogenetica date
0

nucleotida

proteina reglatoare de tip G. dinamica functionala


~1

privind

controland, trecerea libera a ionilor de potasiu prin membrana. Deoarece concentratia potasiului in interior este mai mare decat in exterior, are loc gradientului
0

a canale lor ionice au fost furnizate

datorita

cercetarilor moderne privind microelcctrofiziologia celulare prin tehnica de "patch clamp". De reprezentative altfel, celulele excitabile

membranei

difuzie masiva a potasiului sub actiunea de la interior spre exteriorul

de concentratie

animale,

sunt

celulei. In prezenta efectului Donnan, prin aceasta deplasare, are loc un dezechilibru la nivelul sarcinilor electrice negative ale nedifuzibili, existenti in interiorul

pentru varietatea

de canale ionice identificate

acestea fiind semnalate ~i in regnul vegetal (cu rol de exmeplu in mobilitatea stimulata a frunzelor mimozei), sau in lumea

ionilor macromoleculari, celulei.

microorganismelor

( cu rol in locomotie la Paramaecium sp.) ..

Ionii de sodiu contribuie partial la echilibrul electric al 10.2.1. Tlpuri de canale ionice interiorului celulei, dar concentratia lor in mediul intracelular este mentinuta la nivel scazut print - un transport activ generat Actualmente se cunosc peste cincizeci de tipuri de sub actiunea pompei de Na+ - K+. Pentru mentinerea echilibrului electric
~l

canale ionice, dintre care mentionam

doar cateva tipuri:

respectiv

aI

canale rapide de sodiu; canale lente de sodiu si calciu; canale de calciu voltaj dependente; canale lente pentru potasiu, voltaj dependente; canale lente pentru potasiu - calciu dependente;
104

potentialului

membranar,
0

al celulei

neexcitate

(in absenta

oricaror stimuli externi),

parte din ionii de potasiu din mediul

extracelular sunt atrasi inapoi prin aceleasi canale de potasiu de fortele electrice care apar datorita efectului Donnan.

105

'R. M.ISAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE

iN

BIOFIZiCA MOUCCULARA ~I CITOTISULARA


canal lottie de

Canalele ion ice voltaj dependente - joaca un rol esential in generarea potentialelor de actiune ale celulelor excitabile , in prezenta unor stimuli specifici ca depolarizanti membranari. Depolarizarea micsorarea potentialului membranara atrage dupa sine prin unor canale

membranar, deschiderea

de sodiu sensibile la voltaj (Figura 36). Pe durata de timp cat raman deschise,
0

legarea acetilcollnel duce In acllvarea subunlliltll a. a

mica cantitate

de sodiu intra in celula datorita unui gradient de concentratie membranar, accentuand depolarizarea, pana cand variatia

gradientului electric, contracareaza gradientulde Aceste canale sunt prevazute cuun

concentratie.

mecanism automat
0
de srhlderea canalulnl

de inactivare, determinand blocarea influxului de sodiu pentru scurta perioada si reechilibrarea potentialului electric.

Ionic de potaslu
K'

Activarea acestor canale, in maniera "totul sau nimic" a fost semnalata prin dezvoltarii tehnicilor de investigatie de tip patch-clamp. Aceasta permite
0

ca

mica

portiune

din unuia

membrana, reductibila pana la sau catorva canale ionice

zona corespunzatoare

sa fie "captata" de deschiderea unei


Figura 35, - Deschiderea unui canal de potasiu sub controlul acetilcolinei. GTP-ul comanda deschiderea

micropipete aplicata pe membrana.

Subunitatea G, inactiva - purtatoare a G Dl--ului este activata de acetilcolina


~i leaga GTP-ul. Subunitatea G"ll preluand canaJuiui (J. Darnell ~i col. 1990).

106

107

R.M.ISAC

F. TOPOLlCEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE IN BIOFIZICA MOLECULAKA $1 CITOTISULARA

.... r

S-a constatat

ca numarul canalelor de sodiu deschise membranara, iar

Densitatea relativ mica a canalelor este compensata , tnsa de conductanta relativ mare prin parcurgerea unui canal de 8.000 de ioni pe milisecunda (ms).

variaza in funetie de gradul de depolarizare

gradul de deschidere al unui canal nu prevede faze tranzitorii. In celulele musculare, pe un micron patrat de sarcolema au fost deja identificate cateva sute de canale , ceea ce

Canalele cationice controlate de acetilcolina


destinate transductiei semnalelor chimice extracelulare, semnale electrice intracelulare, dintre celulele nervoase

sunt in

inseamna ca un fosfolipidice.
tetrodoxlna poate bloca canalele de sodIu

canal revine la circa 10.000 de molecule

la nivelul sinapselor chimice controlate de acestea,

si celulele

prevazute cu receptori specifici acestui neurotransmitator. Receptorii colinergici sunt glicoproteine pentamerice,

compuse din cate cinci subunitati relativ insensibile la variatii de


este sensibUa la voltaj

potential

membranar. variatii

Asemenea

agregate

proteice

receptoare

determina

de permeabilitate

mernbranara

Na+

pentru sodiu, potasiu si calciu, care cauzeaza ulterior variatii de potential electric de membrana. Contributia transmembranar unuia sau altuia dintre cationi la fluxul depinde de gradientul
"

de concentratie

al

fiecaruia si de gradientul

electric. transmembranar.

Influxul

semnificativ de sodiu este in general, eel mai remarcabil indiciu al activarii acestor canale (circa 30.000 ioni pe milisecunda pot parcurge fiecare canal activat).
Figura 36. - Canal ionic de sodiu sensibil la voltaj (W. Hope ~icol. 1983).

Daca celula inervata este celula musculara striata sau neteda, atunci influxul masiv de sodiu determina electric a care reprezinta
0

depolarizare al cuplului

si semnalul declansator
109

108

R.M.ISAC

F. TOPOLlCEANU

D. Eo CREANCA.

INTRODUCERE iN BIOFIZICA MOLECULARA. 1>1 CITOTISULARA

excitatie contractie (M. Isac si R. M. Isac 1985; F. Topoliceanu si I. Haulica 1989; M. Isac si R. M. Isac 1990; M. Isac si R. M. Isac 1991; M. Isac ~i R. M. Isac 1994). Ca si canalele de sodiu voltaj dependente, controlate de acetilcolina, raman deschisc pe
0

care desi, nu este parte constituents

a canalu1ui

ionic, prin intermediul unei proteine G, poate realiza controlul deschiderii acestui canal. In acest caz, se poate spune ca cele

canalele

mai variate tipuri de canale se intalnesc in cazul ionilor de potasiu. Unul dintre canalele ionice eel mai mult studiate este eel de calciu (Figurile 37 ~i 38 ) de la nivelu1 rezervelor

perioada de timp

relativ scurta, in decursul careia molecula semnal cuplata la zona receptoare de 1a fata externa a membranei postsinaptice este degradata (hidrolizata),

citoplasmatice atasate reticulului endoplasmic (cu rol deosebit de important in contractia fibrelor musculare).

Figura 37. - Imagini obtinute ia microscopul electronic pentru cateva agregate proteice eu functie de c~nale ionic,e de caici.u extr~se din melll~rana depozitelor intracelulare de calciu de la nivelul reticulului endoplasmic (J, Darnell ~i col. 1990)

Figura 38. - Agregatui proteic care asigura eliberarea ionilor de calciu din depozitele citopiasmatice In citoplasma (J. Darnell ~i col. 1990)

In Figura 35 este redata functionarea unui c~nal ionic de potasiu, activat de acetilcolina,
110

Imaginea tridimensional datele microscopiei

(Figura 38), reconstruita din arata ca agregatul proteic

cuplata

1a un

receptor

electronice
III

R.M.ISAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE IN BIOFIZICA MOLECULARA ~I CITOTISULi\RA.:."


1#

1'1

l...

.•. ,

if:

corespunzator

este format din patru subunitati identice fiecare

Macrotransportul poate fi efectuat direct sau prin

ell cate un canal pentru ioni de calciu.


,

intermediul veziculelor, sub forma de: endocitoza, exocitozast

transcitoza.
In endocitoza are loc
0

lO.3.Permeabilitatea ~i transportul transmembranar


Proprietatea biomembranelor de permeabilitate selectiva a Mg+2,

intrare in celula a particulelor de in timp ce in exocitozd iar in transcitoza sunt

substanta, virusuri si macromolecule, din contra acestea ies din celula, pentru ioni mici (Na+, K+, Ca+2,

cr,
la

transportate spre celula particule de substanta si macromolecule pentru ca, iar dupa
0

etc.) ajuta la explicarea a numeroase fenomene de importanta vitala pentru aetivitatea celulara: transportul nivelul

serie de transformari metabolice din celula

sunt transferate, atat macromolecule cat ~i particule.

epiteliilor, bioelectrogeneza vizuale, etc., comunicarea

din celulele nervoase, musculare, intercelulara prin intermediul

neurotransmitatorilor

si hormonilor, transductia senzoriala, etc.

Odata cu rolul de conturare §i delimitare morfologica a structurilor celulare, membrana celulara constituie
0

veritabila

bariera de control selectiv a schimburilor de substanta , energie si informatie.ff'igura 39) care sunt modulate prin interventia membranar (F.

unor fenomene de micro - si macrotransfer

Topoliceanu ~i col. 1974; F. Topoliceanu §i col. 1991). Principalele tipuri de transport prin membrane sunt: ~i
Figura 39. ._ Model membranar bazat pe domenii de proteine enzimatice lncastrate in bistratullipidic rigid. (W. Hope ~icol. 1983)

macrotransportul

(transport de particule si macromolecule)

microtransportul (molecule mici §i ioni).

112

113

F. TOPOLICEANU
',n,"'""eo/' •

D. E. CREANGA INTRODUCERE iN BlOFIZICA MOLECULARA

Microtransportul

in raport cu implicarea unor surse

~r CITOTISULARA la cealana

energice sau absenta lor, in realizarea transferului de substanta, acesta poate fi: a.- transport activ care este efectuat prin intermediul pompelor ionice '~i care necesita un cuplaj energetic
0

eonsum energetic membranara.

direct),

11 elibereaza

fata

--

10.4. Transportu}

pasiv

cu

10. 4. 1. Dijuzia simp/a

procesele exergonice de la care se preia si se consuma din energia stocata in moleculele de tipul

parte ATP etc. Se considera (Figura 40) care semipermeabila un ansamblu comuniea (permeabiIa intre de doua compartimente ele printr-o speeia membrana moleculara A ~i eu

(adenozintrifosfat),

NADH (nicotinanidadenindinucleotid),

b.- transport pasiv este realizat

tara

eonsum de energie

metabolica, prin intermediul eanalelor ionice. Transportul

pentru

activ poate fi realizat la randul sau sub

eonsiderata) de grosime x, eu suprafata transversala coeficientul considerata). de difuzie D (pentru speeia

forma de transport activ primar, transport activ secundar ~i

moleeulara

translocatie de grup (transportul unei molecule este insotit ~i de


o modificare). Transportu/ pasiv se desfasoara sub doua forme: a. - difuzie simp/a prin care in prezenta unor gradiente chimice (de concentratie) potential .electric), sau electrochimice se realizeaza (de concentratie unor si de

Cantitatea din substanta difuzibila S aflata la momentul t in cele doua eompartimente


Q2(t) iar concentrafiile

se noteaza cu QI(t) ~i respeetiv se noteaza cu CI(t) si

corespunzatoare

respectiv C2(t), astfel ca:

circulatia

ioni sau

molecule mici, cum sunt cele de apa, uree, glucoza, etc. b.- difuzie facilitata este efectuata prin intermediul unor

cl(t)= Qt(t\c2(t)=
Q1 (t)+ VI Q2 (t)= Q

Q2(t)
V2
(39)

= const,

proteine transportoare care cupleaza solvitul la una din fetele membranei si, prin modificari conformationale (in absenta unui

114 . 115

R.M.ISAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERe iN BlOFIZICA MOLECU.LARA st CITOTISULARA

(41)

astfel ca relatia (41) devine:


Ql(t)+~(t)=Q=const.

