III.

BIOSENZORI
Biosenzorii reprezintă sisteme biologico - electronice selective integrate ,
formate dintr-un receptor biologic activ, un traductor şi un sistem electronic de
amplificare, prelucrare şi afişare date. Receptorul biologic activ furnizează informaţii
analitice specifice ce permit recunoaşterea unei anumite specii biologice sau chimice
dintr-un amestec complex ce compune materia analizată, urmată de determinarea
cantitativă sau semicantitativă a acesteia. Receptorul biologic activ al biosenzorului poate
fi format din enzime, anticorpi , microorganisme, lektine, aptamer, DNA şi tesuturi umane
sau animale imobilizat pe un suport.

Fig.III.1. Schema de principiu a unui biosenzor

În urma interferenţei dintre receptorul biologic activ şi substanţa de analizat rezultă

modificări ale soechiometriei reactanţilor şi produselor de reacţie care provoacă la rîndul
lor, în funcţie de sistemele biologice active folosite, evoluţia proporţională ale valorilor
unor mărimi fizico- chimice precum : sarcină electrică, absorbţie/ emisie fotonică,
temperatură, indice de refracţie, grosime de strat, valori care sînt convertite cu
traductoare de tip: amperometric, pH-metric, detector fotometric, termic, refractometric,
piezooscilator , rezonator plasmonic în semnale electrice proportionale cu concentraţia
speciei urmărite în materia analizată. In figura III.2 este reprezentată schematic această
fenomenologie

81
Fig.III.2. Schema conversiei concentraţiei , masei sau grosimii de strat a unei specii chimice sau
biologice într-o mărime electrică proporţională prin intermediul unei structuri biologic active şi a unui
traductor adecvat

Sistemele de tip biosenzorii sînt realizări relativ recente, cu tendinţă de creştere rapidă,
ce permit determinări analitice cantitative rapide, ieftine şi in situ, suficient de precise, a
căror selectivitate sensibilitate şi limită de detecţie depind de receptorul biologic folosit
ultimelele caracteristici avînd valori deosebit de ridicate . Biosenzorii nu folosesc la
determinări reactivi liberi, generează cantităţi infime de deşeuri chimico- biologice care
sînt uşor colectate şi distruse. Un biosenzor este reutilizabil şi ca atare poate fi folosit
pentru un număr mare de analiize. De regulă receptorii biologici activi sînt de unică
utilizare dar există şi situaţii în care din motive de cost sînt păstrate suporturile şi
regenerate componentele active. Aplicaţiile de bază pentru biosenzori sînt în domeniul
medicinei, a problematicii de mediu, a industriei farmaceutice, a industriei alimentare şi
a biotehnologiei. Determinările experimentale cu biosenzori sînt simple şi nu necesită
cunostiinţe de specialitate avansate ci numai parcurgerea a mai multor etape , după cum
urmează :
1 - pornirea aparatului
2 - ataşarea receptorului biologic la sistemul electronic, urmată de recunoaşterea automată
a acestuia de către sistemul electronic precum şi de validarea (invalidarea) acestuia
3 - dozarea unui anumit volum sau cantităţi din analit pe sistemul biologic activ
4 - transformări chimico- biologice între materia analizată şi sistemul biologic activ cu
generarea de produşi de reacţie specifici .
5 - transformarea, pe baza unor dependenţe fizico chimice specifice a cantităţii
produselor de reacţie rezultate pe receptorul biologic activ , într- un semnal electric
proporţional cu concentraţia specieiei urmărite .
6 - procesarea datelor şi afişarea electronică a rezultatului măsurătorii

82
7 -îndepărtarea şi colectarea receptoarelor biologic active folosite la determinare în
scopul dezafectării chimico – biologică ulterioare a acestora şi pregătirii sistemului
pentru o nouă măsurare.
Pentru aducerea componentelor biologice active în apropierea nemijlocită a traductorului,
a asigurării unor productivităţi mari la determinări precum şi pentru asigurarea unor
condiţii optime de reacţie şi de conservare în timp a acestora , sînt folosite suporturi
solide şi diferite metode de imobilizare a componentelor biologic active pe acestea
precum: adsorbţie, absorbţie, gelificare, lipire, legare în reţea, realizarea de legături
covalente. Metoda de imobilizare trebuie să asigure o legare bună a componentelor
biologice active de suportul solid astfel încît acesta să nu difuzexe în materia de analizat
dar să rămînă totodată suficient de activ la reacţia cu materia analizată. Receptorii
biosenzorilor cu componentele biologice active imobilizate pe suprafaţă acestora se
păstrează în cutii închise şi au termene de valabilitate, inscripţionate pe cutie, ce trebuiesc
respectate. In domeniul biosenzorilor sînt încadraţi oarecum greşit şi alţi senzori ce nu au
material biologic activ dar sînt folosiţi în schimb pentru deterinarea selectivă a
concentraţiei unui component în cadrul unor procese biologice. In tabelul 1 sint prezentaţe
căteva specii chimice şi biologice importante ce pot fi determinate pe cale biosenzorială,

Tab.III.1. Detecţie biosenzorială pentru diferite specii chimice şi biologice împreună

cu senzorul corespunzător

nr. Specia chimică sau Senzorul folosit

crt. biologică
1 Glucoză biosenor amperometric
2 Uree biosenor potenţiometric
3 Lactoza biosenor amperometric
4 Sodiu electrod de sticlă ion -selectiv
5 Potasiu electrod de schimb ion -selectiv
6 Calciu electrod de sticlă ion -selectiv ionofor
7 Oxigen senzor cu stingere de fluorescenţă
8 pH electrod de sticlă ion -selectiv
9 Penicilină biosenor potenţiometric
10 Colesterol biosenor amperometric
11 Hepatita B chemoluminiscenţă - immunoassay
12 Candida Albicans piezobalantă - immunoassay

III.1. Biosenzori electrochimici

Sînt deosebit de performanţi, au aplicaţii largi şi se bazează pe detecţie

electrochimică de tip amperometric sau de tip potenţiometric.
Detecţia amperometrică este potrivită pentru detecţia unor produse de reacţie sau
de metabolism care se oxidează respectiv se reduc uşor. La metoda amperometrică este
măsurat curentul electric a unei celule miniaturale de electroliză (aceasta formează
sistemul biosenzorial) , alimentată la o tensiune electrică constantă. Conform legii lui
Faraday masa m a unei specii chimice descărcată la un electrod al celulei electrochimice
într-un timp t este proporţională cu curentul de electroliză I şi cu constanta
electrochimică k :

83
 m  k  I t (III.1)

Una din aplicaţiile cele mai cunoscute ale detecţiei amperometrice la biosenzori o
reprezintă biosenzorul de glucoză, fiind folosit la ora actuală în medicină pentru
determinarea in situ a glucozei din sînge la diabetici şi la sportivi . Senzorul de glucoză
are ca material biologic activ enzima oxidoreductază folosită pentru biocataliza reacţiei
de oxidare a glucozei cu oxigenul din aer cu obţinerea de gluconolactonă şi de peroxid
de hidrogen (H2O2) . Receptorul biologic activ pentru analiza rapidă a sîngelui se prezintă
sub forma unor fîşii de plastic de unică utilizare ce dispun la un capăt de doi electrozi
lamelari miniaturali între care se găseşte depusă oxidoreductază sub formă de gel uscat
iar la celălalt capăt fîşia dispune de pini electrici de conexiune cu sistemul electronic. La
depunerea unei picături de sînge pe zona acoperită de oxidoreductază are loc reacţia :

(III.2)

Peroxidul de hidrogen este deosebit de reactiv şi se descompune electrozii celulei

electrochimice în compunerea căreia mai intră şi o sursă de tensiune constantă asigurată
de partea electronică şi un circuit de amplificare şi măsurare a intensităţii curetului electric
ce curge prin celula de electroliză, intensitate proporţională cu cantitatea de peroxid de
hidrogen descompus şi implicit cu cantitatea de glucoză din sîngele analizat. Conversia
valorii intensităţii curentului electric din celulă cu valorile de concentraţie de glucoză
din sînge, precum şi afişarea automată a rezultatelor este realizată de partea electronică
a aparatului. Determinarea este semicantitativă şi acoperă un domeniu de la 20–500 mg/dl,
se consideră că la concentraţii <60 mg/dl indicaţia este marcată de erori destul de ridicate,
motiv pentru care nu este indicată determinarea glucozei prin această metodă în domeniul
acestor concentraţii. La om se consiteră un metabolism glucozidic normal la valori
cuprinse între 85 şi 110 mg/dl , un metabolism modificat la valori cuprinse între şi un
metabolism diabetic la valori de peste 126 mg/dl. Pe lîngă determinarea glucozei din sînge
asemenea sisteme biosenzoriale sînt folosite pentru determinarea concentraţiei fenolilor,
polifenolilor flavonoizilor, precum şi pentru dezvoltarea de substanţe cu acţiune
antioxidanţă. Mai jos sînt prezentate exemple de biosenzori uzuali ce folosesc drept
catalizator diferite enzime , rezultatul fiind obţinerea de apă oxigenată, ce se gaseste în
raport stoechiometric cu specia analizată, fiind determinată pe cale amperometrică şi
convertită de partea electronică în unităţi de concentraţie a speciei analizate

1.   D  Glucoza  O2 Glucozoxid
aza    Gluconolactona  H 2 O2 (III.3)

2. Colesterol  O2 Colesterol
  oxidaza
 Colestenon a  H 2 O2 (III.4)

84
 
3. Glutamate  O2 D Glutamatoxidaza
 Oxiglutara t  NH 3  H 2 O2 (III.5)

4. Lactate O2 Lactatoxid
 aza
 Piruvat  H 2 O2 (III.6)

5. Piruvat  HPO4 Piruvatoxi

  daza
 Acetilfosf at  CO2  H 2 O2 (III.7)

Detecţia potenţiometrică este folosită la produse ionice . Determinarea cantitativă

a ionilor se face pe baza potenţialului electric determinat la un electrod de măsură. Spre
deosebire de senzorii pe bază de detecţie amperometrică cu sezorii potenţiometrici pot
fi detectaţi produse enzimatice active ca element senzorial fiind folosit un electrod de pH
sau un electrod ion selectiv . În ultimul timp asemenea aplicaţii au dus la miniaturizări
extreme prin combinarea elementelor constructive ale tranzistoarelor ion –selectivi cu
efect de cîmp (ISFET) sau a tranzistoarelor de tip electrolit/izolator/semiconductor (EIS)
cu structuri enzimatice fiind posibilă combinarea mai multor biosenzori în matrici
miniaturale cu posibilitatea urmăririi paralele şi concomitente a mai multor parametrii.
Un alt mare avantaj al biosenzorilor otenţiometrici îl reprezintă şi faptul că la electrozi nu
iau naştere produşi de reacţie. De regulă sînt folosite enzime care hidrolizează substratul
produsele de hidroliză fiind pH- active . Pe această bază se determină urme de penicilină
, sulfoxizi de cisteină , glucozide cianogene ş.a.

III.1.1. Exemple constructive de biosenzori electrochimici

III.1.1.1. Biosenzor enzimatic amperometric şi conductometric

Biosenzorul enzimatic descris în continuare foloseşte drept catalizator enzime

de tip oxidază şi este destinat determinării rapide şi in situ a concentraţiei unor specii
chimice sau biologice.
In vederea determinării rapide şi in situ a concentraţiei sau a masei unor specii
chimice sau biologice sînt folosiţi la ora actuală biosenzori care reprezintă sisteme
biologico - electronice selective integrate , formate dintr-un receptor biologic activ, un
traductor şi un sistem electronic de amplificare, prelucrare şi afişare date. Receptorul
biologic activ dă informaţii analitice specifice ce permit recunoaşterea şi determinarea
cantitativă sau semicantitativă a unei anumite specii biologice sau chimice dintr-un amestec
complex ce compune materia analizată, componenta biologică activă a receptorului
putînd fi formată dintr-o enzimă, un anticorp, ADN, sau chiar din celule întregi. In
domeniul enzimatic reprezentativi sînt biosenzorii care folosesc drept componenta
biologică activă enzime de tip oxidaze care catalizează reacţia specifică de transformare
a speciei urmărite în produs de reacţie de tipul celor descrise de relaţiile III.5-III.7. La toate
aceste reacţii rezultă pe lîngă produsul de reacţie specific şi apă oxigenată care se
determină cantitativ pe cale amperometrică, cantitatea de apă oxigenată generată în reacţie

85
şi consumată în electroliză fiind stoechiometric proporţională cu concentraţia speciei
analizate, deci o măsura a acesteia. Cel mai reprezentativ biosenzor enzimatic este cel de
glucoză folosit la scară largă pentru determinarea glucozei din sînge la diabetici şi la
sportivi în acest scop fiind necesară o singură picătură de sînge ce se aduce pe un suport
de plastic de unică utilizare pe care se găsesc doi electrozi si o depunere uscata a unui gel
ce conţine o cantitate de glucozoxidază dozată în aşa fel încît să poată cataliza glucoza din
picătura de sînge în cîteva secunde în gluconolactonă şi apă oxigenată. Aplicarea unei
tensiuni continue constante din partea electronică celor doi electrozi face ca prin
intermediul curentului de electroliză şi a legii lui Faraday să se determine cantitatea de
apă oxigenată generată şi care la rîndul ei este o măsură a masei, şi prin aceasta a
concentraţiei, glucozei din picătura de sînge transformată integral în glucozoxidază.
La ora actuală există cereri mari de biosenzori industriali şi medicali atît pentru
glucoză , cît şi pentru alte specii de tipul celor arătate în reacţiile de mai sus . Din păcate
profitul înregistrat cu folosirea chitului biologic de unică utilizare este atit de mare încît
producătorii de biosenzori s-au orientat cu toţii spre această formă de aplicaţie. Profitul
înregistrat cu producţia şi distribuţia acestor chituri este însă atît de mare încît la
cumpărarea unui număr de la o sută de unităţi în sus partea de electronică este oferită
drept cadou. Constatînd că partea electronică este de lungă utilizare şi că vînzările scad ,
producătorii acestui segment fac presiuni asupra producătorilor de chituri biologice
determinîndu-i să nu accepte unităţi electronice universale şi să schimbe la cicluri tot mai
mici de timp tipul de cipuri specifici produşi, fiecare nou tip de cip necesitînd altă parte
electronică .
Problema tehnică pe care o rezolvă biosenzorul descris constă în realizarea unui
biosenzor enzimatic ce foloseşte drept catalizator enzime de tip oxidază sub formă lichidă
senzorul fiind destinat determinării rapide şi in situ a concentraţiei unor specii chimice
sau biologice fără folosirea unor chituri biologice de unică utilizare. Prin folosirea acestui
biosenyor se obţin următoarele avantaje:
- se obţine un biosenzor universal şi fiabil utilizabil pe termen lung la toate
tipurile de reacţii catalizate prin enzime de tip oxidaze
- se elimină chiturile de unică utilizare şi prin aceasta scade mult preţul de cost
al analizelor
- prin folosirea atît a metodei amperometrice cît şi a celei conductometrice , în
cadrul aceleiaşi determinări, creşte precizia măsurătorilor
Se prezintă în continuare un exemplu de realizare a biosenzorului în legătură cu figura
III.3. care reprezintă o vedere în secţiune a biosenzorului, figura III.4. care reprezintă o
vedere din faţă şi laterală a biosenzorului şi figura III.5. care reprezintă schema de
principiu a măsurării amprometrice şi conductometrice cu biozenzorul enzimatic.

86
 Fig.III.3. Vedere în secţiune a biosenzorului enzimatic . 1-corp, 2-unitate electronică de
achizitie , prelucrare şi afişare date, 3-unitate electronică amperometrică, 4-unitate electronică
conductometrică, 5-tastatură , 6-capsulă din plastic, o-soluţie de oxidază, 7-şurub, 8-reper, p-
perforator, f-foliei termosudată, c-con, 9 - piulită, 10- furtun siliconic, 11- cilindru spijinit
excentric, l -locas conic, 12- clichet, 13- tijă, 14,15-electrozi din platină, 16-con, 17-cupă, 18,19-
contacte electrice, e-locaş, 20-clichet cu bilă , 21-pipetă sau dozator electronic manual.

Biosenzorul enzimatic conform figurii III.3., figurii III.4. şi figurii III.5. este
format dintr-un corp 1 în care se găseşte o unitate 2 electronică de achizitie , prelucrare
şi afişare date, o unitate 3 electronică amperometrică pentru măsurarea curentului de
electroliză, o unitate 4 electronică conductometrică pentru măsurarea conductivităţii
electrolitului, o tastatură 5 pentru programarea diferitelor aplicaţii cu enzime diferite, un
sistem de dozare peristaltică pentru soluţia ce conţine o enzimă de tip oxidază compus
la rîndul lui dintr-o capsulă 6 din plastic ce conţine o soluţie o de oxidază, un şurub 7 ,
radalinat la partea superioară şi cav la partea inferioară, un reper 8 prevăzut la partea
superioară cu un perforator p pentru tăierea foliei f termosudate de închidere a capsulei 6

87
din plastic iar la partea inferioară cu un con c şi o piulită 9 pentru strîngerea şi etanşarea
unui furtun 10 siliconic subţire prin care curge oxidaza, un cilindru 11 spijinit excentric
şi cu rotaţie excentrică, acţionat manual, prevăzut cu un locas l conic pentru plasarea
cilindrului 11 spijinit excentric pe poziţia obturat a furtunului 10 , un clichet 12 cu un arc
de compresie şi o bilă în corpul 1 se mai găseşte cuplată prin apăsare o tijă 13 prevăzută
la partea inferioară cu doi electrozi 14,15 semicirculari din platină pentru măsurare
amperometrică şi conductometrică , un con 16 perforat pentru fixarea şi strîngerea
furtunului 10, o cupă 17 detaşabilă prin desfiletare ce constituie camera de reacţie şi la

Fig.III.4. vedere din faţă şi laterală a biosenzorului enzimatic 1-corp, 2-unitate electronică
de achizitie , prelucrare şi afişare date, 3-unitate electronică amperometrică, 4-unitate electronică
conductometrică, 5-tastatură , 6-capsulă din plastic, o-soluţie de oxidază, 7-şurub, 8-reper, p-
perforator, f-foliei termosudată, c-con, 9 - piulită, 10-furtun siliconic, 11- cilindru spijinit
excentric, l -locas conic, , 13- tijă, 14,15-electrozi din platină, 16-con, 17-cupă, 21-pipetă sau
dozator electronic manual.

88
partea superioară cu două contacte 18, 19 şi un locaş e de fixare elastică a tijei 13 prin
intermediul unui clichet 20 cu bilă şi arc de compresie , reperul 21 este extern
biosenzorului , poate fi o pipeta sau un dozator electronic manual, şi foloseşte pentru
dozarea precisă a unui anumit volum prescris din soluţia de analizat în cupa 17 ce
constituie camera de reacţie a biosenzorului.
Modul de lucru cu biosenzorul este următorul : se desfiletează la maxim şurubul
7 randalinat şi cav după care se întoarce aparatul cu 1800 faţă de poziţia normală de lucru,
se aşează capsula cu oxidaza în cavitatea şurubului 7 după care acesta se strînge cu mîna
pînă cînd este opusă o rezistenţă mecanică sensibilă ceea ce înseamnă că folia
termosudată a capsulei 6 a fost perforată de cuţitul p al reperului 8 iar gîtul capsulei 6
a realizat etanşarea cu reperul 8 după care se întoarce din nou biosenzorul în poziţia de
lucru şi se desfileteaz cupa 17 detaşabilă de pe tija 13, se execută cîteva rotaţii complete
spre dreapta a cilindrului 11 spijinit excentric pînă cînd pe conul 16 perforat apare o
picătură de oxidază. După aceste operaţii se înfiletează la loc cupa 17 se mai execută o
rotaţie completă a cilindrului excentric în vederea dozării , prin sistemul peristaltic, a
volumului necesar de oxidază în cupa 17 cu

