Sunteți pe pagina 1din 167

UNIVERSITATEA POLITEHNICA DIN BUCUREŞTI

Facultatea de INGINERIE MEDICALĂ

Biomateriale şi Dispozitive Medicale (BDM)


Echipamente şi Sisteme Medicale (ESM)

BIOCOMPATIBILITATEA POLIMERILOR SI
METODE DE ANALIZA

- CURS 6 -

Conf. Dr. ing. Adriana Lungu


1
Imbunatatirea biocompatibilitatii prin modificarea suprafetelor polimerice

Modificare suprafete polimerice -


a) Metode fizico-chimice
b) METODE MORFOLOGICE
c) Metode biologice

2
b) Modificari morfologice

Proprietăţile MORFOLOGICE care pot fi influenţate prin ingineria suprafeţelor:


✓ aspectul suprafeţei: culoare, strălucire
✓ structura peliculei depuse: amorfă, cristalină sau semicristalină, densitate defecte
structurale
✓topografia suprafeţei: rugozitate/ porozitate
Rugozitate = neregularitati pe suprafata
suprafata suprafata
nemodificata rugoasa

Functie de scala neregularitatilor de pe suprafata biomaterial, rugozitatea poate fi:


macrorugozitate (100 μm – mm)
microrugozitate (100 nm – 100 μm)
nanorugozitate (< 100 nm)

3
b) Modificari morfologice

Biomaterials, 01 May 2011, 32(13):3395-3403

4
b) Modificari morfologice - continuare

Rugozitatea unui material moduleaza raspunsul biologic in contact cu un implant:


❖ organizare citoschelet
❖ orientarea componentelor ECM
❖ cantitatea de ECM produsa
❖ angiogeneza

Obtinerea de substraturi polimerice cu suprafata micro- sau nanostructurata – rol


important in controlul adeziunii celulare
ex. Caracteristicile de adeziune, proliferare si diferentiere sunt
puternic stimulate pe suprafete cu structura de fagure

Advanced Drug Delivery Reviews (2013)


doi: 10.1016/j.addr.2013.09.00
5
b) Modificari morfologice - continuare

Raspunsul celular la rugozitatea suprafetei este diferit functie de tipul celulelor =


rugozitate controlabilă :

Rugozitatea macroscopica – osteoblaste, neuroni (prelungiri axonice)


Rugozitate nanometrica (10-100 nm) – celule endoteliale

0.2 mm 0.4 mm 1.0 mm

Osteoblaste MG63 pe
membrana de policarbonat

Adeziunea celulara si
3.0 mm 5.0 mm 8.0 mm
proliferarea sunt inhibate
progresiv cu cresterea porilor

6
Lee, S.J.; Choi, J.S.; Park, K.S.; Khang, G.; Lee, Y.M.; Lee, H.B.. Biomaterials 2004, 25, 4699–4707.
b) Modificari morfologice - continuare

Gonçalves, S., Dourado, F., & Rodrigues, L. R. (2014). Overview on Cell-Biomaterial


Interactions. Advanced Polymers in Medicine, 91–128. doi:10.1007/978-3-319-12478-0_4
7
Metode de modificare a texturii suprafetelor polimerice

Tehnologii de modificare a texturii suprafetelor in vederea imbunatatirii interactiunii


interfaciale biomaterial-celule (creste adeziunea celulelor):
❖ LITOGRAFIE OPTICA (FOTOLITOGRAFIERE)

❖ Tehnica de microcontact printing (μCP)

❖ micro- si nanopaternare prin ablatie laser

❖ gravare cu fascicul de ioni

❖ pulverizare directa solutie de polimer

Metode de structurare suprafata - aplicate uniform sau ca “pattern-uri” de ordinul


μm sau nm

8
Metode de modificare a texturii suprafetelor polimerice - continuare

FOTOLITOGRAFIEREA foto = lumina / radiatie


lithos = pietre
graphie = scriere
-proces similar cu cel utilizat in industria microelectronică (circuite integrate)

9
Metode de modificare a texturii suprafetelor polimerice - continuare

Etape fotolitografiere:
1. acoperire suprafata cu strat de fotorezist negativ sau pozitiv
(pe baza de polimer fotoreactiv: poliizopren / rasina novolac)
2. iradiere prin filtru (masca)
3. indepartare polimer nereactionat cu ajutorul solventilor (apa)

Journal of Science: Advanced Materials and Devices, Volume 2, Issue 1, March 2017, Pages 1-14

https://www.youtube.com/watch?v=B0g1_rr-ApI

10
Metode de modificare a texturii suprafetelor polimerice - continuare

FOTOREZIST NEGATIV: FOTOREZIST POZITIV:


Zonele expuse la radiatie se intaresc Zonele expuse la radiatie se dizolva in solvent
Zonele neexpuse se vor dizolva in solvent Zonele neexpuse la radiatie – raman pe material

11
https://www.slideshare.net/KumarGaurav610/photolithography-84068219
Metode de modificare a texturii suprafetelor polimerice - continuare

FOTOLITOGRAFIEREA in aplicatii biomedicale:

➢ permite crearea pe suprafata unui material de diferite


tipuri de pattern 3D micro – sau nanostructurate (in
domeniul μm sau sub-µm ex. 100 nm)

➢ aceste structuri pot constitui puncte de legare pentru celule

Adv. Mater. 2007, 19, 495–513

12
Metode de modificare a texturii suprafetelor polimerice - continuare

FOTOLITOGRAFIEREA in aplicatii biomedicale:

➢ permite crearea pe suprafata unui


material de diferite tipuri de pattern
3D micro – sau nanostructurate (in
domeniul μm sau sub-µm ex. 100 nm)
➢ aceste structuri pot constitui puncte de
legare pentru celule

A. Revzin, R. G. Tompkins and M.


a) fotolitografiere substrat Toner, Langmuir, 2003, 19, 9855

b) imagine SEM: suprafata de sticla cu pattern de chitosan (modificat anterior cu grupari fotoreactive)
c) cultivare cardiomiocite; celulele adera si formeaza linii confluente care se contracta spontan
d) celulele exprima troponina (verde) care demonstreaza potentialul contractil
13
Metode de modificare a texturii suprafetelor polimerice - continuare

Fotolitografia a condus la dezvoltarea altor metode avansate de texturare a suprafetelor:

Litografie de nanoimprimare (NIL)

✓ Materiale polimerice (“rezist”) sunt


transferate pe un substrat prin presarea unei
matrite, acestea ulterior pot fi tratate termic
(temperaturi adecvate substratului) fie prin
expunere la radiatie UV pentru a se obtine
structuri cu suprafata texturata 3D

S. Gilles, M. Meier, M. Prömpers, A. van der Hart, C. Kügeler, A. Offenhäusser, D. Mayer,


Microelectron. Eng., 86 (2009), pp. 661-664 14
Imbunatatirea biocompatibilitatii prin modificarea suprafetelor polimerice

Modificare suprafete polimerice -


a) Metode fizico-chimice
b) Metode morfologice
c) METODE BIOLOGICE
c) Metode biologice

MODIFICARE CU MOLECULE BIOLOGIC ACTIVE = biofunctionalizare material polimeric

Exemple de molecule biologice


care pot fi imobilizate
pe / in
substraturi polimerice
c) Metode biologice

Exemple de molecule biologice care pot fi imobilizate


pe / in substraturi polimerice pentru a promova adeziunea si cresterea celulara:
proteine, secvente peptidice, factori de crestere (GF) din ECM

Micromediul extracelular contine:


✓ biomolecule insolubile = proteine din ECM (colagen, elastina,
fibronectina) sau secvente peptidice scurte care contin domenii de
adeziune celulara (ex. RGD)
✓ biomolecule solubile: factori de crestere, citochine

M. R. Casanova, R. Reis, A. Martins and N. M. Neves,


proteine secretate de celule Mater. Horiz., 2020, DOI: 10.1039/D0MH00542H.

➢ exercita diferite functii in procesele de proliferare celulara,


vindecare leziuni etc. = molecule semnal
➢ exemple: Factori de creştere a endoteliului vascular (VEGF)
Factori de crestere a fibroblastelor (FGF)
Factori de creștere epidermica (EGF)
Factori de crestere derivati din plachete (PDGF)
Proteine morfogenetice osoase (BMP)
c) Metode biologice

M. R. Casanova, R. Reis, A. Martins and N. M. Neves, Mater. Horiz., 2020,


DOI: 10.1039/D0MH00542H.
Modificare cu molecule biologic active

Metode de 1. Adsorbtie fizica - legaturi de H

Atasare ne-covalenta
imobilizare - interactiuni hidrofobe

biomolecule - van der Waals


- forte electrostatice
2. Entrapare fizica - sisteme tip bariera
- hidrogeluri
- dispersate in matrice

3. Atasare covalenta - sisteme polimerice solubile


- suprafete solide
- hidrogeluri
Modificare cu molecule biologic active – atasare necovalenta

1. Adsorbtie fizica
✓ implica simpla adsorbtie a biomoleculelor la biomaterial prin incubarea materialelor
polimerice in solutii ce contin biomoleculele
✓ ulterior se poate realiza o reactie de reticulare pentru a imbunatati stabilitatea stratului
✓ biomoleculele se pot atasa la suprafata materialului prin interactiuni superficiale: forte Van
der Waals, forte electrostatice, interactiuni hidrofobe, legaturi de hidrogen

Avantaje:
metoda simpla si usor de aplicat
este o metoda “delicata” care nu afecteaza structura fragila a biomoleculelor

Deficiente metode de imobilizare necovalenta:


imposibilitatea de a controla: - conformatia si orientarea peptidelor dupa adsorbtia la substrat
- desorbtie peptide
- cinetica de difuzie
Modificare cu molecule biologic active – atasare necovalenta

Adsorbtie fizica - forte electrostatice

✓ proteine cu diferite puncte izoelectrice (pI) pot forma complexe ionice cu


diversi polimeri (chitosan, gelatina sau polielectroliti sintetici)

https://www.news-medical.net/life-sciences/Overview-of-the-Isoelectric-Point.aspx

!! Aceasta adsorbtie fizica poate determina inactivarea & denaturarea proteinei adsorbite

ex. Factorul de creștere transformant (numit uneori factorul de


creștere al tumorilor sau TGF), care este o polipeptida cationica –
formeaza un complex ireversibil cu alginatul (anionic)
Modificare cu molecule biologic active – atasare necovalenta

Adsorbtie fizica - forte electrostatice

ex. Heparina – molecula hidrofoba cu grupari negative – poate fi atasata:

(a) la un substrat hidrofob


(b) adsorbtie heparina
la un substrat incarcat pozitiv
Modificare cu molecule biologic active – atasare necovalenta

2. entrapare fizica

- reprezinta incapsularea / incorporarea biomoleculelor (ex. medicamente) in biomaterial


-strategie pentru eliberare controlata medicamente de la suprafata unui hidrogel
- medicamentul – nu este legat covalent; este retinut de un sistem tip “bariera”
modalitate de a controla cinetica de eliberare a biomoleculelor

Raspunsul celular si tisular depind de durata expunerii si concentratia biomoleculelor


3. Modificare cu molecule biologic active - atasare covalenta

Imobilizarea covalenta de biomolecule functionale pe biomateriale implantabile →


MATERIALE BIOMIMETICE - induc un raspuns tisular specific prin modularea interactiunilor
celule - biomaterial

- se poate realiza numai pe suprafete care contin grupari de tipul –OH, -COOH, -NH2, -SH, –CH=CH2
Aceste grupari reactive pot exista de novo pe suprafata biomaterialelor sau
daca suprafata polimerica nu contine aceste grupari – este necesara modificarea suprafetelor
(metode fizico-chimice: radiatii ionizante, copolimerizare grefata, descarcari in plasma etc.)
pentru a contine aceste grupe functionale de care biomoleculele se pot atasa covalent.