(42)
Figura 40. - Sistem bicompartimentat transversals A eu membrana de grosime D si sectiune

Aceasta ecuatie diferentiala de ordinul intai are ca necunoscuta pe Ql(t), deci:

Circulatia substantei difuzibile intre cele doua c,ompartimente se realizeaza

in sensul

gradientului va

chimic deci, daca CI(t) > dinspre primul

C2(t), . atunci

membrana

fi strabatuta

compartiment inspre al doilea. Conform legilor difuziei: .

_ dQt (t) = [KQI (tXKI+K2)~KK'2] dt


S-au facut notatiile:

(43)

..
(44)

(40)

Dupa separarea variabilelor si introducerea noilor constante K12


unde Kml si Km2 sunt coeficienti de partitie (rapoartele de

~iK' 2:

distributie) ai substantei S intre membrana ~i cate unul din cele doua compartimente.
Se noteaza:
116 117

(45)

R. M;ISAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

se obtine:

(46)

(50)

ceea ce, prm integrare (cu conditia initiala Ql(O)=QI(t=O»


conduce la:

observa ca:

(51)

e-Kl2t = K"2-Kt2Q)
K"2-K12QI

(t) (0)

(47)

Astfel se obtine:

De aici se deduce expresia de variatie in timp a lui Qt(t): ceea Ql(t)=[QI(O). K'2 ]e-Kut + K'2 Kl +K2 K, +K2 (48) gradientului ee reprezinta, din de

scaderea
primul

exponentiald .in timp


(sub

eompartiment

aetiunea

Prin impartire cu V I se obtine expresia de variatie in timp a eoncentratiei substantei S in primul eompartiment:

concentratie)

dependent de grosimea=si
de cantitatea .totala de

supra/ala transversale a membranei,

substanta difuzibila din cele doua eompartimente si de valoarea

concentratiei
(49)

de echilibru (dupa Un timp

suficient

de

indelungat) din eompartimentul considerat. Astfel s-ar desfasura, de exemplu, procesul de difuzie al

unde s-a notat eu V*:


118

moleculelor de apa prin "porii aposi" ai biomembranelor


119

in

R.M.ISAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE iN BlOFIZICA MOLECULARA $1 CITOTISULARA

cadrul modelului prezentat. In cazul ionilor trebuie luat in considerare corespunzator.


10.4.2. Difuzia facilitata

~i

gradientul

electric

transmembranar

substantei urmarite. Desi, la fel ca ~i relatia enzima - substrat, relatia substanta »>: difuzata proteina transportoare se caracterizeaza printr-o anume specificitate.
•. molecula transportata

j[

Ca ~i in cazul difuziei simple, difuzia facilitata prin biomembrane a unor substante se produce sub actiunea gradientului electrochimic disparand odata cu anularea acestuia. Spre deosebire de difuzia simpla, efectuata prin intermediul canalelor ionice ~i porilor moleculari, difuzia facilitata, efectuata prin intermediul proteinelor transportoare (carrier), poate sa se produca cu cea corespunzatoare
0
proteina transportoare (permeaza)

viteza mult mai mare dedit sau liposolubilitatii

Figura 4l. - Proteinele

transportoare

(permeaze)

(dupa J. Darnell ~i col.

dimensiunilor

1990)

moleculelor respective, viteza care atinge 0 valoare de saturatie la cresterea gradientului de concentratie ~i poate fi afectata de prezenta unor substante cu structuri analoge substantei difuzate. Din aceste puncte de vedere acest fenomen de microtransport prezinta asemanari cu procesele enzimatice, a carer viteza atinge
0

Proteina transportoare, desi nu se cupleaza in mod direct eu procese biochimice exergoniee, este capabila sa efectueze miscari complexe prin care substanta difuzanta este captata la una din fetele membranei, apoi este transportata (Figura 41) la fata opusa (proteina transportoare fiind de tip intrinsec, adica strabatdnd membrana de la 0 fata la alta) unde este eliberata, Unii autori includ in acest tip de microtransport si permeabilitatea de tip ionoforetic (Figura 42) prin care ionoforii
121

limita de saturatie ~i care sunt, in acelasi

timp, procese de competitivitate - competitia dintre doua substante cu structuri asemanatoare fiind de natura sa inhibe participarea la procesul de transport (sau enzimatic) a
120

F. TOPOLlCEANU

D. E. CREANGA

INTHODUClmE

iN BIOFIZICA

MOLECULARA

~I CITOTISULARA

(molecule cu structura peptidica sau nu, de exemplu nistatina, amfotericina, valinomicina, etc.) prezenti In membrana

unde:

este viteza de difuzie, egalii cu valoarea

c este concentratia, concentratiei

kM estc

constanta

care reduce

la

efectueaza transpotul unor ioni mici.

jurnatate vitcza maxima de difuzie.

v
500

V max

---------

--------

250 . - - - <E--- 1/2 V


J •

Ina:>.:

I J

difuzia simpla

3 KM

9 10

12 13 14

concentTa~a (1\11\1)

Figura 42.- Valinomicina

realizeaza

transportul

ionoforic

al ionului de 43. - Comparatie grafica intre difuzia sirnpla ~i difuzia facilitata

potasiu prin biomembrane (dupa J. Darnell 1990)

In Figura 43 este redata

comparatie intre cele dona

In forma inversata, teat in experimente,

relatia este deosebit de usor de conduce Ia


0

tipuri de difuzie. Relatia matematica ce se poate scrie pentru procesele de difuzie facilitata este de forma:

deoarece

dependentg

ce se stabile~le prin metoda celor mai mici patratc ;;i ite calcularea parametilor
Vmax

si

ki\'1

din panta si taietura la

V ()C

CV max =-~=-

kM

+C
122

(53)

a dreptei (Figura 44) celei mai probabile:

123

R. M. ISAC

F. TOPOLICEANU

INTRODUCERE IN BlOFIZJCA MOLECULAR~ D. E. CREANGA

SI CITOTISULARA

1 --=

kM

vee)

v maxC

+-V max

10.5. Transportul activ (54) Un astfel de transfer de masa de tip microtransfer se efectueaza impotriva gradientului electrochimic si se realizeaza pe baza energiei eliberate intr-o reactie exergonica, eel mai frecvent fiind yorba de hidroliza legaturilor fosfat, acumulatoare de energie, din molecula de ATP.
10.5.1. Tipuri de transport activ
1 ~_

1
V

vmu~ 1

• Transportul
Figura 44. - Relatia ce descrie difuzia facilitata poate fi adusa la forma lineara, convenabila masuratorilor practice, prin inversarea relatiei dintre viteza ~iconcentratie

activ primar

implica deplasarea prin

membrana a unor ioni mici care beneficiaza in mod direct de energia eliberata in reactia ATP-ADP;
• Transportul activ secundar

(Figura 45) asigura

Prin difuzie

facilitata

se explica transportul

prin

deplasarea unor ioni mici care beneficiaza de modificarea de gradient electrochimic cauzata de transportul activ primar al altor tipuri de ioni mici. Dupa cum ionii care se transporta pe baza energiei eliberate de hidroliza ATP-ului circula in acelasi sens sau in sens opus transportului activ primar, transportul activ secundar poate fi de tip sinport si respectiv antiport. Tot
grup,
0

membrana eritrocitara, a anionilor moleculari· de uree, glicerol si alti neelectroliti, transportul prin membrana musculara si epiteliul intestinal al glucozei si aminoacizilor, transportul glucidelor prin membranele microorganismelor.

forma de transport activ este si translocatia de molecule deplasata prin


125

prin care structura unei

124

R.M.

ISAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE

IN BIOFIZICA

MOLECULARA

1>1 CITOTISULARA

membrana este modificata la nivelul unui grup de constituenti de atorni.


10.5.2. Pompele ionice

Energia utilizata In transportul activ este eliberata ca urmare a activarii unei enzime, ATP - aza mernbranara, care
membrana

face parte din structura "pompelor ionice" de Na+, K+, Ca+2, etc., numite ~iATP - aze de Na+, K+, Ca+2,etc.
simpnrt
antiport

Pompele

ioruce

sunt

denumite

astfel

deoarece

transport aetiv secundar'

"pornpeaza" ionii in sens invers gradientului electrochimic in mod similar unei pompe care actioneaza pentru deplasarea unui . fluid impotriva gradientului de presiune. Ele sunt agregate proteice, formate din mai multe subunitati structurale care determina deplasarea ioniIor in sens invers difuziei pasive.
"ATP - aza de Na + si

Figura 45. - Transportul activ secundar poate fi sinport sau antiport (dupa J. Darnell ~i col. 1990)

oligo:zrul.arillt'.

K prezenta (Figura 46) in

membrana plasmatica (plasmalema) la majoritatea celulelor


sit situ.suri e nttllitic l'uut:. s-u A'1.'l?'
fj!

:I_su~'i.

IJBnt:ru.
C,,"::I

animale, asigura un eflux activ de sodiu si un influx activ de potasiu care pot contrabalansa influxul pasiv de sodiu si respectiv efluxul pasiv de potasiu (Figura 47), prin mobilizarea a circa 30% din ATP - ul destinat proceselor metabolice dintrun organism animal aflat in repaus. Aceasta deoarece concentratia de sodiu ionic este mai mare in interiorul celulei

ll'lare a :o;udiuI. ....i

3 Nu'+

Figura 46. - Structura ~i rolul pornpci de sodiu ~i potasiu (dupa J. Darnell $1 col. 1990)

dedit In exterior in timp ce concentratia de potasiu este mal mare In interiorul celulei dedit In mediul extracelular.
127

126

R. M.ISAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

...INTRODUCERE iN BIOFIZICA MOLECULARA ~I CITOTISULARA

Raportul dintre numarul de ioni de sodiu ~i eel de

potasiu, antrenati de pompa de Na+- K+ (pompa ionica de sodiu


si potasiu) este de 3/2. Pompa este blocata de ouabaina (F. Topoliceanu ~i 1. Haulica 1965; F. Topoliceanu ~i I. Haulica 1972; F. Topoliceanu si 1. Haulidi 1975).

... ubunitatea a - ~i a unei subunitati glicoproteice, cu situsuri de s de sodiu la fata externa a membranei Ca+2 este bine reprezentata in

• ATP

- aza

de

membranele reticulului sarcoplasmic (reticulul endoplasmic din celulele musculare) - ionii de calciu avand un rol important in bioelectrogeneza celulei musculare.
aflux activ de exteriorul celulei • ATP - aza de

IT

si

K!

este prezenta mai ales in

plasmalema celulelor din mucoasa gastrica asigurandu-se un eflux activ de protoni si un influx activ de ioni de potasiu. Un caz mai aparte il reprezinta pompa de pro/ani din membranele citoplasmatice ale procariotelor ~i in membrana interna a mitocondriilor, care asigura realizarea efluxului de
interiorul celulei [K+]
ext

< [K+] .

mt

protoni

simultan
0

cu

catalizarea

fosforilarii

ADP-ului,

reprezentand deci

ATP - sintetaza, conform mecanismului

propus de Mitchel (Benga 1976). Energia provine din procesele


Figura 47. - Transportul pasiv ~i transportu! activ printr-o biomembrana

redox localizate in aceste tipuri de membrane ~i pe baza ei se deplaseaza protonii ~i se fosforileaza ADP-ul.
• Pompa de protoni bacteriana,

La celulele renale s-au identificat cele mai multe astfel de pompe ionice precizandu-ll-se si structura tetramerica (data de asocierea unei subunitati cu proprietati enzimatice, cu situsuri de legare a ionilor de sodiu la fata interna a membranei
128

este mai putin bacteriei

raspandita
Halobacterium

fiind

localizata

in

membrana

halobium

care utilizeaza energia luminoasa,

129

R·M·ISAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE

iN BIOFIZICA MOLECULARA SI CITOTISULARA

pnn

. mterme di 1 un e 1 1U

proteine

de

membrana

numita

kl si k2 fiind constantele de viteza (rnasurate in S-I) iar [Na], si

bacteriorodopsina.