Fig.III.5. Schema de principiu a măsurării amprometrice şi conductometrice cu biozenzorul

enzimatic. 2-unitate electronică de achizitie , prelucrare şi afişare date, 3-unitate electronică
amperometrică, 4-unitate electronică conductometrică, 10-furtun siliconic‚14,15-electrozi din
platină, 17-cupă, 21-pipetă sau dozator electronic manual.

oprirea cilindrului 11 spijinit excentric pe poziţia de opturare completă a futunului

siliconic, pozitie sesizată prin săgeata indicatoare de pe butonul de rotire dar şi prin clic-
ului bilei clichetului 12. Urmează dozarea în cupa 17 a volumului prescris pentru specia
de analizat cu virful unei pipete 21 de dozare sau a unui dozator electronic manual după

89
care aparatul se ţine în poziţie verticalşă şi se urmăreşte afişajul digital. Declanşarea
reacţiei catalizate duce la apariţia pimelor cantităţi de apă oxigenată, un prag minim al
concentraţiei acesteia provoacă iniţierea măsurătorilor amperometrice şi conductometrice,
acestea desfăşurîndu-se în mod alternativ prin comutare electronică automată. După 20
secunde este afişată valoarea concentraţiei rezultată din media a zeci de măsurători
amperometrice şi conductometrice prelucrate statistic de microprocesorul biosenzorului.
Volumul unei capsule de oxidază ajunge pentru sute de determinări, între două determinări
cu aceeaşi oxidază nu este necesară decît spălarea sub jet de apă a a cupei 17 . La
schimbarea oxidazei se spală tot traseul folosind în acest scop o capsulă cu apă bidistilată
care se fixează, precum s-a descris deja, pe corpul 1 al biosenzorului şi se execută mai
multe rotaţii complete a cilindrului 11 sprijinit excentric în vederea pompării apei prin
circuit. In unele situaţii este necesară înlocuirea furtunului 10 siliconic , aceste situaţii
apar la aplicaţii specifice unde volumul de oxidaze dozat este diferit faţă de aplicaţia
precedentă, acest lucru reclamă inlocuirea furtunului siliconic cu un altul cu diametrul
interior mai mare , respectiv mai mic, precum şi la uzarea furtunului 10 siliconic în zona
de compresiune - întindere ca urmare a unor pompări repetate şi numeroase de către
cilindrul 11 sprijinit excentric. La înlocuirea furunului se desface piuliţa de pe partea
opusă butonului de acţionare a cilindrului 11 după care acesta se extrage din corpul 1 al
biosenzorului urmează întoarcerea aparatului cu 1800 faţă de poziţia normală de lucru
se desfiletarea şurubului 7 , extragerea capsulei 6 şi a reperului 8 din locaşul lui ,
desfiletarea completă a piulitei 9 , extragerea furtunului siliconic de pe reperul 8, urmată
de exragerea tijei 13 din corpul 1 , extragerea conului 16 din tija 13 , scoaterea furtunului
10 de pe conul 16 la montarea noului furtun siliconic operaţiile se repetă în sens invers
celor de la demontarea furtunului 10 siliconic.

III.1.2. Biosenzori optici

Senzorii optici sînt folosiţi în principal pentru determinarea conţinutului de oxigen
din lichide pe baza analizei de fluorescenţă . Structura acestora, figura conţine o sursă de
radiaţie monocromatică , un sistem de transmisie cu fibră optică la capătul căreia este
depus un indicator a cărui intensitate a luminiscenţei este dependentă de mărimi chimice
cum este spre exemplu şi concentraţia de oxigen în lichide. Intensitatea radiaţiei de de
fluorescenţă este preluată de altă fibră optică şi condusă spre un detector fotometric care
o converteşte într-un fotocurent proportional care în partea electronică este transformat şi
afişat electronic în unităţi de concentraţie.

III.1.2.1. Fluorescenţă, fosforescenţă, chemoluminiscenţă

Fluorescenţa, fosforescenţa şi chemoluminiscenţa sînt fenomene optice de emisie
fotonică, cunoscute sub denumirea de luminiscenţă , pentru producerea lor fiind necesară
excitarea moleculelor care, prin spectre de emisie moleculară specifice, permit analize

90
chimice calitative şi cantitative ale substanţelor cărora le sînt specifice aceste fenomene.
Fluorescenţa şi fosforescenţa se aseamănă prin faptul că iau naştere prin absorţie de fotoni
, motiv pentru care poartă şi denumirea de fotoluminiscenţă . Deosebirea între fluorescenţă
şi fosforescenţă constă în faptul că fluorescenţa încetează instantaneu dacă încetează
excitaţia, iar fosforescenţa durează un timp după încetarea excitaţiei fotonice. De regulă
lungimea radiaţiei de fluorescenţă este mai mare decît lungimea de undă a radiaţiei de
excitare ( deplasare Stokes). Atunci cînd lungimea de undă a radiaţiei de fluorescenţă este
egală cu lungimea de undă a radiaţiei de excitare se vorbeşte de fluorescenţă de rezonanţă.
Chemoluminiscenţa se bazează pe spectrul de emisie a unei specii excitate ce ia naştere
în timpul unei reacţii chimice. Avantajele determinării concentraţiei speciilor pe baza
mîsurăţii fotoluminiscenţei sau a chemoluminiscenţei permite determinarea multor specii
anorganice şi organice cu sensibilităţi cu pînă la trei ordine de mărimi mai ridicate ca
cele obţinute în cadrul spectrometriei de absorbţie , limitele de detecţie situîndu-se în
domeniul ppb (10-9). Un alt avantaj al metodelor şi procedeelor bazate pe fotoluminiscenţă
o prezintă domeniul liniar mai mare decît domeniul liniar al metodeor bazate pe
spectrometrie de absorbţie. Dezavantajul principal al folosirii metodelor fotoluminiscente
îl reprezintă numărul relativ redus de substanţe ce prezintă aceste proprietăţi optice
dependente de concentraţie . Atît fenomenul de fluorescenţă de fosforescenţă cît şi de
chemoluminiscenţă stau labaza a numeroase tipuri de biosenzori.

III.1.2.1.2. Exempe constructiuve de senzori optici de fluorescenţă

III.1.2.1.2.1. Biosenzor de luminiscenţă

Senzorul de bioluminiscenţă este destinat convertirii valorii luminiscenţei unei

specii biologice din proba analizată într-o tensiune electrică proportională cu această
valoare în scopul determinări, identificării şi dozării rapide a acestei specii .
Chemoluminiscenţa alături de fluorescenţă şi de fosforescenţă stă la baza unor
metode fotometrice moderne de analiză instrumentală. Anumite specii biologice prezintă
proprietatea de emisie fotonică pe lungimi de undă specifice în domeniul vizibil atunci
cînd participă la reacţii chimice. Lungimea de undă a radiaţiei emise este specifică
naturii speciei participante la reacţie şi stă la baza analizei calitative, iar intensitatea
emisiei de bioluminiscenţă (BL) stă la baza analizei cantitative. Intensitatea radiaţiei
(BL) a unei speciei biologice este proporţională cu concentraţia (c) a acesteia :

CB = K. c (15)

Valoarea factorului de proporţionalitate (K) depinde de natura speciei şi

reprezintă totodată sensibilitatea metodei pentru acea specie.

Exemple de bioluminiscenţe cunoscute sînt:

- bioluminiscenţa folosită la identificarea petelor de sînge în criminalistică

H 2 O2  OH  Microperox
   Aminoftala t  N 2  3H 2 O  hν
idază
(III.16)

91
 - bioluminiscenţa licuriciului (Ponthius Pyralis)
2
E  LH 2  ATP  E  AMP  PPi
Mg
(III.17)
E  AMP  O2  oxiluciferină  AMP  CO2  hν (560m)

Aceasta reacţie stă la baza a numeroase chituri comerciale de luciferin-

luciferază folosite in cercetarea biologică, medicală şi farmacologică
- bioluminiscenţa bacterială folosită pentru determinarea NAD (P)H cu
flavinmononucleotid (FMN)

NAD(P)H  FMN FMN

reductaza
 NAD(P)  FMNH 2
(III.18)
FMNH 2  RCHO  O2  FMN  RCOOH  H 2 O  hν (490nm)

Reacţiile sint doar exemple reprezentative, la ora actuală există o adevărată competiţie
privind dezvoltarea de noi aplicaţii pentru bioluminiscenţă, iar în această competiţie
dezvoltarea de noi senzori competitivi este de importanţă capitală. Tot în acest context se
înscriu şi cercetări astronomice privind identificarea bioluminiscenţei de pe alte planete
ca o expresie a existenţei vietii pe aceste corpuri cereşti. In acest sens sînt folosiţi senzori
de înaltă performanţă ce au limite de detecţie a speciei luminiscente la nivelul de 10-12.
Biosenzorul de bioluminiscenţă descris este de dimensiuni reduse, compact şi
autonom destinat identificării şi determinării concentraţiei unor specii biologice care
pot da reacţii luminiscente. Materia analizată poate să se prezinte sub formă solidă,
lichidă, pulverulentă sau sub formă lichidă îmbibată în suporturi lamelare poroase. In
acest scop măsurarea radiaţiei difuze de luminiscenţă se realizează folosindu-se un
pachet opto-electronic format dintr-o lentilă colectoare, un filtru de interferenţă şi un
detector de mare sensibilitate de tip CCD, întreaga structură fiind montată intr-un tub
metalic cilindric de mici dimensiuni ce are în partea superioară electronica de interfaţare
de tip USB . Avantajele obţinute prin folosirea biosenzorului sînt următoarele :
- senzorul are o construcţie simplă şi un preţ redus
- se obţine un senzor de bioluminiscenţă miniatural compact destinat identificării şi
măsurării concentraţiei diferitelor specii biologice conectându-se direct la un
laptop
- senzorul de bioluminiscentă reprezintă un mijloc util în criminalistică pentru
identificarea şi cuantificarea urmelor de sînge invizibile cu ochiul liber folosindu-
se reacţia de bioluminiscenţă a sîngelui cu luminol.
- senzorul de bioluminiscentă permite construirea de chit-uri ieftine specializate
pe o anumită specie biologică cum ar fi de exemplu celule canceroase din plasma
sanguină pentru identificare şi dozare fiind necesară o singură picătură de sînge
cu care se imbibă o lamelă poroasă. In această execuţie senzorul are microprocesor
propriu cu soft inscripţionat şi sistem de afişare digital al rezultatelor.