Dupa atasare molecule biologice la substrat polimeric, acestea vor interactiona cu domenii
specifice de pe suprafata celulelor sau cu componenti tisulari si isi vor manifesta actiunea
Modificare cu molecule biologic active - atasare covalenta

Atasare biomolecule
a) ulterior sintezei suporturilor polimerice
Modificare cu molecule biologic active - atasare covalenta

b) in timpul sintezei matricilor polimerice prin reactii combinate conjugare /sinteza

Doua modalitati diferite:


❖ conjugare (atasare biomolecule la monomer activat ) urmata de polimerizare

❖ (co)polimerizare urmata de cuplare biomolecule

26
MULTUMESC!

27
UNIVERSITATEA POLITEHNICA DIN BUCUREŞTI
Facultatea de INGINERIE MEDICALĂ

Biomateriale şi Dispozitive Medicale (BDM)


Echipamente şi Sisteme Medicale (ESM)

BIOCOMPATIBILITATEA POLIMERILOR SI
METODE DE ANALIZA

- CURS 7 -

Conf. Dr. ing. Adriana Lungu


1
INTERACTIUNEA BIOMATERIALELOR CU FLUIDUL SANGVIN

PARTEA 1
Compozitia sangelui. Elemente figurate
Compozitie plasma. Proteine plasmatice
Plasma vs. Ser
Mecanismul coagularii
Fibrinoliza
Sisteme si substante anticoagulante
Trombogenicitate
COMPOZITIA SANGELUI
Sange 6-8% greutatea corpului
Mediul intern al organismului Limfa
Lichid interstitial

Sangele = fluid complex, constituit din 2 faze:


1. PLASMA (faza lichida) 55-60% din sangele total
2. ELEMENTE FIGURATE (faza solida) 40-45% din volum total sange

Blood = “the river of life”

3
https://www.britannica.com/science/blood-biochemistry/Plasma
Image ID : 125194602
ELEMENTE FIGURATE Media Type : Vector
Copyright : Daria Heaney

a) Eritrocite - hematii/celule rosii


-contin hemoglobina – proteina cu rol in transportul gazelor respiratorii (O2, CO2)
- membrana eritrocitelor – contine doua tipuri de proteine – ce definesc cele 4 grupe sanguine

b) Leucocite - celule albe


- sunt considerate celulele sistemului imun
-secreta anticorpi, au functii in inflamatii, fagocitoza,
reactii alergice si reactii antigen-anticorp https://www.cancer.gov/publications/dictionari
es/cancer-terms/def/erythrocyte
- pot fi granulocite sau agranulocite (limfocite si monocite)

c) Trombocite - plachete sangvine


- nu au nucleu
-rol important in hemostaza primara si in mentinerea integritatii vaselor:
adera la nivelul leziunii vasculare si elibereaza factori care
provoaca transformarea fibrinogenului in fibrina

https://en.wikipedia.org/wiki/Platelet
Compozitie plasma. Proteine plasmatice

Compozitie plasma

apa 90-92%

proteine 6-8 % PROTEINELE PLASMATICE:


saruri 0.8 % reprezinta un amestec eterogen de proteine (~100),
faza organica
8-10% lipide 0.8 % cu proprietati fizico-chimice si functii diferite.

zaharuri 0.1 %

5
PROTEINE PLASMATICE - continuare
Albumina serica (Alb) - reprezinta 60% din totalul proteinelor plasmatice
❑ are cea mai mica dimensiune si este produsa de ficat Image ID : 116247637
Media Type : Stock Photo
❑ rol principal - asigura in proportie de 80% presiunea osmotica a sangelui Copyright : petarg

❑ adsoarbe la suprafata implantului

Imunoglobuline (Ig) - reprezinta 36% din totalul proteinelor plasmatice


❑ produse de limfocitele B (din maduva osoasa)
❑ cunoscute sub denumirea de anticorpi
❑ sunt produse de sistemul imun la diferiti antigeni
❑ rol in protectia naturala a organismului
❑ 5 tipuri diferite: IgA, IgD, IgE, IgG si IgM
❑ IgG – cea mai raspandita din serul sangvin (75-80% din totalul Ig);
https://www.news-medical.net/life-sciences
cea mai importanta in lupta contra infectiilor bacteriale si virale; singura care traverseaza placenta

Fibrinogen (Fibr) - sintetizat de hepatocite


❑ doua functii importante:
in procesul de coagulare (factorul plasmatic I al coagularii)
si in faza acuta inflamatii din tesut
❑ adsorbtia de Fibr la suprafata implantului perturba procesul de coagulare:
https://www.sigmaaldrich.com/
Fibr distrus in fragmente mici de fibrina sub actiunea trombinei,
apoi trombocitele se ataseaza la fragmentele de fibrina → cheagul solid insolubil in sange
6
PLASMA vs SER

PLASMA versus SER


Compozitie plasma. Proteine plasmatice

https://microbiologyinfo.com/difference-between-serum-and-plasma/

8
PLASMA vs SER

Plasma sanguina = ser sanguin + factorii coagularii (FIBRINOGEN)

PLASMA https://vivadifferences.com/understanding-serum-vs-blood-plasma/

- contine 3 tipuri de proteine: ALBUMINA, GLOBULINE si FIBRINOGEN


- sange recoltat in tuburi cu anticoagulant si apoi centrifugat
- anticoagulantul inhiba formarea de cheaguri

SER
- contine 2 tipuri de proteine: ALBUMINA si GLOBULINE
- sange recoltat in tuburi fara anticoagulant, se asteapta
(~30 min coagularea) si apoi se centrifugheaza
9
PLASMA vs SER

Plasma sanguina = ser sanguin + factorii coagularii (FIBRINOGEN)

PLASMA https://vivadifferences.com/understanding-serum-vs-blood-plasma/

- contine 3 tipuri de proteine: ALBUMINA, GLOBULINE si FIBRINOGEN


- sange recoltat in tuburi cu anticoagulant si apoi centrifugat
- anticoagulantul inhiba formarea de cheaguri Unde dispare fibrinogenul?

SER
- contine 2 tipuri de proteine: ALBUMINA si GLOBULINE
- sange recoltat in tuburi fara anticoagulant, se asteapta
(~30 min coagularea) si apoi se centrifugheaza
10
MECANISMUL COAGULARII

Coagulare (latina) = a închega, a reuni

= proces complex, în urma căruia un coloid de consistenţă lichidă [sol] (sânge, lapte, latex)
se transformă într-un cheag (gel), cu o separare de o parte lichidă (ser, zer, apă)

Coagularea sângelui - proces foarte complex dar REVERSIBIL


✓ coagulare IREVERSIBILA lapte, sânge - in prezenţa tripsinei gastrice şi a calciului
! sângele nu conţine tripsină

COAGULAREA (HEMOLIZA) constă in separarea


sângelui în 2 componente:

- coagul/cheag – format dintr-o reţea de fibrină


în care sunt prinse, ca într-un năvod, elemente figurate
- ser

11
https://ib.bioninja.com.au
MECANISMUL COAGULARII - continuare

D.p.d.v. chimic are loc transformarea Fibr (solubil) în fibrină (insolubilă) sub acţiunea enzimei TROMBINA

Procesul are loc prin desprinderea şi eliberarea de fibrinopeptide A şi B din structura fibrinogenului

Apoi, se formează reţeaua stabilă de fibrină, în urma polimerizării monomerului de fibrină, sub
acţiunea factorului XIIIa (factorul stabilizator al reţelei de fibrină).

Trombina XIIIa

https://pediaa.com/difference-between-fibrin-and-fibrinogen/
12
MECANISMUL COAGULARII - continuare

- proces deosebit de complex, depinzând de o serie întreagă de factori, care


acţionează în cascadă, numai atunci când se îndeplinesc anumite condiţii.

- sunt implicati factorii coagularii: 13 factori plasmatici ai coagularii (notati cu cifre romane)
7 factori trombocitari sau plachetari (notati cu cifre arabe)

Factorii plasmatici ai coagularii


Factori trombocitari ai coagularii
FI – fibrinogen
FVIII – globulina antihemofilica A f1 – identic cu FV
FII – protrombina
FIX – factorul antihemofilic B f2 – catalizeaza transformarea fibrinogen in fibrina, sub
F III – tromboplastina
FX – factorul Stuart actiunea trombinei
FIV – Ca2+
FXI – factorul antihemofilic C f3 – o lipoproteina insolubila care ia parte la formarea
FV – proaccelerina
FXII – factorul Hageman tromboplastinei
FVI – accelerina
FXIII – factorul stabilizator al fibrinei f4 – un factor antiheparinic
FVII – proconvertina
f5 – identic cu fibrinogenul
f6 – o antiplasmina
Factorii plasmatici ai coagulării îşi desfăşoară activitatea doar
f7 – identic cu FVII
când sunt activaţi.
În condiţii normale (obişnuite) ei se găsesc în formă inactivă.
13
MECANISMUL COAGULARII - continuare

Coagularea sângelui urmează 2 căi:


- calea intrinsecă: mai lungă (necesita 7-12 minute pentru coagulare sange)

este determinată numai de factorii plasmatici

este declanşată de contactul cu fibrele de colagen şi de alţi factori nelezionali

- calea extrinsecă: mai scurtă şi mai promptă (in 5-12 secunde are loc coagulare sange)

Cele două căi ale coagulării


pot fi despărţite doar la modul
teoretic, ele desfăşurându-se
simultan şi întrepătruns.

De la factorul la X-lea, coagularea


urmează o cale comună.

https://fabu-club.com/coagulation-cascade-reference-range/
14
MECANISMUL COAGULARII - continuare

HEMOSTAZA = coagulare sange (oprire sangerare)

FIBRINOLIZA = fenomen invers coagularii


(distrugere retea de fibrina formata)

15
FIBRINOLIZA

= are ca efect eliminare fragmente de cheag si depozite de fibrina.


Se realizeaza prin mecanism enzimatic, fiind catalizata de plasmina (sau fibrinolizina).
Acestea scindeaza fibrina in fragmente polipeptidice mici, solubile, care nu mai pot forma retele covalente.

Produsele secundare ale fibrinolizei inhiba formarea trombinei si polimerizarea monomerilor de fibrina.

Echilibrul intre fenomenele de coagulare (hemostaza) si


cele care impiedica coagularea (fibrinoliza)
16
asigura functia circulatorie a sangelui.
SISTEME SI SUBSTANTE ANTICOAGULANTE

ANTICOAGULANTE ENDOGENE
Sangele contine si factori inhibitori ai coagularii care reduc viteza procesului de coagulare: ex. heparina

ANTICOAGULANTE EXOGENE CU APLICATII TERAPEUTICE


Coagularea sangelui la nivelul implantului poate fi controlata prin administrarea de anticoagulanti:
- heparina (inhiba atat activitatea factorului X cat si actiunea enzimatica a trombinei deja formate)
- EDTA, citraţi sau oxalaţi de sodiu sau potasiu, fluorura de sodiu (inhibă calciul - factorul IV),
- cumarine - compusi naturali (se gasesc in portocale, pastarnac, musetel)

! Efecte secundare: scleroza cerebrala, retinopatie, insuficienta renala si hepatica etc.


17
TROMBOGENICITATE

18
TROMBOGENICITATE

Suprafetele care vin in contact direct cu sangele au o misiune mult mai complexa decat alte biomateriale.

Coagularea sangelui reprezinta un mecanism vital de aparare impotriva sangerarii,


dar trebuie evitata in contextul folosirii biomaterialelor.

La caracteristicile cunoscute (biocompatibil, fezabil, biostabil, sterilizabil), unui material care intra in
contact direct cu sangele, i se adauga cerintele:

• sa nu genereze trombi si embolii prin coagulare (TROMBOZA)


• sa nu altereze proteinele plasmatice (INFLAMATIE)
• sa nu determine distructia celulelor sangvine (HEMOLIZA)

19
https://bioinicia.com/electrospinning-for-tissue-engineering/
TROMBOGENICITATE - continuare

Trombogenicitatea = definita ca proprietatea unui material de a induce formarea de trombi


!! componenta importanta a biocompatibilitatii

Journal of Thrombosis
and Haemostasis, 13
(Suppl. 1): S72–S81,
2015
20
TROMBOGENICITATE - continuare

Un material cu trombogenicitate scazuta este caracterizat prin:


✓ adeziune scazuta a proteinelor plasmatice si respectiv
✓ adeziune redusa a plachetelor

Jinku Kim,
Colloids and Surfaces B: Biointerfaces,
Volume 188,2020,110756 21
INTERACTIUNEA BIOMATERIALELOR
CU FLUIDUL SANGVIN

PARTEA 2

Raspuns trombotic

Strategii de imbunatatire a biocompatibilitatii materiale polimerice / sange

A. PASIVARE SUPRAFETE

B. OBTINEREA DE SUPRAFETE ACTIVE

22
RASPUNSUL TROMBOTIC

Raspunsul fluidului sangvin depinde de 4 componente:


- de biomaterial - prin natura acestuia (compozitia chimica) si respectiv prin morfologie
- de natura aplicatiei: cateter, sistem pentru eliberare controlata medicamente
- de prezenta sau absenta unor agenti antitrombogenici (heparina)
- de starea pacientului

La contactul biomaterial/ sange se declanseaza o


serie de mecanisme care conduc la formarea de
cheaguri. Astfel are loc un RASPUNS TROMBOTIC
constituit din trei faze distincte:
1. Faza proteica
2. Faza celulara
3. Raspuns organizational
Int. J. Mol. Sci. 2020, 21(12), 4259;

23
RASPUNSUL TROMBOTIC

1. FAZA PROTEICA
Adsorbtia competitiva de proteine plasmatice la biomaterial = EFECT VROMAN
initial suprafata biomaterialului este acoperita de Alb si IgG (datorita concentratiilor plasmatice
mari), ulterior acestea sunt inlocuite de proteine cu afinitate mai mare pentru biomaterial
(Fibrinogen)

!! Albumina inhiba aderarea plachetelor


!! Fibrinogenul activeaza aderarea plachetele

Adsorbtie proteine plasmatice


reprezentare schematica:

a) albumina (BSA)

b) IgG

c) Fibr
24
RASPUNSUL TROMBOTIC

2. FAZA CELULARA
❖ initial are loc aderarea si aglutinarea (agregarea) plachetelor
(primele minute);
❖ leucocitele (in special neutrofilele) infiltreaza la locul de
agregare al plachetelor.
❖ se declanseaza procese de coagulare a sangelui
(polimerizarea fibrinogen in fibrina, sub actiunea trombinei)
❖ in urmatoarele ore, PMN si monocite se infiltreaza conducand
http://www.strokecenter.org
la cresterea masei trombusului.

https://ib.bioninja.com.au 25
Interactiunea biomaterial/sange (coagulare sange) si
raspunsul inflamator se influenteaza reciproc.

26
RASPUNSUL TROMBOTIC

3. RASPUNS ORGANIZATIONAL

= reorganizare trombus (retractie cheag, proliferare fibro-celulara)

Celulele endoteliale si fibromusculare inlocuiesc proteinele plasmatice adsorbite si


isi sintetizeaza propria matrice in care sa se dezvolte si sa ramana atasate

Aceasta faza dureaza in medie aprox. 48 h

Functie de tipul de implant aceasta


reorganizare poate sa dureze intre cateva
saptamani si luni (ex. grefe vasculare sintetice
de diametru mare)

27
STRATEGII DE IMBUNATATIRE A
BIOCOMPATIBILITATII MATERIALE POLIMERICE / SANGE

= realizare de materiale netrombogene /


cu trombogenicitate redusa

28
ACS Macro Lett. 2017, 6, 992−1000
International Journal of Biomaterials, 2012, Article ID 707863

29
A. Obtinerea de suprafete pasive (inerte)

B. Obtinerea de suprafete active

“PASIVAREA SUPRAFETEI”
- modificarea suprafetei unor materiale polimerice sintetice (ex. poliuretani, polietilena)
pentru a impiedica adsorbtia proteinelor la contactul dintre materialul polimeric si
mediul biologic (implicit este impiedicat fenomenul de coagulare si activarea plachetelor)

1. Hidrofilizare

2. Pasivare prin acoperire cu albumina (Alb)

3. Imobilizare de fosforil-colina

4. Endotelializare 30
A. OBTINEREA DE SUPRAFETE PASIVE (INERTE)

1. Hidrofilizare

2. Pasivare prin acoperire cu albumina (Alb)

3. Imobilizare de fosforil-colina

4. Endotelializare

31
A. OBTINEREA DE SUPRAFETE PASIVE (INERTE)

1. HIDROFILIZARE – pentru a “inactiva” suprafata biomaterialului

Adeziunea proteinelor si respectiv proliferarea celulara sunt influentate


de raportul hidrofil / hidrofob.

O metoda uzuala de imbunatatire a hemocompatibilitatii biomaterialelor o reprezinta


cresterea hidrofilicitatii suprafetelor polimerice – HIDROGELURI:

nu adsorb proteinele plasmatice si nu promoveaza adeziunea celulara cu formarea de


trombus, datorita afinitatii crescute fata de apa si respectiv a energiei interfaciale
scazute (spre deosebite de suprafetele hidrofobe)
32
33
1. HIDROFILIZARE

Deoarece polimerii hidrofili prezinta proprietati mecanice slabe se prefera acoperirea altor polimeri cu proprietati
mecanice mai bune cu polimeri hidrofili, apoi se realizeaza o reticulare a hidrogelurilor pentru a controla gonflarea.
Metode:
simpla acoperire cu polimeri hidrofili sau grefare iradianta hidrogeluri pe biomateriale

Monomeri hidrofili folositi pentru a modifica


suprafata biomaterialelor:
✓ N-vinil-pirolidona (NVP)
✓ Hidroxietilmetacrilat (HEMA)
✓ Acid acrilic (AA)

✓ Polietilen glicol (PEG) /


polietilen oxid (PEO)

Filme polimerice depuse in plasma


“gold standard for
protein-resistant applications” 34
1. HIDROFILIZARE

- PEG/PEO = polimeri sintetici hidrosolubili


- au aceeasi unitate repetitiva –(CH2CH2O–) n

PEG n = 15-3500 (M 400-100 000)


PEO M >100 000

Incorporarea PEG/PEO intr-un biomaterial polimeric


reduce adeziunea proteinelor plasmatice si a plachetelor,
in comparatie cu un substrat hidrofob nemodificat.

35
1. HIDROFILIZARE

DOUA MECANISME POSIBILE:

❖ efect de impiedicare sterica (repulsie) a proteinelor si celulelor sangvine

❖ fenomen de hidratare = lanturile hidrofile retin moleculele de apa la suprafata;


Acest continut crescut de apa este defavorabil pentru aderarea proteinelor plasmatice sau celulelor
(trombocite / leucocite) → PROTEIN-REPELLENT SURFACES (neaderente pentru proteine)

a) Aderare proteine la biomaterial


b) Inhibare aderare proteine (efect de
impiedicare sterica datorita lanturilor de PEG) 36
ACS Macro Lett. 2017, 6, 992−1000
1. HIDROFILIZARE

Exemple de polimeri a caror suprafata poate fi modificata cu PEG/PEO:


Polistiren (PS); poliuretan (PU);
Polisulfona; polimetilmetacrilat (PMMA) etc.

Dezavantaje:
• dificil de realizat in strat perfect uniform - deoarece primele molecule
imobilizate vor respinge atasarea altor molecule de PEG prin impiedicare sterica
(se pot folosi solventi speciali)
• prezenta celui mai mic defect in stratul polimeric poate declansa
coagularea sau inflamatia
• deoarece absoarbe apa, acest tip de substrat nu este stabil, are tendinta sa se
gonfleze si sa se dezlipeasca de pe suprafata implantului 37
A. OBTINEREA DE SUPRAFETE PASIVE (INERTE)

1. Hidrofilizare

2. Pasivare prin acoperire cu albumina (Alb)

3. Imobilizare de fosforil-colina

4. Endotelializare

38
2. Pasivare prin acoperire cu albumina (Alb)

- nu promoveaza adsorbtia de alte proteine plasmatice


- scade trombogenicitate material - nu are secvente peptidice pentru interactia cu celulele
(plachete sau leucocite) sau receptori pentru enzimele care declanseaza cascada
coagularii

Dezavantaje:
➢ daca Alb este legata fizic la biomaterial, la
contactul cu sangele, alte proteine plasmatice
vor adsorbi si vor inlocui Alb la suprafata
biomaterialului (efect Vroman)
➢ imobilizare covalenta Alb pe suprafata
biomaterial → denaturare Alb

39
A. OBTINEREA DE SUPRAFETE PASIVE (INERTE)

1. Hidrofilizare

2. Pasivare prin acoperire cu albumina (Alb)

3. Imobilizare de fosforil-colina

4. Endotelializare

40
3. Imobilizare de fosforil colina

Biomimetism = mimare chimie si topografie endoteliu vascular

fosfatidil colina - componenta importanta din membrana trombocitelor si eritrocitelor

Fosforilcolina (grefata pe biomaterial sau incorporata in suprafata acestuia)


imita gruparile terminale ale fosfolipidelor
Se reduce aderarea plachetelor la grefe vasculare de PTFE

41
A. OBTINEREA DE SUPRAFETE PASIVE (INERTE)

1. Hidrofilizare

2. Pasivare prin acoperire cu albumina (Alb)

3. Imobilizare de fosforil-colina

4. Endotelializare

42
4. Endotelializare

Cea mai buna metoda de hemocompatibilizare a materialelor: ENDOTELIALIZARE

acoperire pereti interiori ai grefelor vasculare sintetice cu un monostrat de celule endoteliale umane;
practic reprezinta singurele suprafete inerte in raport cu trombocite si factorii coagularii

! foarte dificil de realizat

Adv. Healthcare Mater. 2020, 2000920

Celule progenitoare endoteliale (EPCs)


diferentiaza in celule endoteliale (ECs).

43
A. Obtinerea de suprafete pasive (inerte)

B. Obtinerea de suprafete active

incorporare biomolecule active specifice pe o suprafata polimerica


pentru a produce o reactie favorabila

44
B. OBTINEREA DE SUPRAFETE ACTIVE

Mai multe strategii pentru a controla trombogenicitatea – la suprafata


biomaterialelor:

1. incorporare agenti antitrombotici = HEPARINA - previne activarea trombinei


2. incorporare enzime fibrinolitice - distrug cheagurile de fibrina
3. incorporare agenti de antiagregare plachetara = ex. prostacicline

45
B. OBTINEREA DE SUPRAFETE ACTIVE

Metode de heparinizare biomateriale:

Trei strategii de cuplare heparina la suprafete polimerice:

I. compoundarea heparinei cu polimeri (amestec fizic)


II. legarea ionica a heparinei la materiale care contin functii cationice
III. legarea covalenta a heparinei la suprafete polimerice J. Mater. Chem. B, 2014,2, 7649-7672

a. Hep se leaga ionic de o suprafata incarcata pozitiv


b. Hep formeaza complex ionic cu polimeri cationici
c. Materiale acoperite fizic cu Hep
d. Hep legata covalent
e. Hep legata covalent printr-un “spacer arm”
f. Hep dispersata intr-un polimer hidrofob
g. Conjugate Hep-Alb imobilizate pe suprafata unui biomaterial

46
B. OBTINEREA DE SUPRAFETE ACTIVE

Metode I si II – dezavantaj - instabilitate - Hep elueaza in timp si lasa suprafata neprotejata

Metoda III - imobilizare covalenta Hep - prelungeste activitatea Hep


- dezavantaj – se poate pierde eficienta catalitica a Hep imobilizata covalent

!! Doar in conformatia nativa Hep este capabila sa-si exercite functia (interactiune cu antitrombina III)

47
MULTUMESC!

48
UNIVERSITATEA POLITEHNICA DIN BUCUREŞTI
Facultatea de INGINERIE MEDICALĂ

Biomateriale şi Dispozitive Medicale (BDM)


Echipamente şi Sisteme Medicale (ESM)

BIOCOMPATIBILITATEA POLIMERILOR SI
METODE DE ANALIZA

- CURS 8 -

Dr. ing. Adriana Lungu


1
REZUMAT CURS 8

DECONTAMINAREA
TEHNICI DE ANTISEPSIE : dezinfectie, sterilizare
METODE DE STERILIZARE
AUTOCLAVARE
FILTRARE
STERILIZAREA CU GAZE, RADIATII: neionizante, ionizante
CONTROLUL PROCESULUI DE STERILIZARE

2
DECONTAMINAREA

DECONTAMINAREA – reducerea numarului de germeni de pe un obiect

sau dintr-o substanta pana la zero.

Anti – împotriva Sepsis – putrefacţie

Definitii:

ANTISEPSIE = ansamblu de tehnici / procedee fizico – chimice prin care se distrug sau sunt inhibate
microorganismele patogene (bacterii, virusuri, fungi) de pe suprafeţe care vin în contact direct sau
indirect cu organismul

ASEPTIC = nu prezintă microorganisme sau germeni infecţioşi;


Ex. implant, substanţă farmaceutică, suturi, mediu gazos, sala de operatie etc.
Se realizează prin TEHNICI DE ANTISEPSIE

1. DEZINFECTIE
2. STERILIZARE 3
CURAT ≠ DEZINFECTAT ≠ STERIL

4
TEHNICI DE ANTISEPSIE

1. DEZINFECTIA = distrugerea patogenilor (mai putin a sporilor) de pe suprafete, din aer;


impiedica raspandirea unor boli infectioase.

Dezinfectant = inactivează microorganismele patogene, in afara formelor microbiene de spori.


Antiseptic = pentru dezinfecţie suprafete vii (ex. tegumente, mucoase).

Dezinfectant: formaldehida (8%)


Dezinfectant pentru apa: Cl2 (gaz)
Antiseptice (piele): etanol (50-70%), izopropanol (50-70%), tinctura de iod (2% I2 in alcool 70%)
Antiseptic (ochi nou-nascuti): nitrat de Ag (AgNO3)

5
TEHNICI DE ANTISEPSIE - continuare

2. STERILIZAREA = procedeu prin care sunt indepartate sau distruse toate microorganismele vii
(inclusiv sporii ) de pe suprafata si din interiorul unor obiecte.

Inaintea implantarii, biomaterialele trebuie supuse unui proces de sterilizare efectuat in conditii aseptice
pentru a evita infectiile.

Biomateriale sterile: nu contin forme de viata precum


bacterii (forme vegetative, sporulate), virusuri, fungi

Sterilizarea totală este practic imposibilă

6
CUANTIFICARE STERILIZARE

NIVEL DE ASIGURARE A STERILITATII = SAL (sterility assurance level)


= probabilitatea ca un numar oarecare de implanturi dintr-o cantitate mare supusa
unei tehnici de sterilizare sa ramana nesterilizata.

grad minim de sterilizare SAL =10-6


la 1 milion de produse supuse sterilizarii, exista probabilitatea ca unul sa ramana nesterilizat.

Sterilizarea = etapa importanta a procesului de obtinere a unui implant, proteza sau dispozitiv medical,
De modul de realizare al sterilizarii depinde biocompatibilitatea.

O sterilizare necorespunzatoare poate declansa infectii si poate compromite partial sau total actul medical,
dar poate deasemeni afecta proprietatile si rezistenta la uzura a
implantului, protezei sau dispozitivului medical vizat.

7
DEPIROGENARE

(piros = foc, caldura)

= inactivare sau indepartare agenti pirogeni


- prezenta unei cantitati foarte mici de agenti pirogeni in sangele periferic poate cauza
febra inalta
- este esentiala pentru materialele naturale care, datorita originii naturale, prezinta
probabilitatea de a fi contaminate cu agenti pirogeni
- exemple de agenti pirogeni: endotoxine bacteriene, exotoxine pirogene, ARN viral

sunt fragmente din membrana bacteriilor Gram-negative,


considerate a fi cei mai puternici agenti pirogeni

Bacteriile Gram pozitive au o putere pirogena de 100000 de ori mai slaba decat bacteriile Gram negative.

Pentru a fi aprobate (conform FDA), dispozitivele medicale trebuie


sa aiba un nivel foarte scazut de endotoxine (0.06–0.5 EU/mL)!
8
METODE DE STERILIZARE

9
CONTROLUL PROCESULUI DE STERILIZARE

Pentru ca procesul de sterilizare să fie reproductibil, consecvent şi fiabil, acesta trebuie validat.
Validarea procesului de sterilizare = demonstrarea absenţei dezvoltării bacteriilor şi
monitorizare parametri proces de sterilizare

• metode fizice – control temperatura (termometru), presiune (manometru), timp de expunere

• metode chimice: se folosesc substanţe cu punct de topire apropiat de temperatura la care se face sterilizarea
(ex. acid benzoic 120oC)

• metode biologice = bioindicatori: preparate standard de spori bacterieni specifice diferitelor tipuri de sterilizări.

furnizează dovezi directe că s-au atins condiţiile letale necesare sterilizării în timpul tratamentului

“gold standard”

10
CONTROLUL PROCESULUI DE STERILIZARE - continuare

Ex. fiole Stearotest – suspensie de spori de Bacillus stearothermophilus;


atingerea temperaturii de 121°C duce la distrugerea sporilor, indicatorul din fiole virează.

11
METODE DE STERILIZARE FIZICE

12
STERILIZAREA PRIN CALDURA

Caldura uscata:
❖ Incalzire la incandescenta (ex. ansa bacteriologica)

❖ Flambare

❖ Incinerare

❖ Sterilizare cu aer supraincalzit in etuva (cuptor Pasteur, Pupinel) 180°C 1h sau 160°C 2h

✓ aceasta tehnica poate fi folosita pentru DEPIROGENARE (temp >250oC)


✓ pentru validarea acestui proces se recomanda folosirea sporilor de Bacillus subtilis
✓ este aplicata pentru materiale rezistente termic (ex. silicon, sticla, metale)
Avantaj = metode simple
Dezavantaje: temperatura crescuta si timp lung de realizare → deteriorare materiale
(topire, deformare, degradare)

DRY HEAT (CALDURA USCATA) ˃˃ DRY HEAT (CALDURA UMEDA)


necesita temperaturi mai mari si timpi de expunere mai mari
13
STERILIZAREA PRIN CALDURA

Caldura umeda:
❖ Fierbere (min. 30 min la 100°C)

❖ Pasteurizare: T=56oC – 85oC, 6-8 min, urmata de o racire brusca la 4oC;


ultrapasteurizare (UHT): 135-150oC, 2-4 sec.

❖ Tindalizare = sterilizare fractionata sau discontinua; incalzire in baie de apa consecutiv 3-8 zile, 1-3 ore/zi;

60-100°C. intre incalziri materialul este pastrat la 4°C.


Metoda este aplicata in special pentru medii de cultura (se altereaza peste 100°C)
❖ Sterilizarea prin vapori de apa sub presiune (autoclavare) - cea mai sigura metoda de sterilizare

14
STERILIZAREA PRIN CALDURA

AUTOCLAVAREA
Conditii de realizare:
▪ vapori de apa sub presiune
▪ T= 121-124°C;
▪ timp = 15-30 min;
!! se distrug atat formele vegetative cat si sporii

Acest proces implica urmatoarele etape:


Etapa 1: inlocuire aer cu abur
Etapa 2: sterilizare cu control de temperatura;
Etapa 3: uscare cu evacuare de abur

Avantaje: tehnica rapida, eficienta, simpla, fara toxicitate


Dezavantaje:
- toate suprafetele produsului finit trebuie sa fie in contact cu vaporii de abur
-putine materiale polimerice permit incalzirea lor pana la temperatura de autoclavare, fara modificarea
15
proprietatilor optice si fizico-mecanice
STERILIZAREA PRIN CALDURA

Controlul sterilizarii in autoclave:


a) Metode chimice de control sterilizare

In autoclav se plaseaza obiecte de sterilizat + tuburi din sticla cu substante


(pulberi) cu punct de topire cunoscut (~120°C)
(parachinona, sulf, acid benzoic);

Daca in autoclav s-a ajuns la temperatura de topire a acestor substante, dupa


deschiderea autoclavului se va observa ca sunt solidificate in bloc.

b) Metode biologice de control sterilizare

suspensie de spori de Bacillus stearothermophilus;


atingerea temperaturii de 121°C duce la distrugerea sporilor, indicatorul din fiole virează.

