Sunteți pe pagina 1din 113

Digitally signed by

UNIVERSITATEA TEHNICĂ A MOLDOVEI


Biblioteca UTM
Reason: I attest to the
accuracy and integrity FACULTATEA TEHNOOGIE ŞI MANAGEMENT
of this document ÎN INDUSTRIA ALIMENTARĂ
CATEDRA „ENOLOGIE”

BIOCHIMIE

Îndrumar de laborator

Chişinău
U.T.M.
2007
Îndrumarul este destinat studenţilor anilor 2(U) şi 3(U) a
secţiilor de zi şi cu frecvenţă redusă pentru toate specialităţile
tehnologice ale facultăţii TMIA care studiază cursul de
"Biochimie".

Elaborare: conf.univ., dr. Liudmila Palamarciuc


conf.univ., dr. Tatiana Vrabie
lector superior Aliona Sclifos

Redactor responsabil: prof.univ., dr. Anatol Bălănuţă

Recenzent: conf.univ., dr.Rodica Sturza

–––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Bun de tipar 23.05.07. Formatul 60x841/16
Hîrtie ofset. Tipar RISO Tirajul ex. 200
Coli de tipar 7,25. Comanda nr. 85

U.T.M., 2004, Chişinău, bd.Ştefan cel Mare, 168.


Secţia Redactare şi Editare a U.T.M.
2068, Chişinău, str.Studenţilor 9/9

© U.T.M., 2007
2
ORGANIZAREA ŞI METODICA EFECTUARII LUCRĂRILOR
DE LABORATOR, REGULILE TEHNICII DE SECURITATE
PENTRIU LABORATORUL DE BIOCHIMIE

Înainte de a începe lucrul în laborator trebuie să fie


cunoscute regulile generale de lucru, regulile tehnicii securităţii,
măsurile de preîntîmpinare şi prevenire a accidentelor. Studentul
care răspunde materialul însuşit profesorului este notat într-un
registru special. Cei care sînt nepregătiţi pentru efectuarea lucrării
practice nu sînt admişi.

Regulile generale de efectuare a lucrărilor practice

1. Înainte de a începe lucrarea practică trebuie să fie însuşit


materialul teoretic la această lucrare din îndrumarul metodic.
Materialul învăţat se expune profesorului, aceasta fiind ca permis la
efectuarea lucrării.
2. În procesul lucrării practice trebuie să fie respectate
consecutivitatea operaţiilor recomandate de regulile de securitate şi
de indicaţia metodică.
3. În timpul lucrului studentul trebuie să fie atent, să păstreze
liniştea, să fie punctual.
4. Se interzice ca studentul să lucreze în laborator singur, fără
supravegherea profesorului sau a inginerului.
5. Fiecare student trebuie să lucreze la locul stabilit, să
folosească aparatele, vesela chimică, reactivele, care sînt pe masă la
lucrarea corespunzătoare. Dacă lipseşte un reactiv sau un vas
chimic trebuie de adresat la profesor sau inginer. Se interzice de a
lua reactive şi vase chimice de pe alte mese de laborator.
6. Pe masa de laborator nu trebuie să fie obiecte ce nu au
legătură cu lucrarea practică. După terminarea lucrării, locul de
lucrul din laborator trebuie să fie adus în ordine.

3
Tehnica de securitate pentru laboratorul de biochimie şi
regulile de folosire a reactivelor chimice

1. Pe parcursul efectuării experienţelor trebuie cu atenţie de


folosit vasele chimice, aparatele şi reactivele.
2. Se interzice de lucrat cu vase chimice nespălate sau
stricate.
3. Se interzice de lăsat fără supraveghere aparatele în
funcţiune.
4. Toate lucrările cu substanţele toxice sau cu miros iritabil
trebuie să fie efectuate în nişa de ventilare.
5. În timpul lucrărilor practice legate de substanţe inflamabile
(eter, alcool, benzină, benzol, acetonă şi altele) sau explozive
trebuie de respectat următoarele reguli:
• substanţele date se ţin cît mai departe de foc şi de
aparatele de încălzire;
• nu se admite păstrarea lor în vase de sticlă subţire şi
închise ermetic cu dop;
• nu se admite păstrarea reactivelor în cantităţi mari pe
masa de laborator;
• se interzice de turnat aceşti dizolvanţi aproape de foc
sau de încălzit la foc deschis. Se permite de încălzit numai în baia
de apă cu răcitor de apă invers;
• se interzice de turnat reactivele date în chiuvetă;
• dacă au fost vărsate cantităţi mari de substanţe
inflamabile trebuie imediat de închis toate robinetele de gaz, de
deconectat aparatele electrice, aparatele de încălzit, de deschis toate
ferestrele şi de strîns soluţia vărsată cu cîrpa.
6. Vasele cu reactive trebuie de astupat cu dopuri respective.
7. Se interzice de lăsat soluţia în vase fără inscripţii.
8. Pentru a cîntări probe de produs de natură vegetală trebuie
de folosit cîntarul tehnic şi nu cel analitic.
9. Se interzice categoric de tras cu ajutorul gurii în pipete
soluţii care pot provoca arsuri chimice (acizi şi baze alcaline
concentrate, reactivele Fehling, amestecul formolic şi altele).
4
10. În laborator nu se mănîncă nici nu se bea din vesela
chimică.
11. În laborator se interzice de fumat, de consumat băuturi
alcoolice sau droguri.

Primul ajutor în caz de arsuri şi intoxicaţii

1. Dacă arsura provine de la un obiect incandescent sau de la


foc leziunea trebuie tratată cu o soluţie de alcool etilic, apoi de uns
cu glicerină sau vaselină. Arsurile grave se tratează cu soluţie de
permanganat de potasiu sau cu vaselină şi se adresează la medic.
2. Dacă pe suprafaţa pielii au nimerit stropi de lichid agresiv
ea trebuie spălată imediat cu apă din robinet, apoi neutralizată:
acidul – cu soluţie de sodă calcinată de 3 % sau amoniac, iar baza
alcalină – cu soluţie de acid acetic de 2 %.
3. Dacă în ochi au nimerit stropi de acid concentrat, spălaţi
imediat cu apă din robinet, apoi cu soluţie de sodă calcinată de 3 %,
adreseaţi-va urgent la medic. Dacă au nimerit stropi de bază
alcalină se spală cu apă , apoi cu cantităţi mari de soluţie de 0,5 %
de acid boric, se adresează urgent la medic .
4. Dacă întîmplător au nimerit reactive în organism se
recomandă: în caz de bază alcalină – de băut o cantitate mare de
apă, apoi un pahar cu soluţie de 2 % de acid acetic sau citric; în caz
de acid – un pahar cu soluţie de 2 % de bicarbonat de sodiu.
5. Dacă s-a produs lezare cu sticlă în primul rînd trebuie de
înlăturat cioburile din rană, apoi de dezinfectat cu soluţie
alcoolizată de 3 % de iod şi de legat cu pansament steril. Dacă
scurgerea e mare, mai sus de rană se aplică un garou, apoi se
adresează la medic.
6. Dacă în laborator izbucneşte incendiu, trebuie închise
imediat robinetele de gaz şi de lichidat focarul incendiului cu nisip
sau stingător de bioxid de carbon. Dacă s-a aprins haina – stingerea
se face cu o plapumă de lînă.

5
Lucrarea de laborator nr. 1

Determinarea azotului total în produse vegetale


(după metoda Kjeldahl)

Importanţa analizei
Această metodă este utilizată pentru determinarea azotului
aminic, amidic, peptidic şi a amoniacului liber. În materia vegetală
(cu excepţia pomuşoarelor şi strugurilor) masa principală de
substanţe azotoase este reprezentată de proteine.
Protidele şi proprietăţile lor
Protidele sînt substanţe formate din aminoacizi, ele au o
importanţă primordială (grec. ’protos’- primul) pentru organismele
vii. Protidele se găsesc în toate organismele vegetale şi animale. În
regnul animal protidele sînt substanţe predominante 65-70 %, în
plante 2-35 % din masa uscată. Necesitatea fiziologică a omului
este de 100 grame pe zi.
Compoziţia elementară a proteinelor:
C - 50,6 - 54,5 %;
O - 21,5 - 23,5 %;
N - 15,0 - 17,6 %;
H - 6,5 - 7,3 %;
S - 0,3 - 2,5 %;
Numeroase proteine mai conţin în cantităţi mici şi alte
elemente: P, Fe, Mg, Cu, Mn etc.
Reieşind din conţinutul azotului N în proteină (16 % în
mediu) se poate determina indirect cantitatea de proteină brută din
materialul cercetat, utilizînd formula:
Proteina brută = N x 100/16 = N x 6,25
În organismele vii proteinele exercită funcţiile de cataliză,
structură, transport, apărare, depozitare, recepţie şi de reglare a
activităţii genomului, efectuează mişcările şi reprezintă o mare
parte de hormoni.
Pentru proteine se deosebesc patru niveluri de organizare
intramoleculară: structura primară, secundară, terţiară şi cuaternară.

6
Proteinele formează aceste structuri datorită celor cinci tipuri de
legături dintre aminoacizi: peptidice, covalente disulfidice, ionice,
de hidrogen şi hidrofobe. Proteinele au proprietăţi amfotere, fiindcă
conţin grupări acide şi bazice. Proteinele uşor denaturează, ca
rezultat îşi schimbă proprietăţile biologice şi fizico-chimice. Sub
acţiunea enzimelor, bazelor şi acizilor proteinele se descompun
formînd produse intermediare (peptone, polipeptide) şi la ultima
fază a hidrolizei –aminoacizi.
Clasificarea proteinelor simple şi conjugate
Toate proteinele se împart în două grupe mari: proteine
simple (proteine), în compoziţia cărora intră numai resturi de
aminoacizi şi proteine conjugate (proteide), care reprezintă o
combinaţie dintre o proteină simplă cu un compus de natură
neproteică, denumit gruparea prostetică.
Proteinele simple
În funcţie de solubilitatea şi proprietăţile fizice proteinele
simple se divizează în următoarele grupe: albumine, globuline,
prolamine, protamine, histone, gluteline, scleroproteine sau
proteinoide.
Albuminele sînt proteine solubile în apă. Au masa
moleculară relativ mică – de la 10 mii pînă la 100 mii unităţi. Sînt
foarte răspîndite în natură: ovalbumina din albuşul de ou, leucozina
din grîu, legumelina din mazăre, lactalbumina din lapte, etc.
Globulinele sînt proteine insolubile în apă, dar solubile în
soluţii de săruri ale metalelor uşoare (5-10 % NaCl sau Na2SO4).
Au o masă moleculară mare 100 000 – 1 000 000. Sînt foarte
răspîndite în natură: lactoglobulina din lapte, miozina din muşchi,
legumina din mazăre, fasolina din fasole albe etc.
Prolaminele (sau gliadinele) sînt proteinele greu solubile în
apă şi în alcool absolut, dar solubile în alcool de 60-80 %. Ele
conţin multă prolină. Se găsesc mai ales în plante, în seminţele
cerealelor: gliadina din boabele de grîu şi secară, zeina din boabele
de porumb.
Protaminele sînt proteine, soluţiile cărora au un caracter
bazic puternic, sînt uşor solubile în soluţii diluate de acizi, masa

7
moleculară este joasă (pînă la 12 000). Nu conţin sulf, se găsesc în
cantităţi mari în nucleul celular şi sperma peştilor: clupeina din
scrumbie, sturina din nisetru.
Histonele – proteine nucleare cu un caracter slab bazic,
solubile în soluţii diluate de acizi. Intră in componenţa proteidelor
cromozomilor, eritrocitelor , leucocitelor, celulelor timusului.
Glutelinele sînt proteine cu un caracter slab acid, solubile în
baze diluate. Sînt bogate în acid glutamic, au proprietăţi
mucilaginoase, ca şi prolaminele se găsesc în seminţe de cereale
(gluteina din boabele de grîu, orizenina din boabele de orez).
Amestecul format din gluteina şi gliadina care se izolează din făina
de grîu poartă denumirea de gluten. Proteinele din gluten prin
punţile lor -S-S- conferă făinii de grîu proprietatea de a forma cu
apa un aluat elastic, care reţine într-un mod caracteristic dioxidul
de carbon eliberat în timpul fermentării, dînd pîinii o structură
poroasă şi un volum corespunzător.
Scleroproteinele – proteine insolubile (fibrilare). Conţin o
cantitate mare de glicină şi cisteină. Reprezentanţii tipici sînt
colagenul din ţesutul conjunctiv, elastinele din arterii şi tendoane ,
cheratinele din păr, coarne, copite, piele, lînă, unghii.

Proteine conjugate (proteide)


Proteidele în funcţie de gruparea prostetică se clasifică în
subgrupe:
1. Fosfoproteidele sînt un grup mic de proteine care conţin acid
fosforic. Au caracter acid, sînt solubile în soluţii alcaline, se
conţin în lapte (cazeina), în gălbenuşul de ou (vitelina). Unele
enzime sînt fosfoproteide: pepsina, fosforilaza,
fosfoglucomutaza, fosfotriozoizomeraza etc. În plante
fosfoproteidele au fost identificate în polenul de porumb.
2. Cromoproteidele au o grupare prostetică colorată şi în general
sînt biocatalizatori ai fotosintezei şi ale altor reacţii de
oxidoreducere. Ca grupare prostetică pot servi derivaţi ai
porfirinei (clorofila, hem), izoaloxazinei, carotinei. Clorofila
intră în componenţa cloroglobinei, hemul împreună cu globina

8
formează hemoglobina, izoaloxazina este gruparea prostetică a
flavinproteidelor (dehidrogenazelor aerobe), derivaţii carotinei
formează rodopsina din retina ochiului.
3. Glicoproteidele au gruparea prostetică de natură glucidică. În
majoritatea cazurilor, gruparea prostetică este reprezentată de
mucopoliglucide, care prin hidroliză dau manoza, galactoza,
hexozaminele, acizii glucuronic, acetic şi sulfuric. Cele mai
importante glicoproteide sînt mucinele în secreţia mucoaselor
(protejează mucoasele tractului gastro-intestinal) şi mucoidele
(intră în constituţia cartilagiilor, oaselor, tendoanelor şi
ligamentelor). Avidina este o glicoproteidă din albuşul de ou
crud, care inhibă activitatea biotinei. În seminţe şi alte organe
vegetale se găsesc glicoproteide care produc aglutinarea
eritrocitelor, ele se numesc lectine. Cantităţi mai mari de lectine
se găsesc în leguminoase.
4. Lipoproteidele au în componenţa lor lipide: colesterol,
fosfolipide, acilgliceroli. Lipoproteidele au o largă distribuţie,
fiind componente structurale ale biomembranelor. În cantităţi
mari se găsesc în ţesutul nervos, plasma sîngelui, lapte,
gălbenuş de ou. Ele ajută la transportul unor substanţe
liposolubile (vitamine, hormoni, carotinoide, diverse
medicamente).
5. Metaloproteidele conţin un metal (Fe, Cu, Mg, Zn, Mn, Co
etc.) fixat prin legături complexe direct de componenţa
proteică. Grupările proteinei care fixează metalul poartă
denumirea de liganzi.
Unele metaloproteide sînt enzime (polifenoloxidaza,
alcooldehidrogenaza), altele îndeplinesc funcţia de proteine
transportatoare de metal (transferina) şi rezerva de metal
(feritina). Ele participă la diverse procese metabolice:
fotosinteza, respiraţia, transportul de O2 şi electroni.
6. Nucleoproteidele sînt constituite din acid nucleic şi proteină,
au o masă moleculară mare (de la cîteva mii pînă la sute de
milioane). Cromozomii, ribozomii, viruşii sînt particule
nucleoproteice.

9
Principiul metodei
Produsul vegetal, care conţine substanţe azotoase, se
mineralizează prin ardere în acid sulfuric concentrat. Ca catalizator,
în dependenţă de substanţă care se arde, se foloseşte sulfat de cupru
sau peroxid de hidrogen, mercur, permanganat de potasiu, selen
etc.
Pentru a ridica temperatura de fierbere a acidului sulfuric se
folosesc cristale de sulfat de sodiu sau potasiu.
În procesul de mineralizare se formează amoniac, care se
uneşte apoi cu acidul sulfuric, formînd sulfat de amoniu:
__
R __ CH COOH + H2SO4 CO2 + H2O + SO2 + (NH4)2SO4
__

NH2
Arderea produsului analizat se efectuează în balonul
Kjeldahl.
După mineralizarea totală soluţia răcită se dozează cu o
cantitate mare de hidroxid de sodiu, iar amoniacul eliminat se
distilează şi se reţine cu soluţie diluată de acid sulfuric. Cantitatea
de acid sulfuric legat se recalculează în amoniu, apoi în azot, care
se exprimă în procente în raport cu masa produsului analizat.
Pentru a calcula cantitatea de azot în substanţa proteică
rezultatul se înmulţeşte cu coeficientul corespunzător. Pentru
majoritatea proteinelor se foloseşte coeficientul 6,25 din
considerarea că cantitatea de azot este în medie 16 %. Pentru
proteinele din cereale coeficientul este egal cu 5,71 din cauză că
cantitatea de azot este în medie 17,5 %.

Aparate, vase şi materiale:


ƒ aparat pentru ardere;
ƒ aparatul Kjeldahl;
ƒ 2 baloane Kjeldahl;
ƒ 2 pipete gradate de 5 cm3 şi pipeta Mor de 10 cm3;
ƒ 2 baloane conice de 250 cm3;
ƒ cilindru de 10 cm3;
ƒ H2SO4 concentrat;

10
ƒ sulfat de cupru (cristale), CuSO4;
ƒ sulfat de natriu sau potasiu (Na2SO4 sau K2SO4);
ƒ soluţie de 0,02n H2SO4;
ƒ soluţie de 0,02n NaOH;
ƒ soluţie de 33 % NaOH;
ƒ indicator mixt (metilrot-metilen albastru): 0,2 g metilrot şi
0,012 g metilen albastru se dizolvă în 60 cm3 alcool şi cu apă se
aduce pînă la 100 cm3.

Ordinea îndeplinirii lucrării

Aparatul Kjeldahl (fig. 1) este constituit din vaporizator (1),


umplut cu apă distilată cu ajutorul pîlniei (2). Balonul Kjeldahl (6)
este unit cu vaporizatorul printr-un tub (3) înzestrat cu o pîlnie (4)
cu clemă (5) pentru dozarea soluţiei de 33 % NaOH şi este unit cu
răcitorul (7) prin captatorul de picături (8). Alonjul răcitorului (10)
este unit cu un balon conic (de recepţie) de 250 cm3 (9).

Figura 1. Aparatul Kjeldahl

11
Metoda determinării azotului total în produse lichide
În două baloane Kjeldahl se măsoară cu pipeta gradată cîte
3
5 cm soluţie pentru analiză (vin, suc etc.). Baloanele se încălzesc
la aparatul de ardere şi se fierb pînă cînd volumul soluţiei ajunge la
1-1,5 cm3 (nu se admite prinderea de fund). Apoi în fiecare balon
după răcire, se dozează cu cilindrul 3 cm3 de H2SO 4 concentrat,
aproximativ 50 mg de CuSO4 şi 0,5 g de Na2SO4, balonul se
închide liber cu dop de sticlă şi se pune la ardere în nişa de
ventilare.
Arderea probei se face pînă cînd soluţia din balon devine
incoloră şi nu conţine resturi carbonizate de substanţă.
Se pregăteşte aparatul Kjeldahl pentru distilare. Apa din
vaporizatorul (1) se fierbe. Balonul Kjeldahl (6) cu proba
neutralizată şi răcită se uneşte la aparat. În balonul conic (de
recepţie) de 250 cm3 (9) se dozează cu pipeta Mor 10 cm3 soluţie
0,02n de H2SO4 şi balonul se instalează sub răcitorul (7) astfel, încît
capătul alonjului (10) să fie de 2-3 mm în soluţie. În balonul
Kjeldahl prin pîlnia (4) se dozează 15 cm3 de apă distilată, apoi cu
cilindrul soluţie 33 % de NaOH din raportul (la fiecare 1 cm3
H2SO4 concentrat luat la ardere se adaugă cîte 5 cm3 soluţie 33 %
de NaOH). Se închide repede clema (5) la pîlnia (4) şi se începe
procesul de distilare a amoniacului, care decurge 15 min.
În ultimele 5 minute alonjul răcitorului nu trebuie să fie în
soluţia de acid. După distilare alonjul se spală cu o cantitate mică
de apă distilată.
La soluţia obţinută din balonul conic de 250 cm3 se dozează
4-6 picături de indicator mixt şi surplusul de acid se titrează cu
soluţie 0,02 n de NaOH din biuretă.
Paralel se pune proba de control, pentru care în balonul
Kjeldahl în loc de vin se ia apă distilată şi se repetă aceleaşi
operaţii descrise mai sus.
La recalcularea cantităţii de azot total se ia în considerare
că 1 cm3 soluţie 0,02 n NaOH corespunde la 0,28 mg de azot.

12
Cantitatea de azot (X) în mg/dm3 în produsul analizat se
calculează după formula:

(a-b) * K * 0,28 * 1000


____________________
X=
V ,
unde:
a - cantitatea (cm3) de soluţie 0,02 n de NaOH, folosită la
titrarea acidului sulfuric pentru proba de contro,;
b - cantitatea (cm3) de soluţie 0,02 n NaOH, folosită la
titrarea acidului sulfuric pentru proba de lucru;
K – coeficientul de corecţie al bazei;
0,28 – cantitatea de azot în mg, care corespunde unui cm3
de soluţie 0,02 n NaOH;
V – volumul soluţiei analizate, cm3.

Întrebări de control:

1. Caracteristica generală a proteinelor.


2. Compoziţia elementară a proteinelor.
3. Clasificarea proteinelor simple şi compuse.
4. Metoda de determinare a azotului total în produse lichide.
5. Regulile tehnicii de securitate ce trebuie respectate în
procesul determinării azotului total după metoda Kjeldahl.

13
Lucrarea de laborator nr. 2

Determinarea potenţiometrică a derivaţilor formolici


ai α – aminoacizilor

Importanţa analizei
α–aminoacizii sînt elemente structurale ale moleculei
proteice, adică monomerii proteinelor. Totodată aminoacizii liberi
îndeplinesc funcţii vitale în organisme. Aminoacizii şi amidele lor
se întîlnesc, de regulă, în cantităţi mici în stare liberă în materia
primă de origine vegetală sau animală şi în produsele prelucrării
lor. Dar se găsesc şi în cantităţi mari. De exemplu, în mustul din
struguri, în sucuri şi vinuri aminoacizii constituie mai mult de
jumătate din substanţele azotoase.
În organism şi la prelucrarea materiei prime alimentare din
aminoacizi se formează un şir de substanţe, care determină gustul,
culoarea şi mirosul produselor. Melaninele, melanoidinele, uleiurile
de basamac ş. a. se obţin din aminoacizilor
Proprietăţile chimice ale aminoacizilor
α–Aminoacizii sînt derivaţi ai acizilor carbonici, în
molecula cărora atomul de hidrogen de lîngă atomul α–carbonic
este înlocuit cu gruparea aminică (-NH2). Avînd proprietăţi
amfotere (reacţia 1), α–aminoacizii pot să reacţioneze ca amine
(reacţiile 2-4) şi ca acizi carbonici (reacţiile 5-6):

1)
R CH COOH R CH COO-

NH2 NH3 +
Datorită grupării aminice α–aminoacizii intră în reacţia
specifică cu acidul azotos, pot să reacţioneze cu acizii minerali, cu
aldehidele şi glucidele reducătoare. De exemplu:

14
2)
R–CH–COOH + HNO2 → R–CH–COOH + N2↑ + H2O
| |
NH2 OH
În rezultatul ultimii reacţii se elimină azotul şi se formează
hidroxiacidul. Această reacţie stă la baza determinării cantitative a
aminoacizilor după metoda Van Slyke (se ia în considerare
cantitatea de azot eliminat).
3) Cu HCl se formează o sare complexă:
R – CH - COOH + HCl → [ R–CH–COOH ] Cl—
| |
+
NH 2 NH 3

4) În urma interacţiunii aminoacizilor cu aldehide (de exemplu cu


glucide) se formează baze Schiff:
R–CH–COOH + O=CH–R → R–CH–COOH + H2O
| aldehida |
NH2 N=CH–R baza Schiff
Din baze Schiff pot fi formate melanoidine (substanţe de
culoare întunecată).
Grupa carboxilică a aminoacizilor reacţionează cu baze
(reacţia 5) şi alcooli (reacţia 6), formînd respectiv săruri şi esteri:

5) R–CH–COOH + NaOH → R–CH–COONa + H2O


| |
NH2 NH2

15
6) R–CH–COOH + HO–C2H5 → R–CH–COOC2H5 + H2O
| |
NH2 NH2

În rezultatul ultimii reacţii aminoacizii din stare solidă se


transformă în esteri lichizi, amestecul cărora se poate separa prin
distilarea fracţionată cu vid.
Toţi aminoacizii reacţionează cu ninhidrina, formînd în
mediul acid produse incolore, iar în mediul neutru sau bazic
produse colorate albastru intens.
În mediul acid aminoacidul este degradat pînă la aldehidă,
iar ninhidrina se reduce pînă la ceto-alcool:
CO CO
OH H+ H __
C +R CH COOH C + R CHO+ NH 3 + CO 2
OH OH
CO CO
NH2

CO CO CO
OH OH -
2 C +R CH COOH __
C =N CH +
OH
CO CO CO
NH2
__
+ R CHO+ 3H2O + CO 2

Reacţia cu ninhidrină are o mare importanţă pentru


recunoaşterea şi dozarea aminoacizilor.
α–aminoacizii prin încălzire lentă pierd două molecule de
apă şi se transformă în substanţă ciclică – dicetopiperazină. De
exemplu, din două molecule de glicocol se formează 2,5 –
dicetopiperazina:

16
NH2 COOH NH
H2C C=O
CH2 + CH2
-2 H2O O=C CH2
COOH NH2 NH

Prin încălzirea rapidă a unui amestec de aminoacizi se


elimină n molecule de apă din gruparea carboxilică a unui
aminoacid şi gruparea aminică a altui aminoacid şi se formează
peptide (sau polipeptide):

H2N CH COOH + HNH CH COOH

-H
2
O
R R1
H2N CH CO NH CH COOH

R R1
dipeptidă
Legătura ce se formează între doi aminoacizi (sau n
molecule de aminoacizi) se numeşte legătură peptidică (-CO-NH-).
Aminoacizii, care se conţin în materia primă alimentară, pot
fi supuşi proceselor biochimice de dezaminare oxidativă şi în
continuare decarboxilării şi hidrolizei. Aceste reacţii au loc la
diferite operaţii tehnologice în prezenţa oxigenului, peroxizilor,
chinonelor şi altor oxidanţi. În rezultat se formează aldehide, care
dau deseori produselor finale o aromă specifică.
Dezaminărea aminoacizilor are loc în mai multe etape cu
formare de iminoacid (prin dehidrogenare), care apoi prin hidroliză
trece într-un cetoacid şi amoniac. Iar cetoacidul prin decarboxilare
trece în aldehidă. Respectiv, prin decarboxilarea iminoacidului
rezultă o aldimină, care prin hidroliză se transformă în aldehidă şi
amoniac:

17
- 2 H+ iminoacid
R CH COOH R C COOH

NH2 NH

O
-C
H2 O
+ 2

3
NH
-

- CO2 + H2O
R C COOH R CHO R CH NH
- NH3
aldehida
O

Principiul metodei
α–Aminoacizii uşor reacţionează cu un exces de
formaldehidă formînd baze Schiff (sau derivaţi formolici):

R CH COOH

NH 2 + O = CH2 R CH COOH + H2 O
N=CH 2

Prin aceasta aminogrupele îşi pierd proprietăţile bazice, iar


grupele carboxilice libere se titrează cu bază (NaOH), formînd
săruri:

R CH COOH + NaOH R CH COONa + H2 O

N = C H2 N = C H2
Se consideră convenţional, că numărul grupelor carboxilice
titrate sînt echivalente cu numărul grupelor aminice legate de
formaldehidă (ceea ce e corect pentru aminoacizii
monocarboxilici).
Pentru a introduce corecţia la aminoacizii dicarboxilici
(acidul glutamic, asparagic şi alţii), soluţia se neutralizează în
prealabil cu bază pînă la pH = 6,8.
18
Totodată se titrează şi acizii organici (tartric, acetic, malic,
citric etc.), care se conţin în vinuri şi sucuri.

Aparate, vase şi materiale:

ƒ potenţiometru, pH-673 M sau pH-150 MA;


ƒ agitator magnetic ;
ƒ pahar de 100 cm3;
ƒ biuretă de 25 cm3;
ƒ cilindru de 25 cm3;
ƒ pipetă Mor de 10 cm3;
ƒ soluţie 0,1n NaOH;
ƒ amestec formolic (20 cm3 formalină 40 % + 1 cm3
fenolftaleină, se titrează cu soluţie 0,2 n NaOH pînă la pH = 6,8);
ƒ probe de materie primă (vin, suc).

Ordinea îndeplinirii lucrării


Pentru titrare se foloseşte potenţiometrul cu doi electrozi de
sticlă şi calomel. Înainte de a începe lucrarea pH–metrul se
încălzeşte 30 minute. Electrozii se spală bine cu apă distilată şi se
usucă cu hîrtie de filtru.
Biureta se umple cu soluţie 0,1n de NaOH. În pahar se
dozează 10 cm3 soluţie pentru analiză (vin sau suc) şi se adaugă apă
distilată 10 cm3. Se introduc electrozii şi se titrează pînă la pH 6,8.

Titrarea se efectuează în felul următor:


1. Se determină pH-ul soluţiei analizate.
2. Se cuplează agitatorul magnetic.
3. Proba analizată se titrează cu soluţie 0,1n de NaOH cu
viteza de 5-7 picături pe secundă concomitent urmărind indicaţia de
pe ecranul pH–metrului.
4. Cînd indicaţia pH-metrului ajunge la 6,8 titrarea se
stopează. În acelaşi pahar se adaugă 10 cm3 de amestec formolic cu
ajutorul cilindrului gradat.

19
5. Biureta se aduce la „zero” cu bază (volumul de NaOH
care s-a consumat la titrarea soluţiei analizate pînă la pH – ul 6,8 nu
se ia în calcul).
6. Conţinutul paharului se titrează cu bază pănă la pH 9,1
Titrarea se repetă de 3-4 ori. Diferenţa volumelor la titrare
nu trebuie să depăşească 0,1 cm3.
Pentru determinarea cantităţii de azot aminic se ia în
considerare numai volumul (în cm3) de bază, care s-a consumat la
titrarea soluţiei de lucru după ce a fost adăugat amestecul formolic.
1 cm3 de soluţie 0,1n NaOH corespunde la 1,4 mg de azot
aminic.
Se calculează conţinutul de azot aminic în mg/dm3 de
soluţie analizată după formulă:
V × 1,4 × K × 1000
N= ,
Vp
unde
V–volumul NaOH în cm3;
K—coeficientul de corecţie al bazei;
Vp—volumul probei în cm3 ;

Întrebări de control

1. Descrieţi însemnătatea analizei şi principiul metodei.


2. Scrieţi şi explicaţi reacţiile caracteristice gruparii
aminice.
3. Scrieţi şi explicaţi însemnătatea reacţiilor, caracteristice
pentru gruparea carboxilică.
4. Prezentaţi reacţiile aminoacizilor cu ninhidrina.
5. Explicaţi prin reacţii modul de formare a legăturii
peptidice intre aminoacizi în diferite condiţii termice.
6. Prezentaţi schema formării aldehidelor din aminoacizi.

20
Lucrarea de laborator nr. 3.

Determinarea amoniacului după metoda Conwei şi Bairn

Importanţa analizei
În toate plantele, în materia primă şi produsele alimentare se
conţin în cantităţi mari diferite substanţe azotoase. La ele se referă
proteinele, polipeptidele, aminoacizii, amidele, vitaminele grupei
B, ureea şi amoniacul.
Pentru biosinteza compuşilor cu azot plantele şi
microorganismele pot folosi azotul anorganic. Omul şi animalele în
cazul proceselor similare folosesc numai azot organic.
Azotul necesar plantelor se găseşte în natură sub formă
nitrică sau amoniacală.
Azotul nitric (NO3-) din sol este direct asimilabil de către
plante. În celulele plantelor azotul nitric este redus la azotul nitros
(NO2-) şi apoi la azot amoniacal (NH3 sau NH4+).
Azotul nitric din sol provine fie din îngrăşămintele chimice
administrate în sol, sau se formează prin oxidarea amoniacului de
către microorganisme specifice (nitrificatoare).
Azotul amoniacal este asimilat direct de către plante. În
organismul vegetal azotul amoniacal participă direct sau indirect
sub formă de compuşi (săruri de amoniu ale acizilor organici,
amidele acizilor asparagic şi glutamic) la biosinteza aminoacizilor.
Azotul amoniacal din sol provine din îngrăşăminte chimice sau din
resturile substanţelor organice în curs de degradare. Procesul se
numeşte amonificare. Azotul organic provenit din substanţele
organice aflate în sol nu este direct asimilabil. Sub acţiunea
bacteriilor de putrefacţie, azotul organic este transformat în
procesul de amonificare în azot amoniacal asimilabil.
Azotul atmosferic nu este asimilabil pentru plante direct, dar
prin intermediul bacteriilor fixatoare de azot, care trăiesc în
nodozităţile de pe rădăcinile leguminoaselor. Transformarea
azotului atmosferic în azot amoniacal este un proces de reducere
enzimatică.

21
Amoniacul în organismul vegetal se formează ca rezultat al
proceselor de dezaminare suferite de aminoacizi şi de alţi compuşi
cu azot şi serveşte în primul rînd la biosinteza de noi aminoacizi şi
compuşi cu azot. Excesul de amoniac, fiind toxic pentru celule este
fixat de plantă sub formă de săruri de amoniu ale acizilor organici,
amide ale aminoacizilor dicarboxilici şi ca uree. Toţi aceşti
compuşi constituie rezervele de azot ale plantei.
Plantele bogate în acizi organici liberi, numite plante acide
(măcriş, revent, begonia etc.) au capacitatea deosebită de a fixa
amoniacul sub formă de săruri de amoniu (oxalat de amoniu, malat
de amoniu, citrat de amoniu, fumarat de amoniu etc.).
Cea mai importantă cale de detoxicare a amoniacului în
celulele plantelor este fixarea sub formă de amide, îndeosebi ale
acizilor aspartic (asparagina) şi glutamic (glutamina). Asparagina şi
glutamina au fost identificate nu numai în plantele superioare, ci şi
în ciuperci, drojdii, bacterii, precum şi în organismele animale.
Formarea asparaginei şi glutaminei este un proces care
decurge cu consum de ATP:
ATP ADP

HOOC - CH - CH2- CH2- COOH HOOC - CH - (CH2) - CO - O - P +


2

NH2 acid glutamic NH2 acid fosfoglutamic


(forma activa)

+ NH3
HOOC - CH - CH2- CH2- CO - NH2 + H3PO4

NH2 glutamina
Amoniacul fixat sub formă de amide (asparagină şi
glutamină) nu este toxic, poate fi eliberat prin hidroliza enzimatică
pentru a fi utilizat în biosinteza compuşilor cu azot sau în
menţinerea echilibrului acido-bazic din plantă:
+ H2O
HOOC - CH - CH2- CH2- CO - NH2 HOOC - CH - CH2- CH2- COOH
- NH3
NH2 glutamina NH2 acid glutamic

22
Fixarea (dezintoxicarea) amoniacului sub formă de uree
este un proces întîlnit în regnul animal şi uneori în cel vegetal,
numit ciclul ureogenetic sau ornitinic.
După cum susţin savanţii V.I. Nilov şi I. M. Scurihin
cantităţile mari de amoniac duc la scăderea calităţii şi anume
gustului vinului, sucului, compotului. De aceie determinarea
amoniacului are o însemnătate teoretică şi practică.

Principiul metodei
Cînd la soluţia analizată, care conţine săruri de amoniu, se
adaugă bază, se elimină amoniac, care cantitativ se reţine cu soluţie
de 0,02 n H2SO4 luată în exces. Titrînd cu hidroxid de sodiu
excesul de acid, care n-a reacţionat cu amoniacul, se poate calcula
cantitatea de acid necesară pentru a neutraliza amoniacul.
Bazele puternice, odată cu descompunerea sărurilor de
amoniu, parţial hidrolizează şi amidele, care se conţin în obiectele
analizate:
R – CO – NH2 + KOH → R – COOK + NH3
Amoniacul format în acest caz poate falsifica rezultatele
analizei.
De aceea pentru a evita hidroliza amidelor, în loc de bază la
soluţia analizată se dozează soluţie saturată de K2CO3, care în
procesul hidrolizei formează un mediu bazic relativ slab.

Chimismul procesului:

K2CO3 + H2O = KHCO3 + KOH

NH4Cl + KOH = KCl + NH3 + H2O

2 NH3 + H2SO4 = (NH4)2SO4

H2SO4 exces+ NaOH = Na2SO4 + H2O

23
Aparate, vase şi materiale:

ƒ 4 ceşti Conwei;
ƒ 2 pipete Mor de 5 cm3 şi o pipetă gradată de 5 cm3;
ƒ 4 baloane conice de 100 cm3;
ƒ soluţie saturată de carbonat de potasiu (K2CO3);
ƒ soluţie de 0,02 n H2SO4;
ƒ soluţie de 0,02n NaOH;
ƒ indicator mixt (metilrot-metilen albastru): 0,2 g metilrot şi
0,012 g metilen albastru se dizolvă în 60 cm3 alcool şi cu apă se
aduce pînă la 100 cm3.

Ordinea îndeplinirii lucrării

Se dozează 5 cm3 soluţie 0,02n H2SO4 în camera internă (1)


a ceştii Conwei (fig.1). În camera externă (2) se dozează 5 cm3
soluţie analizată (vin, suc etc.). Ceaşca Conwei se închide aproape
la 9/10 cu o placă de sticlă şlefuită. Prin gaura deschisă cu ajutorul
pipetei gradate se dozează în camera externă 3 cm3 soluţie saturată
de K2CO3. Ceaşca se închide cu placa şi prin clătinări atente,
uşoare se amestecă soluţia analizată cu K2CO3. Se pune în
termostat şi se ţine 1 oră la temperatura 50-55 oC.

Fig.1.Ceaşca Conwei

După ce se scoate din termostat, ceaşca Conwei se deschide


şi soluţia din camera internă se transferă cantitativ în balonul conic
de 100 cm3 cu apă distilată (≈ 10 cm3). Soluţia se titrează cu soluţie
de 0,02n NaOH în prezenţa indicatorului mixt pînă la schimbarea
culorii din violet în verde.

24
Experienţa se repetă în 2 ceşti Conwei. Paralel se face proba
de control, unde în loc de soluţie analizată se foloseşte apă distilată.
Cantitatea de azot amoniacal (mg/dm3) în soluţia analizată
se calculează după formula:
(Vcontrol - V lucru) * K * 0.28 * 1000
X=
V
unde:
V control – volumul soluţiei de 0,02n NaOH, folosită la
titrarea probei de control, cm3;
V lucru - volumul soluţiei de 0,02n NaOH, folosită la titrarea
probei de lucru, cm3;
K – coeficientul de corecţie al bazei;
0,28 – cantitatea de azot în mg, care corespunde unui cm3
de soluţie 0,02n NaOH;
V – volumul probei analizate, cm3.

Întrebări de control:
1. Numiţi substanţele azotoase din organisme vii.
2. Ce forme de azot pot utiliza plantele şi animalele ?
3. Descrieţi transformările azotului nitric în plante.
4. Cum se numeşte procesul oxidării amoniacului pîna la
nitraţi ?
5. Daţi definiţia amonificării.
6. Descrieţi asimilarea azotului atmosferic ?
7. Prin ce procese se produce amoniacul în organism ?
8. Cum se fixează excesul de amoniac în plante ?
9. Scrieţi reacţiile formării şi descompunerii amidelor în
plante.
10. Descrieţi principiul metodei determinării amoniacului.
11. Regulile tehnicii de securitate la determinarea
amoniacului.

25
Lucrarea de laborator nr. 4

Determinarea proteinelor în vin după metoda Lowry

Unele din caracteristicile importante ale proteinelor sînt:


capacitatea de a precipita din soluţii şi capacitatea de adsorbţie.
Din soluţii proteinele pot precipita reversibil sau ireversibil.
Precipitaţia reversibilă – are loc cînd se adaugă următoarele
reactive:
¾soluţii concentrate de săruri neutri ale metalelor alcaline
(sulfat de amoniu, sulfat de natriu, clorură de natriu, etc.);
¾soluţii apoase concentrate de alcool: metilic, etilic,
propilic;
¾soluţii concentrate apoase de acetonă.
În urma dozării acestor substanţe, care concurează cu
proteinele pentru apă, învelişul apos din jurul moleculelor de
proteină începe să se descompună şi moleculele sub influenţa
forţelor de coeziune moleculară formează agregate mari; soluţia se
tulbură şi apare un precipitat floculos, care se aşează pe fundul
vasului. Precipitatul format la fundul vasului dispare cînd soluţia
este diluată cu apă.
Alcoolul şi acetona în soliţii diluate formează precipitate
proteice reversibile, iar dacă au o concentraţie mare formează
precipitate ireversibile.
Sărurile alcaline se comportă diferit faţă de proteine. În
soluţii diluate măresc solubilitatea proteinelor, iar în soliţii
concentrate determină precipitarea lor reversibilă. Cauza
precipitării proteinelor este hidratarea ionilor cu apă extrasă din
macromolecula proteică. Neavînd apă suficientă proteinele
precipită, floculează, sau se coagulează.
Prin precipitarea ireversibilă proteinele suferă modificări
fizico-chimice adînci şi se produce denaturarea structurii lor
moleculare.

26
Precipitaţia ireversibilă are loc, cînd proteinele formează
precipitate insolubile, care nu se dizolvă la înlăturarea factorului
precipitant.
Denaturarea este modificarea structurii spaţiale a
moleculei proteice ce duce la micşorarea solubilităţii, pierderea
activităţii biologice. Denaturarea poate fi reversibilă şi ireversibilă.
Denaturarea proteinelor are loc sub acţiunea unor agenţi
denaturanţi care pot fi de natură fizică sau chimică. Factorii fizici
sînt: încălzirea, creşterea presiunii, congelarea, radiaţiile ionizante,
ultrasunetele etc. Agenţii chimici: ureea, sărurile metalelor grele
(mercur, argint, cupru, plumb, bismut, stibiu), solvenţii organici,
acidul tricloracetic, compuşii coloidali (acid wolframic, tanin), pH
mai mic de 4 şi mai mare de 10, detergenţi.
Denaturarea este foarte importantă în panificaţie, prepararea
prafului de ou, lapte, conservare. Proteoliza proteinelor denaturate
este mai rapidă, deci şi asimilarea lor este mai rapidă.
Altă proprietate caracteristică a proteinelor este capacitatea
de adsorbţie pe argila de bentonită sau silicagel, răşini sintetice,
gelatină, cărbune. Fenomenul de adsorbţie (reţinere la suprafaţă)
are loc la suprafaţa de contact dintre faza dispersă şi mediul
dispergent şi constă în fixarea substanţelor (proteinelor) ce se
găsesc în soluţie de către partuculele coloidale.
Adsorbţia are un rol important în vinificaţie şi conservare.
Se aplică acest proces la limpezirea mustului înainte de fermentaţie,
sucurilor şi vinurilor.
Principiul metodei
Metoda Lowry este una din cele mai sensibile metode de
determinare a proteinelor. Este bazată pe două reacţii concomitente
- biuretică şi Folin. Ultima este caracteristică pentru aminoacizii
triptofan, tirozina, cisteina, care reduc Reactivul Folin (amestec de
acizi dodecawolframofosforic H3PW12O40 şi
dodecamolibdofosforic H3PMo12O40) pînă la oxizi (W8O23,
Mo8O23) de culoare albastră. Din cauza formării complecşilor
moleculelor proteice cu cupru coloraţia cu reactivul Folin devine
mult mai intensă decît numai datorită aminoacizilor sus-numite.

27
Deoarece în reacţie intră şi alţi aminoacizi, intensitatea culorii este
direct proporţională cu cantitatea de proteine în soluţia analizată şi
se determină cu ajutorul fotoelectrocolorimetrului la lungimea de
undă 650 nm.

Aparate, vase şi materiale:


ƒ centrifuga de laborator;
ƒ fotoelectrocolorimetru KFK-2;
ƒ acid tricloracetic de 80 %;
ƒ reactivul "A"— conţine 20 g de NaOH, 100g de
Na2CO3, 2g de sare Seignette, 0.5 g de CuSO4 x 5 H2O. Fiecare
component se dizolvă aparte în apă distilată, se amestecă în balon
cu cotă de 1 dm3, volumul soluţiei se aduce la cotă;
ƒ reactivul "B"—reactivul Folin diluat (la 0,5 cm3 de
reactiv Folin 1 n se adaugă 4 cm3 apă distilată);
ƒ soluţie 1 n de NaOH;
ƒ reactivul Folin—100 g wolframat de sodiu şi 25 g
molibdat de sodiu se dizolvă în 700 cm3 apă, se adaugă 50 cm3 acid
ortofosforic 85 % şi 100 cm3 acid clorhidric concentrat, se dizolvă
şi se fierbe cu răcitor invers timp de 10 ore, apoi se adaugă 150
grame sulfat de litiu, 50 cm3 apă distilată şi 3-5 picături de brom şi
iarăşi soluţia se fierbe 15 minute fără răcitor sub nişa de ventilare
pentru a înlătura excesul de brom. Apoi soluţia se răceşte pîna la
temperatura de cameră şi se aduce cu apă la volumul de 1 dm3, se
filtrează şi se păstrează într-un balon întunecat cu dop rodat.
Înainte de a începe lucrarea soluţia se diluează în aşa fel, ca
să corespundă acidului 1 n. Concentraţia soluţiei se controlează
prin titrarea reactivului Folin diluat de 10 ori cu soluţie 0,1 n
hidroxid de sodiu după fenolftaleină;
ƒ patru eprubete şi cilindru de 5-10 cm3;
ƒ pipete de 1-2 cm3 şi de 5 cm3;
ƒ baie de apă;
ƒ termometru.

28
Ordinea îndeplinirii lucrării
Într-o eprubetă cu 10 cm3 de vin se dozează 1 cm3 acid
tricloracetic. Soluţia se pune în frigorifer pe douăzeci şi patru ore.
Apoi soluţia se centrifughează 1 oră la 5000 ture/minut şi se
decantează.
În eprubetă cu precipitat se dozează 1 cm3 soluţie 1n NaOH
şi după 30 minute se adaugă 1 cm3 H2O. Din proba obţinută, în altă
eprubetă, se ia 1 cm3 soluţie şi se dozează 1 cm3 reactiv "A" şi
după 10 minute se adaugă 4 cm3 reactiv "B".
Paralel cu proba de analiză se pregăteşte proba de
comparaţie, constituită din: 1 cm3 H2O + 1 cm3 NaOH + 2 cm3
reactivul"A" + 8 cm3 reactivul "B".
Eprubetele cu probele de analiză şi comparaţie se plasează
în baia de apă la temperatura 55 oC pe 5 minute şi după răcire
rapidă se măsoară intensitatea culorii. Probele se colorimetrează
folosind filtru de lumină №8 (roşu) cu lungimea de undă λ=650
nm, cuva cu lungimea 10 mm.
Conţinutul proteinelor se calculează după formula:
X = Do x 2 x 250 =Do x 50
V
unde:
X – cantitatea de proteine în soluţia analizată, mg/dm3;
Do – densitatea optică a soluţiei analizate;
2 – volumul bazei şi soluţiei analizate, în cm3;
250 – coeficient de recalculare;
V – volumul vinului luat pentru analiză, în cm3.

Întrebări de control

1. Caracteristica generală a proteinelor.


2. Compoziţia elementară şi clasificarea proteinelor.
3. Proprietăţile caracteristice ale proteinelor.
4. Metodica determinării proteinelor după Louri.
5. Regulile tehnicii de securitate în procesul îndeplinirii
lucrării.

29
Lucrarea de laborator nr. 5

Reacţiile de culoare a proteinelor

S-a stabilit că proteinele datorită aminoacizilor formează


circa 30 reacţii de culoare caracteristice. Cele mai importante sînt:
biuretică, xantoproteică, Millon, Louri, Adamkiewics,
sulfhidrilică etc.
Sînt şi reacţii incolore care se realizează prin hidroliza
proteinelor cu acizi, baze sau enzime. Prin hidroliza proteinelor
rezultă produşi mai simpli şi în ultima fază – aminoacizi.
Hidroliza acidă este mai frecvent utilizată. În acest caz
soluţia proteică se fierbe în fiole ermetic închise 10-12 ore cu
soluţie 10 % de acid clorhidric sau soluţie 20 % de H2SO4.
Proteinele se descompun pînă la aminoacizi, dar dispare complet
triptofanul.
Hidroliza alcalină se realizează cu hidroxizi alcalini timp
de 10-12 ore cu soluţie 10 % de NaOH sau Ba(OH)2. Metoda are
avantajul că nu se distruge triptofanul, însă se descompun alţi trei
aminoacizi: arginina, citrulina, histidina.
Din punct de vedere biologic mai importante sînt procesele
de hidroliză enzimatică.
Hidroliza enzimatică se realizează prin intermediul
enzimelor la temperatura 20-40 oC şi la pH –ul aproape de neutru.
În acest caz nu se distruge nici un aminoacid. Hidroliza enzimatică
are loc în tubul digestiv al organismului animal, uman, în celula
vegetală a fructelor, legumelor, în struguri şi vinuri. De exemplu, la
prelucrarea strugurilor hidroliza enzimatică are lor după schema:
Proteine →albumoze→ peptone → polipeptide →
→ oligopeptide→aminoacizi.

Aparate, vase şi materiale:


ƒ lapte degresat sau soluţie 0,5 g cazeină în 100 cm3 bază de
1 %;

30
ƒ soluţie de albuş de ou, (albuşul unui ou se separă de
gălbenuş, se amestecă cu 0,5 dm3 apă distilată şi se agită minuţios);
ƒ soluţie 1 % de gelatină;
ƒ soluţie 1 % de CuSO4;
ƒ soluţie 10 % de NaOH;
ƒ soluţie 30 % de NaOH sau 20 % de NH4OH;
ƒ acid azotic concentrat de HNO3;
ƒ acid acetic glacial de CH3 COOH;
ƒ acid sulfuric concentrat de H2SO4;
ƒ reactivul Millon: la 40 g mercur se dozează sub nişa de
ventilaţie 50 cm3 acid azotic concentrat (ρ=1,42), se lasă pe 30
minute la temperatura de cameră, apoi se încălzeşte în baia de apă
pînă mercurul se dizolvă complet. Soluţia obţinută se diluează cu
două volume de apă (aproximativ pînă la 160 – 180 cm3 ), după
depunere se decantează de sediment;
ƒ 5 % soluţie de Pb(CH3COO)2.

Reacţia biuretică. Această reacţie este caracteristică


pentru toate proteinele, polipeptidele care conţin grupa peptidică
(– CO – NH –). Dar reacţia biuretică se poate obţine şi cu o serie de
compuşi, care nu au nimic comun cu proteinele, de exemplu, cu
biuretul NH2-CO-NH-CO-NH2, sau oxamida NH2-CO-CO-NH2,
etc.
În urma tratării soluţiei de proteine cu soluţie de bază
alcalină (NaOH) şi cîtorva picături de soluţie diluată de sulfat de
cupru (CuSO4), proteinele obţin o culoare violetă datorită faptului
că cuprul formează substanţe complexe cu grupele (-CO-NH-).

Chimismul reacţiei:

CuSO4 + 2 NaOH Cu (OH)2 + Na2SO4

31
R R R1
R1

CH CO NH CH CH C N CH

NH CO N OH OH C-OH
... Cu -2 H 2 O
... OC NH C
N

...
HO HO
... CH NH CO CH HO
HC N C CH
R3 R2
R3 R2
un sector din catena
polipeptidicã
R R1

CH C N CH

N O C-OH
... Cu
C
N
...
O
HO
HC N C CH

R3 R2

complex biuretic
Ordinea îndeplinirii lucrării
În trei eprubete se administrează: în prima – 0,5 cm3 soluţie
de cazeină sau lapte degresat; în a doua – 0,5 cm3 soluţie albuş de
ou; în a treia - 0,5 cm3 soluţie gelatină. În fiecare eprubetă se
dozează cîte 0,5 cm3 soluţie 10 % NaOH şi cîte 5 picături soluţie
1% CuSO4. Eprubetele se agită. Apare culoarea violetă.
Se face concluzia despre natura chimică a substanţelor
analizate.
Reacţia xantoproteică. Aminoacizii aromatici la
fierbere cu HNO3 concentrat se supun nitrării. Ca rezultat soluţia
capătă o culoare galbenă care trece în oranj la adăugarea bazei.
Acidul azotic nitrează nucleul benzenic al aminoacizilor
ciclici: tirozină, fenilalanină, formînd nitrocompuşi de culoare
galbenă. De exemplu, radicalul tirozinei din componenţa proteinei
în prezenţă HNO3 se transformă în nitrotirozină galbenă, care în
mediul bazic dă culoare oranj (forma chinoidică).
Chimismul reacţiei:

32
O
O

... HN CH C ... ... HN CH C ... ... HN CH C0 ...

CH2 CH2 CH2

+ HO NO2 + NH4OH + NH4+ + H2O

O O
N N
O O
OH OH O

Radicalul tirozinei Radicalul nitrotirozinei Radicalul în forma

chinoidică
Ordinea îndeplinirii lucrării
În trei eprubete se administrează: în prima – 0,5 cm3 soluţie
de cazeină sau lapte degresat; în a doua – 0,5 cm3 soluţie albuş de
ou; în a treia – 0,5 cm3 soluţie gelatină. În fiecare eprubetă se
dozează cîte 5-6 picături HNO3 concentrat şi eprubetele se
încălzesc (orientîndu-le în direcţie opusă de la sine sau de la
persoanele, care lucrează în laborator). În urma fierberii, conţinutul
eprubetelor se colorează în galben. După răcire în eprubete se
adaugă 10 picături soluţie 30 % de NaOH (sau soluţie 20 % de
NH4OH), culoarea soluţiilor devine oranj. Se face concluzia despre
compoziţia aminoacidică a proteinelor analizate
Reacţia Millon. Reacţia este caracteristică aminoacizilor
care au radicalul fenolic, de exemplu, tirozina. Reactivul Millon la
cald dă cu tirozina o coloraţie roşie. Adică, la încălzirea proteinei
cu o soluţie azotat mercuric şi în prezenţa acidului azotic concentrat
cu puţin acid azotos se formează un precipitat roşu cărămiziu,
datorită formării nitrocompuşilor tirozinei în forma chinoidică.
Ordinea îndeplinirii lucrării
În trei eprubete se administrează: în prima – 0,5 cm3 soluţie
de cazeină sau lapte degresat; în a doua – 0,5 cm3 soluţie albuş de
ou; în a treia – 0,5 cm3 soluţie gelatină. În fiecare eprubetă se
dozează cîte 5-7 picături reactiv Millon, eprubetele se încălzesc
atent, îndreptîndu-le în direcţie opusă. Peste un timp se observă
apariţia unei coloraţii roşietice şi apariţia precipitatului cărămiziu.
33
După schimbarea culorii se face concluzie despre proteinele în care
este prezentă tirozina. Chimismul reacţiei:
O
. .._ _
HN CH C
CH 2

2 + 2 H O _- -_ N O 2 + H g 2( N O 3 )2

OH
O O
... HN CH C ... ... _ _ ...
HN CH C
CH 2 CH 2

O O
_ _ _ _
O 2 N = N O _ _H g _ _H g O_ _ N = N O 2

O O

Reacţia sulfhidrilică. La încălzirea soluţiilor proteice


cu baze în prezenţa sărurilor de Pb se formează culoarea neagră-
cafenie în urma reacţiei cu aminoacidul cisteina:
CH2 SH +2NaOH CH2 OH +Na2S +H2O
HOOC CH NH2 HOOC CH NH2

Cu plumb sulfura de sodiu formează un sediment PbS.

Na2S + (CH3COO)2Pb PbS + 2 CH3COONa


Intensitatea culorii depinde de cantitatea cisteinei în
proteina şi concentraţia proteinei în soluţie.

Ordinea îndeplinirii lucrării


În trei eprubete se administrează: în prima – 0,5 cm3 soluţie
de cazeină sau lapte degresat; în a doua – 0,5 cm3 soluţie albuş de
ou; în a treia – 0,5 cm3 soluţie gelatină. În fiecare eprubetă se
dozează cîte 5 picături de 30 % NaOH şi 1 picătură de 5 %
Pb(CH3COO)2. La încălzirea îndelungată lichidul devine cafeniu şi
se formează sedimentul negru de PbS.
Reacţia Adamkiewics. Soluţiile de triptofan sau
proteine, care conţin resturi de triptofan fiind tratate cu acid
34
glioxilic (în formă de impurităţi în acidul acetic glacial) în prezenţa
acidului sulfuric concentrat formează la nivelul zonei de contact un
inel violaceu.
O O O O
... HN CH C ... ... HN CH C ... ... HN CH C ... ... HN CH C ...

CH2 CH2 CH2 CH2


+ H2SO4
H H - H2O
O CH
HN HN HN C O HN
CH
HO
C O
HO

Intensitatea culorii depinde de cantitatea de triptofan.


Triptofanul în cantităţi mai mici se găseşte în lapte, carne, ouă. În
cantităţi mai mari se conţine în icre negre şi roşii de peşte.
Ordinea îndeplinirii lucrării
În trei eprubete se administrează: în prima – 0,5 cm3 soluţie
de cazeină sau lapte degresat; în a doua – 0,5 cm3 soluţie albuş de
ou; în a treia – 0,5 cm3 soluţie gelatină. În fiecare eprubetă se
dozează cîte 5 cm3 acid acetic concentrat, puţin se încălzeşte, apoi
atent (pe peretele eprubetei) se adaugă 1 cm3 acid sulfuric
concentrat. Se notează în care eprubete la nivelul zonei de contact
dintre lichide apare inelul roşu-violet, care se extinde treptat în
ambele părţi. După intensitatea culorii se face concluzia despre
proteinele în care este prezent triptofanul.

Întrebări de control:

1. Caracteristica generală a proteinelor.


2. Caracteristica reacţiei biuretice.
3. Caracteristica reacţiei xantoproteice.
4. Caracteristica reacţiei Millon.
5. Caracteristica reacţiei Adamkiewics.
6. Descrierea metodelor de hidroliză a proteinelor.

35
Lucrarea de laborator nr. 6
Determinarea formei reduse a glutationului
(în levuri sau germenii cerealelor)
Glutationul este o tripeptidă formată din trei resturi de
aminoacizi: acidul glutamic, cisteină, glicocolul (glicina):
HS
CH 2
NH 2 - CH - CH 2 - CH 2 - CO - NH - CH - CO - NH - CH 2 -COOH
COOH
Glutationul este foarte răspîndit în natură, se conţine în
aproape toate celulele vii în cantităţi mici. În cantitate mare a fost
găsit în germenii grîului pînă la 0,45 % din masa uscată, în levurile
vechi, struguri. El prezintă o substanţă solidă, albă, solubilă în apă
şi alcool. Din soluţia alcoolică cristalizează sub formă de prisme.
Glutationul are 2 grupe carboxilice libere, deci are un
caracter pronunţat acid (pH= 2,83).
Datorită grupării sulfhidrilice (-SH) glutationul are
proprietăţi reducătoare puternice. Poate fi în două forme: redusă (G
- SH) şi oxidată ( G-S-S-G). Aceste forme trec uşor una în alta
după următoarea reacţie:

-2 H+
G - SH + HS - G G -S-S-G
+ 2 H+

Transformările de oxidare şi reducere sînt reversibile şi în


organismele vii sînt catalizate de enzime specifice, anume de
glutationreductază în prezenţa acidului dehidroascorbic (acceptor
de hidrogen).
Multe enzime proteolitice de natură vegetală, care au în
centrul activ gruparea –SH (enzime tiolice) sînt activate de
glutationul redus. Ca rezultat se hidrolizează proteinele de rezervă
(gluten) din făină şi aluatului se lasă, nu ţine volumul. Acţiunea de
activare a glutationului se datorează faptului, că el este un
reducător puternic şi se oxidează uşor.

36
Forma redusă de glutation se acumulează în cantităţi mai
mari la încolţirea cerealelor şi în procesul de învechire a levurilor,
şi deci este un factor, care diminuează puternic calitatea acestor
produse vegetale. De exemplu, la a patra zi de germinare cantitatea
de glutation redus în orz creşte de 2,5 ori.
În panificaţie pentru a preveni distrugerea glutenului,
glutationul redus se oxidează cu acidul dehidroascorbic (vitamina
C oxidată).
Glutationul redus protejează oxidarea acidului ascorbic şi al
adrenalinei.

Principiul metodei

Metoda se bazează pe oxidarea grupării –SH a glutationului


redus cu iod. Pentru a primi soluţii stabile de iod se foloseşte KIO3
şi titrarea se petrece în prezenţă de KI în mediul acid:
KIO3 + 5 KI + 2 H3PO4 2 K3PO4 + 3 H2O + 3 I2
Iodul oxidează glutationul redus conform ecuaţiei:
2G-SH + I2 G-S-S-G + 2HI
Titrarea se termină cînd apare culoarea albastră a
amidonului, ce indică prezenţa iodului şi dispariţia glutationului în
forma redusă.

Aparate, vase şi materiale:

ƒ materie primă pentru analiză: levuri de panificaţie sau de


vin, germeni de cereale, crupe, cereale.
ƒ soluţie de 5 % acid meta-fosforic;
ƒ soluţie de 1,5 % KI (se pregăteşte înainte de determinare);
ƒ soluţie de 1 % amidon cu adaos de NaCl;
ƒ soluţie de 0,001 n KIO3 (potasiu iodat);
ƒ mojar cu pistil;
ƒ balon cotat de 50 cm3;
ƒ baloane conice de 100 cm3;
ƒ microbiuretă sau biureta de 10 cm3;
37
ƒ pipete: 1, 5, 10 cm3;
ƒ pîlnie de sticlă;
ƒ hîrtie de filtru pliată.
Ordinea îndeplinirii lucrării
Proba produsului analizat (2 g) se transferă în mojar şi se
mărunţeşte cu pistilul cu nisip de cuarţ în prezenţa a 5 cm3 soluţie
de 5 % acid meta-fosforic. Apoi, masa mărunţită cantitativ se
transferă în balonul cotat de 50 cm3, se aduce pînă la cotă cu apă
distilată. După 5 min de macerare conţinutul balonului se agită 2-3
min şi se filtrează prin hîrtie de filtru pliată.
Pentru determinarea conţinutului de glutation în balonul
conic de 100 cm3 se administrează 5 cm3 de filtrat, 1 cm3 soluţie de
1,5 % KI şi 5 picături de soluţie de 1% amidon după care se titrează
din microbiuretă cu soluţie de 0,001 n KIO3 pînă la apariţia culorii
albastre.
Conţinutul glutationului se exprimă în mg-% la masa
uscată a materialului analizat după formula :
A*0,307*C*100*1000
X= , mg -%,
P*b*1000
unde:
X – cantitatea glutationului în mg-%;
0,307 – coeficientul de recalculare a glutationului, care
arată că 1cm3 soluţia de 0,001 n KIO3 este echivalent cu 0,307 mg
de glutation redus;
P – masa levurilor, grame;
C – volumul finit al suspensiei de levuri, cm3;
A – cantitatea de soluţie de 0,001 n KIO3, care a fost
folosită la titrare, cm3;
b – volumul filtratului luat la titrare;
100 – recalcularea la 100 g de produs;
1000 – recalcularea g în mg.
Întrebări de control
1. Descrieţi structura glutationului şi proprietăţile lui.
2. Pe ce se bazează principiul metodei de determinare a
formei reduse a glutationului ?
38
3. Ce împortanţă practică are analiza glutationului redus ?
4. Ce enzime sînt activate de glutationul redus, care este
mecanismul acestei activări ?

39
Lucrarea de laborator nr. 7

Determinarea activităţii invertazei în vinuri, sucuri

Enzimele sînt catalizatori biologici specifici de natură


proteică, care se sintetizează în celulele organismelor vegetale şi
animale. Datorită enzimelor toate organismele vii pot realiza un
număr enorm de diverse procese chimice legate de metabolismul
substanţelor.
Enzimele se împart în două grupe: enzime
monocomponente (proteine), care sînt constituite din aminoacizi şi
enzime bicomponente (proteide), constituite dintr-o componentă
proteică (apoenzimă) şi o moleculă de natură neproteică (cofactor).
Deseori cofactorul prezintă derivaţii vitaminelor hidrosolubile.
Din enzimele monocomponente fac parte multe hidrolazele,
iar din enzimele bicomponente --oxidoreductazele, transferazele,
liazele, izomerazele şi ligazele.
Cînd gruparea prostetică se leagă de apoenzimă prin legături
slabe, uşor disociabile, atunci cofactorul se numeşte coenzimă.
În cazul cînd gruparea prostetică se leagă de apoenzimă prin
legături covalente, nedisociabile, atunci cofactorul se numeşte
gruparea prostetică.
Substanţa asupra căreia acţionează enzima se numeşte
substrat. În cele mai multe cazuri legătura dintre substrat şi enzimă
se face prin intermediul „centrelor active”(regiunea enzimei, care
direct realizează cataliza).

Unităţi de măsură ale activităţii enzimelor.


Activitatea enzimelor se determină prin: măsurarea gradului
de transformare a substratului, măsurarea concentraţiei produsului
de reacţie sau măsurare a cineticii de reacţii, urmărite într-un
anumit interval de timp prin metode fizice sau chimice adecvate.
Activitatea enzimelor se exprimă cantitativ în unităţile
propuse de Comisia de Enzime (CE) şi anume:

40
Unitatea de activitate enzimatică (U) reprezintă cantitatea
de enzimă care catalizează transformarea a 1µmol substrat /min., în
condiţii standard (t 0 = 25 0C, pH şi concentraţie de substrat
optime). Această unitate de măsură este recomandată de CE din
1961 şi folosită pînă în prezent. Dar CE recomandă trecerea la
unitatea Katal.
Katalul (Kat) reprezintă cantitatea de enzimă care
catalizează transformarea a 1 mol substrat ре secundă în condiţii
standard.
În practică se foloseşte microkatalul (µKat = 10–6Kat),
nanokatalul (nKat =10–9 Kat), picokatalul (pKat=10–12 Kat).
Pentru enzimele solide (praf) se foloseşte activitatea
specifică – reprezintă numărul de unităţi enzimatice /mg proteină
(respectiv Kat/mg proteină şi Kat/kg proteină), sau reprezintă
numărul de Katali care corespund la 1 kg de enzimă.
Pentru enzime în stare cristalină cu masa moleculară
cunoscută se foloseşte activitatea enzimatică molară (număr de
transfer) – reprezintă numărul de molecule de substrat transformate
de către o moleculă de enzimă timp de 1 min sau 1s (Kat/mol
enzimă), sau reprezintă numărul de katali care revin unui mol de
enzimă.
Metodele principale de separare şi purificare a enzimelor.
Enzimele se conţin în stare dizolvată în plasma tuturor
ţesuturilor vegetale, animale şi a microorganismelor (bacterii,
drojdii, mucegaiuri).
Prelucrarea materiei prime de origine vegetală, animală sau
microbiană este în linii generale aceia-şi: omogenizare, extracţie,
concentrare, fracţionare şi uscare. Preparatele enzimatice parţial
purificate pot fi în formă lichidă, semilichidă sau uscată.
Enzimele din ţesuturi se extrag uşor cu ajutorul apei,
soluţiilor de săruri, acizi şi baze slabe. Un dizolvant bun pentru
majoritatea enzimelor îl constituie soluţia apoasă de glicerol.
Dacă enzimele sînt strîns legate cu elementele structurale
ale celulei, atunci pentru distrugerea ţesuturilor se folosesc: nisipul

41
de cuarţ sau sticlă, dezintegrarea prin macerare, autoliza şi în
aparate speciale – omogenizatoare etc.
Impurităţile (molecule cu masa moleculară mică) din
soluţiile obţinute se înlătură prin dializă, electrodializă,
precipitarea enzimelor cu alcool, acetonă, săruri.
După extracţie soluţiile enzimatice se purifică şi se
concentrează prin metodele de cromatografie şi electroforeză.

Rolul invertazei

În natură sînt mult răspîndite enzimele care catalizează


hidroliza legăturilor glicozidice din glicozide, oligoglucide şi
poliglucide. Aceste enzime au denumirea generală de
carbohidraze.
Se disting enzime care hidrolizează numai poliglucidele
(poliazele) şi enzime care hidrolizează oligoglucidele (glicozidaze).
Enzima β-fructofuranozidaza se referă la carbohidraze
(glicozidaze). Această enzimă catalizează inversia sau hidroliza
zaharozei şi de aceea se numeşte invertaza sau zaharază.
Invertaza acţionează asupra legăturii β-fructo-furanozidice
din moleculele zaharozei, rafinozei etc., şi desprinde de la ele restul
de β-D-fructofuranoză.
Zaharoza este o dizaharidă din cele mai răspîndite dintre
oligozaharide. Se găseşte aproape în toate plantele, în cantităţi mai
mari se găseşte în sucul florilor alături de monozaharide, apoi în
sfeclă, în trestia de zahăr şi în cocenii tineri de porumb.
Sub influenţa acizilor sau a invertazei zaharoza se
hidrolizează formînd un amestec de monoglucide (D-glucoza şi D-
fructoza):

42
CH2OH
O H CH2OH
H O H
H
OH H H OH
OH
O CH2OH
H OH OH H

Acţiunea invertazei

Zaharoza (sustratul invertazei) are proprietăţi optic active,


este dextrogiră (rotaţia specifică + 66,5o). După hidroliză soluţia
rezultată devine levogiră [α]D20 = -20o, deoarece fructoza este
pronunţat levogiră [α]D20= -93o în comparaţie cu glucoza care este
dextrogiră [α]D20 = +52,5o. Această hidroliză se numeşte inversie
sau invertire, inversiune, iar amestecul echimolar de glucoză şi
fructoză are denumirea de „zahăr invertit” (mierea de albine).
Invertaza e mult răspîndită în plante, în drojdii, ciuperci şi
bacterii, în struguri, suc şi vin. Împreună cu enzima maltaza (care
se conţine în drojdia de bere) invertaza are o mare însemnătate
pentru industria alimentară. Aceste enzime se folosesc în industria
panificaţiei şi fermentaţiei: ele catalizează hidroliza zaharozei şi
maltozei şi prin aceasta pregătesc materia primă de fermentaţie.
Invertaza este foarte rezistentă la acţiunea SO2, este sensibilă la
etanol şi activitatea ei variază foarte mult cu temperatura. Tratarea
mustului şi vinului cu bentonita (fixează proteinele) diminuează
activitatea invertazei. La prelucrarea strugurilor numai o treime din
invertază trece în must, cea mai mare parte rămîne fixată pe
componentele solide ale boştinei şi în burbă. Strugurii au potenţial
invertazic ridicat: 1 cm3 must nedeburbat cu pH 3,5 la temperatura
30 oC are în mediu 200 unităţi. Datorită potenţialului invertazic
ridicat al mustului zaharoza adăugată în el (şaptalizarea) este
complect hidrolizată în cîteva ore.
Drojdiile cu o activitate mică de inversie nu pot fi utilizate
în industria panificaţiei şi fermentaţiei. De aceea studierea
activităţii acestor enzime are o însemnătate practică.
43
Principiul metodei
Activitatea invertazei se determină după cantitatea de zahăr
invertit care s-a format la hidroliza unei anumite cantităţi de
zaharoză sub acţiunea invertazei la to = 25 oC timp de 24 ore.
Cantitatea de zahăr invertit se determină după metoda Bertrand.

Aparate, vase şi materiale:

ƒ 4 baloane conice 100 cm3;


ƒ 4 baloane cotate 100 şi 200 cm3 ;
ƒ 4 cilindre de 50 cm3;
ƒ pîlnie Şott nr.3;
ƒ 2 baloane Bunzen de 500 cm3;
ƒ pipete 5 şi 10 cm3;
ƒ soluţie de zaharoză 10 %;
ƒ soluţie-tampon acetică cu pH = 4,7 (la 50 cm3 soluţie 1N
de NaOH se adaugă 96,8 cm3 soluţie 1 N de CH3 COOH şi volumul
amestecului se aduce cu apă distilată pînă la cota 500 cm3). În
soluţia tampon acetică se adaugă 1-2 cm3 toluol pentru reducerea
creşterii microorganismelor în probele de materie primă (vin, suc);
ƒ reactivul Fehling I: se dizolvă 40 g CuSO4 x 5 H2O într-un
dm3apă de distilată;
ƒ reactivul Fehling II: se dizolvă într-un dm3 apă de distilată
200g sare de Seignette (tatrat dublu de sodiu şi potasiu) şi 150 g de
NaOH;
ƒ soluţie ferică amoniacală (86g sulfat feric amoniacal se
dizolvă în 500 cm3 apă, la soluţie se adaugă 108 cm3 acid sulfuric
concentrat cu densitatea 1,84 şi volumul amestecului se aduce cu
apă distilată pînă la un dm3). Înainte de întrebuinţare soluţia ferică
amoniacală se oxidează cu cîteva picături de 0,1N KMnO4 pînă la
culoarea slab roză;
ƒ soluţie 0,05N KMnO4, care se păstrează în sticle brune la
întuneric;
ƒ probe de materie primă (vin, suc).

44
Ordinea îndeplinirii lucrării
Pregătirea probelor pentru inversia zaharozei
Probe de 10 cm3 vin sau suc se dozează în două baloane
conice de 100 cm3. Conţinutul primului balon (proba de control) se
fierbe timp de 3 minute pentru inactivarea enzimei. Apoi în ambele
baloane se dozează cîte 5 cm3 soluţie 10 % zaharoză, 10 cm3
soluţie-tampon acetică cu toluol. Baloanele se închid strîns cu
dopuri şi se lasă pentru 24 ore la temperatura 25 oC în termostat.
După expirarea termenului proba de lucru (cu excepţia probei de
control) se fierbe 3 minute pentru inactivarea enzimei.
Diluarea probelor
Conţinutul ambelor baloane se transferă cantitativ în două
baloane cu cotă de 200 cm3 şi se aduc cu apă distilată pînă la cotă,
se amestecă minuţios. Din fiecare balon se iau cu pipeta probe de
10 cm3, care se transferă în baloane conice de 100 cm3 şi se
determină în ele zahărul rezidual după metoda Bertrand.
Pentru aceasta la fiecare probă se adaugă cu cilindru cîte 10
3
cm soluţie Fehling I şi II. Probele se încălzesc şi se fierb 3 minute.
La încălzirea soluţie Fehling I şi II cu zahărul invertit (zaharuri
reducătoare) se depune Cu2O (protoxid de cupru) roşu – cărămiziu
şi au loc următoarele reacţii:
CuSO4 + 2 NaOH → Cu(OH)2 + Na2SO4

COOK COOK
CHOH CHO
+ Cu (OH)2 Cu + 2 H2O
CHOH CHO
COONa COONa
complex cuprotartric

45
CH= O COOH
COOK COOK
HCOH HCOH
CHO HCOH
HOCH + 2 Cu + 2 H2O HOCH + Cu2O +2
CHO HCOH
HCOH HCOH
COONa COONa
HCOH HCOH

CH2OH CH2OH

Deoarece reactivul Fehling II este un reactiv alcalin, în


prezenţa lui fructoza se poate transforma într-o aldoză (glucoză sau
manoză), care reacţionează cu soluţia Fehling:
H
CH 2 OH C OH CH= O
C=O C OH CH(OH)
HOCH HOCH HOCH
HCOH HCOH HCOH
HCOH HCOH HCOH
CH 2 OH CH 2 OH CH 2 OH
Fructoza Forma enolică Aldoza
Pentru determinarea cantităţii Cu2O trebuie de îndeplinit
următoarele procese.
Conţinutul primei probe (de control) după răcire pînă la 50
o
– 60 C se transferă în pîlnia Şott, (care are un strat de 0,5 cm de
asbest – celuloză), unită cu balonul Bunzen. Balonul Bunzen se
uneşte cu pompa de apă. Soluţia se filtrează prin pîlnia Şott şi se
spală de 5-6 ori cu apă fierbinte distilată pînă cînd soluţia devine
incoloră.
Precipitatul de Cu2O din pîlnia Şott şi din balonul conic
(unde a fost proba) tot timpul trebuie să fie menţinut sub un strat
de apă pentru a nu permite oxidarea Cu2O în contact cu aerul.

46
Imediat după ultima spălare în vasul conic (unde a fost
proba) se adaugă 10 cm3 soluţie ferică – amoniacală (cu cilindrul)
pentru dizolvarea sedimentului de Cu2O şi se agită pînă cînd
dispare precipitatul roşu – cărămiziu de pe pereţii balonului conic.
Între timp pîlnia Şott se montează pe un alt balon Bunzen curat, iar
pompa de apă se deconectează.
Soluţia ferică - amoniacală din balonul conic se toarnă peste
precipitatul din pîlnia Şott şi se amestecă cu o baghetă de sticlă
pînă la dizolvarea completă a precipitatului de Cu2O. Apoi balonul
Bunzen se uneşte cu pompa de apă şi amestecul obţinut se filtrează.
Balonul conic (unde a fost soluţia ferică - amoniacală) se spală de
5-6 ori cu apă distilată fierbinte şi se filtrează prin pîlnia Şott pînă
cînd picăturile de filtrat din balonul Bunzen au reacţie neutră
(dispare reacţia acidă a soluţiei, pH se determină prin intermediul
indicatorului universal de hîrtie). Are loc reacţia de dizolvare a
sedimentului de Cu2O în soluţia de sulfat feric Fe2(SO)3:
Cu2O + Fe2(SO4)3 +H2SO4→2CuSO4 + 2 FeSO4 + H2O
Sulfatul feros format (FeSO4) se titrează cu KMnO4 :
10 FeSO4 + 2 KMnO4 + 8 H2SO4 → 5 Fe2(SO4)3 +
+2 MnSO4 + K2SO4 + 8 H2O.
Filtratul limpede cu nuanţe verzui se titrează cu soluţie 0,05
n de KMnO4 direct în balonul Bunzen pînă cînd soluţia se colorează
în roz şi la o picătură în exces de KMnO4 coloraţia persistă un
minut. Volumul soluţiei 0,05N KMnO4 consumat la titrarea probei
se fixează.
Analogic se tratează şi se filtrează proba de lucru.
Pentru a obţine rezultate comparabile este necesar în
probele diluate de vin de repetat determinarea zahărului prin
metoda Bertran de 2-3 ori (în proba de lucru şi control). În
corespundere cu reacţiile scrise mai sus 1 cm3 soluţie 0,05 n
permanganat de potasiu echivalează cu 3,18 mg cupru. Cantitatea
de zahăr invertit în mg se determină după tabelul Bertrand (tab.1),
care indică ce cantitate de zahăr invertit corespunde la anumite
cantităţi de cupru.

47
Tabelul 1. Calculul conţinutului de zahăr invertit în mg după
Bertrand.
Zahăr Cu Zahăr Cu Zahăr Cu Zahăr Cu

10 20,6 33 64.8 56 105.7 79 143.7


11 22,6 34 66.7 57 107.4 80 145.3
12 24,6 35 68.5 58 109.2 81 146.9
13 26,5 36 70.3 59 110.9 82 148.5
14 28,50 37 72.2 60 112.6 83 150.0
15 30,50 38 74.0 61 114.3 84 151.6
16 32.5 39 75.9 62 115.9 85 153.2
17 34.5 40 77.7 63 117.6 86 154.8
18 36.4 41 79.5 64 119.2 87 156.4
19 38.4 42 81.2 65 120.9 88 157.9
20 40.4 43 83.0 66 122.6 89 159.5
21 42.3 44 84.8 67 124.2 90 161.1
22 44.2 45 86.5 68 125.9 91 162.6
23 46.1 46 88.3 69 127.5 92 164.2
24 48.0 47 90.1 70 129.2 93 165.7
25 49.8 48 91.9 71 130.8 94 167.3
26 51.7 49 93.6 72 132.4 95 168.8
27 53.6 50 95.4 73 134.0 96 170.3
28 55.5 51 97.1 74 135.6 97 171.9
29 57.4 52 98.8 75 137.2 98 173.4
30 59.3 53 100.6 76 138.9 99 175.0
31 61.1 54 102.3 77 140.5 100 176.5
32 63.0 55 104.0 78 142.1

48
Calculul activităţii enzimei invertaza
Activitatea invertazei sau zaharazei (Az) se exprimă în
„unităţi de activitate enzimatică” într-un dm3 vin sau suc.
Pentru aceasta cantitatea de zahăr invertit găsită după
tabelul Bertrand (Z) se recalculează la conţinutul lui în volumul
balonului cu cotă (200 cm3) şi se înmulţeşte cu 0,95 (coeficientul
de recalculare a zahărului invertit în zaharoză), şi se determină
cantitatea zaharozei (mg), care s-a supus hidrolizei. Activitatea
invertazei se determină după formula:
P ⋅1000 ⋅1000
As =
342 ⋅ t ⋅ v
unde:
P – masa de zaharoză care a fost hidrolizată [mg];
P = Plucru-Pcontrol = (Zlucru –Zcontrol) x 0,95 x 20
342 – masa moleculară a zaharozei;
t – durata inversiei [min];
v – volumul de vin [cm3].
1000 - transformarea mg în micrograme ;
1000 - recalcularea la 1 dm3.

Întrebări de control:

1. Numiţi unităţile de măsură ale enzimelor.


2. Descrieţi structura şi proprietăţile chimice ale zaharozei
şi zahărului invertit.
3. Descrieţi metodele de separare şi purificare a enzimelor.
4. Descrieţi enzima invertaza.
5. Metoda determinării invertazei.

49
Lucrarea de laborator nr. 8
Determinarea activităţii enzimei polifenoloxidaza

Pînă în prezent au fost studiate mai mult de 3000 enzime


diferite.
Enzimele se clasifică după tipul reacţiilor pe care le
catalizează şi după substraturile asupra cărora acţionează.
Denumirea enzimelor este alcătuită din trei părţi. Prima
parte indică denumirea substratului asupra căruia acţionează
enzima, a doua parte indică natura reacţiei catalizate şi a treia parte
─sufixul „aza”. De exemplu, polifenoloxidaza,
piruvatdecarboxilaza, etc. Se deosebesc numai enzimele din clasa 3
– hidrolazele, care sînt formate din denumirea substratului unit cu
sufixul „aza”. De exemplu amilaza, zaharaza, ureaza. Odată cu
denumirile raţionale se păstrează şi denumiri mai vechi: pepsina,
tripsina, papaina, etc.
După tipul reacţiei catalizate enzimele se clasifică în
următoarele 6 clase:
1. Oxidoreductazele sau enzimele, care catalizează reacţiile
de oxidoreducere (cu transfer de hidrogen sau de electroni sau prin
combinarea unui substrat cu oxigenul molecular).
2. Transferazele sînt enzimele, care catalizează reacţii de
transfer ale unor atomi sau grupări de atomi (-NH2, - CH3, -
CH2OH, - O-PO3-H2 etc.) de pe un substrat donator pe un alt
substrat acceptor.
3. Hidrolazele sînt enzime, care catalizează scindarea
hidrolitică a legăturilor esterice, glicozidice, peptidice, amidice etc.
după următorul mecanism:
R1 – R2 + H–OH → R1 – OH + R2 - H
4. Liazele catalizează reacţiile de scindare nehidrolitică a
legăturilor chimice. Se elimină molecule de CO2, H2O, NH3 etc. şi
des se formează legături duble. Liazele Catalizează şi reacţiile
inverse.
5. Izomerazele sînt enzimele care catalizează diverse reacţii
de izomerizare sau de rearanjări intramoleculare.

50
6. Ligazele sau sintetazele sînt enzime care catalizează
reacţiile de formare a legăturilor chimice între două molecule cu
ajutorul energiei cedate de substanţele macroergice (ATP, GTP,
etc.)
Fiecare enzimă are codul de patru cifre, stabilit de Comisia
de Enzimologie a Uniunii Internaţionale de Biochimie (1961).
Prima cifră indică clasa la care aparţine enzima. Şase clase
de enzime se formează în funcţie de tipul general al reacţiilor
catalizate. A doua cifră indică subclasa, referitor la natura chimică
a grupărilor la substrat, a treia cifră reflectă o subdiviziune din
aceeaşi subclasă, iar a patra – enzima concretă (numărul de ordine
al enzimei respective în subdiviziunea din interiorul subclasei).
De exemplu, enzima dehidrogenaza alcoolului (codul
1.1.1.1) este o oxidoreductază (clasa 1), acţionează asupra grupei
CHOH a donatorului de hidrogen (subclasa 1), piridinnucleotidele
(NAD+ şi NADP+) servesc ca acceptor de hidrogen (subsubclasa 1)
şi enzima este prima (a patra cifră-1) din această ultimă diviziune.

Importanţa analizei
Polifenoloxidaza (EC.1.10.3.2) este cunoscută şi sub
denumirea catecholoxidaze, o-difenoloxidaza sau, mai recent,
oxigen oxidoreductaza – enzima din grupa oxidazelor clasei
oxidoreductazelor, care transportă electronii direct la oxigen.
Polifenoloxidaza este răspîndită în plante, găsindu-se în cantitate
mai mare în special în ciuperci, tuberculi de cartofi, frunze de ceai
şi de tutun, boabe de cafea şi în diferite fructe: mere, piersici,
caise, banane, în struguri, etc. Polifenoloxidaza (PFO) are o masă
moleculară de 34000, reprezintă o proteină, ce conţine cupru (0,26
%). Ea poate cataliza oxidarea monofenolilor în difenoli
(activitatea crezolică) şi a o-difenolilor în o-chinone (activitatea
catecholazică):

51
Activitatea crezolica Activitatea catecolazica
__ __
__ R
R + 1/2 O 2
R + 1/2 O2

OH OH O
monofenol OH O
o-difenol chinona
PFO oxidează substanţele tanante (taninurile). Prin acţiunea
ei se explică brunificarea legumelor şi fructelor la uscare.
PFO are un rol important la respiraţia plantelor. După teoria
lui V.I. Paladin sistema polifenol-chinonă are un rol însemnat în
calitate de verigă intermediară la oxidarea diferitelor substanţe
organice în procesul respiraţiei plantelor.
Participarea PFO în acest proces poate fi redată prin schema
următoare:
Compus redus o-chinona
R H2O

OH
OH + 1/2 O2
Compus oxidat o-difenol
Aşadar o cantitate mică de polifenol şi chinonă respectivă
poate de multe ori să fie supusă variabil oxidării şi reducerii.
Sistema PFO, polifenolilor şi chinonilor respectivi, poate
oxida acidul ascorbic în materia primă alimentară. Această situaţie
se ia în considerare la prelucrarea fructelor, legumelor şi
strugurilor, care conţin acid ascorbic.
Materia primă vegetală (fructe proaspete tăiate, legume şi
struguri) în contact cu oxigenul din aer se îmbrunează din cauza
52
polimerizării oxidative a chinonelor formate din mono- şi difenoli.
Pentru inactivarea PFO şi prevenirea formării chinonelor se
foloseşte tratamentul termic (de exemplu, blanşarea fructelor) sau
chimic – cu SO2 sau cu K2S2O5 etc.
Principiul metodei
Metoda determinării polifenoloxidazei se bazează pe
proprietatea ei de a oxida pirocatehina în orto-chinonă. Orto-
chinona oxidează acidul ascorbic. Anume acidul ascorbic rămas în
mediu de reacţie se determină cantitativ prin metoda de titrare cu
0,02 n soluţie de iod.

o-chinona

Acidul ascorbic H2O

OH
Acidul dehidroascorbic + 1/2 O2
OH
pirocatehina
Prin această metodă se determină activitatea
polifenoloxidazei numai în primele 2 minute de acţiune asupra
substratului.
Aparate, vase şi materiale:

ƒ patru baloane conice de 100 cm3;


ƒ mojar cu pistil;
ƒ pîlnie din sticlă;
ƒ balon cotat de 50 cm3;
ƒ pipete Mor 5 cm3, 10 cm3;
ƒ patru pipete gradate 2 şi 5 cm3;
53
ƒ soluţie de substrat: se dizolvă 100 mg acid ascorbic în 100
cm3 apă distilată;
ƒ soluţie 0,02 n pirocatechină, (2,2 g în 1 dm3);
ƒ soluţie 10 % acid fosforic (orto sau meta) ;
ƒ soluţie 0,02 n soluţie de iod;
ƒ soluţie 1 % amidon;
ƒ amestec tampon (aparte se dizolvă 11, 867 g de Na2HPO4
x 2 H2O într-un dm3 apă distilată şi 9,078 g de KH2PO4 într-un dm3
apă distilată) Amestecînd volume egale de soluţie obţinem
amestecul tampon cu pH-6,8) ;
ƒ materie vegetală (mere, cartofi, struguri);
ƒ cîntar tehnic.

Ordinea îndeplinirii lucrării

Pentru a obţine extractul de enzime din materia primă


vegetală de cîntărit 5 g de produs cu balanţa tehnică (precizia de
0,01 g). De transferat proba în mojarul de porţelan şi de mărunţit cu
pistilul. Extracţia enzimelor se efectuează cu cantităţi mici de apă
distilată. Conţinutul mojarului se transferă cantitativ într-o pîlnie cu
filtru din materie instalat într-un balon cotat de 50 cm3. Conţinutul
balonului se aduce pînă la cota 50 cm3 cu apă şi se agită.
În patru baloane conice se dozează cîte 5 cm3 de filtrat şi
cîte 10 cm3 de H2O. Două baloane se încălzesc pînă la fierbere şi se
fierb 2 minute pentru inactivarea enzimei (probele de control), apoi
se răcesc. Probele (de control şi lucru) se aduc la temperatura 25oC.
În fiecare balon se adaugă cîte 5 cm3 soluţie-tampon (cu pH-ul 6,8),
cîte 2 cm3 soluţie pirocatehină, cîte 5 cm3 soluţie acid ascorbic şi
baloanele se omogenizează timp de 2 minute. În fiecare balon se
adaugă cîte 1 cm3 soluţie 10 % acid fosforic şi se titrează cu 0,02 n
soluţie de iod în prezenţa 1 cm3 soluţie 1 % amidon. Se notează
volumul de iod consumat la titrare.
Deoarece 1 cm3 soluţie de 0,02 n iod este echivalent la
1,76 mg sau 10 µmol de acid ascorbic, activitatea PFO ce

54
corespunde unui gram de produs, exprimată în unităţi de
„activitatea enzimatică” se calculează după formula:
(Vc-Vl) x 10 x 10
APFO = = (Vc-Vl) x 10
5x2 ,
unde:
Vc – volumul soluţiei 0,02 n iod, care s-a consumat la
titrarea a 5 cm3 soluţie de control;
Vl – volumul soluţiei 0,02 n iod, care s-a consumat la
titrarea a 5 cm3 soluţie de lucru;
10 – numărul de µmol de acid ascorbic;
10 – gradul de diluare a probei;
5 – volumul filtratului, cm3 ;
2 - durata acţiunii enzimei, minute.

Întrebări de control:

1. Nomenclatura şi clasificarea enzimelor.


2. Caracteristica enzimei PFO.
3. Este posibilă oxidarea acidului ascorbic cu PFO în lipsa
polifenolilor?
4. Pe ce se bazează metoda determinării activităţii PFO?
5. Chimismul determinării activităţii PFO.

55
Lucrarea de laborator nr. 9

Determinarea activităţii enzimei lacaza

Lacaza (oxigenreductaza E.C. 1.10.3.1.) este o enzimă de


origine fungică secretată de mucegaiul Botrytis cinerea, care în
unele condiţii infectează struguri. Lacaza ca şi polifenoloxidaza
este o cuproproteidă dar are un spectru de acţiune mult mai larg,
oxidînd orto- şi para-difenolii, antociane şi acidul ascorbic din must
şi vin. Oxidarea directă a antocianelor este cauza principală a
degradării rapide a culorii vinurilor roşii (casarea oxidazică).
Tratarea mustului şi vinului cu bentonită şi SO2 puţin reduce
activitatea lacazei.
Determinarea lacazei în bobiţe, struguri şi vinuri,
cunoaşterea caracteristicilor fizico-chimice ale acestei enzime
(temperatura optimă, pH-ul optim, constantele, inhibitorii, etc.)
permit de a acţiona asupra proceselor de vinificaţie. Lacaza
denaturează în 10 minute prin încălzirea mustului, vinului la
temperatura 45 oC. Temperatura de 75 oC inactivează lacaza
complet.

Metodele de determinare a lacazei

Sînt utilizate două tipuri de metode:


•metode colorimetrice, utilizînd substraturi sensibile, care
formează după oxidare compuşi coloraţi, determinaţi prin
spectrofotometrie;
•metode polarografice, utilizînd electrozi specifici de
oxigen pentru determinarea cantitativă a oxigenului consumat din
mediu pe parcursul oxidării unui substrat specific de către enzimă.

56
Determinarea colorimetrică a activităţii lacazei

Principiul metodei

Siringaldazina (4-hidroxi-3,5-dimetoxibenzaldehid azin)


este substratul specific utilizat care prezintă o formă redusă
fenolică, incoloră sau pînă la galben pal, care după oxidare cu O2
formează o chinonă, care se condensează formînd un compus
colorat roşu– violet, apariţia cărui-a poate fi urmărită la
spectrofotometru la λ=530 nm (coeficientul de extincţie molară ε =
65000). Chimismul reacţiei:
H3CO- - OCH3

HO- - HC=N - N=CH - -OH


-2H+,-2e-
H3CO - - OCH3
Forma redusa fenolica (incolora pina la galben pal)

H3CO- - OCH3

O= =HC-N=N-CH= =O

H3CO- - OCH3
Forma oxidata chinonica (rosu-violet)

Exprimarea rezultatelor

O unitate de activitate a lacazei corespunde cantităţii


enzimei care catalizează oxidarea unui nanomol (10-9) de
siringaldazina în minut în condiţiile de reacţie (temperatura 20 oC,
pH=5, 1cm3 probă prealabil diluată pentru 3 cm3 de amestec
reactiv, λ =530 nm; cuva = 1 cm, ε = 65000).

57
Notă: metodele colorimetrice necesită de a lucra cu soluţii
destul de limpezi şi incolore la start. Ele pot fi rezervate pentru
lucrul în soluţii pure (pentru determinarea pH-lui optim, Km şi
Vm) sau în cazul mustului din struguri, pentru determinări în „must
decolorat”.

Determinarea activităţii lacazei în soluţii pure


Determinările pH-ului optim şi constantelor cinetice (Km şi
Vm) necesită utilizarea unei enzime deja purificate.
Deci, studiul pH-ului optim va fi efectuat cu Lacaza din
Pyricularia oryzæ (disponibilă în comerţ) şi nu din Botrytis
cinerea.
PH-ul optim:
Măsurările sînt efectuate la 20 o C (temperatură ambiantă)
într-o soluţie apoasă de lacază pură (EC.1.10.3.2.), determinările la
λ =650 nm.
Într-o cuvă de sticlă (1 cm3) curată şi uscată se introduc
succesiv:
1,4 cm3 soluţie-tampon citrat - fosfat 0,1 M;
0,6 cm3 soluţie siringaldazină de 60 mg/l.
Se agită printr-o returnare pentru omogenizare (de a evita
contactul amestecului cu degetele, utilizînd parafilm pentru a
închide cuva).
Cuva se instalează în spectrofotometru, capacul se lasă în
jos şi se reglează la indicaţia „0” (zero). Se programează 15 minute
la cronometru.
Din soluţia analizată de lacază se ia cu exactitate 1 cm3.
Foarte rapid acest volum se introduce în cuva de măsurat, (fără a o
scoate din spectrofotometru), în acelaşi moment se deschide
cronometrul (timpul zero). Amestecul reacţionat se agită prin
returnare (scotînd cuva din spectrofotometru şi utilizînd parafilm
pentru a închide cuva) şi apoi cuva se reinstalează rapid în aparat.
Capacul se lasă jos.

58
Notă: valoarea extincţiei trebuie să fie deja diferită de
indicaţia zero iniţială.
De notat pentru fiecare probă variaţia extincţiei în fiecare
minut, timp de 8 minute (după ce aparatul a fost reglat la "zero" în
timpul zero)
Determinările se efectuează cu fiecare din soluţiile tampon
propuse: tampon citrat – fosfat 0,1 M, pH-3; 4; 5; 6 şi 7.

Rezultate

1.Cinetica
Trasa-ţi pe aceiaşi foaie de hîrtie milimetrică curbele
reprezentative a cineticii de oxidare a siringaldazinei: Extincţia =
= f (timpul) pentru diferite valori a pH-lui în soluţiile tampon
analizate. (Se va lua ca unitate pentru axa absciselor 25 cm = 10
minute).
2. Vitezele iniţiale
Determinaţi pantele curbelor, exprimate în ∆
extincţie/minut. Aceste pante corespund vitezelor iniţiale de
oxidare enzimatică.
Trasa-ţi curba ∆ Extincţie /minut = f (pH).
Analizaţi această curbă. La ce concluzii aţi ajuns?
Notă: toate rezultatele experimentate şi calculele trebuie să
fie prezentate în formă de tabel.

Determinare activităţii lacazei în must şi struguri


Alte tipuri de polifenoloxidaze se găsesc în struguri sănătoşi
(în particular tirozinaza), această determinare implică utilizarea
unui substrat specific de Lacază.
În cazul determinării colorimetrice:
De asemenea este obligatoriu de a elimina în prealabil (fără
a denatura enzima) compuşii fenolici din mediu (taninuri,
antociani) din cauza rolului de inhibitor la oxidarea siringaldazinei.

59
Această eliminare se va face prin tratarea mustului cu o răşină
absorbantă : polivinilpolipirolidonă (PVPP).

Ordinea îndeplinirii lucrării

a) Eliminarea compuşilor fenolici:


Într-un balon conic Erlenmeyer de 50 cm3 care conţine 0,8 g
PVPP, se dozează 10 cm3 suc (limpezit la necesitate) sau must, se
agită energic (aproximativ 1 minut) şi se lasă în contact 10 minute,
se filtrează cu vid (filtrul Millipore), recuperînd filtratul (care
trebuie să fie decolorat) într-un tub prevăzut pentru acest scop.
Aşadar, se obţine prima probă de „suc decolorat”, care va fi
diluată, la necesitate, pentru determinarea activităţii.

b) Determinarea activităţii Lacazei:


Măsurările se vor efectua la spectrofotometru Spectronic 20,
temperatura 20 oC şi λ =530 nm. Într-o cuvă de 1 cm, curată şi
uscată, se dozează:
92,8 cm3 soluţie-tampon acetat pH=5,0;
91,2 cm3 soluţie de substrat (siringaldazină de 60 mg/l).
Soluţia se agită prin returnare pentru omogenizare (fără a pune
degetele în contact cu amestecul, utilizînd o bucăţică de peliculă
mică de peliculă de film pentru a închide cuva).
Cuva se instalează în spectrofotometru, se lasă în jos
capacul şi se reglează la indicaţia „0”. Se programează 15 minute la
cronometru.
Din proba analizată (suc decolorat, prealabil diluat) se ia cu
exactitate 2 cm3.
Acest volum se dozează foarte rapid în cuva (fără a scoate
cuva din spectrofotometru),în acelaşi moment se deschide
cronometrul(timpul zero).Amestecul reactiv se agită rin returnare
(scoţînd cuva din spectrofotometru şi utilizînd parafilm pentru a
închide cuva) şi apoi cuva se reinstalează rapid în aparat. Capacul
se lasă jos.

60
Notă: valoarea extincţiei trebuie să fie deja mai mare de
„0”, care este valoarea iniţială. Se notează valoarea extincţiei în
timp (8 minute).

c) Rezultate:

1. Cinetica
Trage-ţi Pe aceia-şi foaie de hîrtie milimetrică curbele
reprezentative a cineticii oxidării siringaldazinei:
Extincţia = f (timpul) pentru diferite probe examinate. (De
luat ca unitate pentru axa absciselor 25 cm = 10 minute).

2. Vitezele iniţiale
De determinat pantele curbelor, exprimate în
extincţie/minut. Aceste pante corespund la vitezele iniţiale de
oxidare enzimatică.
Transforma-ţi aceste rezultate în „unităţi de activitate”
considerînd că, în condiţiile de măsurări utilizate, o soluţie de 1
µmole de siringaldazină pe litru (1µM) reprezintă o extincţie de
0,065 (ε = 65000, l = 1 cm). (P.M. siringaldazină = 360)

3. Comparaţi activităţile Lacazei pentru diferite probe


analizate. Ce a-ţi putea spune despre gradul de contaminare cu
Botrytis cinerea.?

Determinarea polarografică a activităţii lacazei

Principiul metodei

Cu ajutorul unui electrod specific la oxigen (electrodul lui


CLARC), se măsoară consumul de O2 a unei probe în prezenţa unui
reactiv, ce conţine un substrat fenolic specific lacazei (cu excepţia
siringaldazinei, de exemplu: hidroxichinona sau altul), asociat cu
un ihibitor specific „tirozinazei”.

61
În rezultat, dacă lacaza se conţine numai în boabele
contaminate de Botrytis cinerea, boabele strugurilor sănătoşi conţin
în mod normal o altă fenoloxidază: tirozinaza (EC 1.10.3.1.),
capabilă de a oxida un număr mare de compuşi monofenolici şi
orto-difenolici şi care trebuie, deci, să fie inhibaţi în timpul
măsurării activităţii numai a lacazei.
Electrodul polarografic

Cînd se aplică o diferenţă de potenţial negativă de 0,6-0,8 V


între un electrod inert (aur sau platină) şi un electrod de referinţă
(de calomel ori Ag/AgCl) într-o soluţie neutră de KCl, oxigenul
dizolvat este redus la suprafaţa catodului. Curentul calibrat în
raport cu oxigenul dizolvat este înregistrat. Acest curent este
proporţional presiunii parţiale a oxigenului dizolvat („presiunea
oxigenului”).
Cînd catodul, anodul şi electrolitul sînt separaţi de mediu
printr-o membrană plastică, permeabilă pentru gaze, dar
impermeabilă pentru majoritatea ionilor, rezistenţa esenţială la
transferul de masă se datorează în special membranei, ceea ce
permite măsurarea „presiunii oxigenului” în diverse lichide.

Reacţia la catod: O2 + 2 H2O + 2 eֿ → H2O2 + 2 OH⎯


62
H2O2 + 2 eֿ → 2 OH⎯

Reacţia la anod: Ag + Cl-→ AgCl + eֿ


Reacţia sumară:
4Ag + O2 + 2 H2O + 4Cl → 4AgCl + 4OH⎯

Fiindcă O2 este rapid consumat la catod, se poate de


considerat, că presiunea O2 (Po2) asupra membranei este nulă, deci,
forţa responsabilă de difuzie a O2 prin această membrană este
proporţională cu Po2 în exteriorul membranei. Dacă Po2 creşte, se e
difuzează mai mult O2 prin membrană şi un curent mai mare
traversează detectorul; o presiune Po2 mai joasă va corespunde la
un curent mai slab.
Exprimarea rezultatelor
O unitate de activitate a lacazei corespunde cantităţii de
enzimă care catalizează consumul a 100 µg de oxigen într-o minut
la 1 litru must, în condiţiile experienţei (temperatura 35 oC; pH= 5;
4 cm3 probă prealabil diluată pentru 20 cm3 amestec reactiv saturat
cu oxigen).

Întrebări de control:
1. Caracteristica lacazei.
2. Explicaţi metoda colorimetrică a activităţii lacazei.
3. Explicaţi metoda polarografică a activităţii lacazei.
4. Cum se determină lacaza în soluţii pure şi must de
struguri?
5. Tehnica securităţii la determinarea lacazei.

63
Lucrarea de laborator nr. 10

Determinarea activităţii catalazei


după A. Bah şi A.Oparin

Oxidoreductazele după mecanismul de acţiune se clasifică


în trei grupe:
¾ Dehidrogenaze anaerobe şi aerobe, care sînt enzime
transportoare de hidrogen;
¾ Citocromi, care sînt enzime transportoare de electroni;
¾ Oxidaze, enzime care catalizează reacţiile de oxidare a
substratului cu oxigenul molecular sau cu oxigenul peroxidic.

Oxidazele se împart în trei subgrupe:


• Oxigenaze
• Hidroxilaze
• Oxidaze transportoare de electroni.

Oxigenazele – catalizează reacţiile de combinare a


substratului cu oxigenul molecular (cu ambii atomi din moleculă):
AH + O2 AOOH; sau A + O2 AO2

Hidroxilazele – enzime care oxidează substratul cu


formarea concomitentă a apei. Un atom din oxigenul molecular
participă la oxidarea substratului, iar alt atom la formarea apei:
AH2 + S + O2 A + SO + H2O
unde: AH2 – donator de hidrogen;
S – substrat;
A – donator liber;
SO – substrat oxidat.

Oxidazele transportoare de electroni conţin în molecula sa


ioni metalici şi catalizează reacţia de oxidare a substratului cu
ajutorul oxigenului atomic. Oxidazele se împart în două subgrupe:
64
•Cupruoxidaze, enzime care conţin cupru, din ele fac parte
fenoloxidazele, polifenoloxidazele, ascorbatoxidaza, tirozinaza etc.;
•Feroxidaze, enzime care conţin fier, din ele fac parte
peroxidazele şi catalazele.

Peroxidazele, sînt enzime cu structura heteroproteidică,


adică heminproteide, ce conţin Fe3+. Ele descompun peroxidul de
hidrogen (H2O2) numai în prezenţa unui acceptor de oxigen sau a
unui donator de hidrogen:
H2O2 + A AO + H2O;

H2O2 + AH2 2 H2O + A


Ele sînt larg răspîndite în regnul vegetal (mai ales în
rădăcinile de hrean) şi mai puţin în cel animal (lapte, salivă, ficat,
leucocite).
Peroxidazele sînt active în struguri în perioada maturării
lor. Temperatura de peste 70 oC şi dozele ridicate de SO2
inactivează sau distrug peroxidazele din must şi vin.

Catalazele sînt heminproteide, ce conţin Fe3+. Se găsesc în


toate celulele vegetale, dar pot fi secretate şi de microorganisme, în
special de bacteriile acetice. La animale se conţin mai mult în sînge
şi ficat.
Catalaza (E.C. 1.11.1.6.) are proprietatea de a descompune
peroxidul de hidrogen (apa oxigenată) în apă şi oxigen molecular.
Peroxidul de hidrogen poate fi şi donator de oxigen:

catalaza
H2O2 H2O + 1/2 O2
catalaza
2 H2O2 2 H 2O + O 2

Catalaza se inhibează de cianuri, hidrogenul sulfurat şi


fluoruri.
65
Apa oxigenată se formează la etapa finală de oxidare
biologică, cînd dehidrogenazele aerobe (flavinice) transmit
hidrogenul direct oxigenului atmosferic. Apa oxigenată (H2O2) este
toxică pentru celulele vii. Descompunînd apa oxigenată, catalaza
protejează celulele de intoxicaţii.
Catalaza este foarte sensibilă şi îşi pierde activitatea la
încălzire.
Preparatele enzimatice de catalază, obţinute din ficat de
bovine sau prin sinteza microbiană, se utilizează în industria
alimentară pentru distrugerea H2O2 rămase în urma conservării
laptelui, pasteurizării ouălor.
Principiul metodei
Determinarea activităţii catalazei se bazează pe evidenţa
apei oxigenate, descompuse de enzimă timp de 30 minute, prin
titrarea peroxidului cu permanganat de potasiu 0,1 N:

5 H2O2 + 2 KMnO4 + 4 H2SO4 5 O2 + 2 KHSO4 + 2MnSO4 + 8 H2O

Diferenţa volumelor de soluţie 0,1N KMnO4 (cm3) a probei


de control şi probei de lucru, indică cantitatea apei oxigenate
descompuse de enzimă.

Ordinea îndeplinirii lucrării

a) Pentru probe solide

Aparate, vase şi materiale:

ƒ baloane conice 100 cm3 şi 250cm3 ;


ƒ cilindru de 100 cm3;
ƒ mojar cu pistil;
ƒ pipete 5, 10 şi 20 cm3;
ƒ biuretă 25 cm3;
ƒ soluţie 1 % apă oxigenată;
ƒ soluţie 0,1N KMnO4;

66
ƒ soluţie 10 % H2SO4;
ƒ probe de produs (făină, cereale, malţ).

5 g de produs se infuză timp de 1,5 ore cu 100 cm3 apă


distilată la temperatura camerei în balon conic de 250 cm3.
Suspensia obţinută se filtrează prin hîrtie de filtru pliată.
Pentru determinare se iau două probe cîte 20 cm3 de filtrat
limpede. Conţinutul probei de control se fierbe timp de 5 minute
pentru inactivarea enzimei. În ambele probe se dozează cîte 20 cm3
apă distilată şi 3 cm3 soluţie 1 % peroxid de hidrogen şi se lasă
pentru 30 minute la temperatura de cameră. Acţiunea enzimei este
stopată prin administrarea a 3 cm3 soluţie 10 % de H2SO4, iar
restul de peroxid de hidrogen se titrează cu soluţie 0,1 n de
KMnO4.
Diferenţa volumelor de soluţie 0,1n de KMnO4 (cm3) a
probei de control şi probei de lucru, indică activitatea enzimei.
Activitatea catalazei poate fi exprimată în mg peroxid de hidrogen
sau cm3 soluţie 0,1 n KMnO4 la 1g produs analizat. 1 cm3 soluţie
0,1n KMnO4 corespunde 1,7 mg peroxid de hidrogen.

Activitatea catalazei (Ac) în mg H2O2/g x 30 min se


determină după formula:

(a-b) x 1,7 x 5
Ac =
n
unde:
a – volumul soluţiei 0,1N KMnO4 pentru titrarea probei de
control, cm3;
b - volumul soluţiei 0,1N KMnO4 pentru titrarea probei de
lucru, cm3;
5 – recalcularea la volumul extractului
1,7 – mg H2O2 echivalente 1cm3 0,1N KMnO4;
n- masa probei, g.

67
b) pentru probe lichide

Aparate, vase şi materiale:

ƒ soluţie 1 % de apă oxigenată, prealabil neutralizată cu


soluţie 0,1n NaOH;
ƒ soluţie 0,05 n de KMnO4;
ƒ soluţie 10 % de H2SO4;
ƒ probe de produs (vin, suc).

În 4 baloane conice cu dop rodat de 100 cm3 se adaugă cîte


3
10 cm de vin sec. Două probe ( de control) se fierb 5 minute cu
răcitor invers pentru inactivarea enzimei. În două probe de lucru şi
în cele de control se adaugă cîte 10 cm3 de apă distilată şi cîte 3
cm3 soluţie 1% de H2O2, preventiv neutralizată cu soluţie 0,1n
NaOH şi se lasă în repaus 30 minute la temperatura camerei. Apoi
în toate probele se adaugă cîte 5 cm3 soluţie 10 % H2SO4, se agită
bine şi se titrează cu soluţie 0,05 n KMnO4. Titrarea continuă pînă
cînd apare culoare roză stabilă 5 secunde.
Activitatea catalazei se exprimă prin cantitatea de peroxid,
descompusă de enzimă timp de 30 minute, care se conţine în 1 cm3
de vin.

