BIOCHIMIE
Îndrumar de laborator
Chişinău
U.T.M.
2007
Îndrumarul este destinat studenţilor anilor 2(U) şi 3(U) a
secţiilor de zi şi cu frecvenţă redusă pentru toate specialităţile
tehnologice ale facultăţii TMIA care studiază cursul de
"Biochimie".
–––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––––
Bun de tipar 23.05.07. Formatul 60x841/16
Hîrtie ofset. Tipar RISO Tirajul ex. 200
Coli de tipar 7,25. Comanda nr. 85
© U.T.M., 2007
2
ORGANIZAREA ŞI METODICA EFECTUARII LUCRĂRILOR
DE LABORATOR, REGULILE TEHNICII DE SECURITATE
PENTRIU LABORATORUL DE BIOCHIMIE
3
Tehnica de securitate pentru laboratorul de biochimie şi
regulile de folosire a reactivelor chimice
5
Lucrarea de laborator nr. 1
Importanţa analizei
Această metodă este utilizată pentru determinarea azotului
aminic, amidic, peptidic şi a amoniacului liber. În materia vegetală
(cu excepţia pomuşoarelor şi strugurilor) masa principală de
substanţe azotoase este reprezentată de proteine.
Protidele şi proprietăţile lor
Protidele sînt substanţe formate din aminoacizi, ele au o
importanţă primordială (grec. ’protos’- primul) pentru organismele
vii. Protidele se găsesc în toate organismele vegetale şi animale. În
regnul animal protidele sînt substanţe predominante 65-70 %, în
plante 2-35 % din masa uscată. Necesitatea fiziologică a omului
este de 100 grame pe zi.
Compoziţia elementară a proteinelor:
C - 50,6 - 54,5 %;
O - 21,5 - 23,5 %;
N - 15,0 - 17,6 %;
H - 6,5 - 7,3 %;
S - 0,3 - 2,5 %;
Numeroase proteine mai conţin în cantităţi mici şi alte
elemente: P, Fe, Mg, Cu, Mn etc.
Reieşind din conţinutul azotului N în proteină (16 % în
mediu) se poate determina indirect cantitatea de proteină brută din
materialul cercetat, utilizînd formula:
Proteina brută = N x 100/16 = N x 6,25
În organismele vii proteinele exercită funcţiile de cataliză,
structură, transport, apărare, depozitare, recepţie şi de reglare a
activităţii genomului, efectuează mişcările şi reprezintă o mare
parte de hormoni.
Pentru proteine se deosebesc patru niveluri de organizare
intramoleculară: structura primară, secundară, terţiară şi cuaternară.
6
Proteinele formează aceste structuri datorită celor cinci tipuri de
legături dintre aminoacizi: peptidice, covalente disulfidice, ionice,
de hidrogen şi hidrofobe. Proteinele au proprietăţi amfotere, fiindcă
conţin grupări acide şi bazice. Proteinele uşor denaturează, ca
rezultat îşi schimbă proprietăţile biologice şi fizico-chimice. Sub
acţiunea enzimelor, bazelor şi acizilor proteinele se descompun
formînd produse intermediare (peptone, polipeptide) şi la ultima
fază a hidrolizei –aminoacizi.
Clasificarea proteinelor simple şi conjugate
Toate proteinele se împart în două grupe mari: proteine
simple (proteine), în compoziţia cărora intră numai resturi de
aminoacizi şi proteine conjugate (proteide), care reprezintă o
combinaţie dintre o proteină simplă cu un compus de natură
neproteică, denumit gruparea prostetică.
Proteinele simple
În funcţie de solubilitatea şi proprietăţile fizice proteinele
simple se divizează în următoarele grupe: albumine, globuline,
prolamine, protamine, histone, gluteline, scleroproteine sau
proteinoide.
Albuminele sînt proteine solubile în apă. Au masa
moleculară relativ mică – de la 10 mii pînă la 100 mii unităţi. Sînt
foarte răspîndite în natură: ovalbumina din albuşul de ou, leucozina
din grîu, legumelina din mazăre, lactalbumina din lapte, etc.
Globulinele sînt proteine insolubile în apă, dar solubile în
soluţii de săruri ale metalelor uşoare (5-10 % NaCl sau Na2SO4).
Au o masă moleculară mare 100 000 – 1 000 000. Sînt foarte
răspîndite în natură: lactoglobulina din lapte, miozina din muşchi,
legumina din mazăre, fasolina din fasole albe etc.
Prolaminele (sau gliadinele) sînt proteinele greu solubile în
apă şi în alcool absolut, dar solubile în alcool de 60-80 %. Ele
conţin multă prolină. Se găsesc mai ales în plante, în seminţele
cerealelor: gliadina din boabele de grîu şi secară, zeina din boabele
de porumb.
Protaminele sînt proteine, soluţiile cărora au un caracter
bazic puternic, sînt uşor solubile în soluţii diluate de acizi, masa
7
moleculară este joasă (pînă la 12 000). Nu conţin sulf, se găsesc în
cantităţi mari în nucleul celular şi sperma peştilor: clupeina din
scrumbie, sturina din nisetru.
Histonele – proteine nucleare cu un caracter slab bazic,
solubile în soluţii diluate de acizi. Intră in componenţa proteidelor
cromozomilor, eritrocitelor , leucocitelor, celulelor timusului.
Glutelinele sînt proteine cu un caracter slab acid, solubile în
baze diluate. Sînt bogate în acid glutamic, au proprietăţi
mucilaginoase, ca şi prolaminele se găsesc în seminţe de cereale
(gluteina din boabele de grîu, orizenina din boabele de orez).
Amestecul format din gluteina şi gliadina care se izolează din făina
de grîu poartă denumirea de gluten. Proteinele din gluten prin
punţile lor -S-S- conferă făinii de grîu proprietatea de a forma cu
apa un aluat elastic, care reţine într-un mod caracteristic dioxidul
de carbon eliberat în timpul fermentării, dînd pîinii o structură
poroasă şi un volum corespunzător.
Scleroproteinele – proteine insolubile (fibrilare). Conţin o
cantitate mare de glicină şi cisteină. Reprezentanţii tipici sînt
colagenul din ţesutul conjunctiv, elastinele din arterii şi tendoane ,
cheratinele din păr, coarne, copite, piele, lînă, unghii.
8
formează hemoglobina, izoaloxazina este gruparea prostetică a
flavinproteidelor (dehidrogenazelor aerobe), derivaţii carotinei
formează rodopsina din retina ochiului.
3. Glicoproteidele au gruparea prostetică de natură glucidică. În
majoritatea cazurilor, gruparea prostetică este reprezentată de
mucopoliglucide, care prin hidroliză dau manoza, galactoza,
hexozaminele, acizii glucuronic, acetic şi sulfuric. Cele mai
importante glicoproteide sînt mucinele în secreţia mucoaselor
(protejează mucoasele tractului gastro-intestinal) şi mucoidele
(intră în constituţia cartilagiilor, oaselor, tendoanelor şi
ligamentelor). Avidina este o glicoproteidă din albuşul de ou
crud, care inhibă activitatea biotinei. În seminţe şi alte organe
vegetale se găsesc glicoproteide care produc aglutinarea
eritrocitelor, ele se numesc lectine. Cantităţi mai mari de lectine
se găsesc în leguminoase.
4. Lipoproteidele au în componenţa lor lipide: colesterol,
fosfolipide, acilgliceroli. Lipoproteidele au o largă distribuţie,
fiind componente structurale ale biomembranelor. În cantităţi
mari se găsesc în ţesutul nervos, plasma sîngelui, lapte,
gălbenuş de ou. Ele ajută la transportul unor substanţe
liposolubile (vitamine, hormoni, carotinoide, diverse
medicamente).
5. Metaloproteidele conţin un metal (Fe, Cu, Mg, Zn, Mn, Co
etc.) fixat prin legături complexe direct de componenţa
proteică. Grupările proteinei care fixează metalul poartă
denumirea de liganzi.
Unele metaloproteide sînt enzime (polifenoloxidaza,
alcooldehidrogenaza), altele îndeplinesc funcţia de proteine
transportatoare de metal (transferina) şi rezerva de metal
(feritina). Ele participă la diverse procese metabolice:
fotosinteza, respiraţia, transportul de O2 şi electroni.
6. Nucleoproteidele sînt constituite din acid nucleic şi proteină,
au o masă moleculară mare (de la cîteva mii pînă la sute de
milioane). Cromozomii, ribozomii, viruşii sînt particule
nucleoproteice.
9
Principiul metodei
Produsul vegetal, care conţine substanţe azotoase, se
mineralizează prin ardere în acid sulfuric concentrat. Ca catalizator,
în dependenţă de substanţă care se arde, se foloseşte sulfat de cupru
sau peroxid de hidrogen, mercur, permanganat de potasiu, selen
etc.
Pentru a ridica temperatura de fierbere a acidului sulfuric se
folosesc cristale de sulfat de sodiu sau potasiu.
În procesul de mineralizare se formează amoniac, care se
uneşte apoi cu acidul sulfuric, formînd sulfat de amoniu:
__
R __ CH COOH + H2SO4 CO2 + H2O + SO2 + (NH4)2SO4
__
NH2
Arderea produsului analizat se efectuează în balonul
Kjeldahl.
După mineralizarea totală soluţia răcită se dozează cu o
cantitate mare de hidroxid de sodiu, iar amoniacul eliminat se
distilează şi se reţine cu soluţie diluată de acid sulfuric. Cantitatea
de acid sulfuric legat se recalculează în amoniu, apoi în azot, care
se exprimă în procente în raport cu masa produsului analizat.
Pentru a calcula cantitatea de azot în substanţa proteică
rezultatul se înmulţeşte cu coeficientul corespunzător. Pentru
majoritatea proteinelor se foloseşte coeficientul 6,25 din
considerarea că cantitatea de azot este în medie 16 %. Pentru
proteinele din cereale coeficientul este egal cu 5,71 din cauză că
cantitatea de azot este în medie 17,5 %.
10
sulfat de cupru (cristale), CuSO4;
sulfat de natriu sau potasiu (Na2SO4 sau K2SO4);
soluţie de 0,02n H2SO4;
soluţie de 0,02n NaOH;
soluţie de 33 % NaOH;
indicator mixt (metilrot-metilen albastru): 0,2 g metilrot şi
0,012 g metilen albastru se dizolvă în 60 cm3 alcool şi cu apă se
aduce pînă la 100 cm3.
11
Metoda determinării azotului total în produse lichide
În două baloane Kjeldahl se măsoară cu pipeta gradată cîte
3
5 cm soluţie pentru analiză (vin, suc etc.). Baloanele se încălzesc
la aparatul de ardere şi se fierb pînă cînd volumul soluţiei ajunge la
1-1,5 cm3 (nu se admite prinderea de fund). Apoi în fiecare balon
după răcire, se dozează cu cilindrul 3 cm3 de H2SO 4 concentrat,
aproximativ 50 mg de CuSO4 şi 0,5 g de Na2SO4, balonul se
închide liber cu dop de sticlă şi se pune la ardere în nişa de
ventilare.
Arderea probei se face pînă cînd soluţia din balon devine
incoloră şi nu conţine resturi carbonizate de substanţă.
Se pregăteşte aparatul Kjeldahl pentru distilare. Apa din
vaporizatorul (1) se fierbe. Balonul Kjeldahl (6) cu proba
neutralizată şi răcită se uneşte la aparat. În balonul conic (de
recepţie) de 250 cm3 (9) se dozează cu pipeta Mor 10 cm3 soluţie
0,02n de H2SO4 şi balonul se instalează sub răcitorul (7) astfel, încît
capătul alonjului (10) să fie de 2-3 mm în soluţie. În balonul
Kjeldahl prin pîlnia (4) se dozează 15 cm3 de apă distilată, apoi cu
cilindrul soluţie 33 % de NaOH din raportul (la fiecare 1 cm3
H2SO4 concentrat luat la ardere se adaugă cîte 5 cm3 soluţie 33 %
de NaOH). Se închide repede clema (5) la pîlnia (4) şi se începe
procesul de distilare a amoniacului, care decurge 15 min.
În ultimele 5 minute alonjul răcitorului nu trebuie să fie în
soluţia de acid. După distilare alonjul se spală cu o cantitate mică
de apă distilată.
La soluţia obţinută din balonul conic de 250 cm3 se dozează
4-6 picături de indicator mixt şi surplusul de acid se titrează cu
soluţie 0,02 n de NaOH din biuretă.
Paralel se pune proba de control, pentru care în balonul
Kjeldahl în loc de vin se ia apă distilată şi se repetă aceleaşi
operaţii descrise mai sus.
La recalcularea cantităţii de azot total se ia în considerare
că 1 cm3 soluţie 0,02 n NaOH corespunde la 0,28 mg de azot.
12
Cantitatea de azot (X) în mg/dm3 în produsul analizat se
calculează după formula:
Întrebări de control:
13
Lucrarea de laborator nr. 2
Importanţa analizei
α–aminoacizii sînt elemente structurale ale moleculei
proteice, adică monomerii proteinelor. Totodată aminoacizii liberi
îndeplinesc funcţii vitale în organisme. Aminoacizii şi amidele lor
se întîlnesc, de regulă, în cantităţi mici în stare liberă în materia
primă de origine vegetală sau animală şi în produsele prelucrării
lor. Dar se găsesc şi în cantităţi mari. De exemplu, în mustul din
struguri, în sucuri şi vinuri aminoacizii constituie mai mult de
jumătate din substanţele azotoase.
În organism şi la prelucrarea materiei prime alimentare din
aminoacizi se formează un şir de substanţe, care determină gustul,
culoarea şi mirosul produselor. Melaninele, melanoidinele, uleiurile
de basamac ş. a. se obţin din aminoacizilor
Proprietăţile chimice ale aminoacizilor
α–Aminoacizii sînt derivaţi ai acizilor carbonici, în
molecula cărora atomul de hidrogen de lîngă atomul α–carbonic
este înlocuit cu gruparea aminică (-NH2). Avînd proprietăţi
amfotere (reacţia 1), α–aminoacizii pot să reacţioneze ca amine
(reacţiile 2-4) şi ca acizi carbonici (reacţiile 5-6):
1)
R CH COOH R CH COO-
NH2 NH3 +
Datorită grupării aminice α–aminoacizii intră în reacţia
specifică cu acidul azotos, pot să reacţioneze cu acizii minerali, cu
aldehidele şi glucidele reducătoare. De exemplu:
14
2)
R–CH–COOH + HNO2 → R–CH–COOH + N2↑ + H2O
| |
NH2 OH
În rezultatul ultimii reacţii se elimină azotul şi se formează
hidroxiacidul. Această reacţie stă la baza determinării cantitative a
aminoacizilor după metoda Van Slyke (se ia în considerare
cantitatea de azot eliminat).
3) Cu HCl se formează o sare complexă:
R – CH - COOH + HCl → [ R–CH–COOH ] Cl—
| |
+
NH 2 NH 3
15
6) R–CH–COOH + HO–C2H5 → R–CH–COOC2H5 + H2O
| |
NH2 NH2
CO CO CO
OH OH -
2 C +R CH COOH __
C =N CH +
OH
CO CO CO
NH2
__
+ R CHO+ 3H2O + CO 2
16
NH2 COOH NH
H2C C=O
CH2 + CH2
-2 H2O O=C CH2
COOH NH2 NH
-H
2
O
R R1
H2N CH CO NH CH COOH
R R1
dipeptidă
Legătura ce se formează între doi aminoacizi (sau n
molecule de aminoacizi) se numeşte legătură peptidică (-CO-NH-).
Aminoacizii, care se conţin în materia primă alimentară, pot
fi supuşi proceselor biochimice de dezaminare oxidativă şi în
continuare decarboxilării şi hidrolizei. Aceste reacţii au loc la
diferite operaţii tehnologice în prezenţa oxigenului, peroxizilor,
chinonelor şi altor oxidanţi. În rezultat se formează aldehide, care
dau deseori produselor finale o aromă specifică.
Dezaminărea aminoacizilor are loc în mai multe etape cu
formare de iminoacid (prin dehidrogenare), care apoi prin hidroliză
trece într-un cetoacid şi amoniac. Iar cetoacidul prin decarboxilare
trece în aldehidă. Respectiv, prin decarboxilarea iminoacidului
rezultă o aldimină, care prin hidroliză se transformă în aldehidă şi
amoniac:
17
- 2 H+ iminoacid
R CH COOH R C COOH
NH2 NH
O
-C
H2 O
+ 2
3
NH
-
- CO2 + H2O
R C COOH R CHO R CH NH
- NH3
aldehida
O
Principiul metodei
α–Aminoacizii uşor reacţionează cu un exces de
formaldehidă formînd baze Schiff (sau derivaţi formolici):
R CH COOH
NH 2 + O = CH2 R CH COOH + H2 O
N=CH 2
N = C H2 N = C H2
Se consideră convenţional, că numărul grupelor carboxilice
titrate sînt echivalente cu numărul grupelor aminice legate de
formaldehidă (ceea ce e corect pentru aminoacizii
monocarboxilici).
Pentru a introduce corecţia la aminoacizii dicarboxilici
(acidul glutamic, asparagic şi alţii), soluţia se neutralizează în
prealabil cu bază pînă la pH = 6,8.
18
Totodată se titrează şi acizii organici (tartric, acetic, malic,
citric etc.), care se conţin în vinuri şi sucuri.
19
5. Biureta se aduce la „zero” cu bază (volumul de NaOH
care s-a consumat la titrarea soluţiei analizate pînă la pH – ul 6,8 nu
se ia în calcul).
6. Conţinutul paharului se titrează cu bază pănă la pH 9,1
Titrarea se repetă de 3-4 ori. Diferenţa volumelor la titrare
nu trebuie să depăşească 0,1 cm3.
Pentru determinarea cantităţii de azot aminic se ia în
considerare numai volumul (în cm3) de bază, care s-a consumat la
titrarea soluţiei de lucru după ce a fost adăugat amestecul formolic.
1 cm3 de soluţie 0,1n NaOH corespunde la 1,4 mg de azot
aminic.
Se calculează conţinutul de azot aminic în mg/dm3 de
soluţie analizată după formulă:
V × 1,4 × K × 1000
N= ,
Vp
unde
V–volumul NaOH în cm3;
K—coeficientul de corecţie al bazei;
Vp—volumul probei în cm3 ;
Întrebări de control
20
Lucrarea de laborator nr. 3.
Importanţa analizei
În toate plantele, în materia primă şi produsele alimentare se
conţin în cantităţi mari diferite substanţe azotoase. La ele se referă
proteinele, polipeptidele, aminoacizii, amidele, vitaminele grupei
B, ureea şi amoniacul.
Pentru biosinteza compuşilor cu azot plantele şi
microorganismele pot folosi azotul anorganic. Omul şi animalele în
cazul proceselor similare folosesc numai azot organic.
Azotul necesar plantelor se găseşte în natură sub formă
nitrică sau amoniacală.
Azotul nitric (NO3-) din sol este direct asimilabil de către
plante. În celulele plantelor azotul nitric este redus la azotul nitros
(NO2-) şi apoi la azot amoniacal (NH3 sau NH4+).
Azotul nitric din sol provine fie din îngrăşămintele chimice
administrate în sol, sau se formează prin oxidarea amoniacului de
către microorganisme specifice (nitrificatoare).
Azotul amoniacal este asimilat direct de către plante. În
organismul vegetal azotul amoniacal participă direct sau indirect
sub formă de compuşi (săruri de amoniu ale acizilor organici,
amidele acizilor asparagic şi glutamic) la biosinteza aminoacizilor.
Azotul amoniacal din sol provine din îngrăşăminte chimice sau din
resturile substanţelor organice în curs de degradare. Procesul se
numeşte amonificare. Azotul organic provenit din substanţele
organice aflate în sol nu este direct asimilabil. Sub acţiunea
bacteriilor de putrefacţie, azotul organic este transformat în
procesul de amonificare în azot amoniacal asimilabil.
Azotul atmosferic nu este asimilabil pentru plante direct, dar
prin intermediul bacteriilor fixatoare de azot, care trăiesc în
nodozităţile de pe rădăcinile leguminoaselor. Transformarea
azotului atmosferic în azot amoniacal este un proces de reducere
enzimatică.
21
Amoniacul în organismul vegetal se formează ca rezultat al
proceselor de dezaminare suferite de aminoacizi şi de alţi compuşi
cu azot şi serveşte în primul rînd la biosinteza de noi aminoacizi şi
compuşi cu azot. Excesul de amoniac, fiind toxic pentru celule este
fixat de plantă sub formă de săruri de amoniu ale acizilor organici,
amide ale aminoacizilor dicarboxilici şi ca uree. Toţi aceşti
compuşi constituie rezervele de azot ale plantei.
Plantele bogate în acizi organici liberi, numite plante acide
(măcriş, revent, begonia etc.) au capacitatea deosebită de a fixa
amoniacul sub formă de săruri de amoniu (oxalat de amoniu, malat
de amoniu, citrat de amoniu, fumarat de amoniu etc.).
Cea mai importantă cale de detoxicare a amoniacului în
celulele plantelor este fixarea sub formă de amide, îndeosebi ale
acizilor aspartic (asparagina) şi glutamic (glutamina). Asparagina şi
glutamina au fost identificate nu numai în plantele superioare, ci şi
în ciuperci, drojdii, bacterii, precum şi în organismele animale.
Formarea asparaginei şi glutaminei este un proces care
decurge cu consum de ATP:
ATP ADP
+ NH3
HOOC - CH - CH2- CH2- CO - NH2 + H3PO4
NH2 glutamina
Amoniacul fixat sub formă de amide (asparagină şi
glutamină) nu este toxic, poate fi eliberat prin hidroliza enzimatică
pentru a fi utilizat în biosinteza compuşilor cu azot sau în
menţinerea echilibrului acido-bazic din plantă:
+ H2O
HOOC - CH - CH2- CH2- CO - NH2 HOOC - CH - CH2- CH2- COOH
- NH3
NH2 glutamina NH2 acid glutamic
22
Fixarea (dezintoxicarea) amoniacului sub formă de uree
este un proces întîlnit în regnul animal şi uneori în cel vegetal,
numit ciclul ureogenetic sau ornitinic.
După cum susţin savanţii V.I. Nilov şi I. M. Scurihin
cantităţile mari de amoniac duc la scăderea calităţii şi anume
gustului vinului, sucului, compotului. De aceie determinarea
amoniacului are o însemnătate teoretică şi practică.
Principiul metodei
Cînd la soluţia analizată, care conţine săruri de amoniu, se
adaugă bază, se elimină amoniac, care cantitativ se reţine cu soluţie
de 0,02 n H2SO4 luată în exces. Titrînd cu hidroxid de sodiu
excesul de acid, care n-a reacţionat cu amoniacul, se poate calcula
cantitatea de acid necesară pentru a neutraliza amoniacul.
Bazele puternice, odată cu descompunerea sărurilor de
amoniu, parţial hidrolizează şi amidele, care se conţin în obiectele
analizate:
R – CO – NH2 + KOH → R – COOK + NH3
Amoniacul format în acest caz poate falsifica rezultatele
analizei.
De aceea pentru a evita hidroliza amidelor, în loc de bază la
soluţia analizată se dozează soluţie saturată de K2CO3, care în
procesul hidrolizei formează un mediu bazic relativ slab.
Chimismul procesului:
23
Aparate, vase şi materiale:
4 ceşti Conwei;
2 pipete Mor de 5 cm3 şi o pipetă gradată de 5 cm3;
4 baloane conice de 100 cm3;
soluţie saturată de carbonat de potasiu (K2CO3);
soluţie de 0,02 n H2SO4;
soluţie de 0,02n NaOH;
indicator mixt (metilrot-metilen albastru): 0,2 g metilrot şi
0,012 g metilen albastru se dizolvă în 60 cm3 alcool şi cu apă se
aduce pînă la 100 cm3.
Fig.1.Ceaşca Conwei
24
Experienţa se repetă în 2 ceşti Conwei. Paralel se face proba
de control, unde în loc de soluţie analizată se foloseşte apă distilată.
Cantitatea de azot amoniacal (mg/dm3) în soluţia analizată
se calculează după formula:
(Vcontrol - V lucru) * K * 0.28 * 1000
X=
V
unde:
V control – volumul soluţiei de 0,02n NaOH, folosită la
titrarea probei de control, cm3;
V lucru - volumul soluţiei de 0,02n NaOH, folosită la titrarea
probei de lucru, cm3;
K – coeficientul de corecţie al bazei;
0,28 – cantitatea de azot în mg, care corespunde unui cm3
de soluţie 0,02n NaOH;
V – volumul probei analizate, cm3.
Întrebări de control:
1. Numiţi substanţele azotoase din organisme vii.
2. Ce forme de azot pot utiliza plantele şi animalele ?
3. Descrieţi transformările azotului nitric în plante.
4. Cum se numeşte procesul oxidării amoniacului pîna la
nitraţi ?
5. Daţi definiţia amonificării.
6. Descrieţi asimilarea azotului atmosferic ?
7. Prin ce procese se produce amoniacul în organism ?
8. Cum se fixează excesul de amoniac în plante ?
9. Scrieţi reacţiile formării şi descompunerii amidelor în
plante.
10. Descrieţi principiul metodei determinării amoniacului.
11. Regulile tehnicii de securitate la determinarea
amoniacului.
25
Lucrarea de laborator nr. 4
26
Precipitaţia ireversibilă are loc, cînd proteinele formează
precipitate insolubile, care nu se dizolvă la înlăturarea factorului
precipitant.
Denaturarea este modificarea structurii spaţiale a
moleculei proteice ce duce la micşorarea solubilităţii, pierderea
activităţii biologice. Denaturarea poate fi reversibilă şi ireversibilă.
Denaturarea proteinelor are loc sub acţiunea unor agenţi
denaturanţi care pot fi de natură fizică sau chimică. Factorii fizici
sînt: încălzirea, creşterea presiunii, congelarea, radiaţiile ionizante,
ultrasunetele etc. Agenţii chimici: ureea, sărurile metalelor grele
(mercur, argint, cupru, plumb, bismut, stibiu), solvenţii organici,
acidul tricloracetic, compuşii coloidali (acid wolframic, tanin), pH
mai mic de 4 şi mai mare de 10, detergenţi.
Denaturarea este foarte importantă în panificaţie, prepararea
prafului de ou, lapte, conservare. Proteoliza proteinelor denaturate
este mai rapidă, deci şi asimilarea lor este mai rapidă.
Altă proprietate caracteristică a proteinelor este capacitatea
de adsorbţie pe argila de bentonită sau silicagel, răşini sintetice,
gelatină, cărbune. Fenomenul de adsorbţie (reţinere la suprafaţă)
are loc la suprafaţa de contact dintre faza dispersă şi mediul
dispergent şi constă în fixarea substanţelor (proteinelor) ce se
găsesc în soluţie de către partuculele coloidale.
Adsorbţia are un rol important în vinificaţie şi conservare.
Se aplică acest proces la limpezirea mustului înainte de fermentaţie,
sucurilor şi vinurilor.
Principiul metodei
Metoda Lowry este una din cele mai sensibile metode de
determinare a proteinelor. Este bazată pe două reacţii concomitente
- biuretică şi Folin. Ultima este caracteristică pentru aminoacizii
triptofan, tirozina, cisteina, care reduc Reactivul Folin (amestec de
acizi dodecawolframofosforic H3PW12O40 şi
dodecamolibdofosforic H3PMo12O40) pînă la oxizi (W8O23,
Mo8O23) de culoare albastră. Din cauza formării complecşilor
moleculelor proteice cu cupru coloraţia cu reactivul Folin devine
mult mai intensă decît numai datorită aminoacizilor sus-numite.
27
Deoarece în reacţie intră şi alţi aminoacizi, intensitatea culorii este
direct proporţională cu cantitatea de proteine în soluţia analizată şi
se determină cu ajutorul fotoelectrocolorimetrului la lungimea de
undă 650 nm.
28
Ordinea îndeplinirii lucrării
Într-o eprubetă cu 10 cm3 de vin se dozează 1 cm3 acid
tricloracetic. Soluţia se pune în frigorifer pe douăzeci şi patru ore.
Apoi soluţia se centrifughează 1 oră la 5000 ture/minut şi se
decantează.
În eprubetă cu precipitat se dozează 1 cm3 soluţie 1n NaOH
şi după 30 minute se adaugă 1 cm3 H2O. Din proba obţinută, în altă
eprubetă, se ia 1 cm3 soluţie şi se dozează 1 cm3 reactiv "A" şi
după 10 minute se adaugă 4 cm3 reactiv "B".
Paralel cu proba de analiză se pregăteşte proba de
comparaţie, constituită din: 1 cm3 H2O + 1 cm3 NaOH + 2 cm3
reactivul"A" + 8 cm3 reactivul "B".
Eprubetele cu probele de analiză şi comparaţie se plasează
în baia de apă la temperatura 55 oC pe 5 minute şi după răcire
rapidă se măsoară intensitatea culorii. Probele se colorimetrează
folosind filtru de lumină №8 (roşu) cu lungimea de undă λ=650
nm, cuva cu lungimea 10 mm.
Conţinutul proteinelor se calculează după formula:
X = Do x 2 x 250 =Do x 50
V
unde:
X – cantitatea de proteine în soluţia analizată, mg/dm3;
Do – densitatea optică a soluţiei analizate;
2 – volumul bazei şi soluţiei analizate, în cm3;
250 – coeficient de recalculare;
V – volumul vinului luat pentru analiză, în cm3.
Întrebări de control
29
Lucrarea de laborator nr. 5
30
soluţie de albuş de ou, (albuşul unui ou se separă de
gălbenuş, se amestecă cu 0,5 dm3 apă distilată şi se agită minuţios);
soluţie 1 % de gelatină;
soluţie 1 % de CuSO4;
soluţie 10 % de NaOH;
soluţie 30 % de NaOH sau 20 % de NH4OH;
acid azotic concentrat de HNO3;
acid acetic glacial de CH3 COOH;
acid sulfuric concentrat de H2SO4;
reactivul Millon: la 40 g mercur se dozează sub nişa de
ventilaţie 50 cm3 acid azotic concentrat (ρ=1,42), se lasă pe 30
minute la temperatura de cameră, apoi se încălzeşte în baia de apă
pînă mercurul se dizolvă complet. Soluţia obţinută se diluează cu
două volume de apă (aproximativ pînă la 160 – 180 cm3 ), după
depunere se decantează de sediment;
5 % soluţie de Pb(CH3COO)2.
Chimismul reacţiei:
31
R R R1
R1
CH CO NH CH CH C N CH
NH CO N OH OH C-OH
... Cu -2 H 2 O
... OC NH C
N
...
HO HO
... CH NH CO CH HO
HC N C CH
R3 R2
R3 R2
un sector din catena
polipeptidicã
R R1
CH C N CH
N O C-OH
... Cu
C
N
...
O
HO
HC N C CH
R3 R2
complex biuretic
Ordinea îndeplinirii lucrării
În trei eprubete se administrează: în prima – 0,5 cm3 soluţie
de cazeină sau lapte degresat; în a doua – 0,5 cm3 soluţie albuş de
ou; în a treia - 0,5 cm3 soluţie gelatină. În fiecare eprubetă se
dozează cîte 0,5 cm3 soluţie 10 % NaOH şi cîte 5 picături soluţie
1% CuSO4. Eprubetele se agită. Apare culoarea violetă.
Se face concluzia despre natura chimică a substanţelor
analizate.
Reacţia xantoproteică. Aminoacizii aromatici la
fierbere cu HNO3 concentrat se supun nitrării. Ca rezultat soluţia
capătă o culoare galbenă care trece în oranj la adăugarea bazei.
Acidul azotic nitrează nucleul benzenic al aminoacizilor
ciclici: tirozină, fenilalanină, formînd nitrocompuşi de culoare
galbenă. De exemplu, radicalul tirozinei din componenţa proteinei
în prezenţă HNO3 se transformă în nitrotirozină galbenă, care în
mediul bazic dă culoare oranj (forma chinoidică).
Chimismul reacţiei:
32
O
O
O O
N N
O O
OH OH O
chinoidică
Ordinea îndeplinirii lucrării
În trei eprubete se administrează: în prima – 0,5 cm3 soluţie
de cazeină sau lapte degresat; în a doua – 0,5 cm3 soluţie albuş de
ou; în a treia – 0,5 cm3 soluţie gelatină. În fiecare eprubetă se
dozează cîte 5-6 picături HNO3 concentrat şi eprubetele se
încălzesc (orientîndu-le în direcţie opusă de la sine sau de la
persoanele, care lucrează în laborator). În urma fierberii, conţinutul
eprubetelor se colorează în galben. După răcire în eprubete se
adaugă 10 picături soluţie 30 % de NaOH (sau soluţie 20 % de
NH4OH), culoarea soluţiilor devine oranj. Se face concluzia despre
compoziţia aminoacidică a proteinelor analizate
Reacţia Millon. Reacţia este caracteristică aminoacizilor
care au radicalul fenolic, de exemplu, tirozina. Reactivul Millon la
cald dă cu tirozina o coloraţie roşie. Adică, la încălzirea proteinei
cu o soluţie azotat mercuric şi în prezenţa acidului azotic concentrat
cu puţin acid azotos se formează un precipitat roşu cărămiziu,
datorită formării nitrocompuşilor tirozinei în forma chinoidică.
Ordinea îndeplinirii lucrării
În trei eprubete se administrează: în prima – 0,5 cm3 soluţie
de cazeină sau lapte degresat; în a doua – 0,5 cm3 soluţie albuş de
ou; în a treia – 0,5 cm3 soluţie gelatină. În fiecare eprubetă se
dozează cîte 5-7 picături reactiv Millon, eprubetele se încălzesc
atent, îndreptîndu-le în direcţie opusă. Peste un timp se observă
apariţia unei coloraţii roşietice şi apariţia precipitatului cărămiziu.
33
După schimbarea culorii se face concluzie despre proteinele în care
este prezentă tirozina. Chimismul reacţiei:
O
. .._ _
HN CH C
CH 2
2 + 2 H O _- -_ N O 2 + H g 2( N O 3 )2
OH
O O
... HN CH C ... ... _ _ ...
HN CH C
CH 2 CH 2
O O
_ _ _ _
O 2 N = N O _ _H g _ _H g O_ _ N = N O 2
O O
Întrebări de control:
35
Lucrarea de laborator nr. 6
Determinarea formei reduse a glutationului
(în levuri sau germenii cerealelor)
Glutationul este o tripeptidă formată din trei resturi de
aminoacizi: acidul glutamic, cisteină, glicocolul (glicina):
HS
CH 2
NH 2 - CH - CH 2 - CH 2 - CO - NH - CH - CO - NH - CH 2 -COOH
COOH
Glutationul este foarte răspîndit în natură, se conţine în
aproape toate celulele vii în cantităţi mici. În cantitate mare a fost
găsit în germenii grîului pînă la 0,45 % din masa uscată, în levurile
vechi, struguri. El prezintă o substanţă solidă, albă, solubilă în apă
şi alcool. Din soluţia alcoolică cristalizează sub formă de prisme.
Glutationul are 2 grupe carboxilice libere, deci are un
caracter pronunţat acid (pH= 2,83).
Datorită grupării sulfhidrilice (-SH) glutationul are
proprietăţi reducătoare puternice. Poate fi în două forme: redusă (G
- SH) şi oxidată ( G-S-S-G). Aceste forme trec uşor una în alta
după următoarea reacţie:
-2 H+
G - SH + HS - G G -S-S-G
+ 2 H+
36
Forma redusă de glutation se acumulează în cantităţi mai
mari la încolţirea cerealelor şi în procesul de învechire a levurilor,
şi deci este un factor, care diminuează puternic calitatea acestor
produse vegetale. De exemplu, la a patra zi de germinare cantitatea
de glutation redus în orz creşte de 2,5 ori.
În panificaţie pentru a preveni distrugerea glutenului,
glutationul redus se oxidează cu acidul dehidroascorbic (vitamina
C oxidată).
Glutationul redus protejează oxidarea acidului ascorbic şi al
adrenalinei.
Principiul metodei
39
Lucrarea de laborator nr. 7
40
Unitatea de activitate enzimatică (U) reprezintă cantitatea
de enzimă care catalizează transformarea a 1µmol substrat /min., în
condiţii standard (t 0 = 25 0C, pH şi concentraţie de substrat
optime). Această unitate de măsură este recomandată de CE din
1961 şi folosită pînă în prezent. Dar CE recomandă trecerea la
unitatea Katal.
Katalul (Kat) reprezintă cantitatea de enzimă care
catalizează transformarea a 1 mol substrat ре secundă în condiţii
standard.
În practică se foloseşte microkatalul (µKat = 10–6Kat),
nanokatalul (nKat =10–9 Kat), picokatalul (pKat=10–12 Kat).
Pentru enzimele solide (praf) se foloseşte activitatea
specifică – reprezintă numărul de unităţi enzimatice /mg proteină
(respectiv Kat/mg proteină şi Kat/kg proteină), sau reprezintă
numărul de Katali care corespund la 1 kg de enzimă.
Pentru enzime în stare cristalină cu masa moleculară
cunoscută se foloseşte activitatea enzimatică molară (număr de
transfer) – reprezintă numărul de molecule de substrat transformate
de către o moleculă de enzimă timp de 1 min sau 1s (Kat/mol
enzimă), sau reprezintă numărul de katali care revin unui mol de
enzimă.
Metodele principale de separare şi purificare a enzimelor.
Enzimele se conţin în stare dizolvată în plasma tuturor
ţesuturilor vegetale, animale şi a microorganismelor (bacterii,
drojdii, mucegaiuri).
Prelucrarea materiei prime de origine vegetală, animală sau
microbiană este în linii generale aceia-şi: omogenizare, extracţie,
concentrare, fracţionare şi uscare. Preparatele enzimatice parţial
purificate pot fi în formă lichidă, semilichidă sau uscată.
Enzimele din ţesuturi se extrag uşor cu ajutorul apei,
soluţiilor de săruri, acizi şi baze slabe. Un dizolvant bun pentru
majoritatea enzimelor îl constituie soluţia apoasă de glicerol.
Dacă enzimele sînt strîns legate cu elementele structurale
ale celulei, atunci pentru distrugerea ţesuturilor se folosesc: nisipul
41
de cuarţ sau sticlă, dezintegrarea prin macerare, autoliza şi în
aparate speciale – omogenizatoare etc.
Impurităţile (molecule cu masa moleculară mică) din
soluţiile obţinute se înlătură prin dializă, electrodializă,
precipitarea enzimelor cu alcool, acetonă, săruri.
După extracţie soluţiile enzimatice se purifică şi se
concentrează prin metodele de cromatografie şi electroforeză.
Rolul invertazei
42
CH2OH
O H CH2OH
H O H
H
OH H H OH
OH
O CH2OH
H OH OH H
Acţiunea invertazei
44
Ordinea îndeplinirii lucrării
Pregătirea probelor pentru inversia zaharozei
Probe de 10 cm3 vin sau suc se dozează în două baloane
conice de 100 cm3. Conţinutul primului balon (proba de control) se
fierbe timp de 3 minute pentru inactivarea enzimei. Apoi în ambele
baloane se dozează cîte 5 cm3 soluţie 10 % zaharoză, 10 cm3
soluţie-tampon acetică cu toluol. Baloanele se închid strîns cu
dopuri şi se lasă pentru 24 ore la temperatura 25 oC în termostat.
După expirarea termenului proba de lucru (cu excepţia probei de
control) se fierbe 3 minute pentru inactivarea enzimei.
Diluarea probelor
Conţinutul ambelor baloane se transferă cantitativ în două
baloane cu cotă de 200 cm3 şi se aduc cu apă distilată pînă la cotă,
se amestecă minuţios. Din fiecare balon se iau cu pipeta probe de
10 cm3, care se transferă în baloane conice de 100 cm3 şi se
determină în ele zahărul rezidual după metoda Bertrand.
Pentru aceasta la fiecare probă se adaugă cu cilindru cîte 10
3
cm soluţie Fehling I şi II. Probele se încălzesc şi se fierb 3 minute.
La încălzirea soluţie Fehling I şi II cu zahărul invertit (zaharuri
reducătoare) se depune Cu2O (protoxid de cupru) roşu – cărămiziu
şi au loc următoarele reacţii:
CuSO4 + 2 NaOH → Cu(OH)2 + Na2SO4
COOK COOK
CHOH CHO
+ Cu (OH)2 Cu + 2 H2O
CHOH CHO
COONa COONa
complex cuprotartric
45
CH= O COOH
COOK COOK
HCOH HCOH
CHO HCOH
HOCH + 2 Cu + 2 H2O HOCH + Cu2O +2
CHO HCOH
HCOH HCOH
COONa COONa
HCOH HCOH
CH2OH CH2OH
46
Imediat după ultima spălare în vasul conic (unde a fost
proba) se adaugă 10 cm3 soluţie ferică – amoniacală (cu cilindrul)
pentru dizolvarea sedimentului de Cu2O şi se agită pînă cînd
dispare precipitatul roşu – cărămiziu de pe pereţii balonului conic.
Între timp pîlnia Şott se montează pe un alt balon Bunzen curat, iar
pompa de apă se deconectează.
Soluţia ferică - amoniacală din balonul conic se toarnă peste
precipitatul din pîlnia Şott şi se amestecă cu o baghetă de sticlă
pînă la dizolvarea completă a precipitatului de Cu2O. Apoi balonul
Bunzen se uneşte cu pompa de apă şi amestecul obţinut se filtrează.
Balonul conic (unde a fost soluţia ferică - amoniacală) se spală de
5-6 ori cu apă distilată fierbinte şi se filtrează prin pîlnia Şott pînă
cînd picăturile de filtrat din balonul Bunzen au reacţie neutră
(dispare reacţia acidă a soluţiei, pH se determină prin intermediul
indicatorului universal de hîrtie). Are loc reacţia de dizolvare a
sedimentului de Cu2O în soluţia de sulfat feric Fe2(SO)3:
Cu2O + Fe2(SO4)3 +H2SO4→2CuSO4 + 2 FeSO4 + H2O
Sulfatul feros format (FeSO4) se titrează cu KMnO4 :
10 FeSO4 + 2 KMnO4 + 8 H2SO4 → 5 Fe2(SO4)3 +
+2 MnSO4 + K2SO4 + 8 H2O.
Filtratul limpede cu nuanţe verzui se titrează cu soluţie 0,05
n de KMnO4 direct în balonul Bunzen pînă cînd soluţia se colorează
în roz şi la o picătură în exces de KMnO4 coloraţia persistă un
minut. Volumul soluţiei 0,05N KMnO4 consumat la titrarea probei
se fixează.
Analogic se tratează şi se filtrează proba de lucru.
Pentru a obţine rezultate comparabile este necesar în
probele diluate de vin de repetat determinarea zahărului prin
metoda Bertran de 2-3 ori (în proba de lucru şi control). În
corespundere cu reacţiile scrise mai sus 1 cm3 soluţie 0,05 n
permanganat de potasiu echivalează cu 3,18 mg cupru. Cantitatea
de zahăr invertit în mg se determină după tabelul Bertrand (tab.1),
care indică ce cantitate de zahăr invertit corespunde la anumite
cantităţi de cupru.
47
Tabelul 1. Calculul conţinutului de zahăr invertit în mg după
Bertrand.
Zahăr Cu Zahăr Cu Zahăr Cu Zahăr Cu
48
Calculul activităţii enzimei invertaza
Activitatea invertazei sau zaharazei (Az) se exprimă în
„unităţi de activitate enzimatică” într-un dm3 vin sau suc.
Pentru aceasta cantitatea de zahăr invertit găsită după
tabelul Bertrand (Z) se recalculează la conţinutul lui în volumul
balonului cu cotă (200 cm3) şi se înmulţeşte cu 0,95 (coeficientul
de recalculare a zahărului invertit în zaharoză), şi se determină
cantitatea zaharozei (mg), care s-a supus hidrolizei. Activitatea
invertazei se determină după formula:
P ⋅1000 ⋅1000
As =
342 ⋅ t ⋅ v
unde:
P – masa de zaharoză care a fost hidrolizată [mg];
P = Plucru-Pcontrol = (Zlucru –Zcontrol) x 0,95 x 20
342 – masa moleculară a zaharozei;
t – durata inversiei [min];
v – volumul de vin [cm3].
1000 - transformarea mg în micrograme ;
1000 - recalcularea la 1 dm3.
Întrebări de control:
49
Lucrarea de laborator nr. 8
Determinarea activităţii enzimei polifenoloxidaza
50
6. Ligazele sau sintetazele sînt enzime care catalizează
reacţiile de formare a legăturilor chimice între două molecule cu
ajutorul energiei cedate de substanţele macroergice (ATP, GTP,
etc.)
Fiecare enzimă are codul de patru cifre, stabilit de Comisia
de Enzimologie a Uniunii Internaţionale de Biochimie (1961).
Prima cifră indică clasa la care aparţine enzima. Şase clase
de enzime se formează în funcţie de tipul general al reacţiilor
catalizate. A doua cifră indică subclasa, referitor la natura chimică
a grupărilor la substrat, a treia cifră reflectă o subdiviziune din
aceeaşi subclasă, iar a patra – enzima concretă (numărul de ordine
al enzimei respective în subdiviziunea din interiorul subclasei).
De exemplu, enzima dehidrogenaza alcoolului (codul
1.1.1.1) este o oxidoreductază (clasa 1), acţionează asupra grupei
CHOH a donatorului de hidrogen (subclasa 1), piridinnucleotidele
(NAD+ şi NADP+) servesc ca acceptor de hidrogen (subsubclasa 1)
şi enzima este prima (a patra cifră-1) din această ultimă diviziune.
Importanţa analizei
Polifenoloxidaza (EC.1.10.3.2) este cunoscută şi sub
denumirea catecholoxidaze, o-difenoloxidaza sau, mai recent,
oxigen oxidoreductaza – enzima din grupa oxidazelor clasei
oxidoreductazelor, care transportă electronii direct la oxigen.
Polifenoloxidaza este răspîndită în plante, găsindu-se în cantitate
mai mare în special în ciuperci, tuberculi de cartofi, frunze de ceai
şi de tutun, boabe de cafea şi în diferite fructe: mere, piersici,
caise, banane, în struguri, etc. Polifenoloxidaza (PFO) are o masă
moleculară de 34000, reprezintă o proteină, ce conţine cupru (0,26
%). Ea poate cataliza oxidarea monofenolilor în difenoli
(activitatea crezolică) şi a o-difenolilor în o-chinone (activitatea
catecholazică):
51
Activitatea crezolica Activitatea catecolazica
__ __
__ R
R + 1/2 O 2
R + 1/2 O2
OH OH O
monofenol OH O
o-difenol chinona
PFO oxidează substanţele tanante (taninurile). Prin acţiunea
ei se explică brunificarea legumelor şi fructelor la uscare.
PFO are un rol important la respiraţia plantelor. După teoria
lui V.I. Paladin sistema polifenol-chinonă are un rol însemnat în
calitate de verigă intermediară la oxidarea diferitelor substanţe
organice în procesul respiraţiei plantelor.
Participarea PFO în acest proces poate fi redată prin schema
următoare:
Compus redus o-chinona
R H2O
OH
OH + 1/2 O2
Compus oxidat o-difenol
Aşadar o cantitate mică de polifenol şi chinonă respectivă
poate de multe ori să fie supusă variabil oxidării şi reducerii.
Sistema PFO, polifenolilor şi chinonilor respectivi, poate
oxida acidul ascorbic în materia primă alimentară. Această situaţie
se ia în considerare la prelucrarea fructelor, legumelor şi
strugurilor, care conţin acid ascorbic.
Materia primă vegetală (fructe proaspete tăiate, legume şi
struguri) în contact cu oxigenul din aer se îmbrunează din cauza
52
polimerizării oxidative a chinonelor formate din mono- şi difenoli.
Pentru inactivarea PFO şi prevenirea formării chinonelor se
foloseşte tratamentul termic (de exemplu, blanşarea fructelor) sau
chimic – cu SO2 sau cu K2S2O5 etc.
Principiul metodei
Metoda determinării polifenoloxidazei se bazează pe
proprietatea ei de a oxida pirocatehina în orto-chinonă. Orto-
chinona oxidează acidul ascorbic. Anume acidul ascorbic rămas în
mediu de reacţie se determină cantitativ prin metoda de titrare cu
0,02 n soluţie de iod.
o-chinona
OH
Acidul dehidroascorbic + 1/2 O2
OH
pirocatehina
Prin această metodă se determină activitatea
polifenoloxidazei numai în primele 2 minute de acţiune asupra
substratului.
Aparate, vase şi materiale:
54
corespunde unui gram de produs, exprimată în unităţi de
„activitatea enzimatică” se calculează după formula:
(Vc-Vl) x 10 x 10
APFO = = (Vc-Vl) x 10
5x2 ,
unde:
Vc – volumul soluţiei 0,02 n iod, care s-a consumat la
titrarea a 5 cm3 soluţie de control;
Vl – volumul soluţiei 0,02 n iod, care s-a consumat la
titrarea a 5 cm3 soluţie de lucru;
10 – numărul de µmol de acid ascorbic;
10 – gradul de diluare a probei;
5 – volumul filtratului, cm3 ;
2 - durata acţiunii enzimei, minute.
Întrebări de control:
55
Lucrarea de laborator nr. 9
56
Determinarea colorimetrică a activităţii lacazei
Principiul metodei
H3CO- - OCH3
O= =HC-N=N-CH= =O
H3CO- - OCH3
Forma oxidata chinonica (rosu-violet)
Exprimarea rezultatelor
57
Notă: metodele colorimetrice necesită de a lucra cu soluţii
destul de limpezi şi incolore la start. Ele pot fi rezervate pentru
lucrul în soluţii pure (pentru determinarea pH-lui optim, Km şi
Vm) sau în cazul mustului din struguri, pentru determinări în „must
decolorat”.
58
Notă: valoarea extincţiei trebuie să fie deja diferită de
indicaţia zero iniţială.
De notat pentru fiecare probă variaţia extincţiei în fiecare
minut, timp de 8 minute (după ce aparatul a fost reglat la "zero" în
timpul zero)
Determinările se efectuează cu fiecare din soluţiile tampon
propuse: tampon citrat – fosfat 0,1 M, pH-3; 4; 5; 6 şi 7.
Rezultate
1.Cinetica
Trasa-ţi pe aceiaşi foaie de hîrtie milimetrică curbele
reprezentative a cineticii de oxidare a siringaldazinei: Extincţia =
= f (timpul) pentru diferite valori a pH-lui în soluţiile tampon
analizate. (Se va lua ca unitate pentru axa absciselor 25 cm = 10
minute).
2. Vitezele iniţiale
Determinaţi pantele curbelor, exprimate în ∆
extincţie/minut. Aceste pante corespund vitezelor iniţiale de
oxidare enzimatică.
Trasa-ţi curba ∆ Extincţie /minut = f (pH).
Analizaţi această curbă. La ce concluzii aţi ajuns?
Notă: toate rezultatele experimentate şi calculele trebuie să
fie prezentate în formă de tabel.
59
Această eliminare se va face prin tratarea mustului cu o răşină
absorbantă : polivinilpolipirolidonă (PVPP).
60
Notă: valoarea extincţiei trebuie să fie deja mai mare de
„0”, care este valoarea iniţială. Se notează valoarea extincţiei în
timp (8 minute).
c) Rezultate:
1. Cinetica
Trage-ţi Pe aceia-şi foaie de hîrtie milimetrică curbele
reprezentative a cineticii oxidării siringaldazinei:
Extincţia = f (timpul) pentru diferite probe examinate. (De
luat ca unitate pentru axa absciselor 25 cm = 10 minute).
2. Vitezele iniţiale
De determinat pantele curbelor, exprimate în
extincţie/minut. Aceste pante corespund la vitezele iniţiale de
oxidare enzimatică.
Transforma-ţi aceste rezultate în „unităţi de activitate”
considerînd că, în condiţiile de măsurări utilizate, o soluţie de 1
µmole de siringaldazină pe litru (1µM) reprezintă o extincţie de
0,065 (ε = 65000, l = 1 cm). (P.M. siringaldazină = 360)
Principiul metodei
61
În rezultat, dacă lacaza se conţine numai în boabele
contaminate de Botrytis cinerea, boabele strugurilor sănătoşi conţin
în mod normal o altă fenoloxidază: tirozinaza (EC 1.10.3.1.),
capabilă de a oxida un număr mare de compuşi monofenolici şi
orto-difenolici şi care trebuie, deci, să fie inhibaţi în timpul
măsurării activităţii numai a lacazei.
Electrodul polarografic
Întrebări de control:
1. Caracteristica lacazei.
2. Explicaţi metoda colorimetrică a activităţii lacazei.
3. Explicaţi metoda polarografică a activităţii lacazei.
4. Cum se determină lacaza în soluţii pure şi must de
struguri?
5. Tehnica securităţii la determinarea lacazei.
63
Lucrarea de laborator nr. 10
catalaza
H2O2 H2O + 1/2 O2
catalaza
2 H2O2 2 H 2O + O 2
66
soluţie 10 % H2SO4;
probe de produs (făină, cereale, malţ).
(a-b) x 1,7 x 5
Ac =
n
unde:
a – volumul soluţiei 0,1N KMnO4 pentru titrarea probei de
control, cm3;
b - volumul soluţiei 0,1N KMnO4 pentru titrarea probei de
lucru, cm3;
5 – recalcularea la volumul extractului
1,7 – mg H2O2 echivalente 1cm3 0,1N KMnO4;
n- masa probei, g.
67
b) pentru probe lichide
(a-b) x 0,85
Ac =
n
unde:
a – volumul soluţiei 0,05 n de KMnO4 pentru titrarea probei
de control, cm3;
b - volumul soluţiei 0,05 n de KMnO4 pentru titrarea probei
de lucru, cm3;
0,85 – mg de H2O2 echivalente cu 1cm3 0,05 n de KMnO4;
n - volumul vinului analizat, cm3.
68
Întrebări de control:
69
Lucrarea de laborator nr. 11
Importanţa analizei:
70
1000.000 unităţi). Caracteristica amilozei şi amilopectinei este
prezentată în tabelul 1.
71
Structura macromoleculei de amilopectină:
72
+ n H2O
(C6H10O5)n dextrine nC6H12O6
Acid Acid
mineral mineral
amilaze amilaze
amidon dextrine maltoza
73
de potasiu şi sulfatului de zinc). Soluţia transparentă se
polarimetrează.
Aparate, vase şi materiale:
zaharimetru universal CУ-3;
cîntar tehnic;
baia de apă;
2 baloane cu cotă de 50 cm3;
baloane conice de 250 cm3;
cilindre de 25 cm3;
pipete de 2, 5, 10, 25 cm3;
pîlnie din sticlă;
filtru de hîrtie;
soluţie 0,31n de HCl (sau soluţie cu concentraţia 1,124%);
soluţie 25 % HCl;
reactivul Karrez I: (15g [K4Fe (CN)6]3 X 3 H2O cu
eroarea ± 0,01 g, se dizolvă în balon cotat 100 cm3 şi se aduce cu
apă distilată pînă la cotă);
reactivul Karrez II: (30g ZnSO4 X 7 H2O cu eroarea ±
0,01 g, se dizolvă în balon cotat 100 cm3 şi se aduce cu apă distilată
pînă la cotă).
Reactivul Karrez I şi II pot fi înlocuite cu soluţie 2,5 %
molibdat de amoniu sau soluţie 4 % de acid
dodecavolframofosforic;
produse pentru analiză: făină, crupe şi cereale măcinate.
74
Pentru a precipita proteinele şi a limpezi soluţia în balon se
adaugă cu cilindrul reactivul – precipitant: cîte 1 cm3 soluţie Karrez
I şi II. După 5 minute conţinutul balonului se aduce cu apă distilată
pînă la cota 50 cm3. Soluţia se agită şi se filtrează prin hîrtie de
filtru pliată într-un balon conic uscat. Primele porţii de filtrat (pînă
la 5-10 cm3) nu se folosesc. Cu filtratul limpede la ot = 20 oC se
umple tubul de polarizare cu lungimea 2 dm. Se determină unghiul
de rotaţie a planului de polarizare la zaharimetru CУ-3.
Concomitent se pregăteşte proba de control pentru a
introduce corecţie la substanţele solubile în apă optic active care,
nu precipită cu reactivul precipitant şi se găsesc în soluţie (în
special glucidele).
Pentru proba de control se cîntăreşte 5 g de produs, care se
transferă în balonul cotat de 50 cm3, se adaugă 30 cm3 apă distilată
şi se agită timp de 15 minute. Pîlnia şi gîtul balonului se clătesc cu
10 cm3 apă distilată şi soluţia se decolorează cu reactivul–
precipitant Karrez I şi II ca în proba de lucru. Timp de 5 minute
conţinutul balonului se agită şi se aduce cu apă distilată pînă la cota
50 cm3, se filtrează. Se măsoară cu cilindrul 25 cm3 de filtrat
limpede, se transferă într-un balon cotat de 50 ml şi se adaugă
1 cm3 soluţie 25 % HCl, se menţine 15 minute în baia de apă la
fierbere, apoi se răceşte sub robinet pînă la ot = 20 oC şi se aduce
pînă la cotă cu apă distilată. Cu filtratul limpede la ot = 20 oC, se
umple tubul de polarizare cu lungimea 2 dm. Se determină unghiul
de rotaţie a planului de polarizare la zaharimetru CУ-3.
Conţinutul amidonului se calculează după formula:
(α − α ) × 100 × 100 × 50
C = l 20 c ,
[α ]D × m × l × (100 − W )
unde:
C – partea de masă a amidonului (%) în substanţe uscate;
αl– mărimea unghiului de rotaţie a planului de polarizare
obţinut de substanţele optic active în experienţa de bază, în grade a
zaharimetrului ;
75
αc – mărimea unghiului de rotaţie a planului de polarizare
obţinut de substanţele solubile în apă optic active (nu de amidon) în
proba de control, în grade a zaharimetrului;
(αl - αc) – mărimea unghiului de rotaţie a planului de
polarizare obţinut de proba de amidon dizolvată, în grade a
zaharimetrului;
m – masa (2,5 g) produsului analizat, g;
l – lungimea tubului de polarizare, dm;
[α] D20 – capacitatea de rotaţie spicifică a amidonului din
produsul analizat, în grade;
W – conţinutul de masă a umidităţii în produsul analizat, %.
De obicei pentru a calcula conţinutul de masă a amidonului
se utilizează tabelul 1, unde sînt date mărimile capacităţii de rotaţie
specifică [α] D20 pentru diverse produse ce conţin amidon şi
coeficientul Evers (F, egal cu 1000/[α]D20), pentru diverse produse
ce conţin amidon.
Capacitatea de rotaţie specifică [α] D20 pentru diverse
produse ce conţin amidon. Tabelul 1.
Amidon [α] D20 F
Orez 176,7 5,66
Grîu 177,5 5,64
Porumb 177,5 5,64
Cartofi 181,2 5,50
Întrebări de control:
1. Structura şi proprietăţile amilozei.
2. Structura şi proprietăţile amilopectinei.
3. Hidroliza amidonului.
4. Metodele principale de determinare a amidonului în
produse vegetale.
5. Care este principiul de determinare a amidonului în
metodele polarimetrice ?
6. Ce reprezintă coeficientul Evers ?
76
Lucrarea de laborator nr. 12
77
(acid ascorbic - acid dehidroascorbic) care are rol de reglare a
potenţialului redox din celule, contribuind la transportul
hidrogenului. Prin oxidare lentă vitamina C se transformă în acid
dehidroascorbic:
O=C O=C
+
HO - C -2 H O=C
O O
HO - C + 2 H+ O=C
HC HC
HO - C - H HO - C - H
CH 2 O H CH 2 O H
acid L-ascorbicacid L-dehidroascorbic
În plantele crucifere (varză, ridiche de iarnă, ridiche de lună
etc.) alături de acidul ascorbic liber se conţine forma (complexul)
asociată, numită a s c o r b i n o g e n.
Structura lui poate fi redată prin formulele următoare:
O
C
O
HC CH
O
- CH 2 - C C-OH
O
HC
NH
HO - C - H
CH 2OH
78
O
C
O
CH2 - C CH
O
HC C-O H
O
H C
NH
HO - C - H
CH 2 O H
O C O C
C - OH C O
NaOH
O + O + H2O
C - OH C - O Na
HC HC
HO - C - H HO - C - H
CH2OH CH2OH
Ascorbinat de sodiu
Acidul ascorbic uşor reduce iodul, 2,6–
diclorfenolindofenolul şi alţi oxidanţi.
79
O C O C
C - OH C O
O + I2 O + 2 HI
C - OH C O
HC HC
HO - C - H HO - C - H
CH2OH CH2OH
În prezenţa oxidanţilor mai puternici, îndeosebi în mediul
neutru şi bazic, acidul ascorbic trece ireversibil în acid oxalic şi
treonic:
O C O C COOH COOH
acidul oxalic
C - OH O C O H2O C O O COOH
O O +
C - OH C O C O H2O
COOH
HC HC H-C-OH H-C-OH
HO - C - H HO - C - H HO - C - H HO - C - H
CH2OH CH2OH CH2OH CH2OH
acidul 2,3-diceto-L-gulonic acidul treonic
Principiul metodei
Acidul ascorbic se extrage din materialul analizat cu acid
oxalic. După filtrarea extractului (cu pH-ul 3-4) se titrează cu
soluţie de 0,001n 2,6-diclorfenolindofenol. Ultimul este un oxidant
80
selectiv şi reacţionează cu acidul ascorbic, dar nu reacţionează
asupra zahărului şi a altor substanţe reducătoare.
Cl Cl
+
O H
N ONa O N OH + Na
Cl Cl
2,6-diclorfenolindofenolat de sodiu (albastru) 2,6-diclorfenolindofenol (roşu)
O C
Cl
C - OH
O N OH + O
C - OH
Cl HC
HO - C - H
CH2OH
O C
Cl
C O
O
C O + HO NH OH
HC
Cl
HO - C - H
substanta incolora
CH 2OH
82
Ordinea îndeplinirii lucrării
83
Analiza produselor solide (prin metoda fotocolorimetrică)
Graficul de calibrare
C, mkg/cm3
C * 100 * 100
K =
a * 1000
85
K – conţinutul de vitamina C în mg-%,
a – masa probei;
1000- recalcularea în mg.
Întrebări de control:
86
Lucrarea de laborator nr. 13
Însemnătatea analizei
87
Vitamina A2 (dehidroretinol) se întîlneşte mai mult în
ficatul peştilor de apă dulce. Are în plus o legătură dublă în
poziţiile 2-3 ale ciclului β – iononic.
Structura chimică a vitaminei A1 C20H30O.
__
__
__ __ __ __ __
CH=CH C = CH CH =CH C = CH CH2OH
__
CH3
__
__ __ __ __ __
CH=CH C = CH CH =CH C = CH CH2OH
__
CH3
88
β – carotina
__ CH 3 H 3C CH 3
H3C CH 3 CH 3 + HO H
__
__
__ __ __ __
(C H=C H C = CH) 2 CH = C H __ (CH= C C H=C H) 2
__
__ CH
3 + H OH H 3 C __
H 3C CH 3
__ __ __
(CH=CH C = CH) 2 CH 2 OH
__
2
__ CH 3
CH 3
α – carotina
__
__
__ __ __
__
(CH=CH C = CH)2 CH = CH__ (CH= C CH=CH)2
__ CH
3 H3C __
γ – carotina
H3C CH3
H3C CH3 CH3 CH3
__
__
__ __ __ __ __ __
(CH=CH C = CH)2 CH = CH (CH= C CH=CH)2 HC
__
CH3 H3C __
licopina
__ __ __ __ __
CH __ (CH=CH C = CH)2 CH = CH (CH= C CH=CH)2 HC
__
CH3 H3C __
90
Ordinea îndeplinirii lucrării
Metoda cromatografică
Proba de material vegetal 1 g (pînă la 5 g în dependenţă de
umiditate) se mărunţeşte în mojarul de porţelan cu pistilul, dar nu
mai mult de 30 minute, pentru a evita oxidarea carotenilor. Pentru
deshidratarea probei în mojar se adaugă periodic cristale de Na2SO4
calcinat pînă cînd se obţine o masă uscată, fină. Masa obţinută se
lasă în mojar pe 20 – 30 minute. În partea îngustă a coloanei
cromatografice se pune un tampon de vată cu grosimea 1 de cm.
Apoi coloana se umple cu Al2O3 (praf) pînă la înălţimea 5-10 m, în
dependenţă de cantitatea carotinelor şi compoziţia pigmenţilor
adsorbiţi. Pe suprafaţa stratului adsorbant se aşează hîrtie de filtru.
Proba de analizat mărunţită se transferă cantitativ în coloana
cromatografică. Coloana cromatografică se uneşte cu balonul
Bunzen (fig.1).
În coloană se toarnă solvent organic pînă cînd
conţinutul ei devine umed Balonul Bunzen se uneşte la
pompa cu vid sau la pompa de apă. Proba de analizat se
spală cu solvent (1-2 picături pe secundă), pînă cînd
culoare galbenă a picăturilor dispare. Este necesar ca
adsorbantul să fie acoperit tot timpul cu solvent organic,
deoarece carotenii uşor se oxidează în curentul de aer care
trece prin coloană.
Conţinutul balonului Bunzen se transferă în balonul
cotat de 50 sau 100 cm3 şi se aduce pînă la cotă cu solvent.
Conţinutul de carotene din soluţia obţinută se determină
prin metoda fotocolorimetrică.
La aparatul KFK – 2, la lungimea de undă λ=540 nm (filtrul
de lumină verde), dacă soluţia este colorată intensiv galben – oranj
şi la lungimea de undă λ = 490 nm (filtrul de lumină albastru-
verde), dacă soluţia este colorată în galben pai. Pentru
determinarea extincţiei se folosesc cuve din sticlă cu lungimea de
5 cm (care se acopere cu căpăcel de sticlă).
Ca soluţie de comparaţie va servi soluţia incoloră de solvent
organic. Cuvele se clătesc cu solvent, se usucă cu hîrtie de filtru.
91
După finalizarea lucrării solventul şi soluţiile se toarnă în baloane
corespunzătoare. Solvenţii organici se interzice să fie turnaţi în
lavoar !
93
Volumul K2Cr2O7 şi concentraţiile carotinei. Tabelul 1.
V ml 2 5 10 15 20 25 30 50 75 100
K2Cr2O7
C µg 4 10 21 31 42 52 73 104 156 208
D
Întrebări de control:
94
Lucrarea de laborator nr. 14
Gliceride
Simple Steride
Lipide (esteri ai Ceride
acizilor graşi)
Glicerolipide
Complexe
Sfingolipide
95
Acizii graşi
97
1. Determinarea indicelui de aciditate
98
soluţie alcoolică de fenolftaleină şi agitînd permanent titrăm proba
cu 0,1 n soluţie alcoolică de NaOH sau KOH pînă la apariţia culorii
slab roz, care nu dispare timp de 30 sec.
Indicele de aciditate (mg/g grăsime) se calculează după
formula :
V × K × 5,61
Ia = b
m
unde:
Vb – volumul (cm3) soluţiei de NaOH sau KOH pentru
titrarea acizilor graşi;
K – coeficientul de corecţie a soluţiilor bazice;
5,61 – cantitatea de KOH (mg) în cm3 soluţie de 0,1 n ;
m – masa probei, g.
Unde:
Vb – volumul (cm3) soluţiei de NaOH sau KOH pentru
titrarea acizilor graşi
K – coeficientul de corecţie a soluţiilor bazice
5,61 – cantitatea de KOH (mg) în cm3 soluţie de 0,1 n
m – masa probei, g
100
aciditate mai mare. Is la mono- şi digliceride e mai mic de cît la
trigliceride. După Is în producere se calculează cantitatea de bază,
necesară pentru saponificarea grăsimilor, de exemplu, la rafinarea
uleiurilor—la etapa neutralizării.
101
Indicele de saponificare Is (mg KOH/g ) se calculează după
formula:
I = 28,05 (a-b) K
s
P
Unde:
28,05 – titru 0,5g soluţie de KOH, mg/cm3;
a – cantitate de 0,5n soluţie de HCl pentru titrarea KOH în
proba de control, cm3;
b - cantitate de 0,5n soluţie de HCl pentru titrarea KOH în
proba de lucru, cm3;
K – coeficientul de corecţie de 0,5n soluţie HCl;
P – masa grăsimii, g.
Devierile admisibile la probele paralele nu trebