Curs 6 - : Biocompatibilitatea Polimerilor Si Metode de Analiza

UNIVERSITATEA POLITEHNICA DIN BUCUREŞTI
Facultatea de INGINERIE MEDICALĂ
Biomateriale şi Dispozitive Medicale (BDM)

Echipamente şi Sisteme Medicale (ESM)
BIOCOMPATIBILITATEA POLIMERILOR SI
METODE DE ANALIZA
- CURS 6 -
Conf. Dr. ing. Adriana Lungu

1
Imbunatatirea biocompatibilitatii prin modificarea suprafetelor polimerice
Modificare suprafete polimerice -

a) Metode fizico-chimice
b) METODE MORFOLOGICE
c) Metode biologice
2
b) Modificari morfologice
Proprietăţile MORFOLOGICE care pot fi influenţate prin ingineria suprafeţelor:

✓ aspectul suprafeţei: culoare, strălucire
✓ structura peliculei depuse: amorfă, cristalină sau semicristalină, densitate defecte
structurale
✓topografia suprafeţei: rugozitate/ porozitate
Rugozitate = neregularitati pe suprafata
suprafata suprafata
nemodificata rugoasa
Functie de scala neregularitatilor de pe suprafata biomaterial, rugozitatea poate fi:

macrorugozitate (100 μm – mm)
microrugozitate (100 nm – 100 μm)
nanorugozitate (< 100 nm)
3
b) Modificari morfologice
Biomaterials, 01 May 2011, 32(13):3395-3403
4
b) Modificari morfologice - continuare
Rugozitatea unui material moduleaza raspunsul biologic in contact cu un implant:

❖ organizare citoschelet
❖ orientarea componentelor ECM
❖ cantitatea de ECM produsa
❖ angiogeneza
Obtinerea de substraturi polimerice cu suprafata micro- sau nanostructurata – rol

important in controlul adeziunii celulare
ex. Caracteristicile de adeziune, proliferare si diferentiere sunt
puternic stimulate pe suprafete cu structura de fagure
Advanced Drug Delivery Reviews (2013)

doi: 10.1016/j.addr.2013.09.00
5
Raspunsul celular la rugozitatea suprafetei este diferit functie de tipul celulelor =

rugozitate controlabilă :
Rugozitatea macroscopica – osteoblaste, neuroni (prelungiri axonice)

Rugozitate nanometrica (10-100 nm) – celule endoteliale
0.2 mm 0.4 mm 1.0 mm
Osteoblaste MG63 pe
membrana de policarbonat
Adeziunea celulara si
3.0 mm 5.0 mm 8.0 mm
proliferarea sunt inhibate
progresiv cu cresterea porilor
6
Lee, S.J.; Choi, J.S.; Park, K.S.; Khang, G.; Lee, Y.M.; Lee, H.B.. Biomaterials 2004, 25, 4699–4707.
Gonçalves, S., Dourado, F., & Rodrigues, L. R. (2014). Overview on Cell-Biomaterial

Interactions. Advanced Polymers in Medicine, 91–128. doi:10.1007/978-3-319-12478-0_4
7
Metode de modificare a texturii suprafetelor polimerice
Tehnologii de modificare a texturii suprafetelor in vederea imbunatatirii interactiunii

interfaciale biomaterial-celule (creste adeziunea celulelor):
❖ LITOGRAFIE OPTICA (FOTOLITOGRAFIERE)
❖ Tehnica de microcontact printing (μCP)
❖ micro- si nanopaternare prin ablatie laser
❖ gravare cu fascicul de ioni
❖ pulverizare directa solutie de polimer
Metode de structurare suprafata - aplicate uniform sau ca “pattern-uri” de ordinul

μm sau nm
8
Metode de modificare a texturii suprafetelor polimerice - continuare
FOTOLITOGRAFIEREA foto = lumina / radiatie

lithos = pietre
graphie = scriere
-proces similar cu cel utilizat in industria microelectronică (circuite integrate)
9
Etape fotolitografiere:
1. acoperire suprafata cu strat de fotorezist negativ sau pozitiv
(pe baza de polimer fotoreactiv: poliizopren / rasina novolac)
2. iradiere prin filtru (masca)
3. indepartare polimer nereactionat cu ajutorul solventilor (apa)
Journal of Science: Advanced Materials and Devices, Volume 2, Issue 1, March 2017, Pages 1-14
https://www.youtube.com/watch?v=B0g1_rr-ApI
10
FOTOREZIST NEGATIV: FOTOREZIST POZITIV:

Zonele expuse la radiatie se intaresc Zonele expuse la radiatie se dizolva in solvent
Zonele neexpuse se vor dizolva in solvent Zonele neexpuse la radiatie – raman pe material
11
https://www.slideshare.net/KumarGaurav610/photolithography-84068219
FOTOLITOGRAFIEREA in aplicatii biomedicale:
➢ permite crearea pe suprafata unui material de diferite

tipuri de pattern 3D micro – sau nanostructurate (in
domeniul μm sau sub-µm ex. 100 nm)
➢ aceste structuri pot constitui puncte de legare pentru celule
Adv. Mater. 2007, 19, 495–513
12
FOTOLITOGRAFIEREA in aplicatii biomedicale:
➢ permite crearea pe suprafata unui

material de diferite tipuri de pattern
3D micro – sau nanostructurate (in
domeniul μm sau sub-µm ex. 100 nm)
➢ aceste structuri pot constitui puncte de
legare pentru celule
A. Revzin, R. G. Tompkins and M.

a) fotolitografiere substrat Toner, Langmuir, 2003, 19, 9855
b) imagine SEM: suprafata de sticla cu pattern de chitosan (modificat anterior cu grupari fotoreactive)
c) cultivare cardiomiocite; celulele adera si formeaza linii confluente care se contracta spontan
d) celulele exprima troponina (verde) care demonstreaza potentialul contractil
13
Fotolitografia a condus la dezvoltarea altor metode avansate de texturare a suprafetelor:
Litografie de nanoimprimare (NIL)
✓ Materiale polimerice (“rezist”) sunt

transferate pe un substrat prin presarea unei
matrite, acestea ulterior pot fi tratate termic
(temperaturi adecvate substratului) fie prin
expunere la radiatie UV pentru a se obtine
structuri cu suprafata texturata 3D
S. Gilles, M. Meier, M. Prömpers, A. van der Hart, C. Kügeler, A. Offenhäusser, D. Mayer,

Microelectron. Eng., 86 (2009), pp. 661-664 14
Imbunatatirea biocompatibilitatii prin modificarea suprafetelor polimerice
Modificare suprafete polimerice -

a) Metode fizico-chimice
b) Metode morfologice
c) METODE BIOLOGICE
c) Metode biologice
MODIFICARE CU MOLECULE BIOLOGIC ACTIVE = biofunctionalizare material polimeric
Exemple de molecule biologice

care pot fi imobilizate
pe / in
substraturi polimerice
c) Metode biologice
Exemple de molecule biologice care pot fi imobilizate

pe / in substraturi polimerice pentru a promova adeziunea si cresterea celulara:
proteine, secvente peptidice, factori de crestere (GF) din ECM
Micromediul extracelular contine:

✓ biomolecule insolubile = proteine din ECM (colagen, elastina,
fibronectina) sau secvente peptidice scurte care contin domenii de
adeziune celulara (ex. RGD)
✓ biomolecule solubile: factori de crestere, citochine
M. R. Casanova, R. Reis, A. Martins and N. M. Neves,

proteine secretate de celule Mater. Horiz., 2020, DOI: 10.1039/D0MH00542H.
➢ exercita diferite functii in procesele de proliferare celulara,

vindecare leziuni etc. = molecule semnal
➢ exemple: Factori de creştere a endoteliului vascular (VEGF)
Factori de crestere a fibroblastelor (FGF)
Factori de creștere epidermica (EGF)
Factori de crestere derivati din plachete (PDGF)
Proteine morfogenetice osoase (BMP)
c) Metode biologice
M. R. Casanova, R. Reis, A. Martins and N. M. Neves, Mater. Horiz., 2020,

DOI: 10.1039/D0MH00542H.
Modificare cu molecule biologic active
Metode de 1. Adsorbtie fizica - legaturi de H
Atasare ne-covalenta
imobilizare - interactiuni hidrofobe
biomolecule - van der Waals

- forte electrostatice
2. Entrapare fizica - sisteme tip bariera
- hidrogeluri
- dispersate in matrice
3. Atasare covalenta - sisteme polimerice solubile

- suprafete solide
- hidrogeluri
Modificare cu molecule biologic active – atasare necovalenta
1. Adsorbtie fizica
✓ implica simpla adsorbtie a biomoleculelor la biomaterial prin incubarea materialelor
polimerice in solutii ce contin biomoleculele
✓ ulterior se poate realiza o reactie de reticulare pentru a imbunatati stabilitatea stratului
✓ biomoleculele se pot atasa la suprafata materialului prin interactiuni superficiale: forte Van
der Waals, forte electrostatice, interactiuni hidrofobe, legaturi de hidrogen
Avantaje:
metoda simpla si usor de aplicat
este o metoda “delicata” care nu afecteaza structura fragila a biomoleculelor
Deficiente metode de imobilizare necovalenta:

imposibilitatea de a controla: - conformatia si orientarea peptidelor dupa adsorbtia la substrat
- desorbtie peptide
- cinetica de difuzie
Adsorbtie fizica - forte electrostatice
✓ proteine cu diferite puncte izoelectrice (pI) pot forma complexe ionice cu

diversi polimeri (chitosan, gelatina sau polielectroliti sintetici)
https://www.news-medical.net/life-sciences/Overview-of-the-Isoelectric-Point.aspx
!! Aceasta adsorbtie fizica poate determina inactivarea & denaturarea proteinei adsorbite
ex. Factorul de creștere transformant (numit uneori factorul de

creștere al tumorilor sau TGF), care este o polipeptida cationica –
formeaza un complex ireversibil cu alginatul (anionic)
Adsorbtie fizica - forte electrostatice
ex. Heparina – molecula hidrofoba cu grupari negative – poate fi atasata:
(a) la un substrat hidrofob

(b) adsorbtie heparina
la un substrat incarcat pozitiv
2. entrapare fizica
- reprezinta incapsularea / incorporarea biomoleculelor (ex. medicamente) in biomaterial

-strategie pentru eliberare controlata medicamente de la suprafata unui hidrogel
- medicamentul – nu este legat covalent; este retinut de un sistem tip “bariera”
modalitate de a controla cinetica de eliberare a biomoleculelor
Raspunsul celular si tisular depind de durata expunerii si concentratia biomoleculelor

3. Modificare cu molecule biologic active - atasare covalenta
Imobilizarea covalenta de biomolecule functionale pe biomateriale implantabile →

MATERIALE BIOMIMETICE - induc un raspuns tisular specific prin modularea interactiunilor
celule - biomaterial
- se poate realiza numai pe suprafete care contin grupari de tipul –OH, -COOH, -NH2, -SH, –CH=CH2
Aceste grupari reactive pot exista de novo pe suprafata biomaterialelor sau
daca suprafata polimerica nu contine aceste grupari – este necesara modificarea suprafetelor
(metode fizico-chimice: radiatii ionizante, copolimerizare grefata, descarcari in plasma etc.)
pentru a contine aceste grupe functionale de care biomoleculele se pot atasa covalent.
Dupa atasare molecule biologice la substrat polimeric, acestea vor interactiona cu domenii
specifice de pe suprafata celulelor sau cu componenti tisulari si isi vor manifesta actiunea
Modificare cu molecule biologic active - atasare covalenta
Atasare biomolecule
a) ulterior sintezei suporturilor polimerice
Modificare cu molecule biologic active - atasare covalenta
b) in timpul sintezei matricilor polimerice prin reactii combinate conjugare /sinteza
Doua modalitati diferite:

❖ conjugare (atasare biomolecule la monomer activat ) urmata de polimerizare
❖ (co)polimerizare urmata de cuplare biomolecule
26
MULTUMESC!
27

METODE DE ANALIZA
- CURS 7 -

1
INTERACTIUNEA BIOMATERIALELOR CU FLUIDUL SANGVIN
PARTEA 1
Compozitia sangelui. Elemente figurate
Compozitie plasma. Proteine plasmatice
Plasma vs. Ser
Mecanismul coagularii
Fibrinoliza
Sisteme si substante anticoagulante
Trombogenicitate
COMPOZITIA SANGELUI
Sange 6-8% greutatea corpului
Mediul intern al organismului Limfa
Lichid interstitial
Sangele = fluid complex, constituit din 2 faze:

1. PLASMA (faza lichida) 55-60% din sangele total
2. ELEMENTE FIGURATE (faza solida) 40-45% din volum total sange
Blood = “the river of life”
3
https://www.britannica.com/science/blood-biochemistry/Plasma
Image ID : 125194602
ELEMENTE FIGURATE Media Type : Vector
Copyright : Daria Heaney
a) Eritrocite - hematii/celule rosii

-contin hemoglobina – proteina cu rol in transportul gazelor respiratorii (O2, CO2)
- membrana eritrocitelor – contine doua tipuri de proteine – ce definesc cele 4 grupe sanguine
b) Leucocite - celule albe

- sunt considerate celulele sistemului imun
-secreta anticorpi, au functii in inflamatii, fagocitoza,
reactii alergice si reactii antigen-anticorp https://www.cancer.gov/publications/dictionari
es/cancer-terms/def/erythrocyte
- pot fi granulocite sau agranulocite (limfocite si monocite)
c) Trombocite - plachete sangvine

- nu au nucleu
-rol important in hemostaza primara si in mentinerea integritatii vaselor:
adera la nivelul leziunii vasculare si elibereaza factori care
provoaca transformarea fibrinogenului in fibrina
https://en.wikipedia.org/wiki/Platelet
Compozitie plasma
apa 90-92%
proteine 6-8 % PROTEINELE PLASMATICE:

saruri 0.8 % reprezinta un amestec eterogen de proteine (~100),
faza organica
8-10% lipide 0.8 % cu proprietati fizico-chimice si functii diferite.
zaharuri 0.1 %
5
PROTEINE PLASMATICE - continuare
Albumina serica (Alb) - reprezinta 60% din totalul proteinelor plasmatice
❑ are cea mai mica dimensiune si este produsa de ficat Image ID : 116247637
Media Type : Stock Photo
❑ rol principal - asigura in proportie de 80% presiunea osmotica a sangelui Copyright : petarg
❑ adsoarbe la suprafata implantului
Imunoglobuline (Ig) - reprezinta 36% din totalul proteinelor plasmatice

❑ produse de limfocitele B (din maduva osoasa)
❑ cunoscute sub denumirea de anticorpi
❑ sunt produse de sistemul imun la diferiti antigeni
❑ rol in protectia naturala a organismului
❑ 5 tipuri diferite: IgA, IgD, IgE, IgG si IgM
❑ IgG – cea mai raspandita din serul sangvin (75-80% din totalul Ig);
https://www.news-medical.net/life-sciences
cea mai importanta in lupta contra infectiilor bacteriale si virale; singura care traverseaza placenta
Fibrinogen (Fibr) - sintetizat de hepatocite

❑ doua functii importante:
in procesul de coagulare (factorul plasmatic I al coagularii)
si in faza acuta inflamatii din tesut
❑ adsorbtia de Fibr la suprafata implantului perturba procesul de coagulare:
https://www.sigmaaldrich.com/
Fibr distrus in fragmente mici de fibrina sub actiunea trombinei,
apoi trombocitele se ataseaza la fragmentele de fibrina → cheagul solid insolubil in sange
6
PLASMA vs SER
PLASMA versus SER

https://microbiologyinfo.com/difference-between-serum-and-plasma/
8
PLASMA vs SER
Plasma sanguina = ser sanguin + factorii coagularii (FIBRINOGEN)
PLASMA https://vivadifferences.com/understanding-serum-vs-blood-plasma/
- contine 3 tipuri de proteine: ALBUMINA, GLOBULINE si FIBRINOGEN

- sange recoltat in tuburi cu anticoagulant si apoi centrifugat
- anticoagulantul inhiba formarea de cheaguri
SER
- contine 2 tipuri de proteine: ALBUMINA si GLOBULINE
- sange recoltat in tuburi fara anticoagulant, se asteapta
(~30 min coagularea) si apoi se centrifugheaza
9
PLASMA vs SER
Plasma sanguina = ser sanguin + factorii coagularii (FIBRINOGEN)
PLASMA https://vivadifferences.com/understanding-serum-vs-blood-plasma/
- contine 3 tipuri de proteine: ALBUMINA, GLOBULINE si FIBRINOGEN

- sange recoltat in tuburi cu anticoagulant si apoi centrifugat
- anticoagulantul inhiba formarea de cheaguri Unde dispare fibrinogenul?
SER
- contine 2 tipuri de proteine: ALBUMINA si GLOBULINE
- sange recoltat in tuburi fara anticoagulant, se asteapta
(~30 min coagularea) si apoi se centrifugheaza
10
MECANISMUL COAGULARII
Coagulare (latina) = a închega, a reuni
= proces complex, în urma căruia un coloid de consistenţă lichidă [sol] (sânge, lapte, latex)
se transformă într-un cheag (gel), cu o separare de o parte lichidă (ser, zer, apă)
Coagularea sângelui - proces foarte complex dar REVERSIBIL

✓ coagulare IREVERSIBILA lapte, sânge - in prezenţa tripsinei gastrice şi a calciului
! sângele nu conţine tripsină
COAGULAREA (HEMOLIZA) constă in separarea

sângelui în 2 componente:
- coagul/cheag – format dintr-o reţea de fibrină

în care sunt prinse, ca într-un năvod, elemente figurate
- ser
11
https://ib.bioninja.com.au
MECANISMUL COAGULARII - continuare
D.p.d.v. chimic are loc transformarea Fibr (solubil) în fibrină (insolubilă) sub acţiunea enzimei TROMBINA
Procesul are loc prin desprinderea şi eliberarea de fibrinopeptide A şi B din structura fibrinogenului
Apoi, se formează reţeaua stabilă de fibrină, în urma polimerizării monomerului de fibrină, sub
acţiunea factorului XIIIa (factorul stabilizator al reţelei de fibrină).
Trombina XIIIa
https://pediaa.com/difference-between-fibrin-and-fibrinogen/
12
- proces deosebit de complex, depinzând de o serie întreagă de factori, care

acţionează în cascadă, numai atunci când se îndeplinesc anumite condiţii.
- sunt implicati factorii coagularii: 13 factori plasmatici ai coagularii (notati cu cifre romane)
7 factori trombocitari sau plachetari (notati cu cifre arabe)
Factorii plasmatici ai coagularii

Factori trombocitari ai coagularii
FI – fibrinogen
FVIII – globulina antihemofilica A f1 – identic cu FV
FII – protrombina
FIX – factorul antihemofilic B f2 – catalizeaza transformarea fibrinogen in fibrina, sub
F III – tromboplastina
FX – factorul Stuart actiunea trombinei
FIV – Ca2+
FXI – factorul antihemofilic C f3 – o lipoproteina insolubila care ia parte la formarea
FV – proaccelerina
FXII – factorul Hageman tromboplastinei
FVI – accelerina
FXIII – factorul stabilizator al fibrinei f4 – un factor antiheparinic
FVII – proconvertina
f5 – identic cu fibrinogenul
f6 – o antiplasmina
Factorii plasmatici ai coagulării îşi desfăşoară activitatea doar
f7 – identic cu FVII
când sunt activaţi.
În condiţii normale (obişnuite) ei se găsesc în formă inactivă.
13
Coagularea sângelui urmează 2 căi:

- calea intrinsecă: mai lungă (necesita 7-12 minute pentru coagulare sange)
este determinată numai de factorii plasmatici
este declanşată de contactul cu fibrele de colagen şi de alţi factori nelezionali
- calea extrinsecă: mai scurtă şi mai promptă (in 5-12 secunde are loc coagulare sange)
Cele două căi ale coagulării

pot fi despărţite doar la modul
teoretic, ele desfăşurându-se
simultan şi întrepătruns.
De la factorul la X-lea, coagularea

urmează o cale comună.
https://fabu-club.com/coagulation-cascade-reference-range/
14
HEMOSTAZA = coagulare sange (oprire sangerare)
FIBRINOLIZA = fenomen invers coagularii

(distrugere retea de fibrina formata)
15
FIBRINOLIZA
= are ca efect eliminare fragmente de cheag si depozite de fibrina.

Se realizeaza prin mecanism enzimatic, fiind catalizata de plasmina (sau fibrinolizina).
Acestea scindeaza fibrina in fragmente polipeptidice mici, solubile, care nu mai pot forma retele covalente.
Produsele secundare ale fibrinolizei inhiba formarea trombinei si polimerizarea monomerilor de fibrina.
Echilibrul intre fenomenele de coagulare (hemostaza) si

cele care impiedica coagularea (fibrinoliza)
16
asigura functia circulatorie a sangelui.
SISTEME SI SUBSTANTE ANTICOAGULANTE
ANTICOAGULANTE ENDOGENE
Sangele contine si factori inhibitori ai coagularii care reduc viteza procesului de coagulare: ex. heparina
ANTICOAGULANTE EXOGENE CU APLICATII TERAPEUTICE

Coagularea sangelui la nivelul implantului poate fi controlata prin administrarea de anticoagulanti:
- heparina (inhiba atat activitatea factorului X cat si actiunea enzimatica a trombinei deja formate)
- EDTA, citraţi sau oxalaţi de sodiu sau potasiu, fluorura de sodiu (inhibă calciul - factorul IV),
- cumarine - compusi naturali (se gasesc in portocale, pastarnac, musetel)
! Efecte secundare: scleroza cerebrala, retinopatie, insuficienta renala si hepatica etc.

17
TROMBOGENICITATE
18
TROMBOGENICITATE
Suprafetele care vin in contact direct cu sangele au o misiune mult mai complexa decat alte biomateriale.
Coagularea sangelui reprezinta un mecanism vital de aparare impotriva sangerarii,

dar trebuie evitata in contextul folosirii biomaterialelor.
La caracteristicile cunoscute (biocompatibil, fezabil, biostabil, sterilizabil), unui material care intra in
contact direct cu sangele, i se adauga cerintele:
• sa nu genereze trombi si embolii prin coagulare (TROMBOZA)

• sa nu altereze proteinele plasmatice (INFLAMATIE)
• sa nu determine distructia celulelor sangvine (HEMOLIZA)
19
https://bioinicia.com/electrospinning-for-tissue-engineering/
TROMBOGENICITATE - continuare
Trombogenicitatea = definita ca proprietatea unui material de a induce formarea de trombi

!! componenta importanta a biocompatibilitatii
Journal of Thrombosis
and Haemostasis, 13
(Suppl. 1): S72–S81,
2015
20
TROMBOGENICITATE - continuare
Un material cu trombogenicitate scazuta este caracterizat prin:

✓ adeziune scazuta a proteinelor plasmatice si respectiv
✓ adeziune redusa a plachetelor
Jinku Kim,
Colloids and Surfaces B: Biointerfaces,
Volume 188,2020,110756 21
INTERACTIUNEA BIOMATERIALELOR
CU FLUIDUL SANGVIN
PARTEA 2
Raspuns trombotic
Strategii de imbunatatire a biocompatibilitatii materiale polimerice / sange
A. PASIVARE SUPRAFETE
B. OBTINEREA DE SUPRAFETE ACTIVE
22
RASPUNSUL TROMBOTIC
Raspunsul fluidului sangvin depinde de 4 componente:

- de biomaterial - prin natura acestuia (compozitia chimica) si respectiv prin morfologie
- de natura aplicatiei: cateter, sistem pentru eliberare controlata medicamente
- de prezenta sau absenta unor agenti antitrombogenici (heparina)
- de starea pacientului
La contactul biomaterial/ sange se declanseaza o

serie de mecanisme care conduc la formarea de
cheaguri. Astfel are loc un RASPUNS TROMBOTIC
constituit din trei faze distincte:
1. Faza proteica
2. Faza celulara
3. Raspuns organizational
Int. J. Mol. Sci. 2020, 21(12), 4259;
23
RASPUNSUL TROMBOTIC
1. FAZA PROTEICA
Adsorbtia competitiva de proteine plasmatice la biomaterial = EFECT VROMAN
initial suprafata biomaterialului este acoperita de Alb si IgG (datorita concentratiilor plasmatice
mari), ulterior acestea sunt inlocuite de proteine cu afinitate mai mare pentru biomaterial
(Fibrinogen)
!! Albumina inhiba aderarea plachetelor

!! Fibrinogenul activeaza aderarea plachetele
Adsorbtie proteine plasmatice

reprezentare schematica:
a) albumina (BSA)
b) IgG
c) Fibr
24
RASPUNSUL TROMBOTIC
2. FAZA CELULARA
❖ initial are loc aderarea si aglutinarea (agregarea) plachetelor
(primele minute);
❖ leucocitele (in special neutrofilele) infiltreaza la locul de
agregare al plachetelor.
❖ se declanseaza procese de coagulare a sangelui
(polimerizarea fibrinogen in fibrina, sub actiunea trombinei)
❖ in urmatoarele ore, PMN si monocite se infiltreaza conducand
http://www.strokecenter.org
la cresterea masei trombusului.
https://ib.bioninja.com.au 25
Interactiunea biomaterial/sange (coagulare sange) si
raspunsul inflamator se influenteaza reciproc.
26
RASPUNSUL TROMBOTIC
3. RASPUNS ORGANIZATIONAL
= reorganizare trombus (retractie cheag, proliferare fibro-celulara)
Celulele endoteliale si fibromusculare inlocuiesc proteinele plasmatice adsorbite si

isi sintetizeaza propria matrice in care sa se dezvolte si sa ramana atasate
Aceasta faza dureaza in medie aprox. 48 h
Functie de tipul de implant aceasta

reorganizare poate sa dureze intre cateva
saptamani si luni (ex. grefe vasculare sintetice
de diametru mare)
27
STRATEGII DE IMBUNATATIRE A
BIOCOMPATIBILITATII MATERIALE POLIMERICE / SANGE
= realizare de materiale netrombogene /

cu trombogenicitate redusa
28
ACS Macro Lett. 2017, 6, 992−1000
International Journal of Biomaterials, 2012, Article ID 707863
29
A. Obtinerea de suprafete pasive (inerte)
B. Obtinerea de suprafete active
“PASIVAREA SUPRAFETEI”
- modificarea suprafetei unor materiale polimerice sintetice (ex. poliuretani, polietilena)
pentru a impiedica adsorbtia proteinelor la contactul dintre materialul polimeric si
mediul biologic (implicit este impiedicat fenomenul de coagulare si activarea plachetelor)
1. Hidrofilizare
2. Pasivare prin acoperire cu albumina (Alb)
3. Imobilizare de fosforil-colina
4. Endotelializare 30
A. OBTINEREA DE SUPRAFETE PASIVE (INERTE)
1. Hidrofilizare
4. Endotelializare
31
1. HIDROFILIZARE – pentru a “inactiva” suprafata biomaterialului
Adeziunea proteinelor si respectiv proliferarea celulara sunt influentate

de raportul hidrofil / hidrofob.
O metoda uzuala de imbunatatire a hemocompatibilitatii biomaterialelor o reprezinta

cresterea hidrofilicitatii suprafetelor polimerice – HIDROGELURI:
nu adsorb proteinele plasmatice si nu promoveaza adeziunea celulara cu formarea de

trombus, datorita afinitatii crescute fata de apa si respectiv a energiei interfaciale
scazute (spre deosebite de suprafetele hidrofobe)
32
33
1. HIDROFILIZARE
Deoarece polimerii hidrofili prezinta proprietati mecanice slabe se prefera acoperirea altor polimeri cu proprietati
mecanice mai bune cu polimeri hidrofili, apoi se realizeaza o reticulare a hidrogelurilor pentru a controla gonflarea.
Metode:
simpla acoperire cu polimeri hidrofili sau grefare iradianta hidrogeluri pe biomateriale
Monomeri hidrofili folositi pentru a modifica

suprafata biomaterialelor:
✓ N-vinil-pirolidona (NVP)
✓ Hidroxietilmetacrilat (HEMA)
✓ Acid acrilic (AA)
✓ Polietilen glicol (PEG) /

polietilen oxid (PEO)
Filme polimerice depuse in plasma

“gold standard for
protein-resistant applications” 34
1. HIDROFILIZARE
- PEG/PEO = polimeri sintetici hidrosolubili

- au aceeasi unitate repetitiva –(CH2CH2O–) n
PEG n = 15-3500 (M 400-100 000)

PEO M >100 000
Incorporarea PEG/PEO intr-un biomaterial polimeric

reduce adeziunea proteinelor plasmatice si a plachetelor,
in comparatie cu un substrat hidrofob nemodificat.
35
1. HIDROFILIZARE
DOUA MECANISME POSIBILE:
❖ efect de impiedicare sterica (repulsie) a proteinelor si celulelor sangvine
❖ fenomen de hidratare = lanturile hidrofile retin moleculele de apa la suprafata;

Acest continut crescut de apa este defavorabil pentru aderarea proteinelor plasmatice sau celulelor
(trombocite / leucocite) → PROTEIN-REPELLENT SURFACES (neaderente pentru proteine)
a) Aderare proteine la biomaterial

b) Inhibare aderare proteine (efect de
impiedicare sterica datorita lanturilor de PEG) 36
ACS Macro Lett. 2017, 6, 992−1000
1. HIDROFILIZARE
Exemple de polimeri a caror suprafata poate fi modificata cu PEG/PEO:

Polistiren (PS); poliuretan (PU);
Polisulfona; polimetilmetacrilat (PMMA) etc.
Dezavantaje:
• dificil de realizat in strat perfect uniform - deoarece primele molecule
imobilizate vor respinge atasarea altor molecule de PEG prin impiedicare sterica
(se pot folosi solventi speciali)
• prezenta celui mai mic defect in stratul polimeric poate declansa
coagularea sau inflamatia
• deoarece absoarbe apa, acest tip de substrat nu este stabil, are tendinta sa se
gonfleze si sa se dezlipeasca de pe suprafata implantului 37
1. Hidrofilizare
4. Endotelializare
38
- nu promoveaza adsorbtia de alte proteine plasmatice

- scade trombogenicitate material - nu are secvente peptidice pentru interactia cu celulele
(plachete sau leucocite) sau receptori pentru enzimele care declanseaza cascada
coagularii
Dezavantaje:
➢ daca Alb este legata fizic la biomaterial, la
contactul cu sangele, alte proteine plasmatice
vor adsorbi si vor inlocui Alb la suprafata
biomaterialului (efect Vroman)
➢ imobilizare covalenta Alb pe suprafata
biomaterial → denaturare Alb
39
1. Hidrofilizare
4. Endotelializare
40
3. Imobilizare de fosforil colina
Biomimetism = mimare chimie si topografie endoteliu vascular
fosfatidil colina - componenta importanta din membrana trombocitelor si eritrocitelor
Fosforilcolina (grefata pe biomaterial sau incorporata in suprafata acestuia)

imita gruparile terminale ale fosfolipidelor
Se reduce aderarea plachetelor la grefe vasculare de PTFE
41
1. Hidrofilizare
4. Endotelializare
42
4. Endotelializare
Cea mai buna metoda de hemocompatibilizare a materialelor: ENDOTELIALIZARE
acoperire pereti interiori ai grefelor vasculare sintetice cu un monostrat de celule endoteliale umane;
practic reprezinta singurele suprafete inerte in raport cu trombocite si factorii coagularii
! foarte dificil de realizat
Adv. Healthcare Mater. 2020, 2000920
Celule progenitoare endoteliale (EPCs)

diferentiaza in celule endoteliale (ECs).
43
A. Obtinerea de suprafete pasive (inerte)
B. Obtinerea de suprafete active
incorporare biomolecule active specifice pe o suprafata polimerica

pentru a produce o reactie favorabila
44
Mai multe strategii pentru a controla trombogenicitatea – la suprafata

biomaterialelor:
1. incorporare agenti antitrombotici = HEPARINA - previne activarea trombinei

2. incorporare enzime fibrinolitice - distrug cheagurile de fibrina
3. incorporare agenti de antiagregare plachetara = ex. prostacicline
45
Metode de heparinizare biomateriale:
Trei strategii de cuplare heparina la suprafete polimerice:
I. compoundarea heparinei cu polimeri (amestec fizic)

II. legarea ionica a heparinei la materiale care contin functii cationice
III. legarea covalenta a heparinei la suprafete polimerice J. Mater. Chem. B, 2014,2, 7649-7672
a. Hep se leaga ionic de o suprafata incarcata pozitiv

b. Hep formeaza complex ionic cu polimeri cationici
c. Materiale acoperite fizic cu Hep
d. Hep legata covalent
e. Hep legata covalent printr-un “spacer arm”
f. Hep dispersata intr-un polimer hidrofob
g. Conjugate Hep-Alb imobilizate pe suprafata unui biomaterial
46
Metode I si II – dezavantaj - instabilitate - Hep elueaza in timp si lasa suprafata neprotejata
Metoda III - imobilizare covalenta Hep - prelungeste activitatea Hep

- dezavantaj – se poate pierde eficienta catalitica a Hep imobilizata covalent
!! Doar in conformatia nativa Hep este capabila sa-si exercite functia (interactiune cu antitrombina III)
47
MULTUMESC!
48

METODE DE ANALIZA
- CURS 8 -
Dr. ing. Adriana Lungu

1
REZUMAT CURS 8
DECONTAMINAREA
TEHNICI DE ANTISEPSIE : dezinfectie, sterilizare
METODE DE STERILIZARE
AUTOCLAVARE
FILTRARE
STERILIZAREA CU GAZE, RADIATII: neionizante, ionizante
CONTROLUL PROCESULUI DE STERILIZARE
2
DECONTAMINAREA
DECONTAMINAREA – reducerea numarului de germeni de pe un obiect
sau dintr-o substanta pana la zero.
Anti – împotriva Sepsis – putrefacţie
Definitii:
ANTISEPSIE = ansamblu de tehnici / procedee fizico – chimice prin care se distrug sau sunt inhibate
microorganismele patogene (bacterii, virusuri, fungi) de pe suprafeţe care vin în contact direct sau
indirect cu organismul
ASEPTIC = nu prezintă microorganisme sau germeni infecţioşi;

Ex. implant, substanţă farmaceutică, suturi, mediu gazos, sala de operatie etc.
Se realizează prin TEHNICI DE ANTISEPSIE
1. DEZINFECTIE
2. STERILIZARE 3
CURAT ≠ DEZINFECTAT ≠ STERIL
4
TEHNICI DE ANTISEPSIE
1. DEZINFECTIA = distrugerea patogenilor (mai putin a sporilor) de pe suprafete, din aer;

impiedica raspandirea unor boli infectioase.
Dezinfectant = inactivează microorganismele patogene, in afara formelor microbiene de spori.

Antiseptic = pentru dezinfecţie suprafete vii (ex. tegumente, mucoase).
Dezinfectant: formaldehida (8%)

Dezinfectant pentru apa: Cl2 (gaz)
Antiseptice (piele): etanol (50-70%), izopropanol (50-70%), tinctura de iod (2% I2 in alcool 70%)
Antiseptic (ochi nou-nascuti): nitrat de Ag (AgNO3)
5
TEHNICI DE ANTISEPSIE - continuare
2. STERILIZAREA = procedeu prin care sunt indepartate sau distruse toate microorganismele vii
(inclusiv sporii ) de pe suprafata si din interiorul unor obiecte.
Inaintea implantarii, biomaterialele trebuie supuse unui proces de sterilizare efectuat in conditii aseptice
pentru a evita infectiile.
Biomateriale sterile: nu contin forme de viata precum

bacterii (forme vegetative, sporulate), virusuri, fungi
Sterilizarea totală este practic imposibilă
6
CUANTIFICARE STERILIZARE
NIVEL DE ASIGURARE A STERILITATII = SAL (sterility assurance level)

= probabilitatea ca un numar oarecare de implanturi dintr-o cantitate mare supusa
unei tehnici de sterilizare sa ramana nesterilizata.
grad minim de sterilizare SAL =10-6

la 1 milion de produse supuse sterilizarii, exista probabilitatea ca unul sa ramana nesterilizat.
Sterilizarea = etapa importanta a procesului de obtinere a unui implant, proteza sau dispozitiv medical,
De modul de realizare al sterilizarii depinde biocompatibilitatea.
O sterilizare necorespunzatoare poate declansa infectii si poate compromite partial sau total actul medical,
dar poate deasemeni afecta proprietatile si rezistenta la uzura a
implantului, protezei sau dispozitivului medical vizat.
7
DEPIROGENARE
(piros = foc, caldura)
= inactivare sau indepartare agenti pirogeni

- prezenta unei cantitati foarte mici de agenti pirogeni in sangele periferic poate cauza
febra inalta
- este esentiala pentru materialele naturale care, datorita originii naturale, prezinta
probabilitatea de a fi contaminate cu agenti pirogeni
- exemple de agenti pirogeni: endotoxine bacteriene, exotoxine pirogene, ARN viral
sunt fragmente din membrana bacteriilor Gram-negative,

considerate a fi cei mai puternici agenti pirogeni
Bacteriile Gram pozitive au o putere pirogena de 100000 de ori mai slaba decat bacteriile Gram negative.
Pentru a fi aprobate (conform FDA), dispozitivele medicale trebuie

sa aiba un nivel foarte scazut de endotoxine (0.06–0.5 EU/mL)!
8
METODE DE STERILIZARE
9
CONTROLUL PROCESULUI DE STERILIZARE
Pentru ca procesul de sterilizare să fie reproductibil, consecvent şi fiabil, acesta trebuie validat.
Validarea procesului de sterilizare = demonstrarea absenţei dezvoltării bacteriilor şi
monitorizare parametri proces de sterilizare
• metode fizice – control temperatura (termometru), presiune (manometru), timp de expunere
• metode chimice: se folosesc substanţe cu punct de topire apropiat de temperatura la care se face sterilizarea
(ex. acid benzoic 120oC)
• metode biologice = bioindicatori: preparate standard de spori bacterieni specifice diferitelor tipuri de sterilizări.
furnizează dovezi directe că s-au atins condiţiile letale necesare sterilizării în timpul tratamentului
“gold standard”
10
CONTROLUL PROCESULUI DE STERILIZARE - continuare
Ex. fiole Stearotest – suspensie de spori de Bacillus stearothermophilus;

atingerea temperaturii de 121°C duce la distrugerea sporilor, indicatorul din fiole virează.
11
METODE DE STERILIZARE FIZICE
12
STERILIZAREA PRIN CALDURA
Caldura uscata:
❖ Incalzire la incandescenta (ex. ansa bacteriologica)
❖ Flambare
❖ Incinerare
❖ Sterilizare cu aer supraincalzit in etuva (cuptor Pasteur, Pupinel) 180°C 1h sau 160°C 2h
✓ aceasta tehnica poate fi folosita pentru DEPIROGENARE (temp >250oC)

✓ pentru validarea acestui proces se recomanda folosirea sporilor de Bacillus subtilis
✓ este aplicata pentru materiale rezistente termic (ex. silicon, sticla, metale)
Avantaj = metode simple
Dezavantaje: temperatura crescuta si timp lung de realizare → deteriorare materiale
(topire, deformare, degradare)
DRY HEAT (CALDURA USCATA) ˃˃ DRY HEAT (CALDURA UMEDA)

necesita temperaturi mai mari si timpi de expunere mai mari
13
Caldura umeda:
❖ Fierbere (min. 30 min la 100°C)
❖ Pasteurizare: T=56oC – 85oC, 6-8 min, urmata de o racire brusca la 4oC;

ultrapasteurizare (UHT): 135-150oC, 2-4 sec.
❖ Tindalizare = sterilizare fractionata sau discontinua; incalzire in baie de apa consecutiv 3-8 zile, 1-3 ore/zi;
60-100°C. intre incalziri materialul este pastrat la 4°C.

Metoda este aplicata in special pentru medii de cultura (se altereaza peste 100°C)
❖ Sterilizarea prin vapori de apa sub presiune (autoclavare) - cea mai sigura metoda de sterilizare
14
AUTOCLAVAREA
Conditii de realizare:
▪ vapori de apa sub presiune
▪ T= 121-124°C;
▪ timp = 15-30 min;
!! se distrug atat formele vegetative cat si sporii
Acest proces implica urmatoarele etape:

Etapa 1: inlocuire aer cu abur
Etapa 2: sterilizare cu control de temperatura;
Etapa 3: uscare cu evacuare de abur
Avantaje: tehnica rapida, eficienta, simpla, fara toxicitate

Dezavantaje:
- toate suprafetele produsului finit trebuie sa fie in contact cu vaporii de abur
-putine materiale polimerice permit incalzirea lor pana la temperatura de autoclavare, fara modificarea
15
proprietatilor optice si fizico-mecanice
Controlul sterilizarii in autoclave:

a) Metode chimice de control sterilizare
In autoclav se plaseaza obiecte de sterilizat + tuburi din sticla cu substante

(pulberi) cu punct de topire cunoscut (~120°C)
(parachinona, sulf, acid benzoic);
Daca in autoclav s-a ajuns la temperatura de topire a acestor substante, dupa

deschiderea autoclavului se va observa ca sunt solidificate in bloc.
b) Metode biologice de control sterilizare
suspensie de spori de Bacillus stearothermophilus;

atingerea temperaturii de 121°C duce la distrugerea sporilor, indicatorul din fiole virează.
16
STERILIZARE PRIN FILTRARE
Filtrarea = trecerea unui lichid prin membrane poroase pentru a reţine

diferite tipuri de microorganisme patogene (indepartare fizica)
Se realizeaza la t. camerei si se aplica unor lichide biologice sau solutii
injectabile, care se altereaza prin tratare termica: vaccinuri, soluţii
oftalmice, unele preparate intravenoase, medii de culturi tisulare
Ø pori membrane filtrante de sterilizare = 0.45, 0.22 sau 0.1 µm

Materiale filtre: acetat de celuloză, esteri de celuloză, nitrat de celuloză,
fluorocarbonat, polimeri acrilici, policarbonat, poliester, policlorură de vinil etc
17
STERILIZAREA CU RADIATII
radiaţii de energii diferite, ionizante sau neionizante (ex.: radiaţii gamma, radiatii X, UV, microunde, laser, IR).
Pentru fiecare radiaţie se va preciza:
✓ sursa de radiaţii
✓ mecanismul de obţinere
✓ doza de radiaţie necesară
✓ adâncimea de pătrundere
✓ efecte de încălzire
✓ toleranţe
✓ materiale ce pot fi utilizate
✓ condiţii de stocare.
Sunt necesare dozimetre pentru controlul dozei optime care va asigura

sterilizarea eficientă, fără a distruge suprafaţa implantului.
18
STERILIZAREA CU RADIATII NEIONIZANTE
Sterilizarea cu radiatii UV - radiatii neionizante, cu putere de penetrare mica

Se folosesc radiatii UV-B sau UV-C, produse de lampi cu vapori de Hg (240 and 280 nm)
Conditii: 15-30°C, umiditate max. 60%;
Aplicatii:
sterilizare suprafeţe netede şi încăperi (nise de laborator,
săli de operaţie, blocuri sterile), conservarea apei distilate
19
STERILIZAREA CU RADIATII IONIZANTE
Sterilizarea cu radiatii gamma (1956)

radiatii gamma produse in urma dezintegrarii unei surse radioactive (izotopi 60Co sau 137Cs)
Gradul SAL scade logaritmic cu cresterea dozei de radiatii
MECANISM:
determina alterarea ireversibila a principalelor componente celulare si microorganismele mor.

La dezintegrare, apar si electroni (energie de cca 315 keV), care participa la procesul de
sterilizare, intrerupand viata celulara
20
STERILIZAREA CU RADIATII IONIZANTE
Doza standard de sterilizare cu radiatii ionizante γ = 25 kGy
Controlul sterilizarii:
indicator biologic = spori de Bacillus pumilus
APLICATII:
✓ metoda adecvata pentru majoritatea materialelor, cu unele exceptii
✓ se aplica in general pentru formulari farmaceutice, seringi, ace etc.
21
STERILIZAREA CU RADIATII IONIZANTE - continuare
AVANTAJE:
procedeu eficace, rapid de sterilizare, netoxic, fara reziduuri, bine controlat prin dozimetrie
putere mare de penetrare - permite sterilizarea produselor în ambalajul final
! Se reduce considerabil posibilitatea contaminării post-sterilizare a produsului medical
DEZAVANTAJE:
➢ pret de cost foarte mare
➢ modificari structurale ale materialelor polimerilor:
daca polimerul este resorbabil, proprietatile de degradare vor fi modificate, acest fapt
avand consecinte importante asupra comportarii in vivo
schimbari ale proprietatile mecanice
(ex. poliacetali si poliamide; policarbonati si polipropilena)
22
Alte metode de sterilizare fizica:
Sterilizarea prin ULTRASONARE

➢ microrganismele sunt distruse/indepartate cu ajutorul ultrasunetelor (20–40 kHz)
➢ se foloseste pentru instrumentar medical / chirurgical
https://www.youtube.com/watch?v=owzVcZzNGvA
23
METODE DE STERILIZARE CHIMICE
24
STERILIZAREA CU SUBSTANTE CHIMICE LICHIDE
https://labsafety.gwu.edu/sterilization-disinfection-and-decontamination
25
STERILIZAREA CU SUBSTANTE CHIMICE LICHIDE
Cu SUBSTANTE LICHIDE = metode de dezinfectie

✓ alcooli precum alcool etilic, alcool isopropilic = solutii 70%
deshidrateaza celulele, deterioreaza membrana celulara si cauzeaza
coagularea proteinelor
✓ fenoli – deterioreaza membrana celulara, precipita proteinele si inactiveaza enzimele
sunt bactericide, fungicide dar sunt ineficiente impotriva sporilor si virusurilor
✓ aldehide – sunt agenti de alchilare care distrug acizii nucleici;
distrug microorganismele, inclusiv sporii
!! Comparativ cu alcoolii, care sunt volatili, fenolii si aldehidele sunt in general agenti toxici, corozivi,
iritanti si implica o etapa suplimentara de “clatire” pentru a indeparta reziduurile chimice
26
STERILIZAREA CU GAZE
OXID DE ETILENA (EtO) = gazul cel mai frecvent utilizat pentru sterilizarea produselor cu
aplicatie medico-chirugicala
CONDITII: temperatura 20- 60ºC

umiditate 40-90%
timp de expunere functie de material si de concentratie gaz:
conc. 850 – 900 mg/l pentru 3 ore
conc. 450 mg/l pentru 5 ore
conc. 200 mg/l pentru 16 ore
EtO poate fi folosit singur sau în combinaţii cu alte gaze (ex. EtO + CO2)
MECANISM:
EtO determina alterarea sau distrugerea componentelor
celulare şi a materialului genetic al microorganismelor
patogene şi a sporilor, prin reactii de alchilare a grupelor
SH, OH, COOH si NH2 din acizii nucleici.
27
STERILIZAREA CU GAZE - continuare
AVANTAJE:
foarte bun sterilizant pentru majoritatea materialelor, eficient si la temperaturi mici, cu posibilitate de a
steriliza atat materialul cat si ambalajul acestuia
https://www.youtube.com/watch?v=M3ZICe3Vwj8
DEZAVANTAJE:
❖ agent mutagen - ataca grupele amino din ADN → aberatii cromozomiale etc.
❖ toxic: EtO reziduala se poate elibera din materialele polimerice
❖ inflamabil (temp. fierbere 11oC) si exploziv, de aceea se amesteca cu alte gaze (N2, CO2, ozon, peroxid de
hidrogen vaporizat)
❖ pret de cost al sterilizarii ridicat
❖ timp mare de sterilizare (biomaterialele trebuie AERATE dupa sterilizare (“spalare” cu aer steril), pentru
a elimina gazele reziduale absorbite la suprafata)
UTILIZARE:
majoritatea implanturilor, grefe (cardiace, vasculare, ortopedice),
lentile de contact, fire si mănuşi chirurgicale, instrumente telescopice,
echipamente medicale sensibile la căldură
28
CONTROLUL PROCESULUI DE STERILIZARE - continuare
29

METODE DE ANALIZA
- CURS 9 -
Conf. dr. ing. Adriana Lungu

1
REZUMAT CURS 9
TESTAREA BIOCOMPATIBILITATII
TESTE DE LABORATOR IN VITRO
TESTE PRECLINICE IN VIVO
TESTE CLINICE IN VIVO
Dispozitivele medicale sunt reglementate de trei directive:

Council Directive 90/385 EEC on Active Implantable Medical Devices
Council Directive 93/42 EEC on Medical Devices
Council Directive 98/79/EC on In vitro Diagnostic Medical Devices
Testele de biocompatibilitate sunt diferite, functie de:
- durata de utilizare (TIMP DE CONTACT MATERIAL - MEDIU BIOLOGIC)
- modul in care biomaterialele intra in contact cu tesuturile biologice

(sange, tesuturi moi / dure)
3
CATEGORII DISPOZITIVE MEDICALE (anexa 1)
Pe verticala:
tip dispozitiv
Dispozitive de suprafata:
piele
membrane/mucoase
suprafata afectata
Dispozitive temporare / comunica cu:
tesuturi
sangele (direct / indirect)
Dispozitiv implantabile:
in tesut
in sistemul sangvin
Pe orizontala:
durata contact cu organismul;
A=limitata <24 h;
B=prelungita 24 h-30 zile
C=permanenta>30 zile;
MATRICEA TESTELOR DE BIOCOMPATIBILITATE (anexa 2)

ISO – 10993
Teste:
1. Citotoxicitate
2. Sensibilizare
3. Iritare/Intracutanat
4. Toxicitate sistemica acuta
5. Toxicitate subcronica
6. Genotoxicitate
7. Implantare
8. Hemocompatibilitate
9. Toxicitate cronica
10. Carcinogenicitate
11. Reproductivitate
12. Biodegradare
Biocompatibilitatea materialelor in contact cu organismul viu se

stabileste printr-o succesiune de teste biologice:
teste clinice pe organisme umane (in vivo)
teste preclinice pe animale (in vivo)
teste de laborator (in vitro si ex vivo)

in vitro, ex vivo, in vivo
in vitro = experiment în in vivo = teste pe modele animale
mediu controlat, în / oameni
eprubetă/ vas Petri;

conditiile de testare nu
coincid cu cele din
interiorul organismului
ex vivo (in afara organismului) = experimente realizate în /

pe tesuturi în mediu artificial care implică preluarea de
tesuturi si cultivarea în conditii sterile, permitand astfel
experimentarea în conditii extrem de controlate.
7
Caracteristici – testare biocompatibilitate:
➢ Creste relevanta experimentelor: de laborator (in vitro), preclinice (in vivo), teste clinice (in vivo)
➢ Cu cat riscul este mai mare cu atat testele biologice pe care ar trebui sa le treaca materialul
ar trebui sa fie mai numeroase
➢Teste de biocompatibilitate - ordine foarte precisa, in conditii de pH, temperatura etc.,
similare organism uman
➢ Anumite teste se pot realiza atat in vitro cat si in vivo, ele sunt complementare
➢ Testele se fac cu materiale de referinta (de control)

Teste preclinice Teste clinice
Teste in vitro
in vivo in vivo
Evaluarea biocompatibilitatii prin TESTE DE LABORATOR IN VITRO

Teste in vitro
in vivo in vivo
▪ permite obtinerea de informatii rapid si ieftin

▪ conduce la reducerea numarului de animale sacrificate in acest scop
▪ constau in interactia in vitro a biomaterialului cu celulele
(considerate a fi cele mai simple organisme)
10
TESTE DE LABORATOR IN VITRO - continuare
CULTURI CELULARE:
1. dupa aderenta celulelor la substrat
2. dupa tipul celulelor cultivate
11
1. dupa aderenta celulelor la substrat:

Forma pe care o iau celulele dupa proliferare reflecta de fapt tesutul din care provin.
a) Celule aderente:
- celulele sunt plasate in placi ce favorizeaza atasarea (ex. placi colagenate)
- cresc in monostrat confluent: odata ce devin confluente, celulele nu se mai dezvolta (inhibitie de contact)
- doua tipuri de morfologii: celule epiteliale (poligonale) si celule fibroblastice (alungite)
12
b) Celule neaderente (in suspensie):

- sunt sferice si plutesc in mediul de cultura (sub forma de celule individuale sau sub forma de mici “insule”)
Exemple:
➢culturi derivate din sange (ex. limfocite)
➢linii celulare (accesibile comercial) – adaptate sa creasca in suspensie, pentru a

se obtine concentratii mai mari de celule
➢culturi de celule de insecte

2. dupa tipul celulelor cultivate se disting doua mari categorii de culturi:
a) Culturi de celule primare

- sunt obtinute prin disocierea enzimatica a unui tesut (proteaze si colagenaze)
- pot fi preluate de la: embrioni, animale nou-nascute, animale adulte
- cele mai utilizate culturi celulare: primate, om, rozatoare (soareci, sobolani, hamsteri), pasari
Avantaje culturi primare:
- proprietati mult mai apropiate de celulele organismului (stare fiziologica normala) → rezultate mai elocvente
- exemple de culturi de celule primare: celule umane din maduva osoasa; celule umane fibroblaste gingivale;
osteoblaste din craniu sobolan; celule epiteliale /fibroblaste sobolan
14
b) Linii celulare continue (clonate)

Celule transformate - se diferentiaza de celule normale; se divid si cresc continuu
Avantaje linii celulare:
- permit standardizarea lucrarilor efectuate in mai multe laboratoare (verificare reproductibilitate)
- relativ usor de mentinut; schimbarea mediului de cultura se realizeaza usor
- fiind clone, celulele sint identice genetic
isi mentin caracteristicile genetice si morfologice pe parcursul unei vieti foarte lungi (pana la infinit).
Relevanta testelor de biocompatibilitate este puternic influentata de

tipul de celule utilizate la efectuarea experimentelor
Exemple de linii celulare – proliferare in monostrat:
❖ celule epiteliale: HeLa
❖ celule endoteliale: BAE-1
❖ fibroblaste: MRC-5
❖ neuronale: SH-SY5Y
Morfologia acestora reflecta tesutul de origine.
16
Exemple de linii celulare – proliferare in monostrat:
❖ celule epiteliale: HeLa
❖ celule endoteliale: BAE-1
❖ fibroblaste: MRC-5
❖ neuronale: SH-SY5Y
Morfologia acestora reflecta tesutul de origine.
HeLa =
HENRIETTA LACKS
17
INEDITA POVESTE a Henriettei Lacks, femeia cu CELULE NEMURITOARE, moartă în 1951, dar care trăieşte
„The Immortal Life of Henrietta Lacks” de Rebecca Skloot
best seller - New York, 2010

Celulele HeLa = cea mai veche linie celulara, separata in 1951
din tumora canceroasa (carcinom cervical) col uterin
➢ celulele tumorale foarte agresive care se divizau cu o viteză nemaintâlnită.
➢ de la moartea femeii până în prezent au fost cultivate peste 50 de milioane de tone de celule HeLa, iar utilizarea lor a
fost menționată în peste 60.000 de studii științifice
➢ celulele HeLa se găsesc în aproape toate laboratoarele de cercetare biologică din întreaga lume.
➢ au ajuns chiar și în spațiu, pentru a se vedea dacă țesutul omenesc poate supraviețui în condiții de gravitație zero.
Celulele HeLa pot fi ținute înghețate timp de ani de zile, iar când sunt dezghețate din nou continuă să se înmulțească.
➢ au ajutat la realizarea unora dintre cele mai importante progrese în medicină: vaccinul împotriva poliomielitei,
chimioterapia, clonarea, descifrarea genomului uman sau fertilizarea in vitro.
Medii de cultura:
Se pot clasifica dupa mai multe criterii:
dupa consistenta - sunt medii lichide si semilichide;
dupa compozitie - exista medii naturale, semisintetice si sintetice;
dupa valoarea nutritiva si scopul urmarit :
➢ medii de crestere - asigura proliferarea celulelor din cultura
➢ medii de mentinere -pentru întretinerea culturilor ajunse la dezvoltare
maxima si care pastreaza toate activitatile celulare
➢ medii defective - testarea celulelor în conditii speciale de crestere.
20
Mediile de cultura celulara asigura:

- echilibru ionic, pH optim (pH 7.2 - 7.4), temperatura optima, continutul de 02 si de CO2 favorabil;
- elemente nutritive, indispensabile metabolismului: carbohidrati (glucoza), proteine animale
(din lichide biologice - plasma, ser, lichid amniotic) si aminoacizi esentiali, lipide,
vitamine, hormoni, etc.
- evitarea contaminarii cu germeni patogeni prin adaugarea de antibiotice (penicilina, streptomicina
si antifungice (stamicin, micostatin);
- stimularea multiplicarii si cresterii celulelor prin adaugarea de extracte embrionare.
Exemple:
Mediul bazal EMEM (Eagle's minimal essential medium)
Mediul DMEM (Dulbecco modified Eagle's minimal essential medium)
Evaluarea biocompatibilitatii prin TESTE PRECLINICE IN VIVO

Teste in vitro
in vivo in vivo
ISO 10993-2
- se folosesc animale vii - pentru verificare cerinte de biocompatibilitate

- sunt obligatorii inainte de testele clinice
Avantaje: - reprezinta o aproximatie mai buna decat testele de laborator

- folosesc cele mai adecvate animale ca model
Dezavantaje: - necesita protocoale si timp

- sunt scumpe
- rezultate uneori dificil de interpretat
- ridica anumite probleme de etica
22
TESTE PRECLINICE IN VIVO - continuare
Modele animale pentru evaluarea in vivo a dispozitivelor medicale
Categorie implant Animal de experienta
Chirurgie cardio-vasculara
valve cardiace oaie
grefe vasculare caine, porc
stenturi porc, caine
inima artificiala vitel
Ortopedie / chirurgie osoasa

substitut osos iepure, caine, porc, sobolani
proteza totala de sold/genunchi caine, capra, primate
implant craniofacial iepure, porc, caine, primate
cartilaj iepure, caine
ligamente si tendoane caine, oaie
Neurologie
regenerare nervi periferici sobolani, pisica, primate
stimulare electrica sobolani, pisica, primate
Oftalmologie
lentile de contact iepure
lentile intraoculare iepure, maimute
23
TESTE PRECLINICE IN VIVO - continuare
Testele preclinice – presupun introducerea unui esantion din biomaterial sau extract din acesta
in organismul animal, pe diferite cai:
a) ORALA (ingestie sau inhalare)
b) INJECTII
intramuscular
subcutanat
intravenos
intraperitoneal
intradermic
c) IMPLANTARE propriu-zisa: in tesut moale, intramuscular, subcutanat, intraperitoneal,

intramedular (femur, tibie), transcortical (femur, craniu)
24
Evaluarea biocompatibilitatii prin TESTE CLINICE IN VIVO

Teste in vitro
in vivo in vivo
- sunt cele mai relevante in testarea biocompatibilitatii unui material
- demonstreaza adevarata performanta a unui biomaterial
- nu pot fi standardizate
- implica probleme controversate de etica
- sunt foarte scumpe
- trebuie facute numai dupa teste preclinice pe animale
- se aplica pe VOLUNTARI
- implantarea unui biomaterial in organism se face intr-o regiune cat

mai apropiata de aplicatia pentru care este proiectat
25
TESTE CLINICE IN VIVO - continuare
In cele mai multe teste clinice se utilizeaza EFECTUL PLACEBO – un

grup de pacienti este supus medicatiei/implantului de testat +
un grup de pacienti (de control / referinta) este tratat cu placebo
EFECTUL PLACEBO = raspuns observabil si masurabil al

organismului la o terapie placebo (o medicatie inerta – ex. pilula
de amidon sau zahar, sau un act chirurgical inofensiv)
- este benefic si NU se datoreaza tratamentului aplicat = putere
de autoinsanatosire
EFECT NOCEBO (anti placebo)

Credinta pacientului ca un anumit
medicament/biomaterial ii face rau
declanseaza uneori efecte terapeutice negative
Efectele Nocebo si Placebo trebuie discutate impreuna:

mecanismele de declansare pot fi aceleasi, dar rezultatele sunt opuse 26

METODE DE ANALIZA
- CURS 10-

1
TESTE DE BIOCOMPATIBILITATE BIOMATERIALE
Testarea biocompatibilitatii materialelor se face conform:
standard ISO – 10993:
ISO = ASTM = American Standards for

International Standards Organization Testing and Materials
Cele mai importante instructiuni – se refera la:
➢ Evaluarea si testarea de biomateriale (ISO 10993-1)
➢ Ghid cu privire la folosirea animalelor in teste preclinice (in vivo) (ISO 10993-2)
➢ Teste de mutagenicitate si genotoxicitate (in vitro si in vivo) (ISO 10993-3)
➢Teste de hemocompatibilitate (ISO 10993-4)
➢Teste de citotoxicitate (in vitro) (ISO 10993-5)
➢ Efecte locale dupa implantare (ISO 10993-6)
➢ Teste de iritabilitate si sensibilitate (in vivo) (ISO 10993-10)
➢ Teste de toxicitate sistemica si pirogenitate (in vivo) (ISO 10993-11)

Evaluarea biocompatibilitatii materialelor consta intr-o succesiune de teste biologice:
A. Teste de evaluare initiala a biocompatibilitatii

1. Teste de citotoxicitate
2. Teste de iritare piele/ reactii alergice
(sensibilizare si potential iritant /reactivitate intracutanata)
3. Teste de toxicitate sistemica
4. Genotoxicitatea
5. Efect local dupa implantare
6. Teste de hemocompatibilitate
B. Teste de evaluare complementara a biocompatibilitatii (cu scopul de a scoate pe piata biomateriale mai sigure)
1. Toxicitate cronică
3. Toxicitatea asupra reproducerii şi dezvoltării (creşterii)
4. Degradare
4
TESTE DE EVALUARE INITIALA A BIOCOMPATIBILITATII
5
1. TESTE DE CITOTOXICITATE
Definitie: Capacitatea potentiala a unui dispozitiv medical de a

induce efecte subletale sau letale la nivel celular
Caracteristici generale:
- metode simple, ieftine, standardizate de detectare a efectelor
adverse generate de un biomaterial asupra celulelor
- se refera la efectele toxice provocate de prezenta unui material la nivel celular.
Principiul metodei:
- substantele toxice sunt eliberate de material in mediul de cultura al celulelor
→ difuzeaza prin membrana celulelor → celulele isi schimba marimea,
forma, gradul de proliferare, lizeaza, se dezintegreaza
6
1. TESTE DE CITOTOXICITATE - continuare
Toxicitatea materialului prezent in mediul de cultura se verifica prin raportul intre
nr. de celule moarte si nr. total de celule, la anumite intervale de timp (24, 48 si 72 h)
Citotoxicitatea unui material poate fi efectuata prin 3 tipuri de teste

functie de modul in care materialul este expus celulelor:
a) contact direct cu suprafata biomaterialului

b) contact indirect, difuzie in mediu de agar
c) metoda elutiei - expunerea celulelor pe extracte din biomaterialul de analizat
Fiecare test este interpretat riguros pe baza numarului de celule afectate.

a) Contact direct cu suprafata biomaterialului

Piese din materialul de testat sunt plasate direct pe suprafata stratului
de celule, care este acoperit cu o pelicula din mediul de cultura.
Substantele toxice eliberate din materialul testat pot scadea viteza
cresterii celulelor sau pot provoca diferite leziuni
8
b) Contact indirect (difuzie in agar)

• se obtine mai intai un monostrat confluent de celule
• se acopera cu un strat de agar;
• se asteapta sa se solidifice;
• peste se plaseaza o piesa din materialul de testat.
Substantele toxice solubilizate (cu M<100Da) din material vor difuza prin stratul subtire
de agar si vor omori sau leza celulele din monostrat
AGAR = polimer coloidal special derivat dintr-o alga rosie;

exista tipuri diferite de agar, diferite prin
masa moleculara sau gradul de polimerizare
c) Metoda elutiei: expunerea celulelor pe extracte din biomaterialul de analizat

Se prepara mai intai un extract (eluat) din biomaterialul (de testat de regula in sol. NaCl)
Extractul este plasat in diferite concentratii pe un monostrat de celule;
Se evalueaza toxicitatea la diferiti timpi de incubare la 37°C (48 h)
Celule vii sau moarte, pot fi vizualizate prin utilizarea de coloratii diverse
Coloratii utile in aprecierea proliferarii, viabilitatii si citotoxicitatii celulare:

Coloratii utile in aprecierea proliferarii, viabilitatii si citotoxicitatii celulare:

Coloratie Hematoxilin – Eozina:
Celulele vii sunt fixate si marcate cu un marker citochimic:
hematoxilina - nuclei albastri; eozina – citoplasma roz/rosu
Celulele moarte isi pierd aderenta de placa de cultura si se pierd în timpul procesului de fixare
Testul cu Trypan Blue (TB) – colorant ce patrunde in celula cand membrana este lezata.
Celule moarte colorate în albastru, cele vii incolore.
Testul MTT – sare de tetrazoliu (galbena) redusa de enzime mitocondriale la un formazan (albastru)
3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-
2,5-difeniltetrazolium bromura
Testul cu Rosu Neutru (NR) – colorant cationic ce penetreaza membranele celulare

(difuzie) si se acumuleaza intracelular în lisosomi, in matricea lisosomala.
Celulele vii incorporeaza NR; citotoxicitate = scadere în preluarea si legarea NR
2. TESTE DE IRITARE PIELE / REACTII ALERGICE
Teste de sensibilizare si potential iritant/reactivitate intracutanata
Principiul metodei:
testul consta in investigarea daca DM (ca atare sau extracte)
induce o reactie a sistemului imun la expuneri repetate;
-sunt teste in vivo, atat pe animale (prin teste preclinice) cat si pe oameni (teste clinice);
- teste adaptate si pentru realizare in vitro
Reactia alergica:
- raspuns al sistemului imun al organismului prin reactii alergice in prezenta unor alergeni
- expunerea la alergeni – se face pe diferite cai specializate: oral (inhalare, ingestie), dermic,
ocular, intravenos, intramuscular, subcutanat, intradermal, intraperitoneal
12
2. TESTE DE IRITARE PIELE / REACTII ALERGICE - continuare
Teste in vivo pe animale (preclinice)

Teste de iritabilitate primara – implica un contact intre biomaterial si mucoase (porci guinea - varsta o luna)
respectiv cu piele intacta sau ochi (iepuri albino)
Teste in vivo pe oameni (clinice)
Reactiile alergice ale organismului la interactia cu alergeni pot fi clasificate dupa:

❖ manifestare:
raspunsuri locale ale tesutului (reactii de iritare): eritem (roseata),
inflamatie (edem), durere si chiar distrugere tesuturi
raspunsuri sistemice: simptome respiratorii, astm, anxietate, dureri de
cap, palpitatii, urticarie, voma, soc anafilactic
❖ mod de producere: imediat sau cu intarziere,
❖ reversibilitate: reversibile sau ireversibile
13
Teste in vitro – principiu:
❖ organismul raspunde la un anumit alergen printr-un nivel crescut de anticorpi (IgE) in plasma sanguina,
care stimuleaza eliberarea de histamina si declanseaza reactii alergice ale organismului
❖ se foloseste sange prelevat de la animale / om si se masoara cantitatea de anticorpi care se formeaza, ca un
indicator al efectelor alergice provocate de material/extract
Dupa tehnica de identificare si masurare a complexului anticorp – antigen, testele pot fi:
❑ RAST (radio allergo sorbent testing)
❑ FAST (fluorescent allergo sorbent testing)
❑ ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay)
14
exemplu clasic:
reactia alergica la aliajele metalice care contin nichel cand vin in contact cu pielea
Au şi Ag nu provoacă alergii;
nu pot fi modelate în stare pură, li se adaugă alte metale, precum Ni, extrem de reactiv şi dăunător pielii sensibile
❖ Ag puritate 92,5% + 7,5 de regulă, cupru, adăugat pentru creşterea rezistenţei, care nu provoacă alergie
❖ Au de calitate (18 / 22 K) - conţinutul de Ni e mai mic
❖ bijuteriile din platină şi aur alb pot conţine Ni (rar), de obicei, contin paladiu, mai puţin alergen
15
3. TESTE DE TOXICITATE SISTEMICA
Teste special concepute pentru evaluarea toxicitatii cauzata de compusii secundari
proveniti de la biomateriale
Un biomaterial poate fi biocompatibil in forma bruta, insa componentele

dizolvate sau produsii formati prin reactia dintre componentele eliberate si
gazda organica, ar putea sa nu fie biocompatibili
- teste preclinice in vivo – extractul din material se administreaza injectabil

(intravenos sau intraperitoneal) pe sobolani, soareci, iepuri, caini, porci guinea
Semne clinice toxicitate – diferite functie de nivelul de toxicitate al materialului:

❖ Nici un raspuns (nu apar simptome)
❖ Raspuns slab (dispnee, temperatura, durere)
❖ Raspuns moderat (iritatie abdominala, dispnee evidenta, ptoza, diaree, scadere usoara in greutate)
❖ Raspuns puternic (simptome severe: cianoza, tremur, pierdere masiva in greutate) 16
❖ Raspuns fatal (deces)
3. TESTE DE TOXICITATE SISTEMICA - continuare
Starea de sanatate – se verifica la anumite intervale de timp:

4- 24 h (toxicitate sistemica acuta)
14-28 zile (toxicitate subacuta sau subcronica)
dupa 3 luni (toxicitate cronica)
Testul de toxicitate sistemica se recomanda a fi completat cu testul de pirogenitate – avand in

vedere ca anumite substante pirogene (endotoxine, substante chimice etc.) se introduc in
organism prin catetere, seringi, componente de implant
17
3. TESTE DE TOXICITATE SISTEMICA - continuare
CHIMIOTERAPIA CANCERULUI
toxicitatea medicamentelor utilizate variaza cu doza, ruta de administrare, durata
tratamentului, etc.
Efectele citotoxice ale acestor medicamente sunt maxime fata de celulele care prolifereaza
rapid (canceroase dar si din maduva osoasa, tractul digestiv, foliculii de par si gonade).
Exista si toxicitati particulare.

Exemple:
Vincristine - produce efecte neurologice (disparitia reflexelor, neuropatii);
Doxorubicin- produce efecte cardiace cumulative ca stopul cardiac;
Metotrexat – produce leziuni renale si hepatice
Vincristine - alcaloid, inhibitor mitotic

Doxorubicin – utilizat in regresia unor tumori canceroase
Metotrexatul– antimetabolit, antifolat,
4. GENOTOXICITATEA
Caracteristici generale: Efectele mutagene ale unui biomaterial se pot

urmari prin teste de mutagenitate, atat in vitro cat si in vivo
Mutatia = schimbare ireversibila in materialul genetic al celulei

(in codul moleculei de ADN) care se propaga prin
generarea ulterioara a celulei (mutageneza)
a) Pentru testele in vitro se pot folosi diferite culturi de celule precum si celule bacteriene (E. Coli, Salmonella)
Cel mai simplu test de mutagenitate in vitro - testul Ames (1975)

- foloseste tulpini de Salmonella, o bacterie foarte sensibila la mutatii si cu o permeabilitate crescuta a
peretelui celular la molecule mari
- este gold standard test – evidentiaza rapid si cu acuratete de 90% daca un agent chimic este mutagen
(mutagenul poate fi si cancerigen; cancerul incepe cu o mutatie)
Dezavantaj: Salmonella (procariot) – nu este un

model perfect pentru om – s-a adaptat un model
pentru celulele eucariote (drojdie)
4. GENOTOXICITATEA - CONTINUARE
b) Pentru testele in vivo pe animale se recomanda folosirea de

soareci si sobolani deoarece prezinta similitudini cu genomul
uman, iar mecanismul unor boli este asemanator
Testele de mutagenitate sunt obligatorii pentru toate

biomaterialele care stau mai mult de 30 zile in organism si
uneori sunt denumite teste de genotoxicitate – avand in
vedere ca este vorba de efectele toxice ale unui material asupra
materialului genetic al organismului
Perfectionarea testelor de mutagenitate contribuie la dezvoltarea ingineriei genetice

5. EFECT LOCAL DUPA IMPLANTARE
- raspunsul biologic din jurul materialului contribuie la
determinarea biocompatibilitatii acestuia.
- se evalueaza efectele patologice locale asupra tesuturilor vii, atât

la nivel macroscopic cât si microscopic, pentru un esantion de
material sau produs finit plasat sau implantat într-o zona de
implantare sau un tesut corespunzator pentru aplicatia prevazuta
Deoarece testul este conceput pentru a evalua interfata biologica dezvoltata pe material
sau dispozitiv nu este necesara implantarea biomecanica corecta a dispozitivului
Ex .1: introducere material de implant in buzunar subcutanat/ intraperitoneal/intramuscular la soareci;

Ex. 2: in cazul materialelor ortopedice inserarea se poate face in diafiza femurala de iepure.

METODE DE ANALIZA
- CURS 11 -

1
REZUMAT CURS 11
Teste de evaluare initiala a biocompatibilitatii materialelor

1. Teste de citotoxicitate
2. Teste de iritare piele/ reactii alergice
3. Teste de toxicitate sistemica
4. Genotoxicitatea
5. Efect local dupa implantare
6. Teste de hemocompatibilitate
Teste de evaluare complementara a biocompatibilitatii

4. Degradare
6. TESTE DE HEMOCOMPATIBILITATE
Testele de biocompatibilitate se completeaza cu teste de hemocompatibilitate:
obligatorii pentru biomaterialele folosite la proteze si valve cardiace,
grefe vasculare, catetere, membrane de dializa, fire de sutura
Testele de hemocompatibilitate monitorizeaza:
❖ Efectele biomaterialelor asupra proteinelor plasmatice (albumina, fibrinogen, globuline etc.)
❖ Aderenta de elemente figurate ale sangelui la suprafata materialului
❖ Activarea enzimelor (transaminaze, dehidrogenaze, acid fosfataze) la interfata sange-suprafata

6. TESTE DE HEMOCOMPATIBILITATE - continuare
Se foloseste sange uman sau animal (se recomanda iepuri) preparat dupa un anumit protocol,
in functie de parametrii ce trebuie determinati
Se poate lucra cu: sange integral

sange integral + anticoagulant
plasma sanguina fara celule sanguine
plasma sanguina bogata intr-un anumit tip de celule – ex. trombocite
Folosirea unui anumit anticoagulant este importanta si se alege dupa scopul urmarit:
EDTA (acid etilendiaminotetraacetic) formeaza un complex solubil cu Ca2+ din sange
- nu poate fi utilizat pentru studii de coagulare deoarece afecteaza functia fibrinogenului;
- in prezenta EDTA, viabilitatea leucocitelor nu se mentine un timp suficient pentru analize
Heparina – considerat a fi un anticoagulant de referinta
- impiedica formarea fibrinei
- indicata in analiza morfologiei eritrocitelor, in studii enzimatice si culturi de celule
Dezavantaj: relativ scumpa si produce aglutinarea trombocitelor
Citrat de sodiu – inlatura Ca2+ prin formarea unui complex solubil citrat-calciu si este indicat in studii de coagulare
Pentru teste de hemocompatibilitate in vitro se procedeaza astfel:
✓ colectare sange din vena sau artera si eventual tratare cu

anticoagulant (EDTA/ Heparina/ Citrat de sodiu)
✓plasare sange in contact cu materialul de testat in sisteme de incubare

statice sau dinamice (sangele este pompat in camera de incubare sub forma
unei curgeri laminare),
timpi de incubare de 60, 120 si 240 min, 37oC
✓ separare plasma sanguina/celule prin centrifugare
✓ analiza plasmei si a celulelor - prin diferite procedee
! recomandare: masuratorile sa nu depaseasca 2 ore,

dupa acest timp sangele isi modifica proprietatile
Model experimental de
testare in vitro
a interactiei sange-
biomaterial
Testele de hemocompatibilitate determina anumiti parametri ce

evidentiaza modificari in:
1. Timpi de coagulare
ex: timp Quick - caracterizeaza coagularea extrinseca (valori normale 10-15 sec)
2. Parametri de trombogeneza – se refera la agregarea si aderenta de trombocite la suprafata materialului,
Analiza trombocitelor este foarte importanta deoarece acestea sunt foarte sensibile la suprafete straine si
elibereaza factori procoagulanti
3. Reactiile imune ale organismului la interactia sange-implant se urmaresc prin analiza celulelor, in special a
limfocitelor, in jurul implantului
Din leucocitele prezente pe implant se poate izola si purifica ADN-ul genomic, din analiza caruia se obtin
informatii despre efectele mutagene ale materialului
Metode de analiza sange inainte si dupa interactia cu biomaterialul de testat
✓ Hemo-citometrie pentru a determina concentratia si activitatea celulelor sanguine
✓ Spectroscopie de fluorescenta – pentru identificarea si cuantificarea proteinelor plasmatice,

inclusiv a moleculelor de ADN si ARN
✓ Microscopie optica, electronica si de forta atomica pentru vizualizarea de celule, formare

de trombusi etc., dar si pentru a analiza suprafata materialului in contact cu sangele
✓ Masuratori electrocinetice (electroosmoza, electroforeza, etc.)
✓ Teste ELISA de identificare si cuantificare de produsi sau fragmente din cascada coagularii,
anticorpi, antigene
TESTE DE EVALUARE COMPLEMENTARA A BIOCOMPATIBILITATII
Cu scopul de a scoate pe piata biomateriale mai sigure:
B. Teste de evaluare complementara a biocompatibilitatii
4. Degradare
9
1. TOXICITATE CRONICĂ
Aceste teste determină efectele biomaterialelor şi/sau ale

extractelor acestora asupra animalelor de experienta pe o
perioada de timp mai mare
(ex. peste 90 de zile pentru şobolan)
2. TESTE DE CARCINOGENEZA
Carcinogeneza = afectiune a organismelor
multicelulare caracterizata prin diviziuni anormale, necontrolate
Biomaterialele pot determina carcinogeneza - prin eliberare de:
• produsi carcinogeni
• pro-carcinogeni: sunt convertiti in carcinogeni de procesele metabolice din corp
• co-carcinogeni: in prezenta materialului sunt activate substante pro-carcinogene
11
2. TESTE DE CARCINOGENEZA - continuare
- teste in vivo (preclinice) - se foloseste extract sau
implant din materialul de testat
- se dau doze din extract de material, oral sau

intravenos, in fiecare zi, timp de 18-24 luni, apoi se sacrifica
animalul si se examineaza la microscop tesuturile pentru a
depista prezenta unor eventuale tumori
- sunt foarte scumpe, necesita timp, animale diferite (soareci/sobolani)
Chiar daca rezultatul testului de carcinogenicitate este negativ nu exista siguranta ca

materialul odata implantat nu va induce un raspuns cancerigen.
Studiu SUA:
artroplastie sold dupa 7 ani de la implantare = 17 cazuri de tumori
Dupa 10 ani de la implantare = ~70% din pacienti suspectati de tumori limfatice si hematopoietice
12
2. TESTE DE CARCINOGENEZA - continuare
Testele de carcinogeneza se recomanda daca:
- materialele sunt resorbabile, cu timp de resorbtie de peste 30 de zile
- daca materialul este un implant permanent
- daca testele de genotoxicitate sunt pozitive: daca materialul este MUTAGEN, este si CANCERIGEN
foarte dificil de apreciat potentialul cancerigen al unui implant, sunt necesari 10-15 ani pentru un test corect;
intre timp stiinta biomaterialelor evolueaza, se dezvolta noi materiale cu proprietati superioare, si exista
riscul ca rezultatele testelor incepute sa nu mai fie de actualitate
13
3. TOXICITATEA ASUPRA REPRODUCERII ŞI DEZVOLTĂRII (CREŞTERII)
DACA TESTELE DE MUTAGENITATE SI CARCINOGENEZA SUNT POZITIVE, TREBUIE COMPLETATE CU:

teste de toxicitate asupra reproducerii si dezvoltarii
teste care urmaresc efectele biomaterialului asupra dezvoltarii embrionului si fetusului
- evaluează efectele potenţiale ale dispozitivelor,

materialelor şi/sau extractele lor asupra funcţiei de
reproducere, dezvoltării embrionare (teratogenitate) şi
dezvoltarea prenatală şi postnatală precoce.
ex. dispozitive intrauterine (sterilet)
- teste in vivo - recent dezvoltate: experimente pe animale

transgenice (cu patrimoniu genetic celular modificat prin modificarea
ADN-ului (introducerea unor segmente de ADN uman)
4. DEGRADARE
Caracteristici generale – teste de degradare:
- sunt relativ noi si unele nu sunt inca standardizate, fiind in stadiu de proiect.
- sunt concepute pentru materialele implantabile degradabile si/sau resorbabile (implante temporare):
componentele rezultate in urma degradarii trebuie sa fie in primul rand biocompatibile si sa nu interfere cu
metabolismul celular.
- se incearca reproducerea proceselor degradative pentru METALE, MATERIALE CERAMICE, POLIMERI si

produsi secundari cat mai apropiate de cele din sistemul biologic.
Metale si aliaje - se degradeaza prin coroziune chimica sau electrochimica.
→ compusi noi, de cele mai multe ori solubili, dar care nu sunt biocompatibili.
Ceramice, in special cele poroase, se degradeaza si pot elibera noi compusi secundari,
organismul uman poate manifesta o reactie adversa asemanatoare reactiei in prezenta unui corp strain.
Polimerii: ex. polietilena folosita la proteze de sold - se elibereaza o cantitate mare de compusi secundari care
produc un raspuns inflamator important
15

Limbă

Curs 6 - : Biocompatibilitatea Polimerilor Si Metode de Analiza

Încărcat de

Informații document

Descriere:

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Descriere:

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Curs 6 - : Biocompatibilitatea Polimerilor Si Metode de Analiza

Titlu original:

Încărcat de

Descriere:

Drepturi de autor:

Formate disponibile

UNIVERSITATEA POLITEHNICA DIN BUCUREŞTI

Facultatea de INGINERIE MEDICALĂ

Biomateriale şi Dispozitive Medicale (BDM)

Conf. Dr. ing. Adriana Lungu

Modificare suprafete polimerice -

Proprietăţile MORFOLOGICE care pot fi influenţate prin ingineria suprafeţelor:

Functie de scala neregularitatilor de pe suprafata biomaterial, rugozitatea poate fi:

Biomaterials, 01 May 2011, 32(13):3395-3403

Rugozitatea unui material moduleaza raspunsul biologic in contact cu un implant:

Obtinerea de substraturi polimerice cu suprafata micro- sau nanostructurata – rol

Advanced Drug Delivery Reviews (2013)

Raspunsul celular la rugozitatea suprafetei este diferit functie de tipul celulelor =

Rugozitatea macroscopica – osteoblaste, neuroni (prelungiri axonice)

0.2 mm 0.4 mm 1.0 mm

Gonçalves, S., Dourado, F., & Rodrigues, L. R. (2014). Overview on Cell-Biomaterial

Tehnologii de modificare a texturii suprafetelor in vederea imbunatatirii interactiunii

❖ Tehnica de microcontact printing (μCP)

❖ micro- si nanopaternare prin ablatie laser

❖ gravare cu fascicul de ioni

❖ pulverizare directa solutie de polimer

Metode de structurare suprafata - aplicate uniform sau ca “pattern-uri” de ordinul

FOTOLITOGRAFIEREA foto = lumina / radiatie

FOTOREZIST NEGATIV: FOTOREZIST POZITIV:

FOTOLITOGRAFIEREA in aplicatii biomedicale:

➢ permite crearea pe suprafata unui material de diferite

➢ aceste structuri pot constitui puncte de legare pentru celule

Adv. Mater. 2007, 19, 495–513

FOTOLITOGRAFIEREA in aplicatii biomedicale:

➢ permite crearea pe suprafata unui

A. Revzin, R. G. Tompkins and M.

Fotolitografia a condus la dezvoltarea altor metode avansate de texturare a suprafetelor:

Litografie de nanoimprimare (NIL)

✓ Materiale polimerice (“rezist”) sunt

S. Gilles, M. Meier, M. Prömpers, A. van der Hart, C. Kügeler, A. Offenhäusser, D. Mayer,

Modificare suprafete polimerice -

MODIFICARE CU MOLECULE BIOLOGIC ACTIVE = biofunctionalizare material polimeric

Exemple de molecule biologice

Exemple de molecule biologice care pot fi imobilizate

Micromediul extracelular contine:

M. R. Casanova, R. Reis, A. Martins and N. M. Neves,

➢ exercita diferite functii in procesele de proliferare celulara,

M. R. Casanova, R. Reis, A. Martins and N. M. Neves, Mater. Horiz., 2020,

Metode de 1. Adsorbtie fizica - legaturi de H

biomolecule - van der Waals

3. Atasare covalenta - sisteme polimerice solubile

Deficiente metode de imobilizare necovalenta:

Adsorbtie fizica - forte electrostatice

✓ proteine cu diferite puncte izoelectrice (pI) pot forma complexe ionice cu

ex. Factorul de creștere transformant (numit uneori factorul de

Adsorbtie fizica - forte electrostatice

ex. Heparina – molecula hidrofoba cu grupari negative – poate fi atasata:

(a) la un substrat hidrofob

- reprezinta incapsularea / incorporarea biomoleculelor (ex. medicamente) in biomaterial

Raspunsul celular si tisular depind de durata expunerii si concentratia biomoleculelor

Imobilizarea covalenta de biomolecule functionale pe biomateriale implantabile →

b) in timpul sintezei matricilor polimerice prin reactii combinate conjugare /sinteza

Doua modalitati diferite:

❖ (co)polimerizare urmata de cuplare biomolecule