Capitolul 6

Utilizarea enzimelor industriale

Enzime în sinteza organică

Introducere
O cercetare modernă asupra catalizei nu ar fi completă fără o discuție asupra transformărilor
enzimelor catalizate. Faptul că enzimele reprezintă primii catalizatori chirali ar trebui să le asigure
un loc lângă cei mai sofisticați catalizatori artificiali. Deși poate părea ciudat faptul că catalizatorul
trebuie izolat de celule, țesut sau organe și că uneori sunt folosite organisme întregi, dezvoltarea
rapidă și succesul proceselor biocatalitice pentru sinteza produselor naturale, produsele
farmaceutice și produsele agrochimice și-au sporit enorm acceptarea printre chimiștii organici.
S-au găsit, în special, aplicații industriale deoarece multe probleme tehnice, cum ar fi stabilizarea
enzimei, imobilizarea enzimei, și regenerarea cofactorului, au fost rezolvate.
De asemenea, disponibilitatea enzimelor a fost mult îmbunătățit: din cele peste 3000 de enzime
cunoscute, câteva sute sunt accesibile comercial sau pot fi obținute cu o puritate suficientă prin
anumite proceduri. Mai mult, enzimele pot fi produse în principiu în cantități mari prin tehnici de
ADN recombinant.
Datorită proprietăților caracteristice ale enzimelor, în comparație cu reacțiile chimice utilizate,
transformările enzimatice sunt excepționale din mai multe puncte de vedere:
1. Funcționează în condiții ușoare într-un interval de pH de 5-8 la temperaturi în jur de 20–
40 ℃ în mediu apos;
2. Mulți dintre ei tolerează solvenții organici;
3. Enzimele sunt catalizatori foarte eficienți, accelerând reacțiile prin factori de 105–1012
comparativ cu reacțiile necatalizate corespunzătoare.
4. Enzimele combină adesea o selectivitate ridicată pentru reacțiile pe care le promovează și
pentru structuri pe care le recunosc cu o toleranță largă a substratului.
5. Pe lângă chimoselectivitatea lor, multe enzime prezintă un grad ridicat de diastereo-regio-
și / sau enantioselectivitate.

1
 Exemple de conversii enzimatice
Datorită disponibilității lor accesibile și ușurinței cu care pot fi manipulate, enzimele
hidrolitice au fost aplicate pe scară largă în sinteza organică. Nu au nevoie de coenzime, sunt
stabile în mod rezonabil și adesea tolerează solvenții organici. Potențialul lor pentru
regioselectivitate și mai ales pentru sinteza enantioselectivă le face instrumente valoroase.
 Acilarea
Au fost efectuate acilări regioselective ale compușilor polihidroxilați, cum ar fi
carbohidrații, glicerolii, steroizii sau alcaloizii, cu lipaze, esteraze și proteaze. Un exemplu este
Candida antarctica, lipaza B (imobilizat pe rășină acrilică).

S-a utilizat acetat de vinil pentru că această transesterificare a împins ireversibil reacția
către partea produsului, din moment ce enolul eliberat se izomerizează instantaneu în acetaldehidă.
Uneori aldehida nefavorabilă este evitată atunci când acetații de 1-etoxivinil, esterii tricloror
fluoretilici, esterii oximei sau tioesterii sunt angajați în cursurile de reacție „cvasireversibile”.
 Dezacilarea
În sinteza derivaților fosfoinozidici, hidroliza regioselectivă a uneia din cele trei grupări
butirate de către o lipază din Candida rugosa în tampon pH 7,8 conținând 5% metanol a dat
intermediarul cheie 3, din păcate fără a produce exces enantiomeric (Schema 1).

2
 Schema 1. Hidroliza regioselectivă a butiratului mai puțin împiedicat de o lipază

În exemplul prezentat în Schema 2 a fost utilizat acetat de etil ca agent de acilare și

trietilamină ca solvent. Enzima a fost din nou lipaza imobilizată din Candida antarctica B.
Racemizarea enantiomerului neconvertit (S)-4 a fost realizată cu paladiu pe cărbune. O altă
utilizare avantajoasă a enzimelor hidrolitice este hidroliza enantioselectivă a substraturilor
procirale.

Schema 2. Acilarea enantioselectivă a aminelor racemice și racemizarea in situ a

enantiomerului neconvertit

Reducerea legăturilor C-O și C-C

Carbonil reductazele care utilizează NADH sau NADPH ca cofactor au fost cu succes
aplicate pentru reducerea asimetrică a grupărilor carbonil. Alcoolul dehidrogenat cel mai frecvent
utilizat în acest scop este cel din ficatul calului, care reduce preferențial compușii carbonilici
ciclici.

3
 Schema 3. Alcool dehidrogenaza Lactobacillus brevis recombinată care catalizează
reducerea stereoselectivă a 3,5-dioxocarboxilaților cu regenerare NADPH în situ

Lactatul dehidrogenaza este un alt subgrup important de carbonil reductaze. Reduc

enantiospecific acizii a-oxo în a-hidroxi acizi. Pentru reciclarea formatului NADH, sistemul de
dehidrogenază este bine stabilit, care combină utilizarea unui substrat ieftin (HCOONa) cu
formarea coprodusului volatil CO2
Oxidarea alcoolilor și oxigenarea legăturilor C-H și C-C
Ficatul alcoolului dehidrogenat hepatic a fost utilizat pentru oxidarea enantiotopică a
mezo-diolilor, de preferință prin aplicarea unui sistem de reciclare a acetoglutaratului de
amoniu/glutamat pentru a regenera NAD+ . Hidroxialdehida asimetrică ce este produsă inițial
ciclizează la hemiacetal, care este oxidată în continuare la lactonă 15. Schema 4 prezintă o reacție
ilustrativă cu o cale alternativă de regenerare NAD+. S-a descoperit că mutanții Pseudomonas
putida prezintă activitate dienogenă arenică, care a fost exploatată în reacțiile celulare întregi
pentru prepararea regio- și enantioselectivă a cis-dihidrodiolilor începând din benzen, benzeni
substituiți și compuși policiclici sau heteroaromatici.

4
 Schema 4. Alcool dehidrogenaza hepatică de cal (HLADH) a catalizat oxidarea
stereoselectivă a unui mezo-diol cu regenerare în situ a NAD+ printr-un sistem de
reciclare a oxigenului flavin mononucleotidic (FMN)

Produsele sunt precursori de neprețuit pentru sinteza produselor naturale, după cum este
exemplificat în Schema 5. Folosind celule întregi, amestecurile racemice de cetone ciclice au fost
rezolvate cinetic sau oxidate regioselectiv.

Schema 5. Dihidroxilarea enzimatică a clorobenzenului folosind celule întregi oferă acces la

cisdihidrodioli enantiomeric puri

Schema 6. Formarea legăturii C-C stereoselective prin intermediul utilizării aldazelor DHAP

E1 = D-fructoză-1,6-bifosfat-aldolază
E2= D-tagatoză-1,6-bifosfat-aldolază
E3= L- fuculoza-1-fosfat-aldaloza
E4= L-ramnuloza-1-fosfat-aldolaza

5
 Aplicații comerciale
Este previzibilă utilizarea din ce în ce mai mare a biocatalizei în cercetare și în producția
industrială, în special în domeniul dezvoltării chirotehnologiei. Progresele în următoarele domenii
par cele mai promițătoare:
o Elucidarea situsului activ și a mecanismului de reacție al enzimelor printr-o combinație de
analiză cu raze X și modelare, poate permite predicția precisă a interacțiunii enzimă-
substrat.
o Screeningul microorganismelor din medii exotice poate duce la descoperirea unor noi
activități enzimatice promițătoare.
o Folosind tehnologia genetică modernă, proprietățile catalitice ale enzimelor ar putea fi
îmbunătățite sau personalizate pentru reacții specifice.
o Având în vedere progresul semnificativ în domeniul ingineriei căilor microbiene, este de
așteptat ca importanța acestei tehnologii să crească rapid și în viitor. Ingineria căilor
microbiene duce la biocatalizatori care permit producerea de metaboliți de dorit. Astfel, la
fel ca fermentația, această metodă reprezintă o sinteză biocatalitică într-o oală în care sunt
implicate mai multe etape enzimatice consecutive.
Au fost deja făcute numeroase contribuții importante din punct de vedere industrial în acest
domeniu, de exemplu, ingineria căilor de succes pentru carotenoizi și polichide. Alte exemple
reprezentative sunt producția de indigo, vitamina C și 1,3-propandiol. Există o mare nevoie de noi
metode biocatalitice care să producă compuși enantiomerici puri, care stau la baza sintezei și
producției de compuși biologic activi de importanță agrochimică și farmaceutică.

Enzime terapeutice
Enzimele au specificitate de reacție și substrat de neegalat, precum și o eficacitate
excepțională ca catalizatori biologici. Mai mult, acestea au fost optimizate pentru acțiunea în
organismele vii. Mai ales în cazul defectelor enzimatice codificate genetic, terapia enzimatică va
face posibilă terapia rațională. Cu toate acestea, datorită proprietăților lor moleculare specifice,

6
enzimele (sau, în general, proteinele) nu ar fi în niciun caz considerate agenți terapeutici „ideali”
din mai multe motive:

o Instabilitate: enzimele sunt polipeptide și, prin urmare, inerent labile în ceea ce privește
căldura, valori extreme ale pH-ului , denaturanți și degradări biologice. Acest lucru poate
duce la o perioadă de valabilitate limitată și la scurte perioade de înjumătățire în corpul
uman, de exemplu, datorită proteolizei din stomac și intestin. Prezența inhibitorilor
endogeni, care sunt deosebit de frecvenți în sânge pot distruge activitatea catalitică a
enzimei.
o Biodisponibilitate: deoarece suprafața moleculară a enzimelor solubile este hidrofilă,
proteinele în general nu pot trece prin membranele biologice. Astfel, medicamentele
enzimatice nu sunt disponibile oral și, cu excepția cazului în care enzima este destinată să
acționeze în cavitatea bucală sau în compartimentul gastrointestinal, trebuie aleasă o cale
de administrare intravenoasă, intramusculară sau subcutanată. În unele cazuri
administrarea prin inhalare utilizând un nebulizator s-a dovedit posibilă pentru enzimele
care acționează în căile respiratorii.
o Permeabilitatea celulară. Deoarece enzimele nu vor intra de obicei în țesut prin peretele
intestinal sau în celulele umane din fluxul sanguin, medicamentele proteice nu sunt
adecvate pentru acțiunea intracelulară. Prin urmare, sunt disponibile multe aplicații ale
enzimelor ca medicamente extracelulare. precum utilizări locale, îndepărtarea substanțelor
toxice.
o Utilizarea enzimelor umane recombinate, imunogenitatea, poate fi o problemă, mai ales
dacă procesul de producție nu asigură absența speciilor de enzime pliate sau agregate.
Reacțiile alergice pot apărea la inhalarea pulberilor enzimatice, în special cu proteaze.
o Fabricarea și caracterizarea: enzimele sunt macromolecule complexe care necesită procese
dificile de producție în mai multe etape, ceea ce duce la costuri ridicate ale medicamentului.
Mai mult, spre deosebire de moleculele mici, este posibilă doar caracterizarea analitică
limitată a produsului enzimatic final, chiar și cu tehnicile analitice de proteine extrem de
sofisticate disponibile în zilele noastre. Acest lucru face dificilă controlul calității la nivelul
produsului final, astfel încât modificările procesului pot necesita teste de bioechivalență.