Biosenzorul de lumibniscență are o structură compactă formată dintr-un corp

cilindric cav 1 ce conţine o lentilă colectoare 2, un filtru de interferenţă 3, şi un
detector CCD de mare sensibilitate 4, în partea superioară a structurii se găseşte

92
 un capac 5 ce conţine electronica de interfaţare whirless 6 cu un laptop, iar la
partea inferioară un capac 9

Fig.III.9. secţiune prin senzorul de bioluminiscenţă. 1-corp cilindric cav, 2-lentilă colectoare,
3-filtru de interferenţă, 4-detector CCD, 5-capac , 6-electronică de interfaţare, 7, 8,9-capace
interschimbabile, 10-folie poroasă , 11-probă de analizat

interschimbabil cu alte două capace 7,8 folosite la rîndul lor pentru adaptarea la condiţiile
optime de măsurare în funcţie de starea de agregare a probei. Reperul 10 reprezintă o
folie poroasă îmbibată cu proba de analizat 11 şi cu specia chimică ce provoacă
luminiscenţă, ea este folosită în cazul identificării cantităţii unui anumit component
bioluminiscent din plasma sanguină. Modul de lucru este simplu: se porneşte laptopul, se
verifică prezenţa transmisiei whirless şi se provoacă reacţia de chemoluminiscenţă prin
amestecarea speciei biologice analizate cu specia chimică ce dă emisie luminiscentă cu
acea specie biologică după care se aduce cît mai repede posibil proba analizată în dreptul
senzorului şi se execută măsurătoarea. In funcţie de starea de agregare a probei pentru
determinări se foloseşte unul din cele trei capace speciale 6,7 sau 8, astfel :
- pentru probe lichide sau pulverulente se foloseşte capacul cav 6, reacţia de
bioluminiscenţă provocîndu-se direct în cavitatea acestuia după care senzorul se
înşurubează cu grijă în capac şi se efectuează măsurarea
- pentru probe solide se înşurubează capacul 7 pe senzor, se provoacă reacţia de
biloluminiscenţă pe proba solidă prin adaugarea speciei chimice corespunzătoare
şi se aşează senzorul pe probă în aşa fel încît fereastra capacului 7 să fie in dreptul
zonei de reacţie după care se efectuează masurarea
- pentru determinări din probe sanguine se înşurubează capacul 8 pe senzor, se
provoacă reacţia de bioluminiscenţă prin picurarea unei picături de sînge proaspăt

93
 pe banda siliconică poroasă 10, de tip chit, pe care se găseşte impregnată specia
chimică de luminiscenţă, după care se introduce banda prin orificiul lateral al
capacului 8 pînă la atingerea peretelui opus şi se efectuează măsurarea

III.1.2.1.2.2. Sondă fluorometrică

Sondele fluorometrice portabilă de mici dimensiuni destinate determinării

valorii fluorescenţei unei specii chimice sau biologice şi convertirea acesteia în unităţi de
concentraţie prin intermediul unui soft specific fiind conectată la un laptop sînt deosebit
de utile la analiza in situ . Fluorescenţa, alături de fosforescenţă şi de chemoluminiscenţă,
stă la baza unor metode fotometrice moderne de analiză instrumentală. Anumite specii
chimice sau biologice prezintă proprietatea de reemisie fotonică luminoasă, pe anumite
lungimi de undă specifice, atunci cînd sînt iradiate tot cu energie luminoasă. Reemisia
are loc totdeauna la lungimi de undă superioare celor de iradiere şi poartă denumirea de
fluorescenţă atunci cînd reemisia încetează imediat după iradiere şi de fosforescenţă atunci
cînd reemisia persistă un anumit timp după încetarea iradierii. La o intensitate a radiaţiei
incidente (P0) constantă, fluorescenţa (intensitatea fluorescenţei) (F) a unei speciei
chimice sau moleculare este proportională cu concentraţia(c) a acesteia :

F= K. c (III.19)

Factorul de proporţionalitate (K) depinde de natura speciei şi reprezintă totodată

sensibilitatea metodei pentru acea specie. Ramura analitică ce se ocupă de folosirea acestei
dependenţe în scopul determinării concentraţiei poartă denumirea de fluorometrie. Unul
din principalele avantaje ale fluorometriei este dat de faptul că intensitatea radiaţiei
fluorescente este proporţională cu intensitatea radiaţiei incidente ceea ce permite ca prin
mărirea intensităţii primeia să se ajungă la o mărire la extrem a sensibilităţii metodei ceea
ce determină implicit coborîrea limitei de detecţie a urmelor speciilor chimice sau
moleculare fluorescente analizate cu unul pînă la trei ordine de mărime faţă de metodele
spectrometrice clasice de absorbţie sau de transmisie, limitele de detecţie obişnuite pentru
fluorometrie fiind situate în domeniul părţi per bilion, (1 ppb = 1:10-9) sau chiar părţi
per trilion (1ppt = 1:10-12). Un alt mare avantaj al fluorometriei este acela că domeniul de
liniaritate al relaţiei de mai sus (condiţie obligatorie pentru o precizie de măsurare
ridicată) este mult mai mare decît cel al metodelor spectrofotometrice clasice de absorbţie
sau de transmisie. De asemenea, în fluorometrie pentru analiză sînt suficiente cantităţi
extrem de mici de soluţie de ordinul μl, iar la metodele fluorometrice şi selectivitatea este
mai bună decît la cele spectrofotometrice. Dezavantajul evident al fluorometriei este acela
că se poate folosi numai pentru determinarea concentraţiei speciilor ce prezintă fenomenul
de fluorescenţă.
Pentru măsurarea intensităţii fluorescenţei (F) speciilor chimice lichide sau
gazoase, substanţa de analizat este iradiată cu o radiaţie luminoasă monocromatică in
domeniul vizibil şi măsurată cu un senzor situat la un unghi de 900 faţă de direcţia
radiaţiei incidente şi a unei electronici corespunzătoare, intensitatea radiaţie de

94
fluorescenţă situată tot în domeniul vizibil dar la o lungime de undă superioară celei a
radiaţiei incidente. Determinarea concentraţiei (c) a unei specii chimice sau biologice se
face prin extrapolarea valorii fluorescenţei (F) măsurate pe o curbă de etalonare realizată
în coordonate: fluorescenţă (F) - concentraţie (c), curbă realizată cu ajutorul unor
concentraţii cunoscute pentru acea specie.
Problema tehnică pe care o rezolvă sonda descrisă constă în realizarea unui senzor
de fluorescenţă miniatural compact şi autonom destinat măsurării concentraţiei speciilor
chimice sau biologice fluorescente de natură solidă, pulverulentă sau lichidă (ultimele
numai dacă sînt absorbite pe materiale solide sau poroase de tip folie poroasă). In acest
scop măsurarea radiaţiei de fluorescentă se realizează la 900 faţă de direcţia radiaţiei
incidente folosindu-se o sursă de radiaţie monocromatică de tip LED sau diodă laser cu
emisie în albastru şi pentru recepţie un detector de tip CCD în faţa căruia se găseşte un
filtru de interferentă, iar în faţa filtrului o lentilă colectoare, întreaga structură fiind
montată intr-un tub metalic cilindric de mici dimensiuni, atît alimentarea LED-ului cît şi
preluarea datelor se realizează printr-o interfaţa de tip USB plasată în partea superioară
a senzorului.
Folosirea sondei duce şla obţinerea următoarelor avantaje:
- se obţine un senzor de fluorescenţă miniatural compact şi cu preţ redus destinat
măsurării concentraţiei speciilor chimice sau moleculare fluorescente
- senzorul de fluorescenţă nu necesită sursă electrică de alimentare, LED-ul emiţător de
consum extrem de mic fiind alimentat prin interfaţa USB a unui calculator sau laptop,
aceeaşi interfaţă prin care se preiau şi datele de la senzor în vederea procesării acestora
- senzorul de fluorescenţă permite impreună cu o unitate de calcul externă şi un soft
specializat determinarea concentraţiei speciilor chimice sau moleculare fluorescente de
natură solidă pulverulentă şi lichidă pe teren fără a fi necesară o pregătire complexă a
probelor.
- printr-un suport prins cu două şuruburi senzorul permite analiza de fluorescenţă a unor
specii chimice picurate pe benzi de hirtie sau pe folii siliconice poroase
- folosindu-se avantajele enumerate mai sus, senzorul de fluorescenţă permite
construirea de chit -uri miniaturale, ieftine şi specializate pe anumite specii chimice,
inclusiv pe analiza plasmei sanguine folosind în acest scop o singură picătură de sînge.
Este evident că, în această situaţie senzorul devine o unitate autonomă de analiză şi
trebuie echipat cu microprocesor cu display electronic şi cu soft inscripţionat precum
şi cu sursă electrică de alimentare proprie.
In figura III.10. este prezentată o secţiune prin sonda fluorometrică. Detectorul
de fluorescenţă se compune dintr-o specie chimică sau biologică fluorescentă 1 existentă
în substanţe solide, pulverulente sau în lichide îmbibate în materiale poroase sau pulberi,
un corp 2 în care se găseşte canalul de excitare compus dintr-un un LED 3, cu emisie în
albastru şi un canal de măsurare a fluorescenţei aşezat la un unghi de 900 faţă de canalul
de excitare, format la rîndul lui dintr-o lentilă optică colectoare 4, un filtru de interferenţă
5, un senzor CCD 6 de mare sensibilitate şi o unitate de interfaţare 7 de tip USB. Pentru
măsurări pe solide şi pulberi pe corpul detectorului se prinde cu două şuruburi un corp
de adaptare 8, iar pentru măsurări la lichide imbibate pe benzi de hîrtie sau pe benzi
poroase siliconice este folosit un corp special de adaptare 9, fixat cu aceleaşi două
suruburi ca şi corpul de adaptare 8

95
Fig. III.10. secţiune prin sonda fluorometrică. 1-specie chimică sau biologică fluorescentă, 2-
corp , 3-LED, 4-lentilă optică colectoare, 5-filtru de interferenţă, 6-senzor CCD 7-unitate de
interfaţare, 8-corp de adaptare, 9-corp de adaptare

III.1.2.2. Rezonanţa plasmonică de suprafaţă (SPR)

III.1.2.2.1. Principiul rezonanţei plasmonice.
La rezonanţa plasmonică de suprafaţă ( SPR) o radiaţie monocromatică polarizată cade pe
o suprafaţă subţire de aur sau argint depusă pe faţa unei prisme de sticlă de unde este
reflectată. Fotonii radiaţiei laser incidente interferă cu electronii liberi ai aurului sau
argintului şi formează o aşa numită structură plasmonică . Dacă între electronii liberi şi
fotonii de iradiere se ajunge la rezonanţă se extrage din radiaţia reflectată energia
consumată la rezonanţă, unghiul de reflexie nemaifiind egal cu unghiul de incidenţă , în
spectrul de reflexie apărînd o pierdere energetică care generează un anumit unghi de
reflexie, ( mai mare decît unghiul de reflexie normal în absenţa condiţiilor de rezonanţă)
, a cărui valoare este proporţională cu valoarea pierderii de energie. Frecvenţa de
rezonanţa şi prin ea unghiul de reflexie sînt la rîndul lor proporţionale cu gradul de
încărcare masică a stratului metalic de aur sau argint realizat de anumite specii biologice
ce aderă specific pe faţa metalică exterioară opusă feţei interioare iradiată cu radiaţia
monocromatică. La ora actuală SPR constituie una din cele mai performante metode
pentru determinarea unor creşteri masice extrem de mici de ordinul 10-15 g ( femto grame).
În acest scop un receptor specific este imobilizat pe suprafaţa metalică exterioară de aur
sau argint iar interacţiunea dintre receptor şi un potenţial ligand ce constituie de fapt
specia sau speciile biologice urmărite, creşte proporţional gadul de încărcare masică a
stratului de metal, încărcare care este măsurată cu mare precizie prin măsurarea modificării
unghiului de reflexie cu ajutorul unui fotodetector montat pe un goniometru unghiular sau
prin intermediul unui detector Diode – Array. O modificare a condiţiilor dielectrice în
imediata vecinătate a stratului de metal depus pe prismă , figura III.11.) , prin apariţia
unei specii chimice sau biologice noi , duc la schimbarea condiţiilor de rezonanţă ceea ce
are ca efect deplasarea peak-urilor din pozitia 1 în poziţia 2 , (figura III.11.) valoarea
deplasării peak-uri fiind proporţională cu concentraţia masică a speciilor respective.

96
Moleculede precum : peptide, proteine, acizi nucleici pot fi imobilizate pe suprafaţa
unor cipuri senzoriale, care aduse in contact cu

Fig. III.11. Schema de principiu a măsurării variaţiilor mici de masă sau de grosime de strat prin
fenomenul de plasmonrezonanţă

specii chimice sau biologice ce urmeaza a fi determinate , reactioneză cu acestea rezultînd

produse de reacţie ce provoacă modificări masice pe suprafaţa acestor cipuri , modificari
care sînt sesizate prin fenomenul de rezonantă plasmonică care se materializează în
modifiări ale unghiului de refracţie ale unei radiaţii monocromatice incidente in funcţie
de natura speciei şi in modificari ale intensităţii radiaţiei refractate în funcţie de
concentraţia speciei . Semnalele electrice ale unui detector de tip Diode Array sînt
transformate ulterior prin procesarea semnalelor în informaţii analitice de natură calitativă
şi cantitativa despre speciile biologice urmărite. Aplicaţia poate fi extinsa şi la celule de
curgere cu ajutorul cărora se poat determina cinetica diferitelor aplicaţii biochimice.
Expresiile grafice se prezintă sub forma unor reprezentări in coordonate: Intensitatea
Radiaţie reflectată (RI) in funcţie de ungiul de refracţie (teta) . Un dezavanta al tehnicii
SPR îl reprezintă faptul că nivelul rezonanţei plasmonice este dependent de temperatură
ceea ce necesită o termostatare avansată a sistemelor de analiză.
Biosenzorii SPR sint folositi în bioanalitică în special ca senzori de afinitate in
analiza de interacţiune biomoleculară fără markeri (BIA) , pe suprafaţa stratului metalic
pot fi imobilizati parteneri de legare foarte diferiţi . In cazul clasic acesta este un anticorp
orientat spre o anumită proteină. Cu ajutorul anticorpilor pot fi legate însă şi celule intregi.
In figura III.12. este reprezentată schematic posibilitatea legarii pe un film de aur de
diferite tipuri de receptori .

97
Fig. III.12. Suprafaţa aurită a prismei pe care s-au fixat diferite tipuri de receptori: a- receptor, b-
anticorp pentru proteina, c- anticorp pentru structură celulară, d-hidrat de carbon ce leagă lectine,
e - receptor ce interacţionează ţintit cu structuri proteinergene

III.1.2.2.2.Tehnice de valorificare a efectului rezonanţei plasmonice de rezonanţă

In figura sint prezentate tehnici actuale de valorificare a efectului rezonanţei

plasmonice de suprafaţă . in figura III.13. a este prezentată schema de principiu a

Fig. III.13. Diferite modalităţi de valorificare a fenomenului rezonanţei plasmonice de

suprafaţă. a- clasic cu prismă cu film de aur, b- sondă cu fibră optică cu depunere exterioară de
film de aur , c-nanoparticule de aur analiyate optoelectronic

98
montajului devenit clasic cu folosirea unei prismei aurite pe o faţă . Una din tendinţele
actuale în biosenzorică este obţinerea de sisteme de măsurare miniaturale care pe cît
posibil să poată determina minimalinvaziv diversi parametrii direct în organismul viu .
Această tendinţă are şanse reale în cadrul SPR. In acest sens la tehnica SPR este avantajos
faptul că fenomenul SPR apare şi atunci cînd pe o fibră optică prin care trece lumină
este depus pe o porţiune laterală un strat subţire de aur pe care este depus un strat subţire
din substanţa biologic activă. O asemenea sondă , figura .13.b, poate fi scufundată direct
într-un recipient de lichid în vederea efectuarii de măsurători dar poate fi introdusă şi într-
un ţesut viu datorită diametrului fibrei optice a cărui valoare se situează în domeniul µm.
are şi un Dezavantajul aceastei tehnici constă în imposibilitatea realizării termostatării
ceea ce duce la anumite probleme la interpretarea rezultatelor , efectul rezonanţei
lasmonice de suprafaţă fiind puternic deendent de temperatură.
Pasul următor în miniaturizare îl constituie « nano SPR » unde aurul nu este
imbilizat pe o suprafaţa de sticlă ci introdus sub formă de nanoparticule în soluţia de
cercetat , figura III.13.c, suprafaţa acestor nanoparticule este acoperită ca în cazul clasic
cu structura de legare. Dacă pe suprafaţa acestor nanoparticule se ajunge la reacţii apar
efecte ale fenomenului SPR măsurabile prin tehnică microscopică sau prin tehnica
fibrelor optice care deschid noi posibilităţi de investigare cum ar fi de exemplu în
depistarea şi investigarea tumorilor. Este posibilă injectarea de asemenea nanoparticule în
tumoare urmată de investigarea efectului SPR prin fibră optică introdusă în ţesut.
După rezultatul analizei , rezultat care este instantaneu, prin aceaşi fibră optică poate fi
introdusă energie laser în ţesut în vederea distrugerii acestuia rezultînd concepte de
terapie noi şi deosebit de performante.

III.1.2.2.3. Exemple constructive de biosenzori bazaţi pe fenomenul

rezonantei plasmonice de suprafată

III.1.2.2.3.1. Biosenzor pentru determinarea continuă a variaţiei de masă sau a

grosimii de strat prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă

Asa cum s-a arătat în scopul determinarii grosimii filmelor în zona activă a
biosenzorilor sînt folosite aparate şi echipamente bazate pe rezonanţa plasmonică de
suprafaţă (SPR) ce permite măsurarea unor variaţii de masă extrem de mici sau a unor
grosimi de strat în domeniul nm. Tehnica folosirii rezonanţei plasmonice de suprafaţă
(SPR) pentru determinarea de creşteri de masă şi de grosimi de strat este relativ simplă şi
constă în transmiterea unei radiaţie monocromatice, emisă de o diodă laser sau de un
LED, perpendicular pe latura unei prisme echilaterale de sticlă , latură care este acoperită
cu un strat foarte subţire de metal ( zeci de nm), de regulă aur sau argint, efectul iradierii
metalului depus pe prismă are urmări asupra structurii electronice a acestuia el
răspunzînd iradierii printr-un aşa numit cimp evanescent [] care duce pe de-o parte la
modificarea valorii unghiului şi intensităţii reflecţiei specifice metalului depus . De
asemenea orice modificare a condiţiilor dielectrice în imediata vecinătate exterioară a
stratului de metal depus pe prismă , prin apariţia unei specii chimice sau biologice noi ,
duc la schimbarea condiţiilor de rezonanţă prin deplasarea peak-urilor ce reflectă
absorbşia de energie fotonică, deplasarea acestor peak-uri fiind proporţională cu

99
cresterea de masă ( de grosime de strat) pe suprafaţa exterioară a stratului metalic.
Rezonanta plasmonică de suprafaţă are utilizări importante în bioanalitică în special ca
senzori de afinitate in analiza de interacţiune biomoleculară fără markeri (BIA) , pe
suprafaţa stratului metalic pot fi imobilizati parteneri de legare foarte diferiţi . In cazul
clasic acesta este un anticorp orientat spre o anumită proteină pe care o leagă rezultînd
produse ce provoacă creşteri masice pe suprafaţa metalizată a prismei , modificari care
sînt sesizate prin fenomenul de rezonantă plasmonică care se materializează în modificări
ale unghiului de refracţie ale unei radiaţii monocromatice incidente în funcţie de masa
speciei ce s-a depus pe suprafaţa exterioară a metalului de pe prismă. Aplicaţia rezonanţei
plasmonice de suprafaţă poate fi extinsa şi la celule de curgere cu ajutorul putîndu-se
urmări cinetica diferitelor aplicaţii biochimice. In cazul unor măsurări unice expresiile
grafice se prezintă sub forma unor reprezentări în coordonate: unităţi ale intensităţii
radiaţiei reflectată (URI) in funcţie de ungiul de refracţie (  ) (fig. III.14), iar în cazuil
unor fenomene dinamice, măsurate prin intermediul unor celule de curgere , expresiile
grafice se prezintă sub forma unor reprezentări în coordonate : unităţi ale intensităţii
radiaţiei reflectată (URI) în funcţie de timpul (t) (fig. III.15). Dezavantajul pe care-l
prezintă acest procedeu este faptul că activarea suprafeţei prismei cu un ligand specific
este greoaie, operaţia necesită de regulă demontarea urmată de timpi de uscare care duc
la scăderea productivităţii procesului. De asemenea metalizarea suprafeţei prismei , după
un anumit număr de utilizări , prin depunere de aur în vacuum este scumpă şi greoaie.
Problema tehnică pe care o rezolvă biosenzorii descrişi constă în realizarea unui
echipament care permite pe baza măsurării rezonanţei plasmonice de suprafaţă (SPR)
determinarea rapida şi precisă a cresterii grosimii de strat la măsurări succesive
independente folosind lamele aurite interschimbabile sau care permite determinarea
continuă a grosimii de strat atunci cînd pe el este montată o celulă de curgere. În scopul
materializării acestor echipamente este folosită o structură modificată a aparatului clasic
de rezonanţă plasmonică de suprafaţă, astfel :
- În loc ca aurirea să fie realizată pe o faţă a unei prisme optice aceasta se realizează
pe una din feţele plan paralele a mai multor lamele din sticlă optică lamele ce au
suprafaţa aurită egală cu cea a unei laturi a prismei. În funcţie de situaţiile analitice
concrete partea aurită a lamelelor se tratează cu acelaşi sau cu mai mulţi liganzi biologici
specifici după care sînt fixate pe rînd pe prisma de măsurare folisindu-se pentru cuplarea
optică un ulei cu indice de refracţie mare.
- în locul unui goniometru electronic de mare precizie echipat cu detector optic
singular, specific aparatelor clasice, ce are ca sarcină căutarea unghiului de refracţie
obţinut ca urmare a modificării rezonanţei plasmonice, este folosit un detector
optoelectronic de tip diode - array care determină indicele de refracţie instantaneu , fără
cautare unghiulară, cu o rezoluţie foarte mare.
Din montajul experimental pentru măsurători succesive şi independente fac parte
o sursă de radiaţie monocromatică de tip diodă laser sau LED prevăzut cu un sistem de
rotaţie fără divizare unghiulară, un detector optic de tip diode - array şi o unitate de calcul
cu un program de achiziţie şi prelucrarea datelor, iar la măsurători continue în by - pass
mai este folosită suplimentar o pompă peristaltică, o celulă de curgere şi furtune siliconice
transparente cu diametru interior mic.
Folosirea acestor tipuri de echipamente duce la următoarele avantaje:

100
 - folosirea unor plăcute de sticlă optică cu feţe plan paralele, din care o faţă este
aurită, fixate pe o prismă de sticlă cu un material lichid transparent cu indice de
refracţie mare dă posibilitatea folosirii succesive şi rapidă a mai multor lamele
pregătite în prealabil cu material biologic şi prin această creşte mult
productivitatea procesului de analiză.
- evitarea auririi directe a suprafeţei prismei scade costurile şi timpii morţi prin
nefolosirea acesteia în timpul procesului de aurire şi creşte totodată durata de
viaţă a prismei optice.
- face posibilă folosirea aceleaşi echipări a prismei atît la la măsurători succesive
independente cît şi la măsurători in -situ continuie în regim de by - pass.
- folosirea unui detector optoelectronic de tip diode – array în locul unui fotodetector
monocelular montat pe un sistem goniometric de precizie duce la eliminarea celui
din urmă al cărui preţ reprezintă cca 2/3 din preţul unui aparat actual de rezonanţă
plasmonică de suprafaţă. In plus un detector diode – array face posibilă preluarea
instantanee a tuturor ungiurilor de refracţie eliminînd timpii necesari pentru
cautarea şi măsurarea unghiului de
Se dă în continuare un exemple de realizare a biosenzorilor în legătura cu:
- figura III.14. care reprezintă schema de principiu pentru determinarea rezonanţei
plasmonice de suprafaţă cu lamele de sticlă aurite
- figura III.15. care reprezintă schema de principiu pentru determinarea continuă în
regim de by-pass a variaţiei de masă sau a grosimii de strat prin rezonanţă plasmonică
de suprafaţă

Fig.III. 14 schema de principiu pentru determinarea rezonanţei plasmonice de suprafaţă cu

lamele de sticlă aurite. 1- prismă din sticlă optică, 2-lamela din sticlă, 3-depunere de aur, 4-strat
biologic activ, 5-strat subţire de ulei, 6,7-sistem de strîngere, 8-corp, 9-sursă de radiaţie
monocromatică, 10-detector optoelectronic de tip diode- array, 11-unitate electronică centrală, 12-
unitate de calcul

Echipamentul pentru determinarea grosimii de strat sau a variaţiei acesteia în timp

conform figurii III.14 este format dintr-o prismă 1 din sticlă optică, o lamela 2 din sticlă
optică avînd o depunere 3 de aur pur subţire pe una din feţe , un strat 4 biologic activ
depus pe stratul de aur, un strat 5 subţire de ulei special cu indice de refracţie ridicat folosit
pentru cuplarea prismei cu lamela de sticlă, un sistem 6 şi 7 de strîngere, un corp 8, o sursă
9 de radiaţie monocromatică de tip diodă laser sau LED un detector 10 optoelectronic de
tip diode- array pentru măsurarea unghiului de refracţie  , o unitate 11 electronică

101
centrală, şi o unitate 12 de calcul ce dispune de un soft specific pentru achizitia şi
prelucrarea datelor.

Fig.III. 15 Schema de principiu pentru determinarea continuă în regim de by-pass a

variaţiei de masă sau a grosimii de strat prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă. 1- prismă din sticlă optică,
2-lamela din sticlă, 3-depunere de aur, 4-strat biologic activ, 5-strat subţire de ulei, 6,7-sistem de strîngere,
8-corp, 9-sursă de radiaţie monocromatică, 10-detector optoelectronic de tip diode- array, 11-unitate
electronică centrală, 12-unitate de calcul, 13-celulă de curgere, 14-recipient sau reactor, 15-pompă
peristaltică, 16-motor electric.

Echipamentul pentru determinarea variaţiei grosimii de strat conform figurii III.15 este
format dintr-o prismă 1 optică din sticlă, o lamela 2 optică avînd o depunere 3 de aur
pur subţire pe una din feţe , un strat 4 biologic activ depus pe stratul de aur, un strat 5
subţire de ulei special cu indice de refracţie ridicat, un sistem 6 şi 7 de stringere cu colier
, un corp 8, o sursă 9 de radiaţie monocromatică de tip diodă laser sau LED, un detector
10 optoelectronic de tip diode- array pentru măsurarea unghiului de refracţie  , o unitate
11 electronică centrală, o unitate 12 de calcul , o celulă 13 de curgere , un recipient sau
reactor 14 cu speciile biologice urmărite, o pompă 15 peristaltică acţionată cu un motor
16 electric.

III.1.2.2.3.2. Biosenzor interferometric pentru determinarea creşterii de masă

respectiv a grosimii de strat prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă.

Biosenzorul se refera la un aparat interferometric pentru determinarea cu precizie

ridicată a creşterii de masă respectiv a grosimii de strat prin rezonanţă plasmonică de
suprafaţă. In scopul determinarii creşterii de masă respectiv a grosimii filmelor, în zona
activă a biosenzorilor , pe lingă banţe piezoelectrice sînt folosite şi aparate şi

102
echipamente bazate pe rezonanţa plasmonică de suprafaţă (SPR) ce permite măsurarea
unor variaţii de masă în domeniul 10-15g sau a unor grosimi de strat în domeniul nm.
Problema tehnică pe care o rezolvă biosenzorul constă în folosirea unei structuri modulare
cu fibră optică şi a unei structuri interferometrice de tip Michelson pentru măsurarea
lungimii de undă a radiaţiei refractate cu efecte deosebite asupra rezoluţiei, preciziei şi a
productivităţii măsurării la determinării masei sau a grosimii de strat prin tehnica
rezonanţei plasmonice de suprafaţă (SPR). In acest scop o radiaţie monocromatică emisă
de o diodă laser, prin intermediul unei fibre optice , este divizată în două fascicule paralele
, unul din fasciculele optice (de referinţă) ocoleşte printr-o fibră optică structura de
măsurare a ungiului de refracţie prin tehnica SPR şi ajunge într-un sumator optic.
Celălalt fascicul (de lucru) este îndreptat prin intermediul altei fibre optice spre sistemul
de rezonantă plasmonică de suprafaţă, unde cade perpendicular pe o faţă transparentă a
unei prismei optice, se reflectă pe o depunere de aur sau argint depusă în strat subţire pe
o altă faţă a prismei şi părăseşte prisma prin a treia faţă transparentă a acesteia ajungînd
la o lentilă optică convergentă ce focalizează radiaţia pe o fibră optică care la rîndul
ei se uneşte prin intermediul unui sumator cu fibra optică ce transportă fasciculul de
referinţă, cele două semnale luminoase căzînd după unire pe o oglindă semitransparentă
a unui interferometru de tip Michelson. Atunci cînd drumurile optice parcurse de cele două
fascicule sînt identice este indeplinită condiţia de interferenţă , intensităţile luminoase se
sumează , iar semnalul detectorului, dat sub formă unui fotocurent, este maxim. Devierea
unghiului de refracţie a fasciculului luminos de la valoarea unghiulară iniţială, ca urmare
a cresterii masei depuse pe stratul de aur sau argint, face ca acesta să cadă la rîndul lui
sub un alt unghi pe lentila optică de focalizare şi corespunzător şi focalizarea pe fibra
optică să aibă loc sub alt unghi. Corespunzător drumul parcurs în fibră prin reflexie totală
repetată pe pereţii (modul specific de transmitere a radiaţiei luminoase prin fibre optice)
este diferit faţă de situaţia anterioară, (fig.III.16). În condiţiile măririi ungiului de
incidenţă a radiaţiei în fibra optică fasciculul luminos de lucru parcurge un drum mai
lung şi soseşte cu o întîrziere faţă de un fascicul cu un unghi de incidenţă anterior mai
mic, corespunzător este diminuat şi semnalul electric al detectorului . În structura
interferometrică de tip Michelson drumului optic mai lung parcurs de fasiculul de lucru
este compensat de deplasarea proporţională prin intermediul unui piezomotor a unei
oglinzi cu reflexie totală fiind posibilă obţinerea unor interferograme , în coordonate
.intensitate reflectată – timp care la rîndul lor sînt convertite în spectrograme, în
coordonate intensitate – frecvenţă prin intermediul transformatei Fourier. Din aceste
spectrograme se obţin , prin extrapolarea automată a peak-urilor pe abscisă, valorile
frecvenţelor , care corespund valorilor unghiurilor de refracţie (  ) din diagrama clasică
SPR. Rezoluţia de măsurare obţinută prin structura conform invenţiei se situează la nivelul
jumătăţii valorii lungimii de undă folosite pentru iradiere (λ/2) (rezoluţia maximă ce se
poate obţine la interferometria optică) şi este cu cca 10 -102 ori mai bună decît la măsurarea
goniometrică clasică a ungiului de refracţie cu efect direct şi asupra preciziei de măsurare
a masei respectiv a grosimii de strat a speciilor urmărite. Prin folosirea acestui sistem
interferometric obţin următoarele avantaje:
- este posibilă măsurarea masei şi a grosimii de strat cu rezoluţii şi precizii net superioare
faţă de metoda clasică a măsurării unghiului de refracţie

103
- măsurarea are loc în mod continuu nefiind nevoie de goniometrarea manuală sau
automată a unghiului de refracţie cu efecte deosebit de favorabile asupra proceselor
cinetice
- prin măsurarea instantanee a cca 103 valori diferite de frecvenţă , caracteristică specifică
sistemelor interferometrice cu transformată Fourier, viteza de determinare
experimentală creşte enorm cu aproximativ acelaşi ordin de mărime
- se obţine un raport semnal/zgomot foarte bun caracteristic metodelor spectrale
cu transformată Fourier
In continuare este preyentat un exemplu de realizare a biosenzorului în legătură cu figurile
prezentate mai jos ce reprezintă :
- Fig.III.15. - Schema de principiu a sistemului interferometric de măsurare a
masei respectiv a grosimii de strat prin rezonanţă plasmonică de suprafaţă
- Fig.III.16. - Schema de principiu a transmiterii radiaţiei luminoase reflectate printr-o
fibră optică

Fig.III.15. Schema de principiu a sistemului interferometric de măsurare prin rezonanţă plasmonică de

suprafaţă.. 1-sursă de radiaţie de tip diodă laser, 2-fibră optică, 3-divizor optic, 4 - fibră optică, 5-fibră
optică , 6-prismă optică, 7-depuneresubţire de aur sau de argint, 8-strat de aderenţă, 9-substanţa activă , 10-
structură chimică sau biologică urmărită, 11-lentilă de focalizare , 12-fibră optică, 13-sumator optic , 14-
fibră optică, 15-oglindă semitransparentă, 16-oglindă mobilă cu reflexie totală , 17-motor piezoelectric
liniar, 18-oglindă fixă cu reflexie totală , 19-detector fotoelectric, 21-unitate electronică centrală, 22-unitate
de calcul

104
Biosenzorul interferometric se prezintă sub forma unei structuri modulare formată dintr-
o sursa 1 de radiaţie de tip diodă laser, o fibră 2 optică ce este scindată prin intermediul
unui divizor 3 optic într-o fibră 4 optică pentru transmiterea unui fascicul luminos de
referinţă şi o fibră 5 optică pentru transmiterea unui fascicul luminos de lucru, o prismă
6 optică cu o depunere 7 subţire de aur sau de argint peste care este depus un strat 8

Fig.III.16. Schema de principiu a transmiterii radiaţiei luminoase reflectate printr-o fibră optică . 6-
prismă optică, 7-depuneresubţire de aur sau de argint, 8-strat de aderenţă, 9-substanţa activă , 10-structură
chimică sau biologică urmărită, 11-lentilă de focalizare , 12-fibră optică,

de aderenţă împreună cu substanţa 9 activă pentru fixarea structurii 10 chimice sau

biologice urmărite, o lentilă 11 de focalizare , o fibră 12 optică de transmisie a fasciculului
luminos de lucru, un sumator 13 optic , o fibră 14 optică, un interferometru Michelson
format la rîndul lui dintr-o oglindă 15 semitransparentă, o oglindă 16 mobilă cu reflexie
totală , un motor 17 piezoelectric liniar, o oglindă 18 fixă cu reflexie totală , un detector 19
fotoelectric, o unitate 21 electronică centrală şi o unitate de calcul 22 prevăzută cu un
program de calcul pentru achiziţia şi prelucrarea datelor precum şi pentru transformata
Fourier.

III.1.2.2.3.3. Biosenzor portabil cu fibră optică pentru determinarea variaţiilor mici

de masă respectiv de grosime de strat a unor specii biologic active.

Biosenzorul portabil este aparat optoelectronic portabil , de tip biosenzor, folosit

pentru determinarea variaţiilor extrem de mici de masă respectiv de grosime de strat a
unor specii biologic active. In vederea determinarii modificarilor masice si indirect a
grosimii filmelor în zona activă a biosenzorilor este folosită la ora actuală balanţa
piezoelectrică şi aparate bazate pe rezonanţa plasmonică de suprafaţă (SPR). Biosenzorul
descris în continuare, bazat pe rezonanţa plasmonică de suprafaţă (SPR), permite
determinarea într-un timp scurt a grosimii de strat a unor specii biologic active. În acest
scop este folosit un sistem optoelectronic portabil monobloc ce are la un capăt sistemul
electronic de procesare şi afişare date iar la celălalt capăt o sondă optică de rezonanţă

105
plasmonică de suprafaţă ce se scufundă în mediul urmărit. Aparatul este format dintr-o
sursă de radiaţie monocromatică de tid LED sau diodă laser ce transmite radiaţia luminoasă
printr-o fibră optică flexibilă la un cuplor optic ce permite conectarea rapidă şi pe rînd
a unor sonde interschimbabile de rezonanţă plasmonică de suprafaţă ce se prezintă sub
formă unor de tije cilindrice , cu cămaşă inoxidabilă şi pat polimeric în care sint distribuite
circular un pachet de dousprezece fibre optice fibre optice în jurul unei fibre optice
centrale . La capătul opus fixării în cuplorul optic sonda prezintă o suprafaţă circulară
plană pe care este depus un strat subţire de aur pur iar peste acesta este depus în laborator
un strat subţire ce contine componentele biologic active ce urmează a interacţiona cu
specia sau speciile urmărite. In urma iradierii luminoase a stratului subţire de aur dinspre
cele dousprezece fibre optice are loc excitarea plasmonică de rezonanţă iar răspunsul
sistemului este transmis prin fibra optică centrală, sub forma unei anumite valori a
unghiului de refracţie determinat de către un detector optoelectronic de tip şir de
fotodiode (diode – array) ce are în compunere cca 4.000 de fotodiode. Detectorul
converteşte valoarea unghiului de refracţie intr-un fotocurent , a cărui valoare reflectă
valoarea acestui unghi care la rîndul ei este proportională cu modificarea grosimii
stratului biologic activ
Avantaje le folsirii acestui tip de biosenzor sunt:
- se realizează un biosenzor optoelectronic portabil bazat pe fenomenul de rezonanţă
plasmonică de suprafaţă folosit pentru determinarea creşterilor de masă sau a
grosimii de strat la măsurări rapide in -situ
- se pune la punct un sistem de lucru cu chituri interschimbabile , folosind în acest
scop nişte sonde cu pachete de fibră optică, care permite pregătirea prealabilă a
mai multor substraturi active biologic fiind posibil lucrul în serie, determinările
durînd în aceste condiţii maxim citeva zeci de secunde fiecare.
- se elimină prisma optică din sistemul clasic de măsurare
- folosirea unui detector optoelectronic de tip diode - array, de înaltă rezoluţie, face
posibilă preluarea instantanee a tuturor ungiurilor de refracţie eliminînd timpii
necesari pentru cautarea şi măsurarea unghiului de refracţie iar la măsurări
cinetice elimină prezenţa unui sistem scump de goniometrare automată.
Se prezintă în continuare biosenzorul descris în legătură cu: figura III.17. care reprezintă
o vedere a biosenzorului portabil bazat pe fenomenul de rezonanţă plasmonică de
suprafaţă . Biosenzorul pentru determinarea variaţiei de masă şi/sau a grosimii de strat este
format dintr-un corp 1 prevăzut cu display alfanumeric 2, şi tastatură 3, o sursă 4 de
radiaţie monocromatică de tip diodă laser sau LED , o fibră 5 optică de iradiere , o tijă 6
de legătură , un cap 7 optic divizor , o piuliţă 8 specială de strîngere, o sondă 9
interschimbabilă ce conţine dousprezece fibre 10 optice dispuse radial în jurul unei fibre
11 optice centrale, un strat 12 subţire de aur depus pe capătul plan al sondei 9 şi un strat
13 subţire de material biologic activ ce urmează a interacţiona cu speciile biologice
urmărite, depus la rîndul lui pe stratul de aur. Fibra optică centrală (11) este cuplată cu
un detector 14 optoelectronic de tip Diode - Array legat printr-un amplificator electronic
15 la o unitate electronică digitală de achiziţie , prelucrare şi afişare date.

106
Fig.III.17. Vedere a biosenzorului portabil bazat pe fenomenul de rezonanţă plasmonică de
suprafaţă. a-diagrama intensităţii de reflexie funcţie de valoarea unghiului de reflexie , b-diagramă
de înregistrare continuă a indicelui de reflexie funcţie de timp. 1-corp, 2-display alfanumeric, 3-
tastatură, 4-sursăde radiaţie monocromatică, 5-fibră optică de iradiere, 6-tijăde legătură, 7-cap
optic divizor, 8-piuliţă specială de strîngere, 9-sondă interschimbabilă, 10-dousprezece fibre
optice, 11-fibră optică centrală, 12- subţire de aur, 13 -strat subţire de material biologic activ, 14-
detector optoelectronic de tip Diode - Array, 15-amplificator electronic

Modul de lucru cu acest biosenzor este foarte simplu. Se prepară in laborator

componentele biologic active împreună cu substratul de fixare a acestora după care
acestea se întind în strat subţire pe stratul de aur pe tot setul de sonde 9 interschimbabile
disponibile şi se usucă la temperatura prescrisă. După uscare oricare din sonde poate fi
cuplată la aparat prin fixarea şi strîngerea acesteia cu piuliţa specială 8 pe corpul de
legătură 6. Inainte de scufundarea sondei 9 interschimbabile în mediul biologic analizat
se iniţiază electronic o diagramă de rezonanţă plasmonică pentru a oţine peak-ul de
calibrare I , fig. fig. III.17a a, după care se scufundă sonda în mediul analitic şi la un timp

107
prescris se se execută o nouă inregistrare a unei diagrame de rezonantă plasmonică pentru
obţierea peak-ului de măsurare II, fig. III.17a. Diferenţa ungiulara între Peak-u I şi peak-
ul II este convertită electronic fie in uniati de variaţie masică fie în unităţi de grosime de
strat şi afişată electronic ca atare pe display-u 2 alfanumeric al aparatului. În cazul
urmăririi unei cinetici a evoluţiei speciei biologice vizate se prescrie din tastatura 3 a
aparatului timpul de citire iar în continuare memorie se stochează perechile de valori
masă şi /sau grosime de strat la timpii corespunzători , iar pe display-ul 2 alfanumeric apare
afişată evoluţia grafică a variaţiei masei si/sau a grosimii de strat la fiecare timp citit.

III.1.2.2.3.4. Biosenzor miniatural de rezonanţă plasmonică de suprafaţă

Biosenzorul miniatural descris se bazează pe efectul de rezonanţă plasmonică de

suprafaţă şi este destinat analizei cantitative in situ specifice a unei specii biologice
ăîsau chimice dintr-un mediu lichid sau dintr-un ţesut viu. Acest biosenzor realiyează
analiza unui mediu lichid sau a unui ţesut viu , prin folosirea unei fibre optice speciale,
cu eliminarea automată a influenţei variaţiilor de temperatură asupra valorilor măsurate.
In acest scop este folosit un sistem de generare a rezonanţei plasmonice prin frolosirea
unei fibre optice speciale, cu diametrul de cca 600 nm, cuplată la o extremitate la o
sursă de radiaţie monocromatică ce asigură iradierea alternativă a zonei de lucru cu două
frecvenţe fixe de radiaţie electromagnetică , cuprinsă în domeniul vizibil, una fiind situată
în domeniul albastru şi cealaltă în domeniul roşu, iar la celălalt capăt având un film subţire
de aur , cu lungimea de cca 10 mm şi cu grosimea de cca 30- 50 nm, depus atât pe
partea frontală cît şi pe partea cilindrică a fibrei. Suprafaţa aurită se acoperă cu un strat
subţire de ligand specific speciei care urmează a se determina ( de ex. Ll folosirea
senzorului într-un sistem de detectare imunologic pe stratul de aur se va fixa anticorpul
care va lega în timpul procesului de analiză antigenul specific). Dat fiind faptul că la fibre
optice, al căror diametru este de acelaşi ordin de mărime cu ordinul de mărime al
frecvenţei radiaţiei electromagnetice transportate, transmisia luminii se face prin reflecţii
repetate pe pereţi fibrei, fenomenul de rezonanţă plasmonică de la capătul fibrei provoacă
în zona aurită o reflexie multipla fiecare sub un alt unghi faţă de cel precedent astfel încît
de obţine în final o defazare pronunţată a lungimii de undă a radiaţiei reflectate faţă de
lungimea de undă a radiaţiei incidente, defazare a cărei valoare este o măsură a intensităţii
rezonanţei plasmonice , respectiv a masei ( concentraţiei) speciei urmărite ce se găseşte
pe partea exterioară a filmului de aur .
Din cauza dimensiunii nanometrice a fibrei optice precum şi a imposibilităţii
asgurării unei temperaturi constante în majoritatea situaţiilor de măsurare in situ precum
şi datorită aceleaşi imposiblităţi de folosirea unui senzor de tempertaură pentru realizarea
corecţiei electronice a valorii măsurate cu variaţia de temperatură, la acest biosenzor
eroarea dată de influenţa temperaturii asupra valorii măsurate este eliminată prin folosirea
a două frecvenţe diferite pentru iradiere şi folosirea ca măsură a rezonanţei plasmonice a
valorii raportului celor două valori ale defazări radiaţiei reflectate faţă cele două valori
ale lungimilor de undă ale radiaţiei iniţiale. Valorile defazărilor acestor două lungimi de
undă, provocate de aceeaşi modificare masică, sînt diferite deoarece cele două radiaţii
au frecvenţe (energii) diferite, în schimb efectul influenţei temperaturii asupra valorii
măsurate este acelaşi în cazul ambelor frecvenţe şi ca urmare prin efectuarea raportului

108
matematic această influenţă se simplifică dînd valoarea unu care prin inmulţire cu
valoarea măsurătorii nu afectează rezultatul acesteia. Biosenzorului portabil mimniatural
oferă următoarele avantaje:
- se aduce un sistem de măsurare pe bază de rezonanţă plasmonică la dimensiuni
miniaturale care permite măsurări in situ în locuri greu accesibile inclusiv în
ţesuturi vii
- scade preţul de cost prin înlocuirea unei prisme optice cu o fibră optică
- creşte precizia de măsurare prin inlocuirea măsurării unghiului de refracţie, ca
expresie a modificării masice a speciei urmărite , cu măsurarea defazării între
lungimea de undă a radiaţie incidente faţă de lungimea de undă a radiaţiei
reflectate
- exprimând valoarea mărimii măsurate prin raportul celor două valori ale defazări
radiaţiei reflectate faţă cele două valori ale lungimilor de undă ale radiaţiei iniţiale
este eliminată eroarea de măsurare cauzată de influenţa temperaturii. .
Figura III.18. reprezintă schema de principiu a biosenzorului format dintr-o sursă de
radiaţie S ce conţine două diode 1 şi 2 laser, un chopper 3 optic care comută alternativ
cele două fascicule f1 şi f2 de radiaţie monocromatică, de radiaţie monocromatică, de
fecvenţe diferite spre un optocuplor 4 la care este conectată o fibră 5 optică cu
scindare, prevăzută la un capăt cu o depunere 6 subţire din aur pe o lungimea de cca
10 mm şi avînd grosimea de cca 30- 50 nm, peste care este realizată o depunere 7
subţire biologic activă ce leagă specific specia urmărită, iar la celălalt capăt cu o parte
8 electronică ce măsoară defazajul între valorile lungimilor de undă ale radiaţiei
incidente şi valorile lungimilor de undă ale radiaţiei reflectate şi efectueaza ulterior
raportul celor două valori ale defazajului în vederea eliminării erorii de măsurare
cauzată de influenţa temperaturii .

Fig..III.18. Schema de principiu a biosenzorului miniatural bazat pe efectul de rezonanţă plasmonică

de suprafaţă. S-sursă de radiaţie, 1,2-diode laser, 3-chopper optic, f1,f2-fascicule de radiaţie
monocromatică, 4-optocuplor, 5-fibră optică 6-depunere subţire din aur, 7-depunere subţire biologic
activă, 8-parte electronică

III.1.3. Microbalanţa piezoelectrică

109
 Microbalanţa piezoelectrică reprezintă un sistem de măsurare foarte sensibil a
variaţiilor de masă folosit cu precădere în aplicaţii de biosenzori dar şi în alte aplicaţii
unde se reclamă măsurarea cu mare sensibilitate a unor variaţii masice extrem de mici cu
rezoluţii de pînă la 80 .10-15g (10-15g = 1 femtogram). Microbalanţa piezoelectrică se
bazează pe modificarea frecvenţei de rezonanţă f a oscilaţie a unui detector
piezoelectric ca urmare a modificării masei m pe cele două suprafeţe 2A ale
oscilatorului conform relaţiei :

m
f  K  (III.20)
2A
unde K reprezintă o constantă ce ţine cont de frecvenţa de rezonanţă, de modulul de
forfecare şi de densitatea a cuartului .
Din punct de vedere constructiv o piezobalanţă se compune un sistem oscilator
format dintr-un generator electronic de înaltă frecvenţă şi un oscilator piezoelectric cu
două feţe planparalele, figura III.19. ce oscilează pe frecvenţa de rezonanţă, denumit cip

Fig. III.19. Schema de principiu a unei piezobalanţe . 1-piezocuarţ, 2-matial biologic activ, 3,4 –
conductori electrici, 5- parte electronică

piezoelectric pe care se depune o componenta biologic activă , fig.III.20a., ca receptor

în măsură să ducă la interferenţe cu specia urmărită ceea ce duce la modificări de masă
la suprafaţa piezocipului sesizate prin modificarea frecvenţei de rezonanţă. Peste
microcipurile de cuarţ cu depunere de biomaterial receptor sînt trecute fie cantităţi mici
din substanţa de analizat în flux continuu fie microcipul este scufundat în substanţa de
analizat unde este menţinut un anumit timp

a) b)

110
Fig. III.20. Apectul celor două feţe ale oscilatorului piezoelectric, a- faţa activă pe care se depunde
materialul ce fixează specia biologică urmărită, b- faţa opusă feţei active.

Dezavantajul folosirii microbalanţei piezoelectrice constă în faptul că un cip cu

depunere de receptor poate fi folosit o singură dată , iar frecvenţa de rezonanţă este
influentată de variaţii de temperatură. Primul dezavantaj nu este major deoarece depunerea
de specie activă receptoare pe cele două feţe ale cip-ului se face uşor iar după o scurtă
tarare electronică balanţa este funcţională. Dependenţa valorii frecvenţei de rezonanţă de
temperatură reclamă în schimb termostatări avansate şi destul de costisitoare.

111