Activitatea catalazei se determină după formula:

(a-b) x 0,85
Ac =
n
unde:
a – volumul soluţiei 0,05 n de KMnO4 pentru titrarea probei
de control, cm3;
b - volumul soluţiei 0,05 n de KMnO4 pentru titrarea probei
de lucru, cm3;
0,85 – mg de H2O2 echivalente cu 1cm3 0,05 n de KMnO4;
n - volumul vinului analizat, cm3.
68
Întrebări de control:

1. Caracteristica oxidoreductazelor, oxidazelor.


2. Explicaţi de ce catalazele se referă la oxidaze.
3. Importanţa catalazelor şi peroxidazelor pentru
organismele vii.
4. Descrieţi metodele de determinare a catalazei în produse
solide şi lichide.

69
Lucrarea de laborator nr. 11

Determinarea părţii de masă a amidonului

În prezent toate polizaharidele convenţional se împart în


două grupe: oligoglucide (oligozide) şi polizaharide superioare
(poliozide sau poliglucide).
Din oligozide fac parte ozidele cu o masă moleculară relativ
mică, care conţin 10-20 resturi de monoze. Poliozidele sînt
substanţe macromoleculare cu un număr mare de resturi de monoze
(de la cîteva zeci pînă la cîteva mii), şi alte substanţe, care, nu fac
parte din glucide, numite agliconi. Cele mai importante din ele sînt
poliozidele vegetale: amidonul, celuloza, hemicelulozele, inulina,
substanţele pectice etc., şi poliozidele de origine animală:
glicogenul şi aşa-numitele mucopoliglucidele (acizii hialuronic,
condroitinsulfuric, heparina şi altele).

Importanţa analizei:

Un rol important ca substanţă de rezervă în plante îl are


amidonul, la fel şi glicogenul - atît pentru om cît şi pentru animale.
Amidonul reprezintă o poliglucidă de rezervă cu formula
(C6H10O5)n, care se depozitează sub formă de granule (de la 2 pînă
la 150 µm) în tuberculi, seminţe, frunze, rădăcini şi chiar în părţile
lemnoase ale plantelor. Granulele de amidon la diferite specii se
deosebesc după dimensiuni, formă, componenţa chimică şi
proprietăţi, ce serveşte ca metoda determinării provenienţei fainei.
Amidonul este un praf, insolubil în apă rece, alcool şi eter. În apă
caldă se umflă formînd geluri.
Amidonul este constituit din 3 % substanţe minerale, acizi
graşi şi 97 % amiloză, amilopectină.
Amiloza este o poliglucidă liniară care conţine 200 – 1000
resturi de α – D – glucopiranoză, unite prin legături glicozidice de
tipul α –1,4 în lanţ liniar (masa moleculară variază pînă la 30.000 –

70
1000.000 unităţi). Caracteristica amilozei şi amilopectinei este
prezentată în tabelul 1.

Caracteristica amilozei şi amilopectinei. Tabelul 1.


Amiloza Amilopectina
Structura Polimer al α – D – Polimer al α – D – Glp
chimică Glp format prin format prin legătura
legătura α (1→4) α(1→4) şi α(1→6)
Forma Neramificată Ramificaţia la fiecare 20
moleculei de resturi
Reacţia cu Culoarea albastră Culoarea albastru–violet
I2
Masa 100 – 900 de mii Pînă la 20*106
moleculară
Solubilitate Solubilă în apa caldă, Se dizolvă la temperaturi
a formează soluţii cu înalte, formează soluţii
viscozitatea relativ cu viscozitate înaltă, se
joasă, nu se gelifică gelifică.
Stabilitatea Instabile Stabile
soluţiilor

Structura macromoleculei de amiloză:

71
Structura macromoleculei de amilopectină:

Amiloza în apă caldă formează o dispersie coloidală (dar nu


formează geluri). Amiloza se colorează cu iodul în albastru.
Molecula amilopectinei este puternic ramificată. Este
alcătuită din 600 – 6000 resturi de α – D – glucopiranoză, legate
între ele prin legături α –1,4 şi după 25-30 resturi de glucoză apare
o ramificare cu legătura glucozidică de tipul α –1,6. Masa
moleculară a amilopectinei este cuprinsă între 100 000 şi 1 000 000
unităţi sau zeci de milioane unităţi. De exemplu, în componenţa
amidonului de cartofi se conţin fracţii de amilopectină cu masa
moleculară mai mare de 70 mln. unităţi. Amilopectina nu se
dizolvă în apă rece. Cu iodul se colorează în albastru-violet. În apă
caldă formează un sistem dispers stabil cu viscozitate mare
(cleister).
Principalele tipuri de materie primă care conţin amidonul
sînt cartofii, cerealele şi produsele de prelucrare a lor (crupele,
făina). Conţinutul amidonului în cartofi în mediu constituie 17,5 %
(sau 70-80 % din masa uscată), în seminţele cerealelor 40-80 %
din masa uscată.
Amidonul uşor hidrolizează în prezenţa acizilor minerali
(chiar diluaţi), pînă la glucoză:

72
+ n H2O
(C6H10O5)n dextrine nC6H12O6
Acid Acid
mineral mineral

Hidroliza amidonului este catalizată şi de enzimele α- şi β-


amilaze, care se conţin în malţ şi în salivă. Produsul final al acestei
hidrolize enzimatice este maltoza:

amilaze amilaze
amidon dextrine maltoza

Amidonul la 96,1 –97,7 % este format din polizaharide, care


la hidroliza acidă formează glucoza. De aceea metodele existente
de determinare cantitativă a amidonului se bazează pe proprietăţile
glucozei de reducere, activitatea optică etc.
Din cele mai răspîndite metode de determinare a amidonului
pot fi numite: polarimetrice, colorimetrice, chimice, gravimetrice.
În industria fermentativă de producere a amidonului şi
melasei, în alte ramuri ale industriei alimentare sînt răspîndite
metodele polarimetrice (metodele Evers, Lintner, Arhipovici).
Metoda Evers este metoda standard de bază pentru
determinarea amidonului la aprecierea calităţii cerealelor şi
produselor de prelucrare a lor. Pentru determinarea conţinutului de
amidon în materia primă vegetală prin această metodă este necesar
în prealabil de transferat amidonul în stare solubilă şi de hidrolizat
pînă la glucoză, ce se realizează prin tratarea produsului analizat cu
acid clorhidric sau cu clorură de calciu. Pentru a înlătura
substanţele însoţitoare (care împiedică determinarea), îndeosebi
proteinele, şi pentru a limpezi hidrolizatul, soluţia este tratată cu
unul din reactive – precipitante, care pot fi: acidul
dodecawolframofosforic, acidul picric, molibdatul de amoniu,
reactivul Karrez (un amestec de soluţii ale sărurilor ferocianurii (II)

73
de potasiu şi sulfatului de zinc). Soluţia transparentă se
polarimetrează.
Aparate, vase şi materiale:
ƒ zaharimetru universal CУ-3;
ƒ cîntar tehnic;
ƒ baia de apă;
ƒ 2 baloane cu cotă de 50 cm3;
ƒ baloane conice de 250 cm3;
ƒ cilindre de 25 cm3;
ƒ pipete de 2, 5, 10, 25 cm3;
ƒ pîlnie din sticlă;
ƒ filtru de hîrtie;
ƒ soluţie 0,31n de HCl (sau soluţie cu concentraţia 1,124%);
ƒ soluţie 25 % HCl;
ƒ reactivul Karrez I: (15g [K4Fe (CN)6]3 X 3 H2O cu
eroarea ± 0,01 g, se dizolvă în balon cotat 100 cm3 şi se aduce cu
apă distilată pînă la cotă);
ƒ reactivul Karrez II: (30g ZnSO4 X 7 H2O cu eroarea ±
0,01 g, se dizolvă în balon cotat 100 cm3 şi se aduce cu apă distilată
pînă la cotă).
Reactivul Karrez I şi II pot fi înlocuite cu soluţie 2,5 %
molibdat de amoniu sau soluţie 4 % de acid
dodecavolframofosforic;
ƒ produse pentru analiză: făină, crupe şi cereale măcinate.

Ordinea îndeplinirii lucrării


Proba de lucru. Într-un balon cotat uscat de 50 cm3 se
dozează cu cilindru 15 cm3 soluţie 0,31 n de HCl. Cu ajutorul
pîlniei se administrează agitînd permanent 2,5 g de produs analizat
(făină, crupe, etc). Pîlnia şi gîtul balonului se clătesc cu 10 cm3
soluţie 0,31 n de HCl.
Conţinutul balonului se menţine 3 minute în baia de apă la
temperatura fierberii, agitînd permanent. Apoi încălzirea în baia de
apă se prelungeşte 12 minute. Balonul se scoate din baia de apă şi
repede se răceşte sub robinet pînă la ot = 20 oC.

74
Pentru a precipita proteinele şi a limpezi soluţia în balon se
adaugă cu cilindrul reactivul – precipitant: cîte 1 cm3 soluţie Karrez
I şi II. După 5 minute conţinutul balonului se aduce cu apă distilată
pînă la cota 50 cm3. Soluţia se agită şi se filtrează prin hîrtie de
filtru pliată într-un balon conic uscat. Primele porţii de filtrat (pînă
la 5-10 cm3) nu se folosesc. Cu filtratul limpede la ot = 20 oC se
umple tubul de polarizare cu lungimea 2 dm. Se determină unghiul
de rotaţie a planului de polarizare la zaharimetru CУ-3.
Concomitent se pregăteşte proba de control pentru a
introduce corecţie la substanţele solubile în apă optic active care,
nu precipită cu reactivul precipitant şi se găsesc în soluţie (în
special glucidele).
Pentru proba de control se cîntăreşte 5 g de produs, care se
transferă în balonul cotat de 50 cm3, se adaugă 30 cm3 apă distilată
şi se agită timp de 15 minute. Pîlnia şi gîtul balonului se clătesc cu
10 cm3 apă distilată şi soluţia se decolorează cu reactivul–
precipitant Karrez I şi II ca în proba de lucru. Timp de 5 minute
conţinutul balonului se agită şi se aduce cu apă distilată pînă la cota
50 cm3, se filtrează. Se măsoară cu cilindrul 25 cm3 de filtrat
limpede, se transferă într-un balon cotat de 50 ml şi se adaugă
1 cm3 soluţie 25 % HCl, se menţine 15 minute în baia de apă la
fierbere, apoi se răceşte sub robinet pînă la ot = 20 oC şi se aduce
pînă la cotă cu apă distilată. Cu filtratul limpede la ot = 20 oC, se
umple tubul de polarizare cu lungimea 2 dm. Se determină unghiul
de rotaţie a planului de polarizare la zaharimetru CУ-3.
Conţinutul amidonului se calculează după formula:
(α − α ) × 100 × 100 × 50
C = l 20 c ,
[α ]D × m × l × (100 − W )
unde:
C – partea de masă a amidonului (%) în substanţe uscate;
αl– mărimea unghiului de rotaţie a planului de polarizare
obţinut de substanţele optic active în experienţa de bază, în grade a
zaharimetrului ;

75
αc – mărimea unghiului de rotaţie a planului de polarizare
obţinut de substanţele solubile în apă optic active (nu de amidon) în
proba de control, în grade a zaharimetrului;
(αl - αc) – mărimea unghiului de rotaţie a planului de
polarizare obţinut de proba de amidon dizolvată, în grade a
zaharimetrului;
m – masa (2,5 g) produsului analizat, g;
l – lungimea tubului de polarizare, dm;
[α] D20 – capacitatea de rotaţie spicifică a amidonului din
produsul analizat, în grade;
W – conţinutul de masă a umidităţii în produsul analizat, %.
De obicei pentru a calcula conţinutul de masă a amidonului
se utilizează tabelul 1, unde sînt date mărimile capacităţii de rotaţie
specifică [α] D20 pentru diverse produse ce conţin amidon şi
coeficientul Evers (F, egal cu 1000/[α]D20), pentru diverse produse
ce conţin amidon.
Capacitatea de rotaţie specifică [α] D20 pentru diverse
produse ce conţin amidon. Tabelul 1.
Amidon [α] D20 F
Orez 176,7 5,66
Grîu 177,5 5,64
Porumb 177,5 5,64
Cartofi 181,2 5,50

Întrebări de control:
1. Structura şi proprietăţile amilozei.
2. Structura şi proprietăţile amilopectinei.
3. Hidroliza amidonului.
4. Metodele principale de determinare a amidonului în
produse vegetale.
5. Care este principiul de determinare a amidonului în
metodele polarimetrice ?
6. Ce reprezintă coeficientul Evers ?

76
Lucrarea de laborator nr. 12

Determinarea fotocolorimetrică a vitaminei C

Vitamina C sau acidul ascorbic este cea mai răspîndită


vitamină în regnul vegetal şi poate fi sintetizată de toate animalele
excepţie fiind omul, primatele şi cobaiul.
Insuficienţa în hrană a vitaminei C duce la oboseală, dureri
de dinţi. Lipsa în organism este determinată de apariţia scorbutului.
Boala se manifestă prin inflamarea şi sîngerarea gingiilor,
insuficienţă cardiacă şi apariţia de hematoame.
Necesitatea zilnică pentru om este de 50-100 mg.
Conţinutul vitaminei C este mai mare în fructe şi frunze, în cantităţi
mai mici se conţin în rădăcini şi în cantităţi minime de tot în
organismele animale (tab.1).

Conţinutul de acid ascorbic


în produse vegetale (mg -% sau mg/100 g de produs) Tabelul 1
Produsul Conţinutul de Produsul Conţinutul de
vegetal acid ascorbic vegetal acid ascorbic
Coacăză
Ardei verde 100-400 100-400
neagră
Pătrunjel 150 Lămîi 40
Mărar 100-150 Mere 3-17
Varză albă 30-50 Vişine 15
Măcriş 40-60 Struguri 3-12
Măceşul de
Cartofi 20-30 2000-4500
nord
Ceapă verde 30 Nuci verzi 3000
Tomate 20-25 Cătină albă 100-400
Mazăre Cetină de
25 150-200
verde brad şi pin
Acidul ascorbic participă activ în procesele de oxidare şi
reducere care au loc în celula vie. Acesta se datorează sistemului

77
(acid ascorbic - acid dehidroascorbic) care are rol de reglare a
potenţialului redox din celule, contribuind la transportul
hidrogenului. Prin oxidare lentă vitamina C se transformă în acid
dehidroascorbic:

O=C O=C
+
HO - C -2 H O=C
O O
HO - C + 2 H+ O=C

HC HC

HO - C - H HO - C - H

CH 2 O H CH 2 O H
acid L-ascorbicacid L-dehidroascorbic
În plantele crucifere (varză, ridiche de iarnă, ridiche de lună
etc.) alături de acidul ascorbic liber se conţine forma (complexul)
asociată, numită a s c o r b i n o g e n.
Structura lui poate fi redată prin formulele următoare:
O
C
O
HC CH
O
- CH 2 - C C-OH
O
HC
NH
HO - C - H

CH 2OH

78
O
C
O
CH2 - C CH
O
HC C-O H
O
H C
NH
HO - C - H

CH 2 O H

Această substanţă în prezenţa acidului clorhidric uşor se


hidrolizează formînd acidul ascorbic liber. Hidroliza
ascorbinogenului are loc în tubul digestiv.

Proprietăţile chimice ale acidului ascorbic

Vitamina C aparţine acizilor deşi în structura sa lipseşte


gruparea carboxilică – COOH. Vitamina C este lactona unui acid
hexonic şi caracterul acid se datorează grupei –OH enolice de la
C3. De aceea cu baze diluate acidul ascorbic formează săruri.

O C O C

C - OH C O
NaOH
O + O + H2O
C - OH C - O Na

HC HC

HO - C - H HO - C - H

CH2OH CH2OH
Ascorbinat de sodiu
Acidul ascorbic uşor reduce iodul, 2,6–
diclorfenolindofenolul şi alţi oxidanţi.
79
O C O C

C - OH C O
O + I2 O + 2 HI
C - OH C O

HC HC

HO - C - H HO - C - H

CH2OH CH2OH
În prezenţa oxidanţilor mai puternici, îndeosebi în mediul
neutru şi bazic, acidul ascorbic trece ireversibil în acid oxalic şi
treonic:
O C O C COOH COOH
acidul oxalic
C - OH O C O H2O C O O COOH
O O +
C - OH C O C O H2O
COOH

HC HC H-C-OH H-C-OH
HO - C - H HO - C - H HO - C - H HO - C - H
CH2OH CH2OH CH2OH CH2OH
acidul 2,3-diceto-L-gulonic acidul treonic

Vitamina C este foarte instabilă, se distruge în mediul


neutru şi bazic la temperatura 20 oC, este mai stabilă în mediul
acid. Conţinutul în acid ascorbic scade mult la conservare şi
fierberea alimentelor. Uşor se distruge în prezenţa luminii şi
oxigenului, cationilor metalelor grele şi mai repede în prezenţa
enzimelor din clasa oxidoreductazelor (ascorbatoxidazei,
polifenoloxidazei). Conţinutul în acid ascorbic se micşorează mult
în procesul păstrării materiei prime alimentare.

Principiul metodei
Acidul ascorbic se extrage din materialul analizat cu acid
oxalic. După filtrarea extractului (cu pH-ul 3-4) se titrează cu
soluţie de 0,001n 2,6-diclorfenolindofenol. Ultimul este un oxidant

80
selectiv şi reacţionează cu acidul ascorbic, dar nu reacţionează
asupra zahărului şi a altor substanţe reducătoare.
Cl Cl
+
O H
N ONa O N OH + Na

Cl Cl
2,6-diclorfenolindofenolat de sodiu (albastru) 2,6-diclorfenolindofenol (roşu)

O C
Cl
C - OH
O N OH + O
C - OH
Cl HC
HO - C - H
CH2OH
O C
Cl
C O
O
C O + HO NH OH
HC
Cl
HO - C - H
substanta incolora
CH 2OH

Aparate, vase şi materiale:


ƒ fotocolorimetru, KFK-2;
ƒ cîntar tehnic;
ƒ mojar cu pistil;
ƒ trei baloane cotate de 100 cm3;
ƒ şase eprubete;
ƒ pipete de 0,5; 1,0; 5,0; 10,0; 20,0 cm3;
ƒ pîlnie din sticlă;
ƒ filtru din materie,
81
ƒ soluţie de acid oxalic de 1 %;
ƒ soluţie de 0,001n de sare de sodiu 2,6-
diclorfenolindofenol;
ƒ cristale de acid ascorbic;
ƒ produse pentru analiză: mere, struguri, măcriş, mărar,
ceapă verde, varză, cartofi etc.
Pregătirea soluţiei de 2,6 - diclorfenolindofenol
Reactivul (sau indicatorul) se pregăteşte cu soluţie-tampon
fosfată cu pH= 6,9 – 7,0 deoarece în soluţia apoasă el se distruge.
Pentru tampon se pregătesc următoarele soluţii: KH2PO4 – 9,078 g
în 1 dm3 de apă distilată şi NaHPO4 x 2 H2O –11,867 g în 1 dm3 de
apă distilată. Fiecare soluţie se păstrează aparte. Înainte de
întrebuinţare soluţiile se amestecă: 2 volume soluţie KH2PO4 şi 3
volume soluţie NaHPO4.
0,26 g de reactiv 2,6- diclorfenolindofenol se transferă în
balonul cotat de 1 dm3, se adaugă 700 cm3 apă distilată, amestecul
se aduce pînă la cotă cu soluţie-tampon pH= 6,9 – 7,0. Soluţia de
2,6 – diclorfenolindofenol se păstrează la întuneric nu mai mult de
7 zile. Titrul soluţiei se controlează zilnic cu soluţie 0,01 n tiosulfat
de sodiu. Determinarea titrului se bazează pe proprietatea 2,6-
diclorfenolindofenolului de a oxida cantitativ iodidul în iod.
Determinarea titrului 2,6- diclorfenolindofenolului
În patru baloane conice de 50 cm3 se dozează:
ƒîn primele două (probe de lucru) cîte 10 cm3 soluţie
indicator, 0,5 -1 cm3 acid sulfuric (1:4) şi 1 cm3 soluţie 10 % KI;
ƒîn cele de control în loc de indicator se adaugă 10 cm3 apă
distilată, 0,5 -1 cm3 acid sulfuric (1:4) şi 1 cm3 soluţie 10 % KI.
Soluţia din baloane se agită şi iodul, eliberat la oxidarea KI,
se titrează în prezenţa soluţiei 1 % amidon cu 0,01n de tiosulfat.
Cantitatea de acid ascorbic care corespunde la 10 cm3 de 2,6-
diclorfenolindofenol se determină prin înmulţirea volumului
soluţiei de tiosulfat, care a mers la titrare cu coeficientul 0,88.
(V lucru - V control) * 0,88
T=
10

82
Ordinea îndeplinirii lucrării

Analiza produselor lichide

40-50 cm3 de suc sau must se dozează în balon cotat de 100cm3


şi se aduce pînă la cotă cu soluţie de 5 % acid acetic. Amestecul se
agită şi cu pipeta se transferă 30-40 cm3 într-un balon cotat de 50
cm3 în care se adaugă 0,5 g CaCO3 praf (în cantităţi mici pentru a
evita spumegarea). După dizolvarea CaCO3 se dozează 5-10 cm3
soluţie acidă de 5 % de acetat de plumb. Amestecul se aduce pînă
la cotă cu soluţie de 5 % acid acetic. Soluţia se amestecă şi se
filtrează sau se centrifughează. Ulterior se măsoară cu pipeta (în
dependenţă de conţinutul acidului ascorbic) 10-20 cm3 de filtrat şi
se titrează din microbiuretă cu soluţie 0,001 n 2,6-
diclorfenolindofenol pînă la apariţia culorii slab roze, care se
menţine timp de 30-60 secunde. Se fixează volumul de 2,6-
diclorfenolindofenol consumat la titrare şi se adaugă 2 picături (de
control) 2,6- diclorfenolindofenol şi dacă apare culoare roză
intensivă se consideră că titrarea a fost efectuată corect. Se repetă
titrarea la probe de 2-3 ori.
Conţinutul acidului ascorbic se calculează după formula:
a =V x T x
50
V2
x
100
V3
x
100
V1 x D
unde:
a – conţinutul de acid ascorbic în mg-%;
V - volumul soluţiei de 2,6-diclorfenolindofenol consumat
la titrare;
T - cantitatea de acid ascorbic în mg, care corespunde la 1
cm3 de 2,6-diclorfenolindofenol;
V1 – volumul de suc sau must luat pentru analiză, în cm3;
V2 – volumul probei luat la titrare în cm3;
V3 – volumul probei luat pentru titrarea cu acetat de plumb,
în cm3;
D – densitatea optică a sucului sau a mustului analizat.

83
Analiza produselor solide (prin metoda fotocolorimetrică)

Proba produsului analizat (10 g) se transferă în mojar şi se


mărunţeşte cu pistilul în prezenţa acidului oxalic de 1 %. Apoi,
cantitativ se transferă în balonul cotat de 100 cm3 , se aduce pînă la
cotă cu acid oxalic şi se agită. Conţinutul balonului se filtrează prin
filtrul de materie într-un balon conic. În filtratul obţinut se adaugă
6 cm3 2,6–diclorfenolindofenol. În continuare, se determină
extincţia D1: soluţia obţinută se transferă în cuvă (cu lungimea de
1 cm), se fotocolorimetrează la lungimea de undă λ=540 nm
(contra apei distilate). La determinarea extincţiei D2: în cuva cu
soluţie analizată se adaugă cîteva cristale de acid ascorbic (culoarea
2,6-diclorfenolindofenolului dispare) soluţia se agită şi iarăşi se
fotocolorimetrează.
Pentru a introduce o corecţie la schimbarea intensităţii
culorii la păstrarea soluţiei de 2,6-diclorfenolindofenol, se măsoară
extincţia amestecului (Do), format din 10 cm3 de 2,6-
diclorfenolindofenol, 6 cm3 de soluţie de 1 % de acid oxalic.
Ulterior se măsoară extincţia (D) soluţiei proaspăt pregătite de 2,6-
diclorfenolindofenol, din care se scade extincţia (Do).
Densitatea optică a soluţiei analizate se determină după
formula:
Dx = D1 + (D - Do) - D2
Corecţia (D-Do) se include în calcul atunci cînd calibrarea şi
determinarea D1 şi D2 nu se face în aceeaşi zi.
După graficul de calibrare se determină concentraţia de acid
ascorbic (Cx) care corespunde Dx.

Graficul de calibrare

Substrat ascorbic: se dizolvă 100 mg acid ascorbic în


balon cotat de 100 cm3 şi se aduce pînă la cotă cu soluţie 1 % acid
oxalic.
Pentru a construi graficul de calibrare se diluează substratul
ascorbic: 10 cm3 soluţie de substrat ascorbic se transferă în balon
84
cotat de 100 cm3 şi se aduce la cotă cu soluţie de 1 % acid oxalic
(concentraţia soluţiei diluate de substrat ascorbic este 100
mkg/cm3).
În şase cilindre se administrează de la 1 cm3 pînă la 6 cm3
de soluţie diluată de substrat ascorbic, (ce va corespunde
concentraţiilor 16,6; 33,2; 50,0; 100 mkg/cm3) apoi se dozează
10cm3 soluţie proaspăt pregătită de 2,6-diclorfenolindofenol.
Volumul la fiecare cilindru se aduce pînă la 16 cm3 cu soluţie de
acid oxalic de 1 %.
Exemplu:
C, mkg/cm3 16.6 33.2 50 66.6 83.2 100
D 1.3 1.2 1 0.8 0.7 0.6

Determinarea concentraţiei de vitamina C


D
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 20 40 60 80 100 120

C, mkg/cm3

Recalcularea în mg-% (mg de vitamina C în 100 g de produs


alimentar):

C * 100 * 100
K =
a * 1000

85
K – conţinutul de vitamina C în mg-%,
a – masa probei;
1000- recalcularea în mg.

Întrebări de control:

1. Care sînt proprietăţile fiziologice ale acidului ascorbic ?


2. În care produse se găseşte vitamina C în cantităţi mai
mari ?
3. Scrieţi structura şi proprietăţile chimice ale acidului
ascorbic.
4. Principiul metodei de determinare a acidului ascorbic.
5. Descrieţi metoda determinării acidului ascorbic în
produse lichide şi tari.
6. Argumentaţi formula de calcul a acidului ascorbic prin
două metode.
7. Regulile tehnicii de securitate la determinarea acidului
ascorbic.

86
Lucrarea de laborator nr. 13

Metoda cromatografică de determinare a carotinelor

Însemnătatea analizei

Rolul biochimic al vitaminei A:


¾intră în componenţa membranelor plasmatice, micşorează
permeabilitatea la factori patogeni, prin aceasta protejează celulele
epiteliale;
¾participă în recepţia luminii, fiind în componenţa
purpurului vizual - rodopsinei;
¾participă la fotosinteză, în reglarea fosforilării oxidative,
ciclului acizilor tricarboxilici, biosintezei mucopoliglucidelor;
Insuficienţa vitaminei A duce la încetarea creşterii copiilor,
se micşorează rezistenţa la infecţii. Apare boala „orbul găinilor”
(hemeralopia) – scăderea vederii în amurg ori noaptea.
Lipsa vitaminei A în hrană provoacă boala „xeroftalmie”
(grec. xeros – uscat, ophtalmos - ochi) din cauza inflamării corneei
şi cheratinizării epiteliului canalelor lacrimogene, ceea ce duce la
închiderea lor. Aceasta boală se întîlneşte mai des la copii.
Necesitatea zilnică în vitamina A pentru un om matur
constituie 1,5 – 2 mg, iar în carotine 3 – 5 mg.
Vitaminele grupei A se găsesc exclusiv în produse animale.
În cantităţi mai mari în untura şi ficatul de peşte. De exemplu în
bibanul marin – 5 mg-%; în paltus – 8 mg-%; în ficatul de vite –
1,5 – 2 mg-%.
În cantităţi mai mici se găsesc în lapte, unt, gălbenuş de ou,
etc.
În natură se întîlnesc vitamina A1 şi A2. Vitamina A1
(retinol) reprezintă un alcool, ce are în moleculă ciclul β – iononic,
o catenă laterală din 2 resturi izoprenice şi gruparea terminală –
CH2– OH în poziţia trans, conţine 5 duble legături conjugate.

87
Vitamina A2 (dehidroretinol) se întîlneşte mai mult în
ficatul peştilor de apă dulce. Are în plus o legătură dublă în
poziţiile 2-3 ale ciclului β – iononic.
Structura chimică a vitaminei A1 C20H30O.

H3C CH3 CH3 CH3

__

__
__ __ __ __ __
CH=CH C = CH CH =CH C = CH CH2OH

__
CH3

Structura chimică a vitaminei A2 C20H28O.

H3C CH3 CH3 CH3


__

__
__ __ __ __ __
CH=CH C = CH CH =CH C = CH CH2OH

__
CH3

Provitaminele sau carotine se conţin în produse vegetale şi


plante, sînt hidrocarburi cu structura C40H56, substanţe cristaline de
culoare oranj. Se conţin în: morcov – 5 – 15 mg-%, verdeaţă – 3 –
10 mg-%, mai puţin în frunze şi struguri verzi, caise, piersici,
pepene galben, bostan, iar în roşii se conţine licopina. În vinuri
lipseşte, dar poate fi în cantităţi mici în vinurile aromatizate.
Din carotine se cunosc trei izomeri: α, β, γ, care se
deosebesc prin caracterul şi numărul de cicluri: β – carotina este
mai activă, deoarece conţine două cicluri β – iononice; α – carotina
conţine un ciclu β – iononic şi altul α – iononic; γ – carotina
conţine numai un ciclu β – iononic.
În organismul omului şi animalelor carotinele se transformă
în vitamina A. Din β–carotina prin hidroliza enzimatică în
organismul animal se formează 2 molecule de vitamina A1. Iar din
α şi γ–carotine se obţine numai cîte o moleculă de vitamina A1.

88
β – carotina
__ CH 3 H 3C CH 3
H3C CH 3 CH 3 + HO H

__
__
__ __ __ __
(C H=C H C = CH) 2 CH = C H __ (CH= C C H=C H) 2
__
__ CH
3 + H OH H 3 C __

H 3C CH 3
__ __ __
(CH=CH C = CH) 2 CH 2 OH

__
2
__ CH 3
CH 3

α – carotina

H3C CH3 CH3 CH3 H3C CH3

__
__
__ __ __
__
(CH=CH C = CH)2 CH = CH__ (CH= C CH=CH)2

__ CH
3 H3C __

γ – carotina
H3C CH3
H3C CH3 CH3 CH3
__
__

__ __ __ __ __ __
(CH=CH C = CH)2 CH = CH (CH= C CH=CH)2 HC

__
CH3 H3C __

licopina

H3C CH3 H3C CH3


CH3 CH3
C C
__
__

__ __ __ __ __
CH __ (CH=CH C = CH)2 CH = CH (CH= C CH=CH)2 HC

__
CH3 H3C __

Vitamina A şi carotinele uşor se descompun, se oxidează cu


oxigenul din aer din cauza prezenţei legăturilor duble în molecula
lor. De aceea nu se poate de păstrat mult timp morcovul şi verdeaţa
tăiate mărunt.
89
Carotenoidele se folosesc ca coloranţi naturali netoxici în
industria alimentară, farmaceutică, medicină, cosmetică şi ca adaos
în hrana animalelor de fermă pentru intensificarea coloritului unor
produse alimentare (gălbenuşul de ou, grăsimea corpului păsărilor).

Principiul metodei de determinare a carotinelor


Se bazează pe extragerea lor cu solvenţi organici
corespunzători din plante (fructe) mărunţite şi prin separarea
ulterioară a impurităţilor cu ajutorul cromatografiei de adsorbţie
urmată de fotocolorimetrare.
În practica de laborator se foloseşte pe larg metoda
cromatografică de separare a carotinelor după M. S. Ţvet,
modificată de I.K. Murri.

Aparate, vase şi materiale:


ƒ fotocolorimetru KFK - 2;
ƒ coloana cromatografică – tub de sticlă cu lungimea 30 cm
cu diametrul inferior 1 cm;
ƒ balon Bunzen, uscat;
ƒ pompa cu vid;
ƒ mojar cu pistil;
ƒ baloane cotate 50, 100 cm3, uscate;
ƒ adsorbent – Al2O3 (praf) sau carbonat acid de magneziu
activat;
ƒ Na2SO4 calcinat;
ƒ probe de materie primă (legume colorate, fructe, plante
verzi);
ƒ hîrtie de filtru;
ƒ solvent organic: eter de petrol sau pentan, hexan, heptan,
etc.
NOTĂ: Solvenţii organici sînt inflamabili. Respectaţi
regulile de securitate !

90
Ordinea îndeplinirii lucrării
Metoda cromatografică
Proba de material vegetal 1 g (pînă la 5 g în dependenţă de
umiditate) se mărunţeşte în mojarul de porţelan cu pistilul, dar nu
mai mult de 30 minute, pentru a evita oxidarea carotenilor. Pentru
deshidratarea probei în mojar se adaugă periodic cristale de Na2SO4
calcinat pînă cînd se obţine o masă uscată, fină. Masa obţinută se
lasă în mojar pe 20 – 30 minute. În partea îngustă a coloanei
cromatografice se pune un tampon de vată cu grosimea 1 de cm.
Apoi coloana se umple cu Al2O3 (praf) pînă la înălţimea 5-10 m, în
dependenţă de cantitatea carotinelor şi compoziţia pigmenţilor
adsorbiţi. Pe suprafaţa stratului adsorbant se aşează hîrtie de filtru.
Proba de analizat mărunţită se transferă cantitativ în coloana
cromatografică. Coloana cromatografică se uneşte cu balonul
Bunzen (fig.1).
În coloană se toarnă solvent organic pînă cînd
conţinutul ei devine umed Balonul Bunzen se uneşte la
pompa cu vid sau la pompa de apă. Proba de analizat se
spală cu solvent (1-2 picături pe secundă), pînă cînd
culoare galbenă a picăturilor dispare. Este necesar ca
adsorbantul să fie acoperit tot timpul cu solvent organic,
deoarece carotenii uşor se oxidează în curentul de aer care
trece prin coloană.
Conţinutul balonului Bunzen se transferă în balonul
cotat de 50 sau 100 cm3 şi se aduce pînă la cotă cu solvent.
Conţinutul de carotene din soluţia obţinută se determină
prin metoda fotocolorimetrică.
La aparatul KFK – 2, la lungimea de undă λ=540 nm (filtrul
de lumină verde), dacă soluţia este colorată intensiv galben – oranj
şi la lungimea de undă λ = 490 nm (filtrul de lumină albastru-
verde), dacă soluţia este colorată în galben pai. Pentru
determinarea extincţiei se folosesc cuve din sticlă cu lungimea de
5 cm (care se acopere cu căpăcel de sticlă).
Ca soluţie de comparaţie va servi soluţia incoloră de solvent
organic. Cuvele se clătesc cu solvent, se usucă cu hîrtie de filtru.

91
După finalizarea lucrării solventul şi soluţiile se toarnă în baloane
corespunzătoare. Solvenţii organici se interzice să fie turnaţi în
lavoar !

Reglarea aparatului KFK – 2


Aparatul KFK-2 (fig.2) este alcătuit din :
1. Microampermetrul cu două scări ; scara de sus gradată în
% T, iar scara de jos – în unităţi ale extincţiei (absorbţiei) D.
2. Locaşul cuvelor.
3. Suportul (pîrghia) pentru permutarea cuvelor.
4. Comutatorul filtrelor de lumină.
5. Manete pentru reglarea sensibilităţii : scara neagră -
pentru fotoelementul F–4 ; scara roşie - pentru fotodioda FD–7K.
6. Maneta pentru reglarea grosieră şi fină a acului
galvanometrului la diviziunea 100 %T.

Fig.2. Aparatul KFK-2

Aparatul se conectează la reţeaua electrică şi se lasă 15-20


minute pentru a se încălzi. În acest timp lăcaşul cuvelor trebuie să
fie deschis. La ridicarea capacului aparatului placa metalică închide
calea fluxului luminos către fotoelemente. Rotind maneta din
92
partea stîngă a comutatorului se reglează lungimea de undă
necesară.
Cuva cu solvent pur (proba de comparaţie) se pune în
suportul pentru cuve (în partea din stînga), iar cuva cu soluţia de
analizat în partea dreaptă a suportului şi capacul aparatului se
închide.
În prealabil se reglează scara aparatului la zero cu ajutorul
manetei din partea dreaptă (reglarea grosieră şi fină a acului
galvanometrului la diviziunea 100 % T sau la diviziunea „0” pe
scara extincţiei D).
Schimbînd poziţia suportului de sub capacul aparatului
permutaţi cuvele în fluxul luminos şi notaţi valoarea extincţiei pe
scara de jos a galvanometrului.
Repetaţi măsurările de 3 ori şi notaţi valoarea medie a
rezultatului.
Graficul de calibrare

Cantitatea de carotine se determină cu ajutorul graficului de


calibrare, construit în coordonatele: extincţie – concentraţie. Pe
baza rezultatului obţinut din graficul de calibrare se calculează
cantitatea de carotină mg în 100 g de probă vegetală.
Pentru a construi graficul de calibrare se utilizează soluţia
standard de K2Cr2O7 (bicromat de potasiu). 300 mg K2Cr2O7 uscat
şi recristalizat (de trei ori) se dizolvă în apă distilată în balonul cu
cotă 1dm3. 1 cm3 de aşa soluţie după culoare corespunde la 0,00208
mg (2,08 µg) de carotină.
În 10 baloane cu cotă de 100 cm3 se introduce o anumită
cantitate de soluţie K2Cr2O7 conform tabelului1. Soluţiile se aduc
pînă la cotă cu apă distilată, se agită şi se determină extincţia
fiecărei soluţii.
În baza rezultatelor obţinute se completează tabelul1 şi se
construieşte graficul de calibrare în coordonatele: extincţie (D) –
concentraţie (C) în µg. Ca soluţie de comparaţie va servi apa
distilată.

93
Volumul K2Cr2O7 şi concentraţiile carotinei. Tabelul 1.
V ml 2 5 10 15 20 25 30 50 75 100
K2Cr2O7
C µg 4 10 21 31 42 52 73 104 156 208
D

Conţinutul carotinelor (X) în mg-% se calculează după


formula următoare:
C * 100
X=
m * 1000 ,
unde m—masa probei în g

Întrebări de control:

1. Rolul biochimic al vitaminelor grupei A şi carotinelor.


2. Structura vitaminelor A1, A2, şi a carotinelor.
3. Descrieţi principiul de separare a carotinelor prin metoda
cromatografică.
4. Cum se determină extincţia soluţiilor colorate la aparatul
KFK – 2 ?
5.Cum se pregătesc soluţiile pentru graficul de calibrare a
carotinelor ?

94
Lucrarea de laborator nr. 14

Determinarea indicilor de calitate a lipidelor

Lipidele reprezintă o categorie de substanţe solubile în


solvenţi organici (cloroform, acetona, benzen, eter etilic), dar
insolubile în apă şi săruri minerale.
Din punct de vedere chimic lipidele sînt substanţe foarte
heterogene, caracterizate în general prin structura hidrofobă
apolară. Lipidele au un rol plastic şi energetic, participă la formarea
membranei celulare, la permeabilitatea celulară şi la vehicularea
diferitelor substanţe organice. Lipidele au funcţiile de termoizolare,
termogeneză, apărare de leziuni mecanice, hidroizolare.
Organismul uman necesită pe zi 70-145 grame de lipide.
Schema generală a clasificării lipidelor poate fi redată
astfel:

Gliceride
Simple Steride
Lipide (esteri ai Ceride
acizilor graşi)
Glicerolipide
Complexe
Sfingolipide

Lipide (pe baza Monoterpene C10


izoprenei) Diterpene C20

Politerpene C500 – C25000

95
Acizii graşi

Majoritatea acizilor graşi separaţi din grăsimile naturale sînt


acizi monocarboxilici cu catena normală, care conţin un număr par
de atomi de carbon.
Acizii graşi cu catena saturată corespund următoarei
formule generale:
CH3–(CH2)n – COOH, n=2–30
• n = 10, C12 – acidul lauric (unt de laur);
• n = 14, C16 – acidul palmitic (majoritatea grăsimilor);
• n = 16, C18 – acidul stearic (majoritatea grăsimilor);
• n = 18, C20 – acidul arahic (ulei de arahide);
Acizii graşi lineari nesaturaţi sînt acizii monocarboxilici
care conţin în molecula lor una sau mai multe legături duble.
Structura acizilor graşi nesaturaţi poate fi codificată prin cifre. De
exemplu codul 18.1∆9 înseamnă că în structura acidului oleic intră
18 atomi de carbon, este o singură legătură dubla lîngă C–9.
• 12.1∆ 9 – acidul lauroleic (lapte de capră);
• 16.1∆ 9 – acidul palmitoleic (grăsimi animale);
• 18.2∆ 9, 12 – acidul linoleic (în majoritatea lipidelor);
• 18.3∆ 9, 12, 15 – acidul linolenic (ulei de in);
• 18.4∆ 5, 8, 11, 14 – acidul arachidonic (lipide complexe).
Ultimii trei acizi graşi constituie vitamina F, care stimulează
procesele de creştere la mamifere, previne dermatitele şi
acumularea colesterolului în sînge.
Gliceride
Gliceridele sînt esteri ai acizilor graşi cu glicerolul
(propantriolul).
Denumirea gliceridelor se formează ţinînd seama de acizii
graşi din structura lor şi de poziţia acestora.
CH2–O–CO–(CH2)7–CH=CH–(CH2)7–CH3
CH –O–CO–(CH2)14–CH3
CH3–O–CO–(CH2)16–CH3
Oleopalmitostearina
96
Gliceridele de consistenţă lichidă (uleiurile vegetale) conţin
acizi graşi nesaturaţi. Grăsimile unde predomină acizii graşi
saturaţi sînt solide. Grăsimile lichide se transformă în solide prin
hidrogenizarea la locul legăturilor duble (prepararea margarinei).
Sînt mai mulţi indici care caracterizează calitatea
grăsimilor. De exemplu, indicele de saponificare (Is) reflectă
cantitatea legăturilor esterice în molecula gliceridului şi masa
moleculară a acizilor graşi. Indicii de saponificare al unor grăsimi
alimentare sînt următorii: unt de vaca 220 – 240, ulei de floarea
soarelui 186 – 198 (mg de KOH necesar pentru saponificarea 1 g
de grăsime). Indicele de iod reflectă cantitatea legăturilor duble în
gliceride şi se exprimă în g de iod fixate de 100 g grăsime. Ulei de
floarea soarelui are indicele de iod 114 – 135, de soia – 114 – 140.
La acţiunea luminii, la contactul cu oxigenul şi cu vaporii
de apă grăsimile sînt supuse transformărilor degradative, cunoscute
sub denumirea de rîncezire. Rincezirea poate fi hidrolitică şi
oxidativă. În urma rîncezirii hidrolitice se acumulează acizii graşi
liberi, care au un miros şi gust neplăcut. Reacţiile de oxidare duc la
formarea
a) cetonelor şi b) peroxizilor, aldehidelor, aldoacizilor.

Acumularea produselor de oxidare duce la pierderea


proprietăţilor organoleptice şi scăderea valorii nutritive a
grăsimilor.
Oxidarea grăsimilor poate fi prevenită prin introducerea
antioxidanţilor (tocoferoli, hidrochinona, derivaţi ai acidului galic
etc.).

97
1. Determinarea indicelui de aciditate

Indicele de aciditate se exprimă în mg de KOH necesare


pentru neutralizarea acizilor graşi liberi, care se conţin în 100 g de
lipide.
Cantitate de acizi graşi liberi în grăsime nu este stabilă,
fiindcă depinde de tehnologia obţinerii, duratei şi condiţiilor
păstrării şi de alţi factori. Caracterizează prospeţimea grăsimilor şi
se măreşte cu durata păstrării.
Determinarea se bazează pe neutralizarea acizilor graşi
liberi în proba de grăsime cu soluţii alcoolice de NaOH sau KOH.

Aparate, vase şi materiale:


ƒ soluţia saturată de NaCl;
ƒ două baloane conice de 150- 200 cm3;
ƒ biureta de 50 cm3;
ƒ baia de apă;
ƒ 1% fenolftaleina, soluţie alcoolică;
ƒ 0,1 n soluţie alcoolică de NaOH sau KOH (4,5 g de
NaOH sau 6 g de KOH mărunţim, transferăm în balon, adăugăm
60-70 cm3 96 % alcool etilic rectificat, închidem balonul cu dop şi
lăsăm pe 24 ore. Soluţia de hidroxid o separăm de sediment prin
filtrare (prin vată de sticlă sau asbest), diluăm cu apa distilată pînă
la concentraţia necesară;
ƒ amestecul neutru de alcool şi eter (1:2 — raportul
volumelor).

Ordinea îndeplinirii lucrării


(pentru grăsimi de culoarea deschisă)

În baloanele conice de 150-200 cm3 introducem 3-5 g de


grăsimi analizate cu eroarea 0,01 g, adăugăm 50 cm3 de amestec
neutralizat de etanol şi eter etilic, agităm conţinutul. Dacă grăsimea
nu se dizolvă, balonul îl încălzim la baia de apă, agitînd permanent.
Răcim balonul pînă la 15-20 0C, adăugăm 3-5 picături de 1 %

98
soluţie alcoolică de fenolftaleină şi agitînd permanent titrăm proba
cu 0,1 n soluţie alcoolică de NaOH sau KOH pînă la apariţia culorii
slab roz, care nu dispare timp de 30 sec.
Indicele de aciditate (mg/g grăsime) se calculează după
formula :
V × K × 5,61
Ia = b
m

unde:
Vb – volumul (cm3) soluţiei de NaOH sau KOH pentru
titrarea acizilor graşi;
K – coeficientul de corecţie a soluţiilor bazice;
5,61 – cantitatea de KOH (mg) în cm3 soluţie de 0,1 n ;
m – masa probei, g.

Ordinea îndeplinirii lucrării


(pentru grăsimi de culoare închisă)
În aceasta metodă nu se utilizează solvent pentru grăsime.
Pentru separarea fazelor se introduce soluţia saturată de NaCl. La
titrare se utilizează 1% fenolftaleina. După ce toţi acizii liberi se
neutralizează, surplusul de bază trece în soluţia de NaCl şi îl
colorează în roz. NaCl inhibă hidroliza grăsimilor şi nu permite
formarea emulsiilor stabile la titrare.
Într-un balon de 200 cm3 introducem 10 g de grăsime
(cîntărite cu eroarea 0,01 g), adăugăm cu cilindru 50-60 cm3 soluţie
saturată de NaCl şi 0,5 cm3 de 1 % soluţie alcoolică de
fenolftaleină. Balonul îl închidem cu dop, agităm, apoi o titrăm cu
0,1 n KOH. La titrarea agităm fiecare dată după adăugarea 4-5
picături de KOH pînă nu dispare culoarea stratului de jos a soluţiei.
În procesul de titrare coloraţia trebuie să se schimbe lent, de aceea
la finisarea titrării agitarea o facem mai des. Titrarea se termină,
cînd în stratul de jos a sării va apărea culoarea roz stabilă, care nu
dispare timp de 30 sec.
Indicele de aciditate (mg/g grăsime) se calculă după formula :
99
Vb × K × 5,61
Ia = ,
m

Unde:
Vb – volumul (cm3) soluţiei de NaOH sau KOH pentru
titrarea acizilor graşi
K – coeficientul de corecţie a soluţiilor bazice
5,61 – cantitatea de KOH (mg) în cm3 soluţie de 0,1 n
m – masa probei, g

Limitele normelor admisibile de indicele de aciditate


pentru unele uleiuri şi grăsimi (mg/g grăsime):

Ulei de floarea soarelui


•rafinat – 0,4
•nerafinat calitatea superioară – 1,5
•nerafinat calitatea I – 2,25
Ulei de soia
•rafinat – 0,3
•hidratat calitatea I – 1,0
Ulei de porumb
•rafinat 0,3
•nerafinat – 5,0
Grăsimi alimentare topite:
•calitatea superioară—1,3
•calitatea I—2,2

2. Determinarea indicelui de saponificare


Indicele de saponificare Is se exprimă în mg de KOH pentru
saponificarea gliceridelor şi neutralizarea acizilor graşi liberi într-
un gram de grăsime.
Valoarea Is depinde de masa moleculară a acizilor graşi din
componenţa lipidelor. Cu cît masa moleculară e mai mare, cu atît
valoarea Is este mai mică. Is este mai mare la lipide cu indicele de

100
aciditate mai mare. Is la mono- şi digliceride e mai mic de cît la
trigliceride. După Is în producere se calculează cantitatea de bază,
necesară pentru saponificarea grăsimilor, de exemplu, la rafinarea
uleiurilor—la etapa neutralizării.

Aparate, vase şi materiale:


•2 baloane de 250-300 cm3 cu ştif;
•răcitor de aer;
•biureta –25 cm3;
•baia de apă;
•0,5 n soluţie alcoolică de KOH;
•0,5 n soluţie de HCl;
•1 % soluţie de fenolftaleină.

Ordinea îndeplinirii lucrării

Într-un balon de 250-300 cm3 cu ştif se introduce 2-3 g (cu


precizia 0,0002 g), de grăsime analizată prealabil bine amestecată
şi filtrată din biuretă, se adaugă 25cm3 de 0,5n soluţie alcoolică de
KOH şi balonul se uneşte prin ştif cu răcitorul de aer. Colba se
menţine o oră într-o baie de apă la 100 oC (la fierbere), periodic
conţinutul se agită şi nu se admite evaporarea alcoolului. E necesar
ca nivelul soluţiei în balon să fie mai jos decît nivelul apei în baie.
Concomitent în aceleaşi condiţii se face proba de control prin
menţinerea balonului cu 25 cm3 de 0,5 n soluţie alcoolică de KOH .
Soluţia din balon după terminarea saponificării trebuie să fie
transparentă, fără picături de grăsime.
Apoi conţinut ambelor baloane se titrează cu 0,5 n soluţie
de KOH în prezenţa indicatorului (1 % soluţie alcoolică de
fenolftaleină pentru grăsimi de culoare deschisă şi timolftaleină,
pentru grăsimi de culoare închisă) pînă la dispariţia culorii.
Soluţia de lucru se titrează fierbinte, puţin răcită.

101
Indicele de saponificare Is (mg KOH/g ) se calculează după
formula:
I = 28,05 (a-b) K
s
P
Unde:
28,05 – titru 0,5g soluţie de KOH, mg/cm3;
a – cantitate de 0,5n soluţie de HCl pentru titrarea KOH în
proba de control, cm3;
b - cantitate de 0,5n soluţie de HCl pentru titrarea KOH în
proba de lucru, cm3;
K – coeficientul de corecţie de 0,5n soluţie HCl;
P – masa grăsimii, g.
Devierile admisibile la probele paralele nu trebuie să fie mai
mari de 0,1mg KOH/g.

Limitele normelor admisibile de indicele de saponificare


pentru unele uleiuri şi grăsimi (mg/g grăsime):

Ulei de floare soarelui 188-194


Ulei de soia 192-194
Ulei de cocos 242-269
Ulei de măsline 185-200
Ulei de bumbac 191-200
Unt de vacă 220-245
Unt de cacao 192-196
Grăsime topită de vită 193-200

3. Determinarea indicelui de iod

Indicele de iod reflectă cantitatea legăturilor duble în


gliceride şi se exprimă în g de iod fixate de 100 g grăsime. La
legăturile duble acizii graşi uşor se oxidează, ce determină
procesele de rîncezire şi uscare a grăsimilor. Indicele de iod se

102
utilează la calculul cantităţii de hirogen pentru hidrogenizarea
lipidelor. Determinarea cantităţii legăturilor duble sau indicelui de
iod este bazată pe fixarea unei molecule de halogen (iod, clor,
brom) de o legătură dublă în condiţii cînd halogenul nu substituie
hidrogenul. Reacţia are loc după următoare schemă:
CH2 O- CO- (CH2)7- CH = CH- (CH2)7- CH3
CH O - CO- R1 + I2
CH2 O - CO- R1
I I
CH2 O- CO- (CH2)7- CH - CH- (CH2)7- CH3
CH O - CO- R1

CH2 O - CO- R2 ,
unde R1 şi R2 sînt radicalii acizilor graşi saturaţi.
Pentru determinarea indicelui de iod în industrie este
convenabilă metoda lui Margoşes. Această metodă după precizia
rezultatelor cedează metodelor standard, dar este mai rapidă,
necesită mai puţine reactive complicate şi toxice, nu se cere
calificarea înaltă a personalului.
Metoda este bazată pe reacţia acidului gras nesaturat cu
acidul hipoiodos, care se formează în rezultatul interacţiunii iodului
cu apă:
I2 +H2O─→HOI + HI
Reacţia acidului gras cu acidul hipoiodos trece în modul
următor:
CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH + HOI →
CH3(CH2)7CHOH – CHI - (CH2)7COOH
Restul de iod se titrează cu tiosulfat de sodiu.

Aparate, vase şi materiale:


• sticlă de ceas;
• păharul chimic;
• baie de apă;
103
• ceaşca Petri;
• cilindru de 200 cm3;
• biureta 25 cm3;
• etanol 96 %;
• soluţia alcoolică de iod (25 g de iod cristalin în dm3
de 96 % etanol);
• 0,1 n tiosulfat de sodiu Na2S2O3;
• 1 % soluţie de amidon.
Ordinea îndeplinirii lucrării
Pe o sticlă de ceas, prealabil cîntărită cu eroarea 0, 0002 g,
se introduc 3-5 picături de grăsime analizată şi se cîntăreşte, sticla
cu grăsime se plasează într-un pahar chimic şi se adaugă 100 de
volume de 96 % etanol: E de dorit ca masa grăsimii să fie între 0,2-
0,3 g, atunci cantitatea de alcool adăugata va fi 20-30cm3.Pentru
dizolvarea mai bună amestecul încălzeşte în baia de apa la
temperatura 45-50o C, permanent agitînd conţinutul păharului pînă
la dispariţia picăturilor de grăsime. Păharul trebuie să fie acoperit
cu ceaşca Petri, apoi în păhar din biuretă se adaugă 20 cm3 de
soluţie alcoolică de iod şi cu cilindrul 200 cm3 de apă distilată. La
adăugarea apei amestecul permanent se agită cu bagheta de sticlă,
apoi păharul se acoperă şi se lasă pe 5 minute, după ce surplusul de
iod se titrează cu 0,1n soluţie de Na2S2O3 în prezenţa soluţiei de
amidon, de 1%.
Paralel, în aceleaşi condiţii, se face proba de control (fără
grăsime).
Indicele de iod (g de iod la 100 g de grăsime) se calculează
după formulă :
(a-b) x K x 100 x 0,01269
Indicele de iod =
P
unde a – cantitatea de 0,1 n soluţie de Na2S2O3 pentru
titrarea probei de control, cm3;
b – cantitatea de 0,1 n soluţie de Na2S2O3 pentru titrarea
probei de lucru, cm3;
K – coeficientul de corecţie a 0,1 n soluţie Na2S2O3;

104
0,011269 – cantitatea de iod, care corespunde 1 cm3 0,1 n
soluţie Na2S2O3, g;
P – masa grăsimii, g.

105
Lucrarea de laborator nr. 15

Determinarea substanţelor aromatice în pîine şi alte produse de


panificaţie

Mirosul este un indice organoleptic important al calităţii


pîinii. Aroma pîinei într-o mare măsură caracterizează calitatea şi
prospeţimea ei. Cea mai intensivă este aroma pîinii calde, la răcire
şi păstrare aroma suficient scade.
În formarea aromei pîinii participă aproape 300 de substanţe
care reprezintă alcooli, fenoli, aldehide, cetone, acizi, lactone,
compuşi cu sulf, esteri, amine. Toate acestea substanţe se află în
pîine în cantităţi foarte mici.
Complexul substanţelor aromatice se formează la toate
etapele pregătirii aluatului. În procesul formării aluatului creşte
conţinutul alcoolilor , acizilor organici, esterilor, substanţelor
carbonilice. Importantă este prezenţa în aluat înainte de coacere a
glucidelor reducătoare şi produşilor hidrolizei proteinelor –
peptidelor şi aminoacizilor. Finalizarea proceselor formării aromei
are loc anume la coacere, cînd se formează melanoidinele cu un
miros specific şi alte substanţe aromatice.
Determinarea aromei pîinii este prevăzută de standarde într-
un şir de indice de apreciere organoleptică a calităţii produselor de
panificaţie.
Substanţele carbonilice cantitativ prezintă aproape o treime
din toate substanţele aromei pîinii.
Conţinutul substanţelor carbonilice în miezul pîinii de
secară şi de grîu-secară – 6,8 - 28,9 cm3 0,1 n soluţie de iod la 100g
substanţelor uscate, în miezul pîinii de grîu – 5,4 – 28. În coaja
pîinii de secară şi de grîu-secară – 43,6-162,7, în coaja pîinii de
grîu – 20,4-108,2 cm3 0,1 n soluţie de iod la 100g substanţelor
uscate.

106
Principiul metodei
Metoda se bazează pe interacţiunea substanţelor carbonilice
cu bisulfit de sodiu NaHSO3. Determinarea constituie din
următoarele etape:
• reacţia formării compuşilor bisulfitcarbonilici;
• eliminarea surplusului de NaHSO3;
• scindarea compuşilor bisulfitcarbonilici;
• determinarea cantitativă a NaHSO3 eliminat, care este
echivalent cu conţinutul substanţelor carbonilici.
Conţinutul substanţelor carbonilice se exprimă în cm3 0,1 n
soluţie de iod pentru titrarea bisulfitului de sodiu, legat cu
substanţele carbonilice din 100 g de pîine uscată.
Aparate, vase şi materiale:
• 0,15 % soluţie de NaHSO3 (0,75 g de NaHSO3
nehidratat se dizolvă în 400 cm3 de apă, se acidulează cu 2 n acid
acetic în prezenţa 3-5 picături de indicator metilrot pînă la culoarea
roz, apoi volumul se aduce pînă la 500 cm3);
• soluţie-tampon pH -8,3 (30 g de acid boric şi 5 g de
NaOH se dizolvă în 1000 cm3 de apă distilată).

Ordinea îndeplinirii lucrării


Proba de pîine cu masa de 10 g (eroarea 0,01 g) se
mărunţeşte în mojar cu soluţia 0,15 % de NaHSO3. Suspensia se
transferă cantitativ în balonul cotat de 100 cm3, se aduce pînă la
cotă cu soluţia de bisulfit de sodiu, se agită 10 min, se lasă pentru
decantare 10 min şi se filtrează într-un balon uscat.
Într-un balon conic de 150 cm3 introduc cu pipeta 10 cm3 de
filtrat, la analiza soluţiilor intens colorate se ia 10 cm3 de filtrat şi
10 cm3 de apă distilată. Surplusul de bisulfit de sodiu se titrează cu
0,1 n soluţie de iod în prezenţa indicatorului (1 cm3 de 0,1 % soluţie
de amidon) pînă la culoarea violet-albastră slabă. Dacă a fost
adăugat mai mult iod, el se titrează cu 0,01 n soluţie de tiosulfat de
sodiu Na2S2O3.

107
Pentru scindarea compuşilor bisulfitcarbonilici se utilizează
soluţie-tampon, care permite de a aduce pH mediului pînă la 8,3.
Titrarea bisulfitului de sodiu eliminat se face în două etape:
̶ Titrarea de orientare
̶ Titrarea principală

Titrarea de orientare. În balonul conic după îndepărtarea


excesului de bisulfit de sodiu se adaugă 15 cm3 de soluţie-tampon
şi în acelaşi moment încep titrarea din microbiuretă a bisulfitului
eliminat cu 0,01 n soluţie de iod pînă la apariţia culorii violet-
albastră, care nu dispare 15 s. Se notează volumul titratului.
Titrarea principală. În balonul conic după îndepărtarea
excesului de bisulfit de sodiu se adaugă 90 % de volum soluţie de
0,01 n iod, care s-a utilizat pentru titrarea de orientare, apoi 15 cm3
de soluţie-tampon şi termină titrarea cu 0,01 n soluţie de iod.
Conţinutului substanţelor carbonilice se calculează după
următoare formulă:

,
unde :
X – conţinutul substanţelor carbonilice în cm3/100 g;
K - coeficientul de corecţie a soluţiei de iod;
V - volumul de 0,01 n soluţie de iod pentru titrarea
principală a 10 cm3 de filtrat, cm3;
10 – coeficientul de recalculare la 0,1 n soluţie de iod;
W – % de umiditate în pîine.

108
PRELUCRAREA STATISTICĂ
A DATELOR EXPERIMENTALE

Pentru prelucrarea statistică a datelor experimentale se


îndeplinesc următoarele calcule:
• se efectuează un număr dat de determinări paralele
(n)
• se determină valoarea medie

• se găseşte devierea (abaterea)

• se calculează devierea standard:

• se determină devierea standardă relativă:


Sr = S/x
• se calculează dispersia:
2
V=S
• se determină limita de certitudine a mediei εα
x ± εα, sau x ± S tα
Toate rezultatele prelucrării statistice se introduc în tab.1.

Tabelul 1. Rezultatele finale ale prelucrării statistice.


n x S Sr V x±ε α

Calcularea indicilor statistice


Valoarea medie. Dacă în rezultatul dozărilor directe nu se
cunosc erori grave şi sistematice, se obţine un număr destul de
mare de măsurări şi rezultate, valoarea cea mai probabilă a

109
parametrului, care se determină trebuie luată ca media aritmetică,
obţinută dint-un şir de măsurări. Ea se notează prin simbolul x:
x = (x1 + x2 + x3 + ... + xn)/n = ∑ x/n ,
Unde n este numărul de măsurări.
Devierea (abaterea). Este diferenţa dintre variantă şi
valoarea medie. Ea se notează prin litera "d":
d = (xi-x).
Devierea "d" se caracterizează prin: ∑d = 0
Devierea standard. Măsurările separate sau rezultatele
analizei sînt dispersate faşă de valoarea medie. Pentru caracteristica
statistică a acestei dispersări se foloseşte devierea standardă:

S= ∑
d2
k
unde k este numărul gradelor de libertate, egal cu n-1
Devierea standardă relativă. Sr este egală cu devierea
standardă, împărţiţi la valoarea medie
Sr = S/x
Dispersia. Devierea standardă la pătrat se numeşte dispersie
V= S2. Cu cît e mai mică dispersia cu atît e mai mică împrăştierea
datelor şi e mai corectă analiza.
d2
S=
n(n − 1)

Limita de certitudine a mediei - εα. Întrucît determinarea


valorii reale a parametrului măsurat este imposibilă, ne mărginim
cu determinarea limitelor în care ea se include x ± εα.
εα. se calculează după formulă :
εα. = S tα , unde tα este parametru Stiudent pentru
probabilitatea α =0,95.
Dacă d > 2S, atunci acest rezultat se exclude din rîndul
variantei, supuse prelucrării statistice la probabilitatea admisă.

110
BIBLIOGRAFIE

1. Брухман Е.Е. Прикладная биохимия. – М.; Легкая и


пищевая промышленность: 1981.
2. Кретович В.Л. Биохимия растений.-М.; Высшая школа:
1986.
3. Основы биохимии. Под ред.Анисимова А.А. – М.; Высшая
школа: 1986.
4. Kucerenco N.E., Babeniuk Iu.D. ş. a. Biochimie. - Chişinău;
Universitas: 1993.
5. G. Neamţu Biochimie alimentară. – Bucureşti: Editura Cereş:
1997.
6. R. Segal R. Biochimia. – Galaţi; Universitatea "Dunăre de
Jos": 1992.
7. Лабораторный практикум по общей технологии
пищевых производств. Под редакцией Ковальской Л.П.
-М.; ВО „ Агропромиздат”: 1991.
8. Рихтер М., Аугустат З., Ширбаум Ф. Избранные методы
исследования крахмала.-М.; Пищевая промышленность:
1975.

111
CONŢINUTUL
ORGANIZAREA ŞI METODICA EFECTUARII LUCRĂRILOR DE
LABORATOR, REGULILE TEHNICII DE SECIRITATE PENTRU
LABORATORUL DE BIOCHIMIE.............................. ………………..3
Lucrarea 1. DETERMINAREA AZOTULUI TOTAL ÎN PRODUSE
VEGETALE(DUPĂ METODA KJELDAHL)..........................................6
Lucrarea 2. DETERMINAREA POTENŢIOMETRICĂ A
DERIVAŢILOR FORMOLICI A α– AMINOACIZILOR......................14
Lucrarea 3. DETERMINAREA AMONIACULUI DUPĂ METODA
CONWEI ŞI BAIRN................................................................................21
Lucrarea 4. DETERMINAREA PROTEINELOR ÎN VIN DUPĂ
METODA LOURI....................................................................................26
Lucrarea 5. REACŢIILE DE CULOARE A
PROTEINELOR.......................................................................................30
Lucrarea 6. DETERMINAREA FORMEI REDUSE A
GLUTATIONULUI (ÎN LEVURI SAU GERMENII
CEREALELOR)......................................................................................36
Lucrarea 7. DETERMINAREA ACTIVITĂŢII INVERTAZEI ÎN
VINURI, SUCURI..................................................................................40
Lucrarea 8. DETERMINAREA ACTIVITĂŢII ENZIMEI
POLIIFENOLOXIDAZA.........................................................................50
Lucrarea 9. DETERMINAREA ACTIVITĂŢII ENZIMEI
LACAZA..................................................................................................56
Lucrarea 10. DETERMINAREA ACTIVITĂŢII CATALAZEI
DUPĂ A. BAH ŞI A.OPARIN.................................................................64
Lucrarea 11. DETERMINAREA PĂRŢII DE MASĂ A
AMIDONULUI........................................................................................70
Lucrarea 12. DETERMINAREA FOTOCOLORIMETRICĂ A
VITAMINEI C.........................................................................................77
Lucrarea 13. METODA CROMATOGRAFICĂ DE
DETERMINARE A CAROTENILOR ..................................................87
Lucrarea 14. DETERMINAREA INDICILOR DE CALITATE A
LIPIDELOR.............................................................................................95
Lucrarea 15. DETERMINAREA SUBSTANŢELOR AROMATICE
ÎN PÎINE ŞI ALTE PRODUSE DE
PANIFICAŢIE.......................................................................................106
PRELUCRAREA STATISTICĂ A DATELOR
EXPERIMENTALE.............................................................................109

112
UNIVERSITATEA TEHNICĂ A MOLDOVEI

BIOCHIMIE

Îndrumar de laborator

Chişinău
2007

113