7
Pe de altă parte, există câteva avantaje importante în utilizarea enzimelor în terapie:
o mai puține reacții adverse (inclusiv efecte teratogene) pentru medicamentele proteice decât
pentru compușii cu greutate moleculară mică sintetizați chimic, pentru care profilul de
siguranță al noilor entități chimice ( NCES) nu poate fi prezis.
o timpi de dezvoltare mai scurți: de la apariția medicamentelor proteice recombinante în anii
1980, s-a constatat inițial că timpul total necesar cercetării și dezvoltării unui medicament
nou de la inițierea proiectului până la aprobarea comercializării a fost în general
semnificativ mai scurt . Rata de uzură (adică , fracțiunea proiectelor de dezvoltare care
trebuie încheiate în timpul dezvoltării preclinice sau clinice) este mai mică decât pentru
compușii tradiționali cu greutate moleculară mică. Cu toate acestea, timpul mediu de
dezvoltare pentru biofarmaceutice a crescut dramatic în cursul anilor 1990 și pare să fie
convergent pentru biofarmaceutice și, prin urmare, o serie de provocări rămân pentru
dezvoltarea viitoare a enzimelor pentru utilizarea terapeutică.

Obținerea enzimelor terapeutice

În prezent, diferite sisteme de expresie sunt utilizate pentru a obține proteinele terapeutice
o Producția din linii celulare umane va oferi în mod clar cea mai bună potrivire tiparului de
modificare naturală, dar poate da naștere la probleme de contaminare virală. Cu toate
acestea, odată cu apariția unor linii celulare de producție umană extrem de dezvoltate,
imortalizate, cum ar fi celula PerC6 derivată din retina umană, utilizarea celulelor umane
ca gazde pentru producția recombinantă va crește.
o Producția din celule de mamifere [în principal linii celulare de ovar de hamster chinezesc
(CHO) și rinichi de hamster (BHK)] este adesea utilizată, în special pentru proteinele
glicozilate în cazurile în care glicozilarea afectează eficacitatea terapeutică. Glicozilarea
furnizată de celulele gazdă de mamifere poate fi oarecum diferită în detaliu, dar este în
general similară cu modelul de glicozilare umană.
o Producția din drojdie (S. cerevisiae) are ca rezultat modificări post-tradiționale diferite de
modelul uman; prin urmare, a fost utilizat până acum în primul rând pentru proteinele
fungice.
o Producția din E. coli are ca rezultat produse neglicozilate. În principiu, sistemele de
producție bacteriană au avantaje semnificative în ceea ce privește costurile de dezvoltare
mai mici, economia proceselor îmbunătățită și absența contaminării virale. Cu toate
8
 acestea, întrucât proteinele eucariote nu sunt adesea pliate corect în bacterii, este necesară
reîntoarcerea proteinei țintă din „corpurile de incluziune”. Acest lucru se poate face la
scară industrial, dar poate necesita o optimizare extinsă a procesului pentru a obține un
randament bun al produsului.
o Producția din plante transgenice sau din laptele animalelor transgenice: aceste sisteme de
producție sunt în studiu și pot oferi opțiuni interesante, în special pentru proteinele
necesare în cantități foarte mari sau pentru proteinele foarte complexe, cum ar fi factorul
de coagulare VIII. Niciun produs enzimatic terapeutic produs la animale sau plante
transgenice nu a fost încă aprobat pentru comercializare.
S-a discutat dacă terapia genică va fi o viitoare a treia generație de terapie cu proteine după
prima (terapia cu proteine naturale) și a doua (muteine proteice proiectate). În acest caz, proteinele
nu mai sunt produse într-un fermentator, ci de către pacienții înșiși după aplicarea genei de
codificare a proteinelor prin intermediul unui sistem adecvat de transfer de gene.

Clasificarea enzimelor terapeutice

a) Oxidoreductaze: Urat-oxidaza, o enzimă care catalizează oxidarea acidului uric către

alantoina mai solubilă, este prezentă în multe organisme (inclusiv mamifere), dar nu și în
primatele superioare. Un produs non-recombinant urat-oxidazic izolat din Aspergillus
flavus a fost utilizat în unele țări de mulți ani (Franța, din 1975; Italia, din 1984) pentru
profilaxia sau tratamentul hiperuricemiei la pacienții cu maligne hematologice care sunt
predispuse la riscul sindromului de liză tumorală (TLS) . Aceasta este o urgență oncologică
care apare cel mai frecvent spontan sau după chimioterapie la pacienții cu sarcini tumorale
mari, cum ar fi leucemie acută, limfom agresiv sau tumori solide voluminoase. TLS se
caracterizează prin hiperuricemie care duce la precipitarea acidului uric și la obstrucție
intraluminaltubulară, hiperfosfatemie și hipocalcemie.
b) Transferaze: singura enzimă din această clasă care este utilizată în terapie este factorul de
coagulare XIII (factor de stabilizare a fibrinei) obținut din plasma umană. Factorul XIII
este o glicoproteină care circulă în sânge ca proenzimă. În timpul etapelor finale ale
coagulării sângelui, trombina se transformă într-o formă activă numită factorul XIIla
Aceasta este o transglutaminază care, în prezența ionilor de Ca, catalizează legarea
încrucișată a monomerilor de fibrină prin formarea de legături intermoleculare e- (y-
glutamil) lizină. Deficitul de factor XIII este o boală moștenită rară caracterizată prin
9
 vindecarea slabă a rănilor și formarea anormală a cicatricilor, sângerarea din buricul
ombilical după naștere fiind cel mai frecvent simptom clinic. Deficiența factorului XIII
poate fi corectată cu perfuzii de plasmă proaspătă congelată sau concentrate umane de
factor XIII. Deși clonarea și expresia recombinantă a factorului XIII au fost raportate în
mai multe publicații încă din anii 1980, niciun preparat de factor XIII recombinant nu a
fost aprobat pentru utilizare terapeutică
c) Esterazele: factorul de activare a trombocitelor (PAF, 1-O-alchil-2-acetil-sn-glicero-3-
fosfatidil colină) este un puternic mediator fosfolipidic cu efecte pleiotropice, produs de o
mare varietate de celule.
d) Nucleazele: În bolile pulmonare caracterizate prin infecții persistente ale căilor respiratorii,
cum ar fi fibroza chistică (FC, mucoviscidoză) și bronșita cronică, suferința respiratorie și
distrugerea pulmonară progresivă sunt puternic asociate cu persistența bacteriană și
acumularea de secreții purulente vâscoase în căile respiratorii. Secrețiile infectate ale căilor
respiratorii conțin glicoproteine mucoase și cantități abundente de ADN care, ca polimer
extrem de vâscos polianion, este o cauză majoră a viscozității crescute.
Dezoxiribonucleaza umană I recombinantă reduce vâscozitatea sputei prin hidrolizarea
ADN-ului. În studiile efectuate pe pacienți cu FC cu stabilitate clinică, s-a constatat că
dornaza alfa, administrată printr-un dispozitiv de inhalare, reduce morbiditatea legată de
FC, inclusiv riscul exacerbărilor infecțioase ale tractului respirator care necesită tratament
cu antibiotice parenterale și îmbunătățește funcția pulmonară și calitatea viaţă. A fost
aprobat pentru tratamentul FC în 1993. Streptodornaza, o desoxiribonuclează obținută din
bacteriile Streptococcus, este utilizată împreună cu streptokinaza pentru debridarea rănilor,
precum și pentru tratarea ulcerelor în vederea lichefierii cheagurilor de sânge și a țesutului
mort, astfel încât acestea să poată fi ușor de îndepărtat.
e) Liazele: Există doar două liaze utilizate therapeutic în prezent. Porfobilinogen dezaminaza
umană recombinantă (rhPBGD), o enzimă implicată în calea de sinteză a hemului, pentru
tratamentul porfiriei acute intermediare, o manifestare clinică a unei tulburări genetice
autozomale dominante. Rezultă o reducere cu 50% a activității enzimatice, a concentrațiilor
sanguine și urinare ale precursorilor hemului, cum ar fi porfobilinogenul, dar și un deficit
în sinteza hemului. Efectele PBDG uman recombinant, până acum, au fost demonstrate
doar în modele experimentale.

10
 Aplicațiile analitice ale enzimelor terapeutice
1) Determinarea trigliceridelor
Trigliceridele (grăsimile) sunt hidrolizate de lipază și carboxil esterază. Glicerolul este apoi
fosforilat de glicerol kinază. ADP format în această reacție este refosforilat la ATP cu
fosfoenolpiruvat și piruvat kinază. În cele din urmă, piruvatul este hidrogenat de L-lactat
dehidrogenază și urmează scăderea concentrației de NADH:
Triglicerid + 3 H20= Glicerol + 3 Acid gras
Glicerol + ATP = Glicerol 3-fosfat + ADP
ADP + Fosfoenolpiruvat = ATP + Piruvat
Piruvat + NADH + H= L-Lactat + NAD
2) Determinarea concentrației substratului
Concentrațiile substratului sunt determinate enzimatic în două moduri generale: (1) metode cu
timp fix (punct final) și (2) metode cinetice (măsurarea vitezei de reacție).
Metode cu timp fix-În cel mai simplu caz, conversia substratului catalizat de enzime este practic
completă și fie scăderea concentrației substratului, fie creșterea concentrației produsului pot fi
măsurate, de exemplu, prin absorbția luminii la o lungime de undă dată . Timpul necesar pentru
finalizarea reacției enzimatice depinde puternic de viteza maximă de reacție (V) și de constanta
Michaelis (Km) a enzimei utilizate. Testele în timp fix au nevoie de o perioadă de timp fixă, relativ
lungă și se bazează pe conversia substratului cantitativ sau aproape cantitativ. Sunt utilizate
exclusiv pentru cuantificarea substratului. Ele nu pot fi utilizate pentru măsurarea activității
enzimatice, deoarece condițiile de saturare trebuie menținute pe durata reacției.
3) Determinarea glucozei
Determinarea glucozei cu glucoză oxidază este de departe cea mai utilizată enzimă analitică
din lume. Milioane de diabetici îl folosesc zilnic, în principal în biosenzorii de mână. Pentru a
detecta glucoza cu metode optice, în prima reacție, glucoza este oxidată cu glucoză oxidază și se
formează peroxid de hidrogen:

B-D-glucoză + O2= 8-D-gluconolactonă + H2O2

4) Imunoanalize
Enzimele sunt cele mai utilizate etichete pentru imunoanalize, deoarece o singură etichetă
enzimatică poate prin amplificare catalitică să ofere copii multiple ale speciilor detectabile. Prin

11
urmare, limitele de detecție rivalizează cu cele ale testelor radioimunologice fără probleme de
stocare și eliminare asociate radioizotopilor. Imunotestele enzimatice folosesc enzime ca etichete
pentru a determina cantitatea de imunocomplex (antigen-anticorp) format. Cel mai popular test
imunologic este tehnologia testului imunosorbent legat de enzime (ELISA) care utilizează plăci
de microtitrare. Eticheta ideală pentru imunoanalize este ieftină, sigură și are proceduri simple de
etichetare. Este legat covalent de reactivul de testare în mai multe locuri pentru o sensibilitate
ridicată
Specia etichetată este stabilă și este ușor de detectat folosind instrumente ieftine care sunt ușor
automatizate. Etichetarea trebuie să aibă un efect minim asupra comportamentului de legare. În
funcție de reacția chimică catalizată de enzima respectivă, activitatea acesteia poate fi măsurată
fotometric, fluorometric sau luminometric. Enzimele pot fi legate de anticorpi utilizând astfel de
reactivi de cuplare bifuncționali precum glutaraldehidă, 3-maleinimidobenzoil-N-
hidroxisuccinimidă sau bis (- maleido) -metil eter, în funcție de natura grupurilor reactive de pe
enzimă.

Enzime utilizate pentru analiza alimentelor

Utilizarea activității catalitice a enzimelor pentru determinarea analitică datează de la mijlocul

secolului al XIX-lea. Cu toate acestea, utilizarea enzimelor pentru analiza alimentelor în forma sa
actuală a fost stabilită doar acum aproximativ 30 de ani. Acest lucru a fost posibil prin prepararea
pe scară largă a enzimelor pure, disponibilitatea fotometrelor adecvate și ieftine și elaborarea atât
a procedurilor enzimatice, cât și a metodelor de preparare a probelor. În cercetarea alimentară,
sunt determinate cantitățile diferiților constituenți alimentari, iar modificările care apar în timpul
procesării tehnologice și depozitării ulterioare sunt monitorizate. Datorită marii specificități
manifestate de enzime, metodele enzimatice sunt acum din ce în ce mai utilizate în acest scop. În
industrie, materiile prime sunt verificate, se efectuează controale de producție și sunt analizate atât
produsele finale, cât și produsele concurente.

Carbohidrați
a) Glucoza este de departe cel mai abundent zahăr și este de obicei determinată folosind
metoda hexokinazei;

D-Glucoză + ATP = ADP + Glucoză 6- fosfat

12
 Glucoză 6-fosfat dehidrogenază + Glucoză 6-fosfat + NADP = D-Glucoză 6-fosfat + NADPH
+ H+
Alte metode enzimatice pot cauza probleme din mai multe motive: de exemplu, enzimele sunt
nespecifice (glucoză dehidrogenază) sau substanțele reducătoare din probă interferează cu reacția
(metoda glucozei oxidază-peroxidază). În plus, alte metode permit determinarea simultană a
fructozei în aceeași cuvă. Glucoza este de obicei determinată împreună cu alți carbohidrați, cum
ar fi fructoza, zaharoza, maltoza și amidonul.

b) Fructoza
Enzima hexokinază acționează și asupra frcutozei, care este determinată după glucoză
D-Fructoză + ATP + hexokinaza = ADP + Fructoză 6- fosfat

Fructoză 6-fosfat + Glucoză fosfat izomerază = Glucoză 6 fosfat

c) Galactoza este ușor de determinat utilizând următoarea reacției:

Galactoză dehidrogenază + D-Galactoză + NAD+ = Acid D-galactonic + NADH + H+

Această determinare este de interes numai pentru anumite produse lactate (iaurt, brânză
moale). Metoda poate fi aplicată și hidrolizaților acizi ai agenților de îngroșare, cum ar fi agar,
guar, caragenan, gumă arabică, gumă de lăcustă și gumă tragacantă.

d) Manoza
Determinarea manozei libere este, de asemenea, de puțin interes.Cu toate acestea, precum
galactoza, este o componentă importantă a agenților de îngroșare și poate fi estimată după
supunerea acestor substanțe la hidroliză acidă conform:

Hexokinază + D-Manoză + ATP = ADP + Manoză 6-fosfat

Fosfomanoză izomerază + Manoză 6-fosfat = Fructoză 6-fosfat

Acizi organici
Acizii organici și sărurile lor apar frecvent în metabolism și au o importanță diferită.
Fermentarea lor în alimente are un efect considerabil asupra gustului și poate indica prezența
acidului acetic.

a) Acidul acetic, o componentă a „acizilor volatili”, este determinat în mod specific prin
utilizarea reacțiilor următoare. Utilizarea acetat kinazei nu este adecvată deoarece această
enzimă acționează și asupra propionatului.