[Na], fiind concentratiile interiorul celulei.

ionice

in exteriorul

si respectiv

10.6. Ecuatii diferentiale pentru descrierea cantitativa a bilantului transportului activ ~i pasiv
Se considera, pentru exernplificare, cazul ionilor de din mediul

Desigur ca exists relatia: kl>k2 dupa cum ~i k3>kt in cazul transportului activ, modelat fenomenologic ~i cantitativ dupa cum se poate vedea mai jos. Actiunea transportoare a pompei de Na+ (Figura 48)este redata prin cuplarea reversibila a acestui agregat proteic cu ionii de Na + (constantele de viteza fiind k3 ~i ka) si cedarea acestor ioni la fata externa a membranei (constanta de viteza fiind ks). In relatiile matematice care urmeaza se presupune ca ionul ~i transportorul proteic formeaza un complex, notat. Deci procesele care conduc la transportul activ se pot reprezenta schematic astfel:

sodiu, la care se urmareste variatia concentratiei

intracelular (din citoplasma). Viteza de variatie a concentratiei intracelulare are doua componente, cea pas iva ~i cea activa:
If

d[Nal = d[Na]P
dt dt

d[Nafi
dt

(55)

Pentru explicarea fiecarei componente se are in vedere faptul ca proeesele de intruzie, respectiv extruzie a ionilor cat ~i

prezinta 'Un caracter partial stocastic, amt difuziapasiva

transportul activ fiind, fiecare din ele, rezultanta unor intrari ~i iesiri In ~i din celula, Astfel, transportul pasiv transmembranar , poate fi descris prin ecuatia: Ecuatiile diferentiale corespunzatore sunt de forma:

(57)

130

131

R. M. ISAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE iN BIOFIZICA MOLECULARA $1 CITOTISULARA

d[NaJ. =-k3[TINa]i +k4[TNa]


dt Sistemul de ecuatii diferentiale ce urmeaza a se rezolva are forma:

d[:~a]=k3[TINal-ks[TNa]-k4[TNa]

De aici si.din ecuatia diferentiala a transportului pasiv se vede ca:

dx = k.z - kzx - k3x[T]+ k4y


dt (63)

dy = k3x[T]- (k4 + ks )y
dt

d[Nal =k1[Nal-kz[Na]i
dt Notam:

-k3[Nal[T]-k4[TNa]
Folosind ecuatia (62), variabila
Z

se inlocuieste si se pot face

[Naj=x, [TNa]=y, [Na]e=z


C1

=kt +k2 +k3[T]


(64)

si, la momentul initial, t=O, avem:

c2 = k, c3=k4-k1
C4

= k, +ks

X(O)=Xo, y(O)=Yo, z(O)=zo,


adica, tot sodiul ionic este prezent doar la interiorul celulei. Se poate considera, in baza conservarii cantitatii totale de sodiu, ipoteza unor volume egale, ca;

Cs

=k3[T]

Sistemul ia forma:

(65) (
132

133

F. TOPOLICEANU

D. E.CREANGA INTRODUCERE

IN BIOFIZICA

MOLECULARA ~I CITOTISULARA

Pentru rezolvare se procedeaza la diferentierea ambelor ecuatii in raport eu timpul:


canal

d2y
dt2

=-c4ill+csill

dy

dx

(66)

interioruI celulei pompa Innica de sndiu

exterioruI celulei

Din sistemele (65) si (66) se obtin ecuatii eu cate variabila:

singura

Figura 48. - Reprezentarea modelului bilantului transportului membrane biologice (dupa F. Gremy si J. Perrin 1975)

pasiv ~i activ

Cautam solutiile de forma:

X=X1

+x2

= AIC-IXt
at

+ B1c-IH +C +B2e~t

Se trece la ecuatiile earaeteristice On variabila r, de exemplu) ale carer solutii rl'=rl=a, r2'=r2=~ sunt de forma:

Y=Yl +Y2 =A2e-

+C

(69)

Din conditia ca aceste sisteme sa verifice sistemul de . propus si din conditiilo initiale se obtin coeficientii de i

134 135

R.M.ISAC

F. TOPOLlCEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE iN BIOFIZICA MOLECULARA 1>1 CITOTISULARA

AI::;

13 13 - a

[x

0_

C 2 C 4 (X 0

A2 =
BI::;

p~a[X. _5~:~:!c;~:)]
1

C1C4 - c3CS

+ YO)]

acestui model matematic in cazul membranei eritrocitare (F. Topoliceanu si co1.1977). Dintre preocuparile cercetatorilor ieseni asupra unor aspecte experimentale ale transportului activ, mentionam cercetarile privind bazele electrochimice ale transportului (70) transepitelial de sodiu (1. Haulica l?iF. Topoliceanu I967;,F. Topoliceanu l?iI. Haulica 1972), sau pe cele bazate pe utilizarea izotopilor radioactivi, (M. Isac l?iS. C. Bumbu 1979).

l3-a
13 -a
C1C4

[_XO+C2C4(XO+YO)]
C1C4-C3CS

B_1 2
C1
C

[• -

X0

C2CS{XO+YO)] + --=~_.:;..-='----';.....;:..-'C1

C4 - C3CS

::; C 2 C 4 (X 0 -

+ YO)
C3CS

2 ::; C 2 C 5 (X 0

+ YO)

10.7. Structurlle membranare semipermeabile ~i percolarea Atat in cazul membranelor celulare cat ~i al structurilor membranare macroscopice porii permeabili pentru molecule

C1C4 - C3CS

Cu aceste expresii ale coeficientilor solutiilor propuse se obtin relatiile ce dau dependentele de constantele de viteza ~i de concentratia de pompe ionice din membrana, ale concentratiilor de ioni de sodiu Ia exteriorul membranei, la interiorul acesteia precum ~iconcentratia de transportori cuplati cu ioni de sodiu. Atilt concentratiile ionice cat si constantele de viteza se: pot determina experimental prin metode bazate pe radioactivi, ceea ce a stat ~i la baza verificarii aplicabilitatii

mid sunt formatiuni caracterizate de sugerand continuitatea


,

geometrie mai degraba pe toata grosimea

neregulata, in primul caz modelele cele mai frecvent utilizate canaliculelor membranei dar ~i instabilitatea lor temporala, iar in al doilea caz, din contra, se admite constanta in timp a retetei de pori dar
f

~i numeroase ramificatii ale acestora intre cele doua fete ale membranei. Traseul apei si al altor molecule mici ~i ioni pnntr-o structura mernbranara macroscopica are, .deci un car~cter'
:":';:':',::+:,.; H",,;

FlY

.r}

136

137

F. TOPOLlCEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE

IN BlOFIZICA

MOLECULARA

SI CITOTISULARA

impredictibil, deoarece nu se poate cunoaste prin care din ramificatiile canaliculare existente se deplaseaza fluxurile de ioni ~i molecule. Ceea ce se semnaleaza cu precizie este starea initiala ~icea finala a fluidului ce se filtreaza, Odata cu dezvoltarea teoriilor modeme referitoare la detenninismul ascuns sub
0

care se efectueaza observarea lor. In cazul retelei de canalicule ce se poatc asocia porilor rarnificati ai unci structuri membranare macroscopice, estimarea caracterului fractal, chiar daca nu ofera posibilitatea unei descrieri matematice cantitative, lasa loc totusi acceptarii unei prcdictibilitati limitate a traseelor disponibile pentru transportul ionilor, apei ~i alter molecule mici. De remarcat ca acelasi earaeter fractal se atribuie si organizarii intime a tesutului pulmonar.

aparenta haotica, fie a comportarii

temporale a unor sisteme complexe, fie a caracteristicilor geometrice ale unor obiecte, s-a dezvoltat ~i eoneeptul de
percolare. Acest concept a fost introdus de matematicianul J.M

Hammersley si inginerul S.R. Broadbend, in legatura eu fenomenul de filtrare a aerului printr-o masca de gaze. Cei doi cercetatori urmareau sa stabileasca in ee conditii
0

astfel de

masca devine inutilizabila prin colmatarea porilor sai, in speta, la ce pr,()centajde pori blocati functia de filtrare nu se mai poate realiza.Ulterior s-a facut analogia cu fenomenul de raspandire a unei epidemii intr-o populatie (de exemplu un parazit intr-o livada) si cu eel de raspandire a focului intr-o padure. In majoritatea cazurilor se urmarea
0

estimare cantitativa a

pragului de realizare a fenomenului in vederea controlarii lui. Semnificativ este faptul ca structurile la nivelul carora se inregistreaza fenomenul de percolare par sa aiba caracteristici geometrice fraetale sau, cum se mai poate spune, sa prezinte aceleasi caracteristici geometrice indiferent de scara
138 139

R.M.lSAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE iN BIOFIZICA MOLECULARA $1 CITOTISULARA

celulare (plasmalema), CAPITOLUL 11

intre cauzele determinante

ale acestei

asimetrii electrice se numarandu-se in primul rand:

concentratiile
doua

diferite de ioni mici de la nivelul celor mai ales a cationilor mici

fete ale membranei,

Biofizica bioelectrogenezei celulare


Prin bioelectrogeneza se intelege fenomenul complex,
0

(Na+,

K+,

Ca2+, Mg2+) aflati atst in mediul extracelular

cat si in mediul intracelular; prezenta anionilor macromoleculari, nedifuzibili, din omniprezent in structurile materiei vii, prin care este generata

mediul intracelular;

diferenta de potential electric, cu rol de asigurare a unei stari electrice caracteristice (potentiale electrice de repaus) sau de

prezenta la exteriorul membrane lor a unor concentr~tii


semnificative sialic care de resturi anionice de molecule de acid apartin terminatiilor glucidice ale unor

modificare a starii electrice de repaus ca urmare a actiunii unor stimuli (potentiale de actiune), Caracterizarea starii electrice a unor celule, tesuturi sau unor parametri electrici de tip

glicoproteine din structura membranei.

organe, impune identificarea

Fata externa ca ~i cea interna a membranei prezinta


0

celulare

capacitiv, disipativ (rezistiv), inductiv si studiul dependentei lor de starea fiziologica precum si de alti parametri fizico-chimici

incarcare

electrica

permanenta,

caracterizata

de

(pl-l, grad de ionizare, etc.).


Un organism viu se comporta ca un conductor de ordinul II (ionic), neomogen si anizotrop, caci distributia volumica de sarcini electrice elementare este neuniforma in timp ~i de-a

potentiale electrice diferite la exteriorul interiorul negative (Vi) celulei. dar inegale In principiu astfel

(V e) si respectiv la sunt

ambele potentiale

ca ~i potentialul

electric; de

membrana, care se mascara de la interior spre exterior, este ~i el, prin conventie, negativ:

lungul directiilor spatiale de referinta, Bioelectrogeneza celulara este determinata in principal


0

de asimetria distributiei ionice de


140

parte ~i de alta a membranei

Ve<O,Vi<O V=Vj-Ve<O
141

R. M. ISAC

F. TOPOLlCEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE iN BIOFIZICA MOLECULARA

sr CITOTISULARA

canalelor caci intre valorile absolute ale potentialelor relatia: V,


~1

~i pompelor
la exteriorul

ionice precum

~i porii membranari.

Vi exista

Existenta dublului strat de sarcini electrice - prin conventie pozitive membranei si negative in interior _ de

datorita caruia exista componenta (72)

eleetrica a gradientului

potential electrochimic, permite analogia cu actiunea unei surse de tensiune electromotoare in circuitul electric echivalent al

In

cazul

celulelor

excitabile

(celulele

musculare,

membranei. Asadar, pentru unitatea de suprafata a membranei, avem un circuit echivalent de forma (Figura 49):

nervoase, vizuale) potentialul

electric de membrana poate sa

varieze foarte mult in timpul actiunii stimulilor specifici, cand apar asa numitele de potentiale repaus care de pot actiune fi variatii ale sau

potentialelor

depolarizari

R
exterio~~ ........__:::___.

hiperpolarizari electrice ale membranei.

11.1.Modele electrice pentru membrana

excitabila

~II •J ·
interior

c
electrice,

Pentru modelarea proprietatilor electrice ale membranei celulare bazate, s-au prop us diferite in principal, variante de circuite
Figura ,49. - ~opriet~tile electrice ale unitatii de suprafata a membranei excitabile (modiflcat dupa F. Gremy ~iJ. Perrin 1975)

pe elemente

capacitive

si elemente

rezistive de circuit. Elementele capacitive reflecta proprietatile de izolator electric conferite de bistratul lipidic In timp ce unde: valoarea capacitiuii este de circa 1 ~/cm2, valoarea

elementele disipative de energie (rezistive) descriu proprietatile de permeabilitate ale membranei pentru ioni, permeabilitate al

rezistentet pe unitatea de lungime este de circa 1000 O:m2 iar


potentialul de repaus al membranei, ~ este cuprins intre

card suport molecular 11constituie agregatele proteice de tipul


142

.50mV ~i - 90 mY.
143

R. M. JSAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE iN BIOFIZICA MOLECULARA $1 CITOTISULARA

In mod similar, proprietatile conductoare de electricitate ale mediului interior precum si ale celui exterior celulei sunt reprezentate schematic prin rezistentele unitatii de lungime, ~i reo
a
rj,

serie de unitat; repetitive

cu proprietati

electrice disipative

(rezistive), capacitive ~i respectiv generatoare de diferenta de potential electric (Figura 50).

11.2. Potentlalul

de difuzie

'.

"

I.

R.

Fluxul, f, de ioni caracterizati de sarcina electrica z si mobilitatea ID, este determinat de gradientul de concentratie potential electric d'Hdx,

Il(

dC/dx

~l

de

gradientul

de

IN.

caracteristice membranei strabatute:


Ie

'.

F
R

qt:

;:!J--jr
~ f

:
I

f=-ID
ATP-82:8 de

dC RT-+zFC-1 ( dx

d'P\ dx )

(73)' .

Na+-K+
I

unde: R este constanta

gazelor perfecte, Teste

temperatura de

absoluta, F este constanta lui Faraday. Pentru potentialul

Figur~ .50".- S~h~me electrice echivalente pentru proprietatile electrice capac~t~ve ~~rez~stJ.ve ale membranei unei celule excitabile ; a - proprletatile cap~cltlve ~I rezistive constante, in aproxlmatia transportului ionic exclusiv ~aslV; b - proprietatile c.apac!tive ~i ~ezistive variabile, In eproximatta ~ndependentel transr0rt~IUl pasl~ de. SOdlU, potasiu ~ialti ioni precum ~i in ipoteza transpertului acnv de sodiu ~I potasiu (F. Gremy ~i J. Perrin 1975)

membrana evaluat teoretic va fi utilizata notatia 'P iar pentru eel real, masurabil experimental, ioni a trecut gradientul notatia V. Odata ce un numar de In altul, se modifica de

dintr-un compartiment
(se reduce)

de concentratie

ca si distributia electric.

Membrana

axonal a a celei mai reprezentative

celule

. sarcina electrica si deci ~i gradientul fluxul se anuleaza si avem:


145

La echilibru

excitabile, celula neuronala, poate fi astfel reprezentata printr-o


144

R. M.ISAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE iN BIOFIZICA MOLECULAR.~ ~I CITOTISULARA

d~ _ RT dC _ -_----_-RT
dx zF'C dx zF'

d(lnC)
dx

(74)

Integrand

intre

doua

puncte

ce limiteaza

grosnnea

Ia

membranei obtinem ecuatia lui Nernst:

(75)
Figura 51. - Sistem eu doua eompartimente, eu concentratiile ionice C1 si C] ~i potentialele eleetriee 'If si 'f5 separate de 0 membrana de grosime / (dupa J. Darnell)

unde: a'¥este

'¥.2-'¥t intre cele doua punete de pe

fat~ ~i de pe

cealalta a membranei. , Daca prin membrana difuzeaza (Figura 51) ~i cationi ~i anioniatunci conditia de echilibru implica anularea fluxului

Daca notam: b = _::__!_ a = zF d~ mRT' RT dx

rezultant al eel or doua fluxuri. Fie I grosimea membranei ~i fie [r(O)], [f(!)], [i+(O»), [t(l)) valorile concentratiilor de anioni '(de exemplu Cl') ~i respectiv cationi (de exemplu Na +) in x=O siin . x=l, sau, pentru un tip oarecare de ioni, fie aceste concentratii [C(O)] ~i [C(!)].

(76)

atunci: pentru dependenta concentratiei de distanta de difuzie se obtine, indiferent de tipul de ioni urmarit:

de (x) + dx

aC (x)=

(77)

rezulta

ecuatie diferentiala neomogena de ordinul intai, care,

prin integrare, duce la:

146

147

R. M. ~SAC

F. TOPOUCgANU

D. KCREANGA INTR'ODUCERE iN BIOFIZICA MOLECULARA

SI CITOTISULARA

c (X)= ~

+ et .e -ax

(78)

eaI
unde: ct. este constanta de integrare. Din conditiile initiale si introducand
0

(82)

noua notatie simplificatoare, CI,o obtinem: adica: in aproximatia unei variatii liniare a potentialului electric

b = 'a [C (1)]- [C(O)~ -al = aC 1,0


1- e -al

(79)

in membrana de grosime I (grosimea membranei se reduce de la numitorii egalitatii urmatoare):

Reconsiderand notatiile a si b rezulta:

f = -mzFC

d'f
1,0~

(80) Daca exista mai multe tipuri de cationi si mai muite

Revenind la cazul moleculei de Nael disociata in ioni in mediu apos, de exemplu, vom avea:

tipuri de anioni monovalenti atunci:

mlii- ~Ii~

J
(84)

r.,
I

= -m .+F ~+
I

1,0 ~

dx
-.-

f _• = -m._
i
J

F ~- ]d 'P
I 1,0

(81)

m Iii- ~p~ ]

dx

unde: notatiile [i\ol si rr/,o] sunt particularizari ale notatiei CI,O pentru anionii si respectiv cationii difuzibili. Din egalitatea cu zero a fluxului rezultant rezulta:
148

unde: a ~i ~ sunt indici de sumare pentru tipurile de ~ationi si respectiv de anioni. Particularizand

pentru

membrana

biologics, prin care difuzeaza doua tipuri principale de cationi


149

R.M:ISAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE iN BIOFIZICA MOLECULARA

SI CITOTISULARA concentratie

monovalenti, Na + ~i K+ precum si un tip de anion monovalent,

membrana imediat adiacenta, adica gradientulde este strict localizat pe grosimea membranei). Coeficientii de difuzie,

cr, din

relatia de mai sus se obtine potentialul de membrana:

D, se pot regasi in forma

produselor dintre factorul RT ~i mobilitatile fiecarui tip de ioni (85) prin membrana considerata: DNa+= RTmNa+ unde s-au introdus permeabilitatile difuzibili, PK+,
PNa+

membranei

pentru

10nIl

DK+ =RTmK+ D CI- = RTm


CI-

(87)

si PCI-

Na+ -

._ =

Na +K +K K

m Na

+RTm I
K

Nil+ +

Evaluarile experimentale efectuate eu ajutorul izotopilor radioaetivi pentru urmarirea fluxurilor ionice, ea ~i masuratorile (86) electrice directe realizate cu ajutorul electrozilor intracelulari, au dat valori de -50 mV parra la -90 mV pentru potentialul de membrana la diferite tipuri de biomembrane. interiorului
~l
."

ZK

mK

+RTm I RTm

.. ..

P CI- =

Z CI -

mCI -

CI-

Indicii

1 si 2 corespund

respectiv

..

exteriorului membranei. Sarcinile electrice ionice sunt egale cu unitatea (difera doar semnul) iar KmNa+, etc. sunt coeficienti de partitie a concentratiilor sau extracelular, ionice tntre membrana si spatiul intra pentru simplificare, egali cu la de

11.3. Echilibrul Donnan

In cazul
biomembrane

membranelor celulare precum ~i in cazul altor din organismele animale (epiteliul alveolelor intestinal, pulmonare, ionilor

considerati,

unitatea (concentratia fiecarui tip de ioni este nemodificata trecerea din spatiul exterior membranei la portiunea

peretii vaselor sangvine, s.a.) exista mici,


0

membranele semnificativa prezenta


151

modificare de

a echilibrului

determinata

ionilor

macromoleculari,

150

R. M:ISAC ;

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE iN BIOFIZICA MOLECULARA ~I CITOTISULARA

nedifuzibil', rezultati din disocierea unor particule coloidale de natura proteica, etc. (1. Haulica si col. 1984; I. Haulica ~i col. 1992; I. Haulica ~i col. 1998). Adesea este yorba de anioni nedifuzibili doar unuia dintre 'cele doua compartimente bicompartimental anterior. Daca numai in primul compartiment, exista anioni cu membrane care apartin ale modelului discutat

AW

= RT
F

In ~ +

aq> =

R: In t= 1

1 f+T

(90)

(91)

semipermeabile,

de unde rezulta: ecuatia Donnan:

(92)

nedifuzibili, cu n sarcini elementare fiecare, in concentratie de [P -] t iar concentratiile de anioni si cationi mici monovalerui sunt [a-h, [c+h, [c+b , atunci se transpune

din cele doua compartimente neutralitatea

In

cele prezentate

este Iuat In consideratie

numai

electric a a fiecarui compartiment

transportul pasiv al ionilor, formulele obtinute referindu-se la

potentialul de repaus (in lipsa actiunii unor stimuli asupra unor


celule excitabile)

cantitativ astfel:

(89)

11.4. Potentialul de actiune neuronal


Generarea potentialului

de actiune -

la

nivelul

Conditiile

ca la echilibru

sa se anuleze fluxurile potentialului

membranei neuronale cuprinde ansamblul modificarilor suferite de potentialul electric de membrana, sub influenta unui stimul

cationi ~i anioni mici conduc la expresiile membrana:

umoraI (depolarizarea acetilcolinica a membranei postsina~~i~~)' sau electric, de intensitate superioara pragului de excita~ie.I~ dezvoltarea
152

lui, excitarea

se realizeaza
153

intre doua'

~unct;

R.M.)SAC

F. TOPOLlCEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE

iN BIOFIZICA

MOLECULARA

~I CITOTlSULARj\.

apropiate,

printr-un

microelectrod

(cu

arie

foarte

mica, de o
t

/punctiforma / a sectiunii suprafata (cu arie relativmare

transversale)

~i un electrod

fata de electrodul ' punctiform' )

intre care se aplica un puIs rectangular de tensiune electrica, V E - Vs. Intre acelasi electrod de suprafata si un alt microelectrod plasat In imediata lui apropiere se receptioneaza variatia de

tensiune V s - V A generata de celula neuronala - masura directa a potentialului electric de actiune a membranei sale. Se obtine
a f

un raspuns electric de forma caracteristica la care se disting mai multe faze (Figura 52). Intai este receptionat un prepotential (portiunea de curba notata ab), apoi se inregistreaza asa numitul spike (bed) - variatia cea mai ampla din cadrul acestui fenomen care este urmat de un postpotential negativ (de)

spike -ul (bcd), postpotentialul

Figura 52.- Forma generala a unui potential de actiune: prepotential (ab), negativ (de) si postpotential pozitiv (ej) (modificat dupa F. Gremy si J. Perrin 1975)

prepotentialul

~i care nu este urmata de spike daca nu se

:;;i un

depaseste pragul de excitatie, Astfel in cazul (1) potentialul de membrana sufera este
0

postpotential pozitiv (ej). eel mai adesea potentialul de actiune este In principal
0

accentuare

polarizarii si electrodul

caci de

depolarizarea electrica a membranei, dar la


0

microelectrodul

electrodul

negativ

unele celule vizuale poate fi in principal Prepotentialul este


0

hiperpolarizare. de

suprafata este electrodul pozitiv - curent de excitatie negativ. In schimb, in cazul (2), inversandu-se polaritatea celor doi de

variatie locala a potentialului

repaus care precede aparitia spike-ului. In functie de sensul :;;i intensitatea curentului electric de excitatie, I, potentialul
0

electrozi, curentul de excitatie este pozitiv :;;i potentialul

de

membrana este diminuat dar nu apare si un spike, excitatia fiind sub nivelul pragului. Abia in cazurile (3) si (4), curenti de acelasi sens cu (2) dar de intensitate egala ~i respectiv mai mare dedit cea a pragului, indue depolarizari de membrana care

membrana poate suferi accentuare

variatie mai mare sau mai mica, de a starii de polarizare electrica

sau diminuare

caracteristica repausului (lipsei excitatiei), care constituie


154

contin un prepotential ~iun spike. Sunt motive sa se presupuna


155

INTRODUCEUE R.M.ISAC F. TOPOLICEANU


0

IN BIOFIZICl ...i\HYLl.i;CULARA ~i CrrOTISllLARA

"

D. E. CREANGA

Potentialul de actiune propriu-zis, spike-ul, reprezinta

ca generarea prepotentialului nu este numai variatiilor de permeabilitate ionica

manifestare a

variatia rapida de potential de membrana care se produce sub actiunea unui stimul de intensitate suficient de mare pentru a depasi pragul de excitatie. Amplitudinea acestei variatii poate sa insemne chiar
0

proprietatilor conductoare pasive ale membranei dar si induse de actiunea stimulului, mai ales cand acesta se apropie mult de valoarea pragul Ul. de excitatie. Spike-ul are aceeasi intensitate indiferent .. . de intensitatea curentului de excitatie cu conditia ca sa fie depasita limita pragului de excitatie (Figura 53). Ceea ce difera in cazurile (3) si (4) este latenta adica intervalul de timp dupa care se inregistreaza componenta principala a potentialului de
A • ~

inversare a sensului polaritatii membranei.

Ea nu depinde de intensitatea stimulului, daca acesta a depasit pragul de excitatie, deci se supune legii totul sau nimic.
Postpotenlialui

este considerat ca tezultanta a doua

faze, un postpotential de acelasi sens cu potentialul de actiune propriu-zis si un potential de sens opus care are o durata mai mare. Amplitudinea primei faze poate avea valori de la cdtiva milivolti in axonul gigant al calmarului (axon nemielinizat) pana la cateva zeci de milivolti in fibra musculara, infibra

actiune - spike-us. La

intensitate mai mare a excitatiei, Iatenta

este mai scurta si invers.


I 4 3 0

miocardica fiind comparabila chiar cu cea a spike-ului. Durata


t

.
I

primei faze este de ordinul zecilor de milisecunde la fibra nervoasa mielinizata si de circa 200 milisecunde la fibra miocardica, in timp ce durata celei de-a doua faze poateatinge chiar
0

I
I

1
t

secunda - dar amplitudinea acesteia din urma este, de

regula, sub 1 milivolt (mV).


2

1
Figura 53 - Curentii de.excitatie I (t) ~i potentialele de membrana induse V(t) (dupa F.Gremy ~iJ. Perrin 1975) 157 156

R.M.ISAC

F. TOPOLlCEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE iN BIOFIZICA MOLECULARA ~I CITOTISULARA

curenti sunt fluxuri de ioni mici pozitivi, prezenti intotdeauna la


11.4.1. Propagarea potentialului de actiune

ambele fete ale membranei. Deplasarea ionilor pozitivi de la fata externa a membranei dinspre zonele cu incarcare pozitiva spre zona excitata, eu incarcare negativa la exteriorul membranei, produce aparitia spike-ului (cand potentialul ajunge la limita pragului de excitabilitate). Propagarea excitatiei se produce In ambele sensuri, lara modificarea amplitudinii spike-ului
(propagare

Propagarea potentialului de actiune se concretizeaza In principal In propagarea spike-ului care realizeaza conducerea excitatiei in lungul fibrei. Se considera
0

,fibra nervoasa

nemielinizata, cum este cazul, de exemplu, la axonul gigant de calmar, material biologic foarte mult utilizat in studii de excitabilitate celulara. Stimularea experimentala se realizeaza cu
0

pereche de electrozi dintr-un circuit electric de tensiune

tara decrement),

cu

viteza cu atat mai marecu cat

diametrul fibrei nervoase este mai mare (Figura 55).

continua. Mecanismul acestei propagari poate fi reprezentat prin intermediul modificarilor de distributie de sarcina electrica pe fetele membranei celulare ea urmare a aplicarii stimulului excitant intre doua punete apropiate ale aeestei membrane. Astfel se considera ca exeitarea locala este echivalenta eu inversarea semnului sareinii electrice adica
0

++++++

+++++++++

-------++++++---------

_____,..
~

++++++

inversie de

________.,.

++++++ +++++++++

potential electric (plus la exterior si minus la interior (Figura 54). Tendinta de compensare a aeestei perturbari de sarcina electrica se manifesta prin aparitia unor curenti electrici locali ~i la interiorul si la exteriorul fibrei avand rolul de diminuare a diferentei de potential de membrana din zona excitata. Acesti
158 Figura 54.- Inversarea polarizarii electrice a membranei excitabile determina aparitia unor curenti de sarcini ionice pozitive care tind sa compenseze perturb area electrica produsa (modificat dupa F. Gremy ~iJ. Perrin 1975)

Teoria cablului coaxial demonstreaza ca proprietatile

conductoare ale acestuia (in conditiile in care, intre doua puncte se aplica
0

diferenta de potential ce nu depaseste pragul de


159

R.M.lSAC

F. TOPOUCEANlJ

D. E. ClmANGA

INTRODUCERE iN BIOFIZICA MOLECULARA $1 ClTOTlSULARA

excitabilitate),

depind numai de doi parametri,

cunoscuti sub

de tensiune intre doua puncte separate prin distanta dx este data de

denumirile de constanta de timp, 't, si constanta spatiala,

A.

curentul

transmembranar

~1

rezistentele

pasive
:)i i

corespunzatoare 't=RC

eelor doua fete ale rnembranei

(dupa Hughe~

1979, citat de V. Gheoghe ~i A. Popescu 1990): (93) descrie

A=Jr;:r.
Constanta potentialului de timp

variatia

in

timp

(96)

de membrana

dintr-un punct considerat, fata de Ecuatia undelor cu propagare unidimensionala OX) poate descrie destul de bine propagarea cum au aratat masuratorile (94) experimentale (pe
0

valoarea de la un anumit moment initial, pe durata propagarii electrotonice aplicata:


t

a curentului

generat de diferenta

de potential

directie

excitatiei, dupa
cu

in comparatie

'P{t) = 'Poc-:t

valorile obtinute computational, este


0

unde potentialul de membrana

functie de distanta ~itimp.:

Constanta spatiala descrie variatia in Iungul cablului a acestui potential electrotonic, dintre fetele membranei, adica a diferentei de potential potentialului de

:tara declansarea

d2'P(x,t)_ dx 2

1 d2'P(x,t) v2 dt 2

(97)

actiune, fata de un punct considerat initial: Descrierea


x

cantitativa in

a circulatiei .ionilor mict prin generarii


~l

membrana (95) pulsului de tensiune stimulator se potentialului

axonala

timpul

propag~i

A'P{x)=A'Poe ~
Daca aplicarea

de actiune {excitatia

sau impulsul electric care

depaseste pragul de excitatie) , se poate face cu ajutorullegilor


de baza ale circuitelor electrice (legile lui Ohm).
161

efectueaza la momentul t=0, atunci in acest moment diferenta


160

R.M.ISAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE

IN BIOFIZICA

MOLECULAR-\' $1 CITOTISlJLARA

Astfel, in modelul lui Hodgkin si Huxley, pentru fiecare din cele trei categorii de ioni se pot scrie relatiile de legatura intre intensitatile curentilor pasivi (I) ~i diferentele de tensiune electrica generatoare (~:

de permeabilitate mcrnbranara). Curentul prin membrana va fi atunci de forma:

(98)

Pentru sodiu sunt propuse ecuatiile:

unde: \{I este potentialul de membrana, iar


,")iJ,

RNa,

RK,

R, sunt

g Na dm
dt

(t) = g ~a
=

3 (t )1 (t )
A Pm

rezistentele membranei pentru fiecare catego~ie de ioni.


d;

a.

(1 - m ) _ h)-

(101)

Curentul

ionic total prin membrana,

1M, are si

db =
dt

a. h (1 -

Phh
temporale la un ecuatiilor si
~b

componenta capacitiva:

(99)

unde: met) si h(t) sunt functii exponentiale potential dat, dupa cum rezulta

din integrarea

diferentiale (D. G. Margineanu, 1976), iar Om, Pentru caracterizarea variabilitatii rezistentei electrice in functielde potentialul de membrana s-au propus mai multe

an,

~m

sunt

constantele de viteza corespunzatoare variatiilor functiilor met) ~i bet) care, la un potential that, au valori constante. Valoarea maxima a conductantei pentru sodiu este notata g~a . Pentru potasiu este data functie temporals, n(t):
0

variantedintre

care, cea care descrie,jormai, eel mai bine acest

fenomen - in cea mai buna concordanta cu datele experimentale - este redata mai jos (se prefera conductanta, g, adica inversul rezistentei, pentru a da
0

relatie ce depinde de

alta

imagine mai sugestiva proprietatilor


162 163

R.M.ISAC

F. TOPOLlCEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE iN BIOFIZICA MOLECULARA ~I CITOTISULARA

gK
dn

(t) =

g ~ n4
0

(t)
n )-

dt

(t.) = a. (t -

Po

(102)

fie controlata de absenta din apropierea suprafetei membranare a unui ion bivalent pozitiv ( de ex.: ionul de calciu). In cazul ionului de sodiu, in mod analog, se poate presupune ca activarea este declansata de prezenta a trei sarcini electrice elementare astfel ca parametrul h(t) dobandeste semnificatia probabilitatii ca in apropierea canalului sa se afle una din aceste particule. Pentru celelalte tipuri de ioni (cum ar fi clorul s.a.) conductanta, ga, este presupusa constanta. Dependenta de timp a intensitatii curentului ionic prin membrana apare ca
0

Constantele de viteza On si a functiei n(t) si, la precum si la


0 0

po corespund variatiei in timp

concentratie data de ioni de calciu,

temperatura data, depind numai de potentialul

electric de membrana. Parametrii mtt), htt), n(t) pot fi considerati ca descriind actiunea unor ~actori neprecizati ca natura, ce controleaza activarea canalelor ionice de Na (parametrul m), de K (parametrul n) si respectiv inactivarea canalelor de Na (parametrulh). De exe~plu, deschiderea canalului pentru K+ ar putea fi conditionata de prezenta a patru sarcini electrice negative elementare, purtate de particule ipotetice, mobile sub actiunea campului electric. In aceste conditii, n(t) ar avea semnificatia
I

relatie de parametrii m, n, h care

moduleaza conductantele ionice pentru sodiu si potasiu:

Acest model conduce la graficul de variatie ,in timp a potentialului de membrana precum si a conductantelor ionice pentru sodiu si potasiu., ca rezultat al integrarii ecuatiilor diferentiale propuse. Limitele acestui model, sugerate chiar de aproximatiile in care este formulat, decurg si din necesitatea de a preciza mecanismele de activare a diferitelor tipuri de canale ionice
165

fizica a probabilitatii ca prezenta uneia din cele patru sarcini sa conditioneze independent deschiderea canalului de potasiu, n2(t) ar fi probabilitatea ca aceasta activare sa fie conditionata Intr-o interpretare bazata pe simetrie, n (t) ar putea avea semnificatia probabilitatii, ca activarea canalului de potasiu sa
164
2

de prezenta a doua sarcini electrice negative, etc.