16
STERILIZARE PRIN FILTRARE

Filtrarea = trecerea unui lichid prin membrane poroase pentru a reţine


diferite tipuri de microorganisme patogene (indepartare fizica)
Se realizeaza la t. camerei si se aplica unor lichide biologice sau solutii
injectabile, care se altereaza prin tratare termica: vaccinuri, soluţii
oftalmice, unele preparate intravenoase, medii de culturi tisulare

Ø pori membrane filtrante de sterilizare = 0.45, 0.22 sau 0.1 µm


Materiale filtre: acetat de celuloză, esteri de celuloză, nitrat de celuloză,
fluorocarbonat, polimeri acrilici, policarbonat, poliester, policlorură de vinil etc

17
STERILIZAREA CU RADIATII

radiaţii de energii diferite, ionizante sau neionizante (ex.: radiaţii gamma, radiatii X, UV, microunde, laser, IR).

Pentru fiecare radiaţie se va preciza:

✓ sursa de radiaţii

✓ mecanismul de obţinere

✓ doza de radiaţie necesară

✓ adâncimea de pătrundere

✓ efecte de încălzire

✓ toleranţe

✓ materiale ce pot fi utilizate

✓ condiţii de stocare.

Sunt necesare dozimetre pentru controlul dozei optime care va asigura


sterilizarea eficientă, fără a distruge suprafaţa implantului.

18
STERILIZAREA CU RADIATII NEIONIZANTE

Sterilizarea cu radiatii UV - radiatii neionizante, cu putere de penetrare mica


Se folosesc radiatii UV-B sau UV-C, produse de lampi cu vapori de Hg (240 and 280 nm)

Conditii: 15-30°C, umiditate max. 60%;

Aplicatii:
sterilizare suprafeţe netede şi încăperi (nise de laborator,
săli de operaţie, blocuri sterile), conservarea apei distilate

19
STERILIZAREA CU RADIATII IONIZANTE

Sterilizarea cu radiatii gamma (1956)


radiatii gamma produse in urma dezintegrarii unei surse radioactive (izotopi 60Co sau 137Cs)
Gradul SAL scade logaritmic cu cresterea dozei de radiatii

MECANISM:

determina alterarea ireversibila a principalelor componente celulare si microorganismele mor.


La dezintegrare, apar si electroni (energie de cca 315 keV), care participa la procesul de
sterilizare, intrerupand viata celulara

20
STERILIZAREA CU RADIATII IONIZANTE

Doza standard de sterilizare cu radiatii ionizante γ = 25 kGy

Controlul sterilizarii:
indicator biologic = spori de Bacillus pumilus

APLICATII:
✓ metoda adecvata pentru majoritatea materialelor, cu unele exceptii
✓ se aplica in general pentru formulari farmaceutice, seringi, ace etc.

21
STERILIZAREA CU RADIATII IONIZANTE - continuare

AVANTAJE:
procedeu eficace, rapid de sterilizare, netoxic, fara reziduuri, bine controlat prin dozimetrie
putere mare de penetrare - permite sterilizarea produselor în ambalajul final
! Se reduce considerabil posibilitatea contaminării post-sterilizare a produsului medical

DEZAVANTAJE:
➢ pret de cost foarte mare
➢ modificari structurale ale materialelor polimerilor:
daca polimerul este resorbabil, proprietatile de degradare vor fi modificate, acest fapt
avand consecinte importante asupra comportarii in vivo
schimbari ale proprietatile mecanice
(ex. poliacetali si poliamide; policarbonati si polipropilena)

22
Alte metode de sterilizare fizica:

Sterilizarea prin ULTRASONARE


➢ microrganismele sunt distruse/indepartate cu ajutorul ultrasunetelor (20–40 kHz)
➢ se foloseste pentru instrumentar medical / chirurgical

https://www.youtube.com/watch?v=owzVcZzNGvA

23
METODE DE STERILIZARE CHIMICE

24
STERILIZAREA CU SUBSTANTE CHIMICE LICHIDE

https://labsafety.gwu.edu/sterilization-disinfection-and-decontamination
25
STERILIZAREA CU SUBSTANTE CHIMICE LICHIDE

Cu SUBSTANTE LICHIDE = metode de dezinfectie


✓ alcooli precum alcool etilic, alcool isopropilic = solutii 70%
deshidrateaza celulele, deterioreaza membrana celulara si cauzeaza
coagularea proteinelor
✓ fenoli – deterioreaza membrana celulara, precipita proteinele si inactiveaza enzimele
sunt bactericide, fungicide dar sunt ineficiente impotriva sporilor si virusurilor
✓ aldehide – sunt agenti de alchilare care distrug acizii nucleici;
distrug microorganismele, inclusiv sporii
!! Comparativ cu alcoolii, care sunt volatili, fenolii si aldehidele sunt in general agenti toxici, corozivi,
iritanti si implica o etapa suplimentara de “clatire” pentru a indeparta reziduurile chimice

26
STERILIZAREA CU GAZE

OXID DE ETILENA (EtO) = gazul cel mai frecvent utilizat pentru sterilizarea produselor cu
aplicatie medico-chirugicala

CONDITII: temperatura 20- 60ºC


umiditate 40-90%
timp de expunere functie de material si de concentratie gaz:
conc. 850 – 900 mg/l pentru 3 ore
conc. 450 mg/l pentru 5 ore
conc. 200 mg/l pentru 16 ore
EtO poate fi folosit singur sau în combinaţii cu alte gaze (ex. EtO + CO2)

MECANISM:
EtO determina alterarea sau distrugerea componentelor
celulare şi a materialului genetic al microorganismelor
patogene şi a sporilor, prin reactii de alchilare a grupelor
SH, OH, COOH si NH2 din acizii nucleici.

27
STERILIZAREA CU GAZE - continuare

AVANTAJE:
foarte bun sterilizant pentru majoritatea materialelor, eficient si la temperaturi mici, cu posibilitate de a
steriliza atat materialul cat si ambalajul acestuia

https://www.youtube.com/watch?v=M3ZICe3Vwj8
DEZAVANTAJE:
❖ agent mutagen - ataca grupele amino din ADN → aberatii cromozomiale etc.
❖ toxic: EtO reziduala se poate elibera din materialele polimerice
❖ inflamabil (temp. fierbere 11oC) si exploziv, de aceea se amesteca cu alte gaze (N2, CO2, ozon, peroxid de
hidrogen vaporizat)
❖ pret de cost al sterilizarii ridicat
❖ timp mare de sterilizare (biomaterialele trebuie AERATE dupa sterilizare (“spalare” cu aer steril), pentru
a elimina gazele reziduale absorbite la suprafata)

UTILIZARE:
majoritatea implanturilor, grefe (cardiace, vasculare, ortopedice),
lentile de contact, fire si mănuşi chirurgicale, instrumente telescopice,
echipamente medicale sensibile la căldură

28
CONTROLUL PROCESULUI DE STERILIZARE - continuare

29
UNIVERSITATEA POLITEHNICA DIN BUCUREŞTI
Facultatea de INGINERIE MEDICALĂ

Biomateriale şi Dispozitive Medicale (BDM)


Echipamente şi Sisteme Medicale (ESM)

BIOCOMPATIBILITATEA POLIMERILOR SI
METODE DE ANALIZA

- CURS 9 -

Conf. dr. ing. Adriana Lungu


1
REZUMAT CURS 9

TESTAREA BIOCOMPATIBILITATII
TESTE DE LABORATOR IN VITRO
TESTE PRECLINICE IN VIVO
TESTE CLINICE IN VIVO
TESTAREA BIOCOMPATIBILITATII

Dispozitivele medicale sunt reglementate de trei directive:


Council Directive 90/385 EEC on Active Implantable Medical Devices
Council Directive 93/42 EEC on Medical Devices
Council Directive 98/79/EC on In vitro Diagnostic Medical Devices

Testele de biocompatibilitate sunt diferite, functie de:

- durata de utilizare (TIMP DE CONTACT MATERIAL - MEDIU BIOLOGIC)

- modul in care biomaterialele intra in contact cu tesuturile biologice


(sange, tesuturi moi / dure)

3
TESTAREA BIOCOMPATIBILITATII

CATEGORII DISPOZITIVE MEDICALE (anexa 1)

Pe verticala:

tip dispozitiv
Dispozitive de suprafata:
piele
membrane/mucoase
suprafata afectata
Dispozitive temporare / comunica cu:
tesuturi
sangele (direct / indirect)
Dispozitiv implantabile:
in tesut
in sistemul sangvin

Pe orizontala:
durata contact cu organismul;
A=limitata <24 h;
B=prelungita 24 h-30 zile
C=permanenta>30 zile;
TESTAREA BIOCOMPATIBILITATII

MATRICEA TESTELOR DE BIOCOMPATIBILITATE (anexa 2)


ISO – 10993

Teste:
1. Citotoxicitate
2. Sensibilizare
3. Iritare/Intracutanat
4. Toxicitate sistemica acuta
5. Toxicitate subcronica
6. Genotoxicitate
7. Implantare
8. Hemocompatibilitate
9. Toxicitate cronica
10. Carcinogenicitate
11. Reproductivitate
12. Biodegradare
TESTAREA BIOCOMPATIBILITATII

Biocompatibilitatea materialelor in contact cu organismul viu se


stabileste printr-o succesiune de teste biologice:

teste clinice pe organisme umane (in vivo)

teste preclinice pe animale (in vivo)

teste de laborator (in vitro si ex vivo)


TESTAREA BIOCOMPATIBILITATII

in vitro, ex vivo, in vivo

in vitro = experiment în in vivo = teste pe modele animale

mediu controlat, în / oameni

eprubetă/ vas Petri;


conditiile de testare nu
coincid cu cele din
interiorul organismului

ex vivo (in afara organismului) = experimente realizate în /


pe tesuturi în mediu artificial care implică preluarea de
tesuturi si cultivarea în conditii sterile, permitand astfel
experimentarea în conditii extrem de controlate.
7
TESTAREA BIOCOMPATIBILITATII

Caracteristici – testare biocompatibilitate:

➢ Creste relevanta experimentelor: de laborator (in vitro), preclinice (in vivo), teste clinice (in vivo)

➢ Cu cat riscul este mai mare cu atat testele biologice pe care ar trebui sa le treaca materialul

ar trebui sa fie mai numeroase

➢Teste de biocompatibilitate - ordine foarte precisa, in conditii de pH, temperatura etc.,

similare organism uman

➢ Anumite teste se pot realiza atat in vitro cat si in vivo, ele sunt complementare

➢ Testele se fac cu materiale de referinta (de control)


Teste preclinice Teste clinice
Teste in vitro
in vivo in vivo
Evaluarea biocompatibilitatii prin TESTE DE LABORATOR IN VITRO

Teste preclinice Teste clinice


Teste in vitro
in vivo in vivo

▪ permite obtinerea de informatii rapid si ieftin


▪ conduce la reducerea numarului de animale sacrificate in acest scop
▪ constau in interactia in vitro a biomaterialului cu celulele
(considerate a fi cele mai simple organisme)

10
TESTE DE LABORATOR IN VITRO - continuare

CULTURI CELULARE:

1. dupa aderenta celulelor la substrat

2. dupa tipul celulelor cultivate

11
TESTE DE LABORATOR IN VITRO - continuare

1. dupa aderenta celulelor la substrat:


Forma pe care o iau celulele dupa proliferare reflecta de fapt tesutul din care provin.

a) Celule aderente:
- celulele sunt plasate in placi ce favorizeaza atasarea (ex. placi colagenate)

- cresc in monostrat confluent: odata ce devin confluente, celulele nu se mai dezvolta (inhibitie de contact)

- doua tipuri de morfologii: celule epiteliale (poligonale) si celule fibroblastice (alungite)

12
TESTE DE LABORATOR IN VITRO - continuare

b) Celule neaderente (in suspensie):


- sunt sferice si plutesc in mediul de cultura (sub forma de celule individuale sau sub forma de mici “insule”)

Exemple:

➢culturi derivate din sange (ex. limfocite)

➢linii celulare (accesibile comercial) – adaptate sa creasca in suspensie, pentru a


se obtine concentratii mai mari de celule

➢culturi de celule de insecte


TESTE DE LABORATOR IN VITRO - continuare

2. dupa tipul celulelor cultivate se disting doua mari categorii de culturi:

a) Culturi de celule primare


- sunt obtinute prin disocierea enzimatica a unui tesut (proteaze si colagenaze)

- pot fi preluate de la: embrioni, animale nou-nascute, animale adulte

- cele mai utilizate culturi celulare: primate, om, rozatoare (soareci, sobolani, hamsteri), pasari

Avantaje culturi primare:

- proprietati mult mai apropiate de celulele organismului (stare fiziologica normala) → rezultate mai elocvente

- exemple de culturi de celule primare: celule umane din maduva osoasa; celule umane fibroblaste gingivale;
osteoblaste din craniu sobolan; celule epiteliale /fibroblaste sobolan

14
TESTE DE LABORATOR IN VITRO - continuare

b) Linii celulare continue (clonate)


Celule transformate - se diferentiaza de celule normale; se divid si cresc continuu

Avantaje linii celulare:

- permit standardizarea lucrarilor efectuate in mai multe laboratoare (verificare reproductibilitate)

- relativ usor de mentinut; schimbarea mediului de cultura se realizeaza usor

- fiind clone, celulele sint identice genetic

isi mentin caracteristicile genetice si morfologice pe parcursul unei vieti foarte lungi (pana la infinit).

Relevanta testelor de biocompatibilitate este puternic influentata de


tipul de celule utilizate la efectuarea experimentelor
TESTE DE LABORATOR IN VITRO - continuare

Exemple de linii celulare – proliferare in monostrat:

❖ celule epiteliale: HeLa

❖ celule endoteliale: BAE-1

❖ fibroblaste: MRC-5

❖ neuronale: SH-SY5Y

Morfologia acestora reflecta tesutul de origine.

16
TESTE DE LABORATOR IN VITRO - continuare

Exemple de linii celulare – proliferare in monostrat:

❖ celule epiteliale: HeLa

❖ celule endoteliale: BAE-1

❖ fibroblaste: MRC-5

❖ neuronale: SH-SY5Y

Morfologia acestora reflecta tesutul de origine.

HeLa =
HENRIETTA LACKS
17
INEDITA POVESTE a Henriettei Lacks, femeia cu CELULE NEMURITOARE, moartă în 1951, dar care trăieşte

„The Immortal Life of Henrietta Lacks” de Rebecca Skloot

best seller - New York, 2010


Celulele HeLa = cea mai veche linie celulara, separata in 1951

din tumora canceroasa (carcinom cervical) col uterin

➢ celulele tumorale foarte agresive care se divizau cu o viteză nemaintâlnită.

➢ de la moartea femeii până în prezent au fost cultivate peste 50 de milioane de tone de celule HeLa, iar utilizarea lor a
fost menționată în peste 60.000 de studii științifice

➢ celulele HeLa se găsesc în aproape toate laboratoarele de cercetare biologică din întreaga lume.

➢ au ajuns chiar și în spațiu, pentru a se vedea dacă țesutul omenesc poate supraviețui în condiții de gravitație zero.
Celulele HeLa pot fi ținute înghețate timp de ani de zile, iar când sunt dezghețate din nou continuă să se înmulțească.

➢ au ajutat la realizarea unora dintre cele mai importante progrese în medicină: vaccinul împotriva poliomielitei,
chimioterapia, clonarea, descifrarea genomului uman sau fertilizarea in vitro.
TESTE DE LABORATOR IN VITRO - continuare

Medii de cultura:

Se pot clasifica dupa mai multe criterii:

dupa consistenta - sunt medii lichide si semilichide;

dupa compozitie - exista medii naturale, semisintetice si sintetice;

dupa valoarea nutritiva si scopul urmarit :

➢ medii de crestere - asigura proliferarea celulelor din cultura

➢ medii de mentinere -pentru întretinerea culturilor ajunse la dezvoltare

maxima si care pastreaza toate activitatile celulare

➢ medii defective - testarea celulelor în conditii speciale de crestere.

20
TESTE DE LABORATOR IN VITRO - continuare

Mediile de cultura celulara asigura:


- echilibru ionic, pH optim (pH 7.2 - 7.4), temperatura optima, continutul de 02 si de CO2 favorabil;
- elemente nutritive, indispensabile metabolismului: carbohidrati (glucoza), proteine animale
(din lichide biologice - plasma, ser, lichid amniotic) si aminoacizi esentiali, lipide,
vitamine, hormoni, etc.
- evitarea contaminarii cu germeni patogeni prin adaugarea de antibiotice (penicilina, streptomicina
si antifungice (stamicin, micostatin);
- stimularea multiplicarii si cresterii celulelor prin adaugarea de extracte embrionare.

Exemple:
Mediul bazal EMEM (Eagle's minimal essential medium)
Mediul DMEM (Dulbecco modified Eagle's minimal essential medium)
Evaluarea biocompatibilitatii prin TESTE PRECLINICE IN VIVO

Teste preclinice Teste clinice


Teste in vitro
in vivo in vivo
ISO 10993-2

- se folosesc animale vii - pentru verificare cerinte de biocompatibilitate


- sunt obligatorii inainte de testele clinice

Avantaje: - reprezinta o aproximatie mai buna decat testele de laborator


- folosesc cele mai adecvate animale ca model

Dezavantaje: - necesita protocoale si timp


- sunt scumpe
- rezultate uneori dificil de interpretat
- ridica anumite probleme de etica

22
TESTE PRECLINICE IN VIVO - continuare

Modele animale pentru evaluarea in vivo a dispozitivelor medicale

Categorie implant Animal de experienta

Chirurgie cardio-vasculara
valve cardiace oaie
grefe vasculare caine, porc
stenturi porc, caine
inima artificiala vitel

Ortopedie / chirurgie osoasa


substitut osos iepure, caine, porc, sobolani
proteza totala de sold/genunchi caine, capra, primate
implant craniofacial iepure, porc, caine, primate
cartilaj iepure, caine
ligamente si tendoane caine, oaie

Neurologie
regenerare nervi periferici sobolani, pisica, primate
stimulare electrica sobolani, pisica, primate

Oftalmologie
lentile de contact iepure
lentile intraoculare iepure, maimute

23
TESTE PRECLINICE IN VIVO - continuare

Testele preclinice – presupun introducerea unui esantion din biomaterial sau extract din acesta
in organismul animal, pe diferite cai:
a) ORALA (ingestie sau inhalare)
b) INJECTII

intramuscular
subcutanat
intravenos

intraperitoneal

intradermic

c) IMPLANTARE propriu-zisa: in tesut moale, intramuscular, subcutanat, intraperitoneal,


intramedular (femur, tibie), transcortical (femur, craniu)
24
Evaluarea biocompatibilitatii prin TESTE CLINICE IN VIVO

Teste preclinice Teste clinice


Teste in vitro
in vivo in vivo

- sunt cele mai relevante in testarea biocompatibilitatii unui material

- demonstreaza adevarata performanta a unui biomaterial

- nu pot fi standardizate

- implica probleme controversate de etica

- sunt foarte scumpe

- trebuie facute numai dupa teste preclinice pe animale

- se aplica pe VOLUNTARI

- implantarea unui biomaterial in organism se face intr-o regiune cat


mai apropiata de aplicatia pentru care este proiectat

25
TESTE CLINICE IN VIVO - continuare

In cele mai multe teste clinice se utilizeaza EFECTUL PLACEBO – un


grup de pacienti este supus medicatiei/implantului de testat +
un grup de pacienti (de control / referinta) este tratat cu placebo

EFECTUL PLACEBO = raspuns observabil si masurabil al


organismului la o terapie placebo (o medicatie inerta – ex. pilula
de amidon sau zahar, sau un act chirurgical inofensiv)
- este benefic si NU se datoreaza tratamentului aplicat = putere
de autoinsanatosire

EFECT NOCEBO (anti placebo)


Credinta pacientului ca un anumit
medicament/biomaterial ii face rau
declanseaza uneori efecte terapeutice negative

Efectele Nocebo si Placebo trebuie discutate impreuna:


mecanismele de declansare pot fi aceleasi, dar rezultatele sunt opuse 26
UNIVERSITATEA POLITEHNICA DIN BUCUREŞTI
Facultatea de INGINERIE MEDICALĂ

Biomateriale şi Dispozitive Medicale (BDM)


Echipamente şi Sisteme Medicale (ESM)

BIOCOMPATIBILITATEA POLIMERILOR SI
METODE DE ANALIZA

- CURS 10-

Conf. Dr. ing. Adriana Lungu


1
TESTE DE BIOCOMPATIBILITATE BIOMATERIALE

Testarea biocompatibilitatii materialelor se face conform:

standard ISO – 10993:

ISO = ASTM = American Standards for


International Standards Organization Testing and Materials
TESTE DE BIOCOMPATIBILITATE BIOMATERIALE

Cele mai importante instructiuni – se refera la:

➢ Evaluarea si testarea de biomateriale (ISO 10993-1)

➢ Ghid cu privire la folosirea animalelor in teste preclinice (in vivo) (ISO 10993-2)

➢ Teste de mutagenicitate si genotoxicitate (in vitro si in vivo) (ISO 10993-3)

➢Teste de hemocompatibilitate (ISO 10993-4)

➢Teste de citotoxicitate (in vitro) (ISO 10993-5)

➢ Efecte locale dupa implantare (ISO 10993-6)

➢ Teste de iritabilitate si sensibilitate (in vivo) (ISO 10993-10)

➢ Teste de toxicitate sistemica si pirogenitate (in vivo) (ISO 10993-11)


TESTE DE BIOCOMPATIBILITATE BIOMATERIALE

Evaluarea biocompatibilitatii materialelor consta intr-o succesiune de teste biologice:

A. Teste de evaluare initiala a biocompatibilitatii


1. Teste de citotoxicitate
2. Teste de iritare piele/ reactii alergice
(sensibilizare si potential iritant /reactivitate intracutanata)
3. Teste de toxicitate sistemica
4. Genotoxicitatea
5. Efect local dupa implantare
6. Teste de hemocompatibilitate

B. Teste de evaluare complementara a biocompatibilitatii (cu scopul de a scoate pe piata biomateriale mai sigure)
1. Toxicitate cronică
2. Carcinogenicitate
3. Toxicitatea asupra reproducerii şi dezvoltării (creşterii)
4. Degradare

4
TESTE DE EVALUARE INITIALA A BIOCOMPATIBILITATII

5
1. TESTE DE CITOTOXICITATE

Definitie: Capacitatea potentiala a unui dispozitiv medical de a


induce efecte subletale sau letale la nivel celular

Caracteristici generale:
- metode simple, ieftine, standardizate de detectare a efectelor
adverse generate de un biomaterial asupra celulelor
- se refera la efectele toxice provocate de prezenta unui material la nivel celular.

Principiul metodei:
- substantele toxice sunt eliberate de material in mediul de cultura al celulelor
→ difuzeaza prin membrana celulelor → celulele isi schimba marimea,
forma, gradul de proliferare, lizeaza, se dezintegreaza

6
1. TESTE DE CITOTOXICITATE - continuare

Toxicitatea materialului prezent in mediul de cultura se verifica prin raportul intre

nr. de celule moarte si nr. total de celule, la anumite intervale de timp (24, 48 si 72 h)

Citotoxicitatea unui material poate fi efectuata prin 3 tipuri de teste


functie de modul in care materialul este expus celulelor:

a) contact direct cu suprafata biomaterialului


b) contact indirect, difuzie in mediu de agar
c) metoda elutiei - expunerea celulelor pe extracte din biomaterialul de analizat

Fiecare test este interpretat riguros pe baza numarului de celule afectate.


1. TESTE DE CITOTOXICITATE - continuare

a) Contact direct cu suprafata biomaterialului


Piese din materialul de testat sunt plasate direct pe suprafata stratului
de celule, care este acoperit cu o pelicula din mediul de cultura.
Substantele toxice eliberate din materialul testat pot scadea viteza
cresterii celulelor sau pot provoca diferite leziuni

8
1. TESTE DE CITOTOXICITATE - continuare

b) Contact indirect (difuzie in agar)


• se obtine mai intai un monostrat confluent de celule
• se acopera cu un strat de agar;
• se asteapta sa se solidifice;
• peste se plaseaza o piesa din materialul de testat.
Substantele toxice solubilizate (cu M<100Da) din material vor difuza prin stratul subtire
de agar si vor omori sau leza celulele din monostrat

AGAR = polimer coloidal special derivat dintr-o alga rosie;


exista tipuri diferite de agar, diferite prin
masa moleculara sau gradul de polimerizare

c) Metoda elutiei: expunerea celulelor pe extracte din biomaterialul de analizat


Se prepara mai intai un extract (eluat) din biomaterialul (de testat de regula in sol. NaCl)
Extractul este plasat in diferite concentratii pe un monostrat de celule;
Se evalueaza toxicitatea la diferiti timpi de incubare la 37°C (48 h)
Celule vii sau moarte, pot fi vizualizate prin utilizarea de coloratii diverse
1. TESTE DE CITOTOXICITATE - continuare

Coloratii utile in aprecierea proliferarii, viabilitatii si citotoxicitatii celulare:


1. TESTE DE CITOTOXICITATE - continuare

Coloratii utile in aprecierea proliferarii, viabilitatii si citotoxicitatii celulare:


Coloratie Hematoxilin – Eozina:
Celulele vii sunt fixate si marcate cu un marker citochimic:
hematoxilina - nuclei albastri; eozina – citoplasma roz/rosu
Celulele moarte isi pierd aderenta de placa de cultura si se pierd în timpul procesului de fixare

Testul cu Trypan Blue (TB) – colorant ce patrunde in celula cand membrana este lezata.
Celule moarte colorate în albastru, cele vii incolore.

Testul MTT – sare de tetrazoliu (galbena) redusa de enzime mitocondriale la un formazan (albastru)

3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-
2,5-difeniltetrazolium bromura

Testul cu Rosu Neutru (NR) – colorant cationic ce penetreaza membranele celulare


(difuzie) si se acumuleaza intracelular în lisosomi, in matricea lisosomala.
Celulele vii incorporeaza NR; citotoxicitate = scadere în preluarea si legarea NR
2. TESTE DE IRITARE PIELE / REACTII ALERGICE

Teste de sensibilizare si potential iritant/reactivitate intracutanata

Principiul metodei:
testul consta in investigarea daca DM (ca atare sau extracte)
induce o reactie a sistemului imun la expuneri repetate;

Caracteristici generale:
-sunt teste in vivo, atat pe animale (prin teste preclinice) cat si pe oameni (teste clinice);
- teste adaptate si pentru realizare in vitro

Reactia alergica:
- raspuns al sistemului imun al organismului prin reactii alergice in prezenta unor alergeni
- expunerea la alergeni – se face pe diferite cai specializate: oral (inhalare, ingestie), dermic,
ocular, intravenos, intramuscular, subcutanat, intradermal, intraperitoneal

12
2. TESTE DE IRITARE PIELE / REACTII ALERGICE - continuare

Teste in vivo pe animale (preclinice)


Teste de iritabilitate primara – implica un contact intre biomaterial si mucoase (porci guinea - varsta o luna)
respectiv cu piele intacta sau ochi (iepuri albino)

Teste in vivo pe oameni (clinice)

Reactiile alergice ale organismului la interactia cu alergeni pot fi clasificate dupa:


❖ manifestare:
raspunsuri locale ale tesutului (reactii de iritare): eritem (roseata),
inflamatie (edem), durere si chiar distrugere tesuturi
raspunsuri sistemice: simptome respiratorii, astm, anxietate, dureri de
cap, palpitatii, urticarie, voma, soc anafilactic
❖ mod de producere: imediat sau cu intarziere,
❖ reversibilitate: reversibile sau ireversibile

13
2. TESTE DE IRITARE PIELE / REACTII ALERGICE - continuare

Teste in vitro – principiu:

❖ organismul raspunde la un anumit alergen printr-un nivel crescut de anticorpi (IgE) in plasma sanguina,
care stimuleaza eliberarea de histamina si declanseaza reactii alergice ale organismului
❖ se foloseste sange prelevat de la animale / om si se masoara cantitatea de anticorpi care se formeaza, ca un
indicator al efectelor alergice provocate de material/extract

Dupa tehnica de identificare si masurare a complexului anticorp – antigen, testele pot fi:
❑ RAST (radio allergo sorbent testing)
❑ FAST (fluorescent allergo sorbent testing)
❑ ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay)

14
2. TESTE DE IRITARE PIELE / REACTII ALERGICE - continuare

exemplu clasic:
reactia alergica la aliajele metalice care contin nichel cand vin in contact cu pielea
Au şi Ag nu provoacă alergii;
nu pot fi modelate în stare pură, li se adaugă alte metale, precum Ni, extrem de reactiv şi dăunător pielii sensibile
❖ Ag puritate 92,5% + 7,5 de regulă, cupru, adăugat pentru creşterea rezistenţei, care nu provoacă alergie
❖ Au de calitate (18 / 22 K) - conţinutul de Ni e mai mic
❖ bijuteriile din platină şi aur alb pot conţine Ni (rar), de obicei, contin paladiu, mai puţin alergen

15
3. TESTE DE TOXICITATE SISTEMICA

Caracteristici generale:
Teste special concepute pentru evaluarea toxicitatii cauzata de compusii secundari
proveniti de la biomateriale

Un biomaterial poate fi biocompatibil in forma bruta, insa componentele


dizolvate sau produsii formati prin reactia dintre componentele eliberate si
gazda organica, ar putea sa nu fie biocompatibili

- teste preclinice in vivo – extractul din material se administreaza injectabil


(intravenos sau intraperitoneal) pe sobolani, soareci, iepuri, caini, porci guinea

Semne clinice toxicitate – diferite functie de nivelul de toxicitate al materialului:


❖ Nici un raspuns (nu apar simptome)
❖ Raspuns slab (dispnee, temperatura, durere)
❖ Raspuns moderat (iritatie abdominala, dispnee evidenta, ptoza, diaree, scadere usoara in greutate)
❖ Raspuns puternic (simptome severe: cianoza, tremur, pierdere masiva in greutate) 16
❖ Raspuns fatal (deces)
3. TESTE DE TOXICITATE SISTEMICA - continuare

Starea de sanatate – se verifica la anumite intervale de timp:


4- 24 h (toxicitate sistemica acuta)
14-28 zile (toxicitate subacuta sau subcronica)
dupa 3 luni (toxicitate cronica)

Testul de toxicitate sistemica se recomanda a fi completat cu testul de pirogenitate – avand in


vedere ca anumite substante pirogene (endotoxine, substante chimice etc.) se introduc in
organism prin catetere, seringi, componente de implant

17
3. TESTE DE TOXICITATE SISTEMICA - continuare

CHIMIOTERAPIA CANCERULUI
toxicitatea medicamentelor utilizate variaza cu doza, ruta de administrare, durata
tratamentului, etc.
Efectele citotoxice ale acestor medicamente sunt maxime fata de celulele care prolifereaza
rapid (canceroase dar si din maduva osoasa, tractul digestiv, foliculii de par si gonade).

Exista si toxicitati particulare.


Exemple:
Vincristine - produce efecte neurologice (disparitia reflexelor, neuropatii);
Doxorubicin- produce efecte cardiace cumulative ca stopul cardiac;
Metotrexat – produce leziuni renale si hepatice

Vincristine - alcaloid, inhibitor mitotic


Doxorubicin – utilizat in regresia unor tumori canceroase
Metotrexatul– antimetabolit, antifolat,
4. GENOTOXICITATEA

Caracteristici generale: Efectele mutagene ale unui biomaterial se pot


urmari prin teste de mutagenitate, atat in vitro cat si in vivo

Mutatia = schimbare ireversibila in materialul genetic al celulei


(in codul moleculei de ADN) care se propaga prin
generarea ulterioara a celulei (mutageneza)

a) Pentru testele in vitro se pot folosi diferite culturi de celule precum si celule bacteriene (E. Coli, Salmonella)

Cel mai simplu test de mutagenitate in vitro - testul Ames (1975)


- foloseste tulpini de Salmonella, o bacterie foarte sensibila la mutatii si cu o permeabilitate crescuta a
peretelui celular la molecule mari
- este gold standard test – evidentiaza rapid si cu acuratete de 90% daca un agent chimic este mutagen
(mutagenul poate fi si cancerigen; cancerul incepe cu o mutatie)

Dezavantaj: Salmonella (procariot) – nu este un


model perfect pentru om – s-a adaptat un model
pentru celulele eucariote (drojdie)
4. GENOTOXICITATEA - CONTINUARE

b) Pentru testele in vivo pe animale se recomanda folosirea de


soareci si sobolani deoarece prezinta similitudini cu genomul
uman, iar mecanismul unor boli este asemanator

Testele de mutagenitate sunt obligatorii pentru toate


biomaterialele care stau mai mult de 30 zile in organism si
uneori sunt denumite teste de genotoxicitate – avand in
vedere ca este vorba de efectele toxice ale unui material asupra
materialului genetic al organismului

Perfectionarea testelor de mutagenitate contribuie la dezvoltarea ingineriei genetice


5. EFECT LOCAL DUPA IMPLANTARE

Caracteristici generale:
- raspunsul biologic din jurul materialului contribuie la
determinarea biocompatibilitatii acestuia.

- se evalueaza efectele patologice locale asupra tesuturilor vii, atât


la nivel macroscopic cât si microscopic, pentru un esantion de
material sau produs finit plasat sau implantat într-o zona de
implantare sau un tesut corespunzator pentru aplicatia prevazuta

Deoarece testul este conceput pentru a evalua interfata biologica dezvoltata pe material
sau dispozitiv nu este necesara implantarea biomecanica corecta a dispozitivului

Ex .1: introducere material de implant in buzunar subcutanat/ intraperitoneal/intramuscular la soareci;


Ex. 2: in cazul materialelor ortopedice inserarea se poate face in diafiza femurala de iepure.
UNIVERSITATEA POLITEHNICA DIN BUCUREŞTI
Facultatea de INGINERIE MEDICALĂ

Biomateriale şi Dispozitive Medicale (BDM)


Echipamente şi Sisteme Medicale (ESM)

BIOCOMPATIBILITATEA POLIMERILOR SI
METODE DE ANALIZA

- CURS 11 -

Conf. Dr. ing. Adriana Lungu


1
REZUMAT CURS 11

Teste de evaluare initiala a biocompatibilitatii materialelor


1. Teste de citotoxicitate
2. Teste de iritare piele/ reactii alergice
3. Teste de toxicitate sistemica
4. Genotoxicitatea
5. Efect local dupa implantare
6. Teste de hemocompatibilitate

Teste de evaluare complementara a biocompatibilitatii


1. Toxicitate cronică
2. Carcinogenicitate
3. Toxicitatea asupra reproducerii şi dezvoltării (creşterii)
4. Degradare
6. TESTE DE HEMOCOMPATIBILITATE

Testele de biocompatibilitate se completeaza cu teste de hemocompatibilitate:

obligatorii pentru biomaterialele folosite la proteze si valve cardiace,

grefe vasculare, catetere, membrane de dializa, fire de sutura

Testele de hemocompatibilitate monitorizeaza:

❖ Efectele biomaterialelor asupra proteinelor plasmatice (albumina, fibrinogen, globuline etc.)

❖ Aderenta de elemente figurate ale sangelui la suprafata materialului

❖ Activarea enzimelor (transaminaze, dehidrogenaze, acid fosfataze) la interfata sange-suprafata


6. TESTE DE HEMOCOMPATIBILITATE - continuare

Se foloseste sange uman sau animal (se recomanda iepuri) preparat dupa un anumit protocol,
in functie de parametrii ce trebuie determinati

Se poate lucra cu: sange integral


sange integral + anticoagulant
plasma sanguina fara celule sanguine
plasma sanguina bogata intr-un anumit tip de celule – ex. trombocite
6. TESTE DE HEMOCOMPATIBILITATE - continuare

Folosirea unui anumit anticoagulant este importanta si se alege dupa scopul urmarit:

EDTA (acid etilendiaminotetraacetic) formeaza un complex solubil cu Ca2+ din sange

- nu poate fi utilizat pentru studii de coagulare deoarece afecteaza functia fibrinogenului;

- in prezenta EDTA, viabilitatea leucocitelor nu se mentine un timp suficient pentru analize

Heparina – considerat a fi un anticoagulant de referinta

- impiedica formarea fibrinei

- indicata in analiza morfologiei eritrocitelor, in studii enzimatice si culturi de celule

Dezavantaj: relativ scumpa si produce aglutinarea trombocitelor

Citrat de sodiu – inlatura Ca2+ prin formarea unui complex solubil citrat-calciu si este indicat in studii de coagulare
6. TESTE DE HEMOCOMPATIBILITATE - continuare

Pentru teste de hemocompatibilitate in vitro se procedeaza astfel:

✓ colectare sange din vena sau artera si eventual tratare cu


anticoagulant (EDTA/ Heparina/ Citrat de sodiu)

✓plasare sange in contact cu materialul de testat in sisteme de incubare


statice sau dinamice (sangele este pompat in camera de incubare sub forma
unei curgeri laminare),

timpi de incubare de 60, 120 si 240 min, 37oC

✓ separare plasma sanguina/celule prin centrifugare

✓ analiza plasmei si a celulelor - prin diferite procedee

! recomandare: masuratorile sa nu depaseasca 2 ore,


dupa acest timp sangele isi modifica proprietatile
Model experimental de
testare in vitro
a interactiei sange-
biomaterial
6. TESTE DE HEMOCOMPATIBILITATE - continuare

Testele de hemocompatibilitate determina anumiti parametri ce


evidentiaza modificari in:

1. Timpi de coagulare

ex: timp Quick - caracterizeaza coagularea extrinseca (valori normale 10-15 sec)

2. Parametri de trombogeneza – se refera la agregarea si aderenta de trombocite la suprafata materialului,

Analiza trombocitelor este foarte importanta deoarece acestea sunt foarte sensibile la suprafete straine si
elibereaza factori procoagulanti

3. Reactiile imune ale organismului la interactia sange-implant se urmaresc prin analiza celulelor, in special a
limfocitelor, in jurul implantului

Din leucocitele prezente pe implant se poate izola si purifica ADN-ul genomic, din analiza caruia se obtin
informatii despre efectele mutagene ale materialului
6. TESTE DE HEMOCOMPATIBILITATE - continuare

Metode de analiza sange inainte si dupa interactia cu biomaterialul de testat

✓ Hemo-citometrie pentru a determina concentratia si activitatea celulelor sanguine

✓ Spectroscopie de fluorescenta – pentru identificarea si cuantificarea proteinelor plasmatice,


inclusiv a moleculelor de ADN si ARN

✓ Microscopie optica, electronica si de forta atomica pentru vizualizarea de celule, formare


de trombusi etc., dar si pentru a analiza suprafata materialului in contact cu sangele

✓ Masuratori electrocinetice (electroosmoza, electroforeza, etc.)

✓ Teste ELISA de identificare si cuantificare de produsi sau fragmente din cascada coagularii,
anticorpi, antigene
TESTE DE EVALUARE COMPLEMENTARA A BIOCOMPATIBILITATII

Cu scopul de a scoate pe piata biomateriale mai sigure:

B. Teste de evaluare complementara a biocompatibilitatii

1. Toxicitate cronică

2. Carcinogenicitate

3. Toxicitatea asupra reproducerii şi dezvoltării (creşterii)

4. Degradare

9
1. TOXICITATE CRONICĂ

Aceste teste determină efectele biomaterialelor şi/sau ale


extractelor acestora asupra animalelor de experienta pe o
perioada de timp mai mare
(ex. peste 90 de zile pentru şobolan)
2. TESTE DE CARCINOGENEZA

Carcinogeneza = afectiune a organismelor

multicelulare caracterizata prin diviziuni anormale, necontrolate

Biomaterialele pot determina carcinogeneza - prin eliberare de:

• produsi carcinogeni

• pro-carcinogeni: sunt convertiti in carcinogeni de procesele metabolice din corp

• co-carcinogeni: in prezenta materialului sunt activate substante pro-carcinogene

11
2. TESTE DE CARCINOGENEZA - continuare

Caracteristici generale:
- teste in vivo (preclinice) - se foloseste extract sau
implant din materialul de testat

- se dau doze din extract de material, oral sau


intravenos, in fiecare zi, timp de 18-24 luni, apoi se sacrifica
animalul si se examineaza la microscop tesuturile pentru a
depista prezenta unor eventuale tumori

- sunt foarte scumpe, necesita timp, animale diferite (soareci/sobolani)

Chiar daca rezultatul testului de carcinogenicitate este negativ nu exista siguranta ca


materialul odata implantat nu va induce un raspuns cancerigen.

Studiu SUA:
artroplastie sold dupa 7 ani de la implantare = 17 cazuri de tumori
Dupa 10 ani de la implantare = ~70% din pacienti suspectati de tumori limfatice si hematopoietice

12
2. TESTE DE CARCINOGENEZA - continuare

Testele de carcinogeneza se recomanda daca:

- materialele sunt resorbabile, cu timp de resorbtie de peste 30 de zile

- daca materialul este un implant permanent

- daca testele de genotoxicitate sunt pozitive: daca materialul este MUTAGEN, este si CANCERIGEN

foarte dificil de apreciat potentialul cancerigen al unui implant, sunt necesari 10-15 ani pentru un test corect;
intre timp stiinta biomaterialelor evolueaza, se dezvolta noi materiale cu proprietati superioare, si exista
riscul ca rezultatele testelor incepute sa nu mai fie de actualitate
13
3. TOXICITATEA ASUPRA REPRODUCERII ŞI DEZVOLTĂRII (CREŞTERII)

DACA TESTELE DE MUTAGENITATE SI CARCINOGENEZA SUNT POZITIVE, TREBUIE COMPLETATE CU:


teste de toxicitate asupra reproducerii si dezvoltarii
teste care urmaresc efectele biomaterialului asupra dezvoltarii embrionului si fetusului

Caracteristici generale:

- evaluează efectele potenţiale ale dispozitivelor,


materialelor şi/sau extractele lor asupra funcţiei de
reproducere, dezvoltării embrionare (teratogenitate) şi
dezvoltarea prenatală şi postnatală precoce.

ex. dispozitive intrauterine (sterilet)

- teste in vivo - recent dezvoltate: experimente pe animale


transgenice (cu patrimoniu genetic celular modificat prin modificarea
ADN-ului (introducerea unor segmente de ADN uman)
4. DEGRADARE

Caracteristici generale – teste de degradare:

- sunt relativ noi si unele nu sunt inca standardizate, fiind in stadiu de proiect.

- sunt concepute pentru materialele implantabile degradabile si/sau resorbabile (implante temporare):
componentele rezultate in urma degradarii trebuie sa fie in primul rand biocompatibile si sa nu interfere cu
metabolismul celular.

- se incearca reproducerea proceselor degradative pentru METALE, MATERIALE CERAMICE, POLIMERI si


produsi secundari cat mai apropiate de cele din sistemul biologic.

Metale si aliaje - se degradeaza prin coroziune chimica sau electrochimica.

→ compusi noi, de cele mai multe ori solubili, dar care nu sunt biocompatibili.

Ceramice, in special cele poroase, se degradeaza si pot elibera noi compusi secundari,

organismul uman poate manifesta o reactie adversa asemanatoare reactiei in prezenta unui corp strain.

Polimerii: ex. polietilena folosita la proteze de sold - se elibereaza o cantitate mare de compusi secundari care
produc un raspuns inflamator important

15