13
Acetil-CoA sinteză + Acetat + ATP +CoA = Acetil CoA + AMP + Pirofosfat

Citrat sintetază + Acetil – COA + Oxaloacetat + H2O = Citrat + CoA

L-Malat +NAD+ = Oxaloacetat + NADH + H+

Ultima reacție este o reacție indicator precedent. Acetatul se măsoară în vin, produse din fructe
și legume, brânză, sosuri și oțet ca o verificare pentru fermentare.

b) Acid Aspartic

Acidul aspartic este estimat în principal în suc de:

L-Aspartat + α-Oxoglutarat + GOT = Oxaloacetat + L-Glutamat

Oxaloacetat + NADH + H+ = L-Malat + NAD+

c) Acid Citric

Acidul citric este o substanță cheie în metabolism. Apare abundent în plante și, de asemenea,
în lapte. Se determină utilizând reacțiile:

Citrat (pro-35) –liaza + Citrat = Oxaloacetat + Acetat

Decarboxilarea acidului oxaloacetic în acid piruvic poate avea loc chimic sau enzimatic.
Cu toate acestea, pierderea oxaloacetatului nu duce la rezultate inexacte, deoarece piruvatul format
este, de asemenea, estimat prin utilizarea reacției L-lactat dehidrogenază. Produse din fructe și
legume, pâine, brânză, produse din carne, băuturile, vinul, ceaiul și produsele de cofetărie sunt
toate analizate pentru acid citric.

d) Acid formic
Un produs final al metabolismului bacteriilor și ciupercilor, acidul formic este utilizat ca
conservant într-o varietate de alimente. Cu toate acestea, utilizarea acestui aditiv trebuie să respecte
legea. Acidul formic este determinat conform reacției:

Format dehidrogenază + Format + NAD+ + H2O = Hidrogen carbonat + NADH + H+

Alcoolii
Enzimele sunt, de asemenea, utilizate pentru determinarea analitică a alcoolului, cum ar fi
etanolul, glicerina, alcoolii zahărului (sorbitol și xilitol), sau colesterolul, în alimente.

14
 a) Etanol- metabolismul anaerob al multor microorganisme, în special drojdia, are ca rezultat
formarea etanolului. Oxidarea sa enzimatică este mai rapidă și mai eficientă:

Etanol + NAD+ = Acetaldehidă + NADH + H+

Concentrația de etanol servește ca un indice al calității băuturilor alcoolice, cum ar fi vinul,
șampania, băuturile spirtoase și berea. Conținutul de etanol al produselor obținute din fructe indică
fie utilizarea de materii prime alterate, fie prezența drojdiei (de exemplu, în cazul chefirului).
Concentrația maximă de etanol din băuturile clasificate drept „sărace în alcool” sau „nealcoolice”
a fost stabilită prin lege.
b) Glicerolul este larg distribuit în natură, cea mai mare parte a acestuia fiind legat sub formă
de lipide. Glicerolul este determinat prin utilizarea reacțiilor:

Glicerol kinază + Glicerol + ATP = Glicerol 3 fosfat + ADP

Piruvat kinază + ADP + PEP = ATP + Piruvat

Determinarea glicerolului în vin este de o importanță considerabilă deoarece raporturile de

etanol la glicerol și de glicerol la acid gluconic indică imediat dacă vinul a fost adulterat prin
adăugarea de glicerol. Berea, băuturile spirtoase și marțipanul sunt, de asemenea, analizate pentru
glicerol.
c) Sorbitolul se obține prin reducerea fructozei; este de interes ca înlocuitor al zahărului
pentru persoanele care suferă de diabet. Determinarea enzimatică a sorbitolului poate fi
efectuată utilizând următoarea reacție, care nu este specifică, deoarece enzima acționează
și asupra altor polioli:

Sorbitol dehidrogenază + D-Sorbitol + NAD+ = D- Fructoză + NADH + H+

Această analiză poate fi făcută specifică pentru sorbitol prin măsurarea cantitativă a
fructozei produse, prin intermediul reacțiilor. Diferența dintre determinarea cantitativă a
sorbitolului prin fructoză și prin INT diaforora dă cantitatea de xilitol prezentă în probă. Alimente
dietetice, produse de fructe cu conace, înghețata și biscuiții sunt analizați pentru sorbitol. Xilitolul
este estimat în alimente dietetice, gumă de mestecat.
Xilitolul care face parte de asemenea din reacția sorbitol dehidrogenazei, poate fi măsurat
astfel:
Xilitol + NAD+ + sorbitol dehidrogenază = xiluloză + NADH + H+

15
 Enzime în ingineria genetică
Tehnicile de clonare oferă baza tehnologiei ADN recombinant și a aplicațiilor sale în
ingineria genetică, Termenul "inginerie genetică" include metode pentru formarea de noi
combinații de material genetic și pentru reintroducerea înmulțirii moleculelor de acid nucleic
recombinant într-un nou mediu nenatural. Disponibilitatea unei mari varietăți de endonucleaze de
restricție de clasa II cu specificități de secvență diferite necesită tehnologia ADN-ului recombinant.
Aplicațiile analitice ale acestei clase de enzime pot fi clasificate aproximativ după cum
urmează:
1. Analiza moleculară a cromozomului și a structurii genomului (cartografiere, gradul de
metilare)
2. Caracterizarea defectelor genetice ereditare manifestate sau latente la nivel ADN
(analiza polimorfismului)
3. . Dovezi ale degenerării celulare într-un stadiu incipient prin alterarea anumitor situri
de restricție în secvențe oncogene
4. Taxonomia virușilor sau a altor organisme cauzatoare de boli prin corelarea modelelor
caracteristice ale fragmentelor
5. Relațiile filogenetice prin compararea site-uri de restricție selectate în gene esențiale,
cum ar fi gena hemoglobinei.

Endonucleaze de restricție și metilaze

În căutarea enzimelor care stau la baza sistemelor de modificare a restricțiilor enzimele de
clasa I au fost descoperite în 1968. Primul membru al unei endonucleaze de restricție de clasa II,
Hind II, a fost găsit în 1970. Mai târziu, au fost izolate și enzimele din clasa III care au proprietăți
între cele din clasa I și clasa II. Enzimele de clasa I sunt codificate de cele trei segmente genetice
hsdS, hsdR și hsdM, exprimând funcțiile pentru specificitatea secvenței, restricționarea și
metilarea modificării. Endonucleazele și ADN metiltransferazele corespunzătoare sunt complecși
enzimatici cu masă moleculară ridicată. Aceste complexe enzimatice necesită ioni de magneziu,
ATP și SAM ca cofactori esențiali.
Enzimele de clasa II sunt exprimate ca două proteine unice din două gene diferite care
acționează ca enzime separate. Clasa Il-endonucleaze hidrolizează ambele catene de ADN la nivel
specific. Activitatea lor depinde de ioni. Metiltransferazele ADN de clasa II corespunzătoare
metilează ambele catene de ADN, independent de prezența unei reacții dependente de SAM. Un

16
exemplu de sistem de clasa II este sistemul de restricție și modificare EcoRI. Endonucleazele de
restricție de clasa II sunt de departe cele mai importante instrumente pentru sinteza ADN-ului
recombinant datorită specificității lor secvenței absolute atât pentru legare, cât și pentru scindare.
Enzimele de clasa III sunt, de asemenea, exprimate din două gene. Cu toate acestea, la fel ca
enzimele de clasa I, endonucleazele corespunzătoare și metiltransferazele ADN formează
complecși enzimatici în care ambele activități acționează simultan. Enzimele de clasa III recunosc
secvențe specifice, dar scindează în mod specific 25 până la 27 de perechi de baze în aval de
această regiune. Activitatea endonuclează depinde de magneziu, în timp ce metilarea are loc în
prezența SAM. Endonucleaze și metilaze de restricție de clasa II se găsesc în toate celulele
procariote. În conformitate cu propunerile făcute de SMITH și NATHANS, diferitele enzime sunt
abreviate luând primele litere ale numelui bacterian.

ADN polimeraze

1. Enzima E. coli polimerază 1: ADN deoxinucleotidiltransferază (ADN direcționat), se

obține din Escherichia coli.
ADN polimeraza I a Escherichia coli este utilizată predominant pentru etichetarea în vitro a
ADN-ului prin traducere de nick. Mai multe proceduri publicate urmează toate un principiu
comun. Urmele cantităților de DNază I introduc ciocniri în ADN nemarcat, expunând astfel grupări
3'-hidroxil interne. Aceste ciocănituri se deplasează spre capătul 3 'prin acțiunea secvențială
ulterioară a ADN polimerazei E. coli I. Mai întâi, enzima îndepărtează nucleotida de pe partea 5'
a nickului. În reacția cuplată care urmează, nucleotida excizată este înlocuită cu o nucleotidă
marcată la capătul 3'-terminal al nickului. Acțiunea repetată a E. coli polimerazei I înlocuiește
toate nucleotidele cu nucleotide marcate în aval de nick.
2. Enzima Klenow este cel mai mare fragment obținut prin proteoliza ADN polimerazei I a
Escherichia coli cu subtilisină
Enzima Klenow este utilizată într-o mare varietate de tehnici, cum ar fi următoarele:
1. Conversia capetelor 3’-încastrate ale fragmentelor de ADN restricționate în capete tocite
prin reacția de completare
2. 3’-Etichetare finală a fragmentelor de ADN prin utilizarea a- "P-deoxinucleotidelor
3. Sinteza celei de-a doua catene a AND-ului
4. Marcarea omogenă a fragmentelor de ADN cu oligodeoxinucleotide aleatorii ca primeri

17
 3. Transferaza terminală, numită și nucleozid trifosfat: ADN deoxinucleotidylexo-
transferază este obținută din timusul vițelului
Deoarece transferaza terminală necesită ADN monocatenar ca primer, eficiența încorporării
este cea mai mare pentru dsADN cu capete 3'-proeminente. Transferaza terminală este utilizată în
principal pentru a adăuga cozi de homopolimeri fragmentelor de ADN pentru construirea ADN-
ului recombinant. Prin utilizarea acestei metode de coadă, orice fragment de ADN dublu catenar
poate fi unit cu un vehicul de clonare. Lungimile optime pentru cozile G-C sunt de aproximativ
20-25 nucleotide, pentru cozile A-T aproximativ 100 nucleotide.

ARN polimeraze
1. Enzima SPG ARN polimerază, numită și nucleozid trifosfat: ARN nucleotidiltransferază se
obține din Salmonella typhimurium LT2 infectată cu fagul SP6
Enzima SP6 ARN polimerază este utilizată pentru sinteza specifică in vitro a transcrierilor de
ARN obținute din secvențe de ADN distincte clonate în situsul de clonare multiplă al vectorilor
PSP64 sau pSP65. În acești vectori, promotorul SP6 situat în fața situsului de clonare multiplă
direcționează inițierea specifică a reacției de transcripție. Scindarea enzimei de restricție a
vectorului la un sit de restricție unic în aval de secvențele de ADN inserate oferă un capăt discret
pentru transcrierea ARN de scurgere. Pot fi generate transcripții ARN de sens sau anti-sens de
lungime unică, în funcție de orientarea ADN-ului integrat.
2. Enzima ARN T7 diltransferază este obținută din Escherichia coli infectată cu fagul T7
Sistemul de transcripție T7 format din ARN polimerază T7 și vectorii pT7-1 și pT7-2 este
utilizat pentru sinteza in vitro a ARN-ului specific. În acest scop, șablonul ADN este clonat în
regiunile polilinker ale acestor vectori în aval de promotorul T7. Prin tăierea ADN-ului clonat la
capătul 3' înainte de începerea reacției de transcriere, se obțin transcripții de ARN de scurgere de
mărime definită. Prin utilizarea vectorilor T7 pT7-1 și pT7-2 cu regiuni polilinker orientate opus,
ADN-ul poate fi transcris în ARNm de sens și anti-sens. Sistemul T7 permite sinteza in vitro fie
a unor molecule de ARN marcate omogen, fie a unui ARN nemarcat. Cu transcripțiile ARNm
primare nemarcate, splicarea ARN-ului poate fi studiată in vivo sau in vitro. Cu ajutorul ARNm
anti-sens sintetizat in vitro, expresia genelor corespunzătoare poate fi suprimată după introducerea
acestui ARN în celulele eucariote [1750]. Sistemul T7 permite, de asemenea, sinteza transcrierilor
de ARN pur pentru studii de traducere în vitro.

18
 Nucleaze ADN

1. Enzima DNază I, numită și dezoxiribonucleaz I este obținută din pancreasul bovin

DNase I este utilizată pentru etichetarea ADN-ului prin traducere de nick. DNase I fără RNază
se aplică, de asemenea, la digestia șablon după sinteza in vitro a ARN-ului cu ARN polimeraze
codificate cu bacteriofagul SP6-, T7- sau T3.
2. Exonucleaza III, numită și exodeoxiribonuclează III se obține de la Escherichia coli
Exonuclează III este utilizată în principal pentru generarea de regiuni terminale monocatenare
din ADN-ds, acționând ca o exonuclează 3'-5 '. ADN-ul modificat în acest mod este utilizat ca
substrat pentru etichetarea ADN-ului cu enzima Klenow sau pentru studii de secvențiere.
O altă aplicație a exonucleazei III este scurtarea progresivă a ambelor fire de de ADN prin
digestia suplimentară a cozilor monocatenare generate de exonucleaza III cu nuclează S1.

ARN Nucleaze
Enzima RNaza H, numită și endoribonuclează este obținută din Escherichia coli.
Aceasta se utilizează pentru studiul funcțiilor in vivo, cum ar fi inițierea ARN-inițiată de
sinteza ADN. Mai mult, RNaza H este utilizată pentru a detecta regiunile ARN · ADN din ADN-
ul de origine natural. O altă aplicație a enzimei este îndepărtarea secvențelor poli (A) de ARNm,
ceea ce duce la o omogenitate electroforetică crescută a ARNm în electroforeza pe gel. RNaza H
poate fi, de asemenea, utilizată pentru scindarea enzimatică specifică site-ului ARN.
Enzime modificatoare
1. Fosfataza alcalină, numită și monoester fosfohidrolază este obținută din intestinul vițelului.
Fosfataza alcalină catalizează hidroliza a numeroși esteri de fosfat, cum ar fi esteri de alcooli
primari și secundari, alcooli de zahăr, alcooli ciclici, fenoli și aminoalcooli. Enzima este utilizată
preferențial pentru a scinda selectiv grupări fosfat terminale din oligonucleotide și esteri
monofosfat. În biologia moleculară, fosfataza alcalină este utilizată în principal pentru
defosforilarea capetelor ADN sau ARN 5'-fosforilate. De asemenea, fosfataza alcalină este
implicată și în etichetarea fragmentelor de ADN și ARN utilizate pentru studiile de cartografiere
și amprentare.
2. Enzima E. coli ADN ligază (care formează AMP) se obține din Escherichia coli.
ADN ligaza E. coli este utilizată în sinteza completă a cADN. Cu această nouă tehnică, sinteza
celei de- a doua catene este mediată de acțiunea sincronă a enzimelor E. coli ADN polimeraza I,
E. coli RNaza H și E. coli ADN ligaza după sinteza primei catenă cu transcriptază inversă.
19