R.M: [SAC

F. TOPOLlCEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE iN BIOFIZICA MOLECULARA ~I CITOTISULARA


canale de lodlu inchilt tlmpul

precumsi

din restrictia, ca fiecare tip de ion sa circule prin

canal separat (In realitate existand si canale ionice pentru doua tipuri de ioni). Luand in considerare si rezultatele teoriei cablului
mV

t=o

coaxial, mode/ul Hodgkin si Huxley , poate descrie variatia temporara considerat, a potentialului de membrana intr-un punct
dlstllll~a in IWlgula:xonulul eanale de sodlu deschlse (mm)

ca urmare a actiunii unui stimul care depaseste

pragul de excitabilitate (Figurile 56 ~i 57):


tlmpul tl=lms

11.5. Fluxuri ion ice ~i electrogeneza 11.5J

in fibra musculara

d1stan~ain lunguI axonulul (mm) canale de sodlu deschise tlmpul t2=2ms

Poteruialul de actiune in fibra musculara cardiaca si neteda

In cazul fibrei musculare cardiace aparitia potentialului de actiune este legata de modificarea potasiu, sodiu si ealciu.
dlstan!ain lWlgul axonulul (mm)

fluxurilor

ionice de

Figura 55. - Canale de sodiu dependente de voltaj ce penn it propagarea unidirectionala a potentialului de actiune (J. Darnell ~i cot. 1990)
166 167

R..M.ISAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE iN BIOFIZICA MOLECULARA ~I CITOTISULARA

Cresterea
'I'(t)

permeabilitatii

membranei

pentru

sodiu

respectiv deschiderea "canalului rapid de sodiu/ .determina un influx de ioni de sodiu electrica in celula, ceea ce inseamna ~i
0 0

depolarizare

a membranei

crestere

rapida a

curentului ionic prin membrana - portiunea AB - (Figura 58). Acest canal poate fi inhibat de tetrodotoxina (TTX).
t

Potentialul de repaus are valoarea de-

70 sau -90 mY,

iar ca urmare a acestei depolarizari rapide, se poate ajunge la valoarea zero sau chiar la valori pozitive.
Figura 56. - Variatia in timp a conductantei membranare pentru ionii de sodiu ~i potasiu precum ~i a potentialului de membrana (dupa F. Gremy si J. Perrin 1975)

Ulterior, membranare

cresterea

in sodiu

continuare

permeabilitatii calciu este

amt pentru

cat ~i pentru

consecinta activarii asa numitului "canal calciu-sodic lent", Faptul ca influxul de sodiu continua si este suplimentat
experimental +20

de influxul de calciu (gradientul

electrochimic

avand acelasi

sens pentru ambele tipuri de ioni), se concretizeaza in existenta

2,0

t(ms)

unui

"'platou/

al

intensitatii

curentului

transmembranar

(portiunea BC). Depolarizarea fibrei cardiace este determinata in acest

·60

caz de intrarea in joe a canalelor ionice rapide de Na - voltaj dependente, si pe de alta parte a canalelor lente de Na - Ca. Cresterea concentratiei calciului in citoplasma este data

Figura 57.• Variatia temporara a potentialului de membrana (dupa F. Gremy ~iJ. Perrin 1975) 168

~i de eliberarea sa din rezervele intracelulare afiate la nivelul


169

R.

1\1. ISAC .

·,

"f

',I.

F. TOPOLICEANU

D.

E. CREANGA

INTRODUCERE

IN

BIOFIZICA

MOLECULAR,'\

~ICITOTISULARA

reticulului sarcoplasmic (RS). Acesta reprezinta semnalul pentru declansarea contractiei musculare (sistola mecanica) ,pe toatadurata platoului. Intrarea in de-a treia actiune a pompelor ionice cauzeaza de permeabilitate membranara: diminuarea curentului ionic de intrare in celula, simultan cu cea modificare deschiderea retarda a unor canale de potasiu, adica generarea unui eflux de potasiu catre exteriorul celulei. Aceasta se traduce printr-o diminuare a curentului total (portiunea CD) ~i 0 repolarizare electrica rapida a membranei ~i printr-o relaxarea fibrei musculare cardiace. Daca variatiile de potential electric a membranei celulei museulare se pot masura direct prin tehnicile bazate pe electrozi intracelulari (clamp volatage, etc.), eeeaee se capteaza eu
Q

mV

-10

F igura 58.- Vari~tia pote?lialului de membrana (d upa.·. F Grerny ~I J. Perrin 1975).

in celula musculara

cardiaca

- unda P - reprezinta

depolarizare de mica amplitudine ce


0

precede complexul QRS si are (activarea miocardului atrial);


-

semnificatie similara

complexul QRS - de depolarizare ventriculara;


0

ajutorul microeleetrozilor plasati la suprafata membranei este rezultatul potentialelor de membrana generate in diferite etape ale contractiei museulaturii cardiace, propagate la nivel cutanat. Untraseu (Figura 59): electrocardiografic prezinta unde bipolare
~1

o o

- unda negativa Q - este

hiperpolarizare initiala de foarte

mica amploare uneori imperceptibila; - unda pozitiva R - de depolarizare rapida si ampla care , in ' . unele cazuri poate fi urmata de 0 a doua depolarizare la fel . de rapida dar mai putin ampla, notata R' ;
Q

se

caracterizeaza prin urmatoarele componente numite unde

unda negativa S- de mica amplitudine, urmata, In unele cazuri de 0 a doua unda , S" ,

o
170

- unda T - corespunde fazei de repolarizare ventriculara ~i relaxarii musculaturii ventriculare si apare la intreaga mass
171

R.M.ISAC

F. TOPOLICEANU
0

D. E. CREANGA

INTRODUCERE iN BIOFIZICA MOLECULARA ~I CITOTISULAIU

ventriculara, are

amplitudine de 0,2 - 0,3 mV ~i 0 durata

Tabelul 9. Componentele semnalului electrocardiografic


(dupa F. Gremy ~iJ. Perrin, 1975)

intre 0,35 - 0,30 sec.


lilY 1 R

Miocard Auricular 1 repaus

Miocard Ventricular Repaus

Electrocardiograma potential de repaus (linia de zero) unda P (complex rapid) Iinia de zero (izoelectrica) QRS (complex rapid ventricular) linia de zero (izoelectrica) , unda T'

2
p

T 1
sec

in curs de depolarizare

Repaus Repaus in curs de excitare (depolarizare) Excitat in curs de repolarizare

3
excitat 4 in curs de repolarizare

Q
Figura 59. - Variatia diferentei plasati pe tesutul cutanat

S de potential electric dintre doi electrozi

5
repaus 6 repaus

Modelul

vectorial

de

activare

componentelor

electrocardiogramei daca se considera inima ca pe un dipol electric ce variaza in timp. Dintre studiile publicate de noi asupra potentialelor de actiune de la nivelul celulei musculaturii striate mentionam articolele publicate in reviste ca J. Muscle Res. &Cell Motility (M. Isac ~i col. 1987) ~i Pflugers Arch. (M. Isac ~i col. 1988).

172

173

R.l\1.~SAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA INTRODUCERE iN BlOFIZICA MOLECULARA 1>1 CITOTISULARA

CAPITOLUL

12

raspunsul

survenind

la un interval

variabil

de timp

La animale, majoritatea acestor molecule semnal sunt

Elemente biofizice de interactiune comunicare celulara


12.1. Semnalizarea receptoare In eomumeare intercelulara:

si

solubile in apa ~i se leaga la receptori de pe membrana celulara (Figura 63).

horrnoni si proteine

organismele

multieelulare, complexa,

exista care

retea

de

intercelulara,

coordoncaza

cresterea, diferentierea

si metabolismul

diverselor tesuturi si

• Setrtnal

organe. Intre grupe mici de celule comunicarea se poate realiza prin contact direct intre celule (la nivelul jonctiunilor celulare). In cazul in care celulele trebuie sa eomunice intre ele la distante mai mari decat pot asigura contactele atunci intervin unii produsi extraeelulari semnale intercelulare (Figurile 60, 61, 62). Astfel, eelulele semnalizatoare sintetizeaza si elibereaza substante speeifice - molecule semnal - sau mesagcri ehimiei, care se deplaseaza sprc alte celule tinta, prevazute eu reeeptori specifici, in care indue un raspuns specific. Unele molecule semnal indue modificari in activitatea uneia sau mai multor enzime prezente intotdeauna In celulele
174 175

Y Receptor
Figura .60.- ~ecretia de mesager chimic a unei glande endocrine (stanga) se transrntte pr~n vase Ie de sange eatre celulele tintli aflate la distantli (dreapta) (J, Darnell ~I col. 1990)

directe intercelulare, care actioneaza ea

Alte molecule semnal altereaza mecanismul exprimari genetice (Figura 64), acestea sunt putin hidrosolubile, fiind mai ales liposolubile, indue raspunsuri mai tarzii In celulele tinta. Cei mai reprezentativi, receptori intracelulari, sunt hormonii steroizi care se leaga la control and anumite regiuni ale

moleculelor de acid dezoxiribonucleic.

R.M.ISAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

o proteina

INTRODUCERE iN BIOFIZICA MOLECULARA ~I CITOTISULARA

receptoare de la suprafata membranei celulei •. Sflmnal extracelulat

tinta sau din citoplasma sau din nucleul acestei celule, prezinta un situs de legare eu mare afinitate pentru semnal: hormon sau neurotransmitator, in postura de liganzi.
0

anume substanta

Moleculele semnal sunt

Y Receptor
y

• •••

."Semnsl extracelular

• ~em~af I ntr:acelular

Y Receptor

Figura 63. - Receptori mesagerului primar, In secundari (stanga), dar concentratia intracelulara col. 1990)

aflati Ia suprafata membranei celulare. In lipsa citoplasma exista un nivel scazut de mesageri dupa cuplarea mesagerului primar cu receptorul, de mesager secundar creste sensibil (J. Darnell ~i

Figura 61. - Cazul semnalizarii celulare la distants mica (J. Darnel ~i col. 1990).

Cuplarea

ligandului

la proteina

receptoare

se poate

realiza prin forte de interactiune slabe, de natura electrostatica

(forte van der Waals), forte ionice si legiituri hidrofobe, care


.. Semoal extracelular

determina receptorului

modificari

ale

inomentului
0

dipolar

electric

al

~i declanseaza

serie de reactii care modifica

Y Receptor

functiile celulei. Printre moleculele semnal care se cupleaza la receptorii de pe suprafata membranei celulare se pot exemplifica :

hormonii peptidici, prostaglandinele,


Figura 62. - Semnalizarea celulara poate avea ca tinta chiar celula care secretamolecula semnal (J. Darnell ~icol., 1990)

aminoacizii, epinefrinele cresterea sau scaderea secundari (cAMP,

~i compusi inruditi, care declanseaza concentratiei citoplasmatice Ca2+, 1,2-diacilglicerol).


177

de mesageri

176

R.'M •.ISAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE IN BIOFIZICA MOLECULARA ~I CITOTISULARA

cazul mesagerilor primari din categoria hormonilor se disting trei grupe de molecule functionale :

o o
o

Molecule lipofile care pot trece prin membrana celulara si se cupleaza la receptorii din citoplasma sau nucleu; Molecule lipofile care se cupleaza la receptorii de suprafata ai plasmalemei; ,
semnal ,

Molecule hidrofile care se cupleaza la proteinele receptor de la suprafata membranei citoplasmatice (plasmalema); Din prima grupa, cei mai reprezentativi sunt steroizii, de exemplu,

tiroxina

si acidul retinoic.

Hormonii

steroizi,

interactioneaza eu reeeptori citoplasmatici sau nucleari formand complexe moleeulare ce se acumuleaza in nucleu, unde se leaga la secvente specifice reglatoare din molecula de aci,~
Figura 64. - Cuplarea mesagerilor Jiposolubili - steroizi, tiroxina, acid retinoic - (triunghiuri) la receptori citosolici sau nucleari determina modifican la nivelul acizilor nucleici (1, Darnell §i col. 1990)

dezoxiriboIiti~leic crescand sau diminuand viteza de transcriptie a genelor corespunzatoare (Figura 64). G~pa a doua este reprezentata de prostaglandinele Unii mesageri chimici care se cupleaza la ptoteinele receptoare de pe suprafata plasmalernei determina
0

activarea crestere a - mesager

care actioneaza moduland raspunsul altor hormoni, implicati, spre exemplu in, initierea contractiei musculaturii netede. In cea de a treia grupa sunt incluse polipeptidele marl ca insulina (Figura 65) si hormonii de crestere sau compusi mici,incarcati electric cum sunt epinefrinele.

unei enzime (Figurile 66 si 67) care genereaza concentratiei intracelulare a unui alt me sager

secundar - implicat la randul sau, In modificarea activitatii altei enzime sau proteine neenzimatice din celula, Exemple de mesageri secundari sunt: AMP-ul ciclic (cAMP), GMP-ul ciclic (c-GMP), diacilglicerolul, ionii de calciu, inositolul, s.a.

178

179

R.M. ISAC

F. TOPOLlCEANU

D. E. CREANGA
q

INTRODUCERE iN BIOFIZICA MOLECULARA ~I CITOTISULARA

cuplarea
a

cu

proteinele

receptoare

tara
b

declansarea

raspunsului asteptat - antagonisti.

Figura 65. a - AcetiIcolina eliberata de celula nervoasa controleaza canalul 'cationic de pe suprafata membranei celulei musculare (jonctiunea neuromusculara); b - Insulina controleaza proteinkinaza care controleaza fosforilarea unui substrat proteic (J. Darnell ~i col. 1990)

Figura 66. a - Tirozinfosfataza proteica controlata de ligand; b - guanilat ciclaza controlata de ligand (J. Darnell si co1.l990)

Un transportul moleculesau

tip prin

de

ligand

deosebit se refera

de

important

pentru

membrana

ioni, capabile

la acele canalele

sub stante, ionice -

sa activeze

agregate proteice membranare care permit trecerea fluxurilor de ioni mici prin biomembrane legare a mesagerului (Figura 65). In acest caz situsul de pe una din subunitatile

G*

G*E*

este situat

constitutive ale canalului ionic. Molecule analoage structural hormonilor naturali pot fi recunoscute de receptorii respectivi determinand doua situatii:
q

Figura 67. - Activarea controlata de ligand a proteinei G traductoare care activeaza 0 enzima ce declanseaza generarea unui mesager secundar (R receptor, G - proteina G - inactiva, G* - proteina G activata, E - enzima inactiva, E* - enzima activata) (J. Darnell ~i col. 1990)

Antagonistii intra In competitie cu hormonii naturali, sau agonistii, limitand posibilitatea de actiune a

declansarea raspunsului specific, normal - agonisti;

blocandu-le activitatea fiziologica,


181

180

B.M.'ISAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE iN BIOFIZICA MOLECULARA ~I CITOTISULARA

12.1.1. Jonii de calciu - mesageri secundari

declansand, de exemplu un alt raspuns celular cum ar fi contractia musculara (M. Isac ~i col. 1987).

.Mai .multi hormoni sunt capabili, ca prin cuplarea la receptorii membranari de la nivelul plasmalemei, sa declanseze o crestere a concentratiei de calciu din citoplasma rara contributia ealciului extracclular, ci doar pc baza golirii depozitelor intracelulare atasate reticulului endoplasmic. este Mecanismul propus si sustinut de doveziexperimentale redat In schema de mai jos (Figura 68). La cuplarea ligandului eli receptorul se activeaza
proteina G care determina transformarea fosfatidil inositolului
protelnaG

In diacilglicerol si inositoltrifosfat (transformare in care este implicata si fosfolipaza C).: Diacilglicerolul activeaza proteinkinaza C iar apoi aceasta determina fosforilarea si activarea unor proteine capabile sa declanseze reactii bioehimice in celula sub forma raspunsului eelular specific. Inositoltrifosfatul (IP3) determina deschiderea unor canale ionice de calciu din rezervele citoplasmatice atasate reticulului endoplasmic. Ionii de calciu eliberati reprezinta un mesager seeundar, cresterea nivelului caleiului eitoplasmatic
rezervor de caldu de Ia nlvelul retlclilulul endoplasmic

::1

inosltoll,4,5 Wasrat .

Figura 68. - Rolul calciului de mesager secundar (explicatia in text) (J. Danell ~icol. 1990)
182 183

R.M.ISAC

F. TOPOLIC!£ANtJ

D. E. CREANGA

..
INTRODUCERE iN BIOFIZICA MOLECULARA ~I CITOTISULARA

care preiau mesajul de la receptorii membranari ~i declanseaza 12.1.2. Dinamica receptorilor anumite reactii bioehimice in celula, ajungandu-se la finalitatea

comunicarii intercelulare pe baza de molecule me sager.


Majoritatea reeeptorilor
0

sunt alcatuiti din mat multe 12.1.3. Cinetica interactiunii ligand - receptor transmisia neuronale Cinetica interactiunii ligand receptor poate fi descrisa prin schema urmatoare:

subunitati proteiee eu

mare mobilitate in membrana. mediaza nivelul ehimie sinapselor

Neurotransmitatorii impulsului nervos la

corespunzatoare

(sinapse chimice) cuplandu-se Ia situsurile de Ia receptorii

legare ale unor canale ioniee sau cuplandu-se

membranari, care nu sunt canale .ionice.


Cuplarea moleculelor sau neurotransmitatorii, la
0

k,

ks

L+R precum hormonii specializati din

LR

de mesageri, receptorii

membranele celulare presupune

modificare conformationala a se gasesc dispersate in

acestora care, in lipsa mesagerului,

unde: L si R sunt ligandul si receptorul - in starea inactiva, LR ~iLR* sunt complexele receptor-ligand in stare neactivata ~i

membrana sub forma de subunitati proteice cu mare mobilitate de miscare. Receptorii membranari cuplati cu molecule mesager

respectiv activata, R' este receptorul in stare inactiva po sibil

regenerativa.
Constanta de echilibru a reactiei de formare a complexului ligand-receptor poate :fiscrisa ca:

prezinta un moment dipolar electric, modi:ficat fata de eel al receptorului liber. In consecinta, se modifica $1 cdmpul electric radiat de dipolul macromolecular electrica a celorlalte componente rezultat si deci ~i starea cu momente

membranare

kD

==

k)
k
_I

[L

IR ]
]

dipolar electrice se modifies. In aceste circumstante se produce si activarea unor enzime (molecule proteice
184

[LR

(105)

185

R.M.ISAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE iN BIOFIZICA MOLECULARA l>ICITOTISULARA

unde: parantezele patrate se refera la concentratiile respective, de ligand, receptor si complex ligand - receptor. Ea mascara afinitatea receptorului pentru ligand ~i cu ajutorul ei reactia de cupare a ligandului cu receptorul poate fi adusa la

in unele tipuri de celule, acelasi raspuns celular poate fi indus de diferite complexe receptor-ligand. Delimitarea intre hormoni ~i neurotransmitatori este

destul de dificil de facut, de

regula hormonii actionand la acestia din urma

binecunoscuta forma a relatiei Michaelis - Menten:

distante mai mici decat neurotransmitatorii,

fiind, pe de alta parte eliberati din celulele nervoase sub forma


,.::__---=:

[LR]
R
tot

= -----. 1+ k

1
D

I[L]

.........

(106)

de vezicule In spatiul postsinaptic (la nivelul sinapselor) iar nu de glandele endocrine. Ligandul nu este metabolizat de in

produse utile celulei, nu este un intermediar in in vreuna din unde: RT este numarul total de receptori liberi ~i cuplati cu ligandul (1. Darnell, H. Lodish, D. Baltimore, 1990). Pentru activatatile celulare si nici nu are proprietati enzimatice. Moleculele proteice receptoare adesea, degradeaza modifica moleculele semnal. In acest feI, modificandu-si incheindu-si modificarile stau raspunsul structurale unor sau sau

acelasi ligand diferite tipuri de celule tinta pot avea diferite tipuri de proteine receptoare si, pe de alta parte, un anume tip de celula poate avea receptori diferiti pentru acelasi ligand. Dar acelasi tip de receptor poate fi prezent In mai multe tipuri de celule, astfel ca acelasi ligand poate induce diferite raspunsuri, De exemplu, acetilcolina poate fi receptata de proteine receptor din mai multe tipuri de celule (musculare cardiace striate §i acestui celulelor celulele

specific fata de ligand, dupa cum si sau reducerea situsurilor receptoare sau

la baza

importante

mecanisme

biologice

patologice,incomplet pacemacker, miotonic,

elucidate, (ex: activitatea spontana de tip din sindromul miastenic sau

electrogeneza

traseele

de tip neurogen

sau miogen,

etc. (F ..

§i unele
striate

celule

pancreatice).

Eliberarea adiacente iar in

Topoliceanu si I. Haulica si col., 1984; I. Haulica si col.,1989).

neurotransmitator musculaturii

din celulele neuronale determina contractia,

cardiace incetinesc viteza de contractie, Dar sunt situatii cand ,

186

187

R.l\l.ISAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE iN BIOFIZICA MOLEcULAR;\. ~I CITOTISULARA'; ,

12.2. Interactiuni antigen - anticorp


Una din functiile sangelui este cea legata de participarea sa la reactiile exercita imunitare ale organismului,

12.2.1. Antigenii functie care se

Daca anticorpii sunt In exclusivitate molecule proteice,


asa cum se va arata mai jos, antigenii pot fi polipeptide, lipopolizaharide, acizi nucleici s.a, care In urma patrunderii in
organism pot declansa un raspuns imun, adica indue elaborarea de anticorpi (fenomenul de imunogenitate) care reactioneaza antigen-

in principal

prin intermediul

unora din tipurile de

celule albe ale sangelui si anume Iimfocitele de tip B ~i T, care participa diferentiat la realizarea, respectiv a imunitatii umorale " si a celei celulare. Generarea raspunsului imun se realizeaza In raport cu fie

specific in vivo ~i in vitro, sub forma complexului anticorp. Struetura antigenilor contine
0

diferiti agenti straini, patrunsi in interiorul organismului, prin distrugerea imunitatii proteice

lor de catre limfocitele T activate, In cadrul eelular, fie prin geneza unor molecule

parte extinsa, cu rol de in principal

mediate (globuline),

purtator (un suport coloidal

constituit
0

dintr-o

denumite antieorpi, in cadrul imunitatii

proteina cu masa moleculara mare) ~i

grupare determinanta

umorale, prin interactiuni de tip angigen - anti corp. Reactiile antigen-anti corp constituie fenomene esentiale avand un rol bine precizat de distrugere, neutralizare eliminare (de catre anticorpi) a toxinelor sau de

(determinant antigenic sau situs antigenic sau epitop), care este un fragment cu masa moleculara mica apartinand, de asemenea moleculei de antigen.

sau a agentilor

molecula de antigen poate avea unul sau mai multi

patogeni (antigenii). Fenomenele fizieo - chimice sunt eele eare ofera posibilitatea Intelegerii partiale, a inaltei specificitati a

epitopi, numiti si situsuri antigenice sau haptene.

Daca un antigen are

singura grupare determinanta

acestor interactiuni, problema ramanand deschisa cercetarilor In domeniu.

(haptena), atunci este denumit antigen monovalent si poate sa reactioneze cu un singur anti corp. Daca antigenul are mai rritilte haptene atunci se numeste polivalent si poate sase l&'ge

188

189

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE iN BIOFIZICA MOLECULARA $1 CITOTISULARA '

simultan

de mal multi anticorpi.

Valenta

antigenilor

poate

, ajunge la valoarea de 500.

12.2.2. Anticorpii

Anticorpii soot proteine din clasa imunoglobulinelor

cu

greutate moleculara mare, de la 100.000 Da la 1.000.000 Da, elaborate In principal de limfocitele de tip B, unele limfocite de tip T, putand fi implicate in formarea anticorpilor si reglarea complex

a a intregului

mecanism imun, inclusiv celnatural. (Ig) se impart, dupa masa lor de


Figura 69. - Reprezentare schematics a unui .antic?~ bival~nt. Lan!Urile paraleJe din structura primara sunt unite prin legaturi disulfurice (modificat dupa F. Gremy ~iJ. Perrin 1975).

Imunoglobulinele moleculara,

dupa compozitia

chimica ~i dupa constanta

sedimentare, in clase denumite: Ig G, Ig A, Ig M, Ig D, Ig E, etc. Ele reprezinta structuri proteice care includ un situs de combinare (analog situsului antigenic) numit ~~ paratop la

La categoriile IgG ~i IgA intalnim asociatii de doua


"lanturi grele" ~i "lanturi usoare"; imunoglobulinele

Ig M sunt

compuse din ansambluri de "lanturi grele" ~i "lanturi usoare" in numar egal dar numarul lanturilor este un multiplu al celui care se gaseste in alte imunoglobuline. Cel mai adesea imunoglobulinele fi ~i multivalente. sunt bivalente, dar pot interactiunea

nivelul caruia, se realizeaza legatura cu antigenul. Aceasta are loc la nivelul jumatatii terminale a Iegaturii azotice compusa din lanturile H ~i L, jumatatea terminala C fermata din lanturi grele individuale determinand clasa anticorpilor. Schema unei imunoglobuline prezinta "lanturi grele' de

In cazul eel mai simplu,

elementara intre

atomi ~i "Ianturi usoare", legate prin punti disulfurice (Figura 69). Structurile primare ~i secundare sunt cunoscute pentru mai multe imunoglobuline.
190

haptena ~i un anti corp univalent se scrie:

191

R. M. JSAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE iN BIOFIZICA MOLECULAR.:\. $1 CITOTISUt.A.RAlt

(107)

AG = AH - TAS

.'(110)

unde: A reprezinta format. Reactia este

anticorpul, H-haptena

iar AH complexul

in care: S este entropia iar H este entalpia libera (energia de legatura la presiune normala).

reversibila

si

se caracterizeaza

pnn

Studiile efectuate arata ca variatia entropiei este uimitor de mica dar aceasta se expliea prin faptul ca se poate masura numai variatia deentropie globala pentru doua tipuri de proeese

.constantele de viteza kJ ~i k2. Legea actiunii maselor permite ca la echilibru formula (107) sa devina:

care au Ioe (unul este eel care intereseaza in primul rand din punet de vedere imunologic si presupune diminuarea numarului

(l08)

de grade de libertate ale moleculelor legate dar exista ~i un.al doilea proces ~i anume procesul de indepartare a moleculelor de

uncle: K este constanta de echilibru, respectiv concentratiile

[A

1[H

}i [AH

] sunt

apa legate (adsorbite) anticorp.

care precede

fixarea

antigenului ,pe

de anti corp liber, haptena

Iibera ~i

imunocomplex (complexul antigen-anticorp). Cunoscand valoarea lui K este usor de calculat variatia energiei libere de reactie:

1(111)

AG

=-

RTlnK

(109)

(112)

unde: G - este energia libera a reactiei, R - constanta universala a gaze lor perfecte iar T - temperatura absoluta. Energia de

Daca ordinul

de marime

a lui AG

este de eea.7

keal/mol atunci ~i pentru energia de legatura se obtin valoriJ~ fel de mici ~i cu putine diferente de la
193
0

legatura antigen - anticorp rezulta din ecuatia lui Gibbs:


192

reactie la alta.

R.M.ISAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA.

INTRODUCERE IN BIOFIZICA MOLECULARA. ~I CITOTlSULARA

imunocomplexului 12.2.3. Natura fortelor implicate in interaciiuntle elementare antigen - anticorp acestuia.

ceea ce duce la deosebita

stabilitate

12.2.4. Reactiile secundare Interactiunile antigen - anticorp se deruleaza in doua faze succesive,
0

faza primara (elemenatra) ~i 0 faza secundara,


mica de legatura a reactiilor elementare

Este destul de probabil ca daca reactia antigen - anticorp

Energia

~i

s-ar limita la reactia elementara descrisa mai sus, atunci nu s-ar cunoaste finalitatea inca dedit purine ,lucruri in imunologie si chiar

influenta pll-ului

asupra cineticii reactiilor (pH-ul optim este

7,3 - 7,5 similar eu valoarea serului sangvin), arata ca fortele de legatura nu sunt eovalente (la acestea energia de legatura fiind de 50+ 100 kcal/mol), ci de natura electrostatica, ceea ce nu este de mirare stiind ca sunt implicate proteine amfolite; avem de-a face asadar eu: • legaturi ionice; forte eleetrostatice de atractie intre grupuri eu sarcini

acestui tip de reactie ar fi mai putin clara cad sunt adesea solubili ~i greu de evidentiat '( se apeleaza la metode radioimunochimice

imunocomplecsii microscopic

RIA).
Dar cum, in majoritatea cazurilor reactia elementara este urmata rapid de reactii secundare, ce due la transformari mult mai usor de pus in evidenta, cercetarile care s-au tntreprins, au avut puncte de sprijin importante In aceste reactii secundare . In majoritatea cazurilor fenomenul secundar este atat de dominant Indit serveste la definirea reactiei considerate.

.electriee de semne opuse; forte eleetriee de interactiune dipol - dipol; forte de dispersie Vander Waals - London intre grupari de

atomi initial neancarcate electric dar care se pot polariza; interactiuni intre grupe de atomi hidrofobe. Struetura anticorpilor
~l

Reactiile secundare sunt mult mai usor de pus in evidenta caci se insotesc de precipitari, floculari, aglutinari, hemolize, etc. ~i

antigenilor

permite

acestea sunt usor de observat macroscopic.

reprezentare care sugereaza ~i faptul ca, desi slabe, legaturile electrostatice se manifesta in contextul
194

stereospecificitatii
195

R.M.ISAC

F..TOPOLlCEANU

D. E. CREANGA

INT~ODUCERE.iN

BIOFIZICA MOLECULARA

sr

CITOTISULARA

Nutrebuie

scapat din vedere, ca numai reactia elementara seeundare nu sunt specifice) adica ao - a(t)::: ho - h(t) (115)

este specific a (reactiile

reactii primare diferite pot antrena aceeasi reactie secundara . eu ajutorul careia se po ate ajunge Ia
0

ecuatie eu

singura

12.2.5. Cinetica formdrii imunocomplexului antigen-anticorp


In cazul eel mai simplu, al unui anticorp monovalent ~i al unei haptene libere (singurul caz real cunoscut este eel al brucelozei) ecuatia diferentiala care a fost propusa sa descrie

variabila - aCt). Astfel ecuatia de mai sus devine:

da (t) ::: _ k dt

[a 2 (t)+

(h

0-

a0

)t (t)]

16)

Se separa variabilele pentru a integra:

cinetiea proeesului (cinetica de ordinul doi): A+H=AH eorespunde, de fapt, cineticii concentratiei de anticorp: (113)
,

(117)

Folosind conditiilc initiale si In ipoteza unui exces de .antigeni (caz apropiat de situatiile real e), se obtine: (114) In a(t)to aolaoat+ho-ao~

unde: a(t) ~i h(t) sunt concentratiile de anticorp si respectiv de antigen la momentul de timp t iar kl este constanta de cuplare a eelor doi reactanti. La momentul initial to=O aeeste concentratii au valorile ao ~i ho iar consumul estel: 1 (0 molecula de anticorp la
196

r«)

() ')~:::-kltho-ao

;"

(118)

ceea ce reflects de anti corp.

variatie exponentiala In timp a concentratiei

In forma logaritmica, relatia dedusa mai sus este foarte


I

molecule de antigen) permite scrierea relatiei de legatura:

convenabila

pentru determinarea
197

experimental a a raportului

R. M.ISAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE iN BIOFIZICA MOLECULARA ~I CITOTISULARA

concentratiilor de la momentul initial precum si a constantei de viteza a procesului (daca se cunoaste eel putin una din aceste concentratii initiale), Practic se lucreaza prin marcare eu izotopi radioactivi in eazul evaluarilor assay), radioimunologice datele numeriee (RIA prelucrandu-se

avand in vedere

ca

graficul este

dreapta

Reversibilitatea

procesului

este

mult

mai

putin

probabila, constanta de viteza a desfacerii imunocomplexului


fiind cu multe ordine de viteza mai mica decat cea complexului antigen-anti corp.

a formarii

radioimmunologycal

prin atdt de cunoscuta metoda a celor mai mici patrate (pentru obtinerea numerica a pantei si taieturii la ordonata a dreptei celei mai probabile). Daca initial cele doua concentratii egale atunci ecuatia diferentiala devine: de reactanti sunt

1
a(t)

(119)

iar integrarea conduce 1a:

Figura 70. - Dependenta liniara de timp a inversului concentratiei anticorp in cazul cand concentratiile initiate de reactanti sunt egale

de

1 1 ----+kjt a (t) - a 0

(120)

12.2.6. Cinetica desfacerii complexului imunologic

ceea ce conduce 1a evaluari ~i mai rapide ale concentratiilor initiale

Ecuatia diferentiala propusa pentru descrierea acestei faze a a procesului corespunde unei cinetici de ordinul intai:

si

ale

eonstantei

vitezei

de

formare

198

199

R.M.ISAC

F. TOPOLICEANU

D. E. CREANGA

INTRODUCERE iN BIOFIZICA r.WLECULARA ~I CITOTISULARA

(121) unde: x(t) este concentratia de imunocomplex Ia momentul de la momentul

x(t)

timp t iar Xo este valoarea acestei concentratii initial considerat, to#O. Prin integrare rezulta:

(122)

sau:

Figura 71.- Scaderea in timp a concentratiei de complex antigen - anticorp

(t ) = . x

e-

(t - to)
0

(123) simpla exponentiala (Figura a constantei de

Pentru

evidentierea

interactiunii

antigen-anti corp

se poate

ceea ce grafic se reprezinta ca


j

utiliza fenomenul de difuzie prin membrana dializanta.

71) ~i permite determinarea viteza k2• Cunoscand cele doua

rara dificultati

12.2.7. Determinarea constantei de echilibru a procesului constante de viteza rezulta imediat imunologic pe baza difuziei prin membrana dializantd

constanta de echilibru a acestei interactiuni: Prin cuplarea antieorpi, (124) dimensiunile haptenelor la moleculele proteice de acestora erese in raport eu cele ale

porilor unei membrane dializante, astfel ca aceasta membrana permite realizarea echilibrului de difuzie libera pentru

moleeulele mici de haptena, dar nu si pentru imuncomplecsi.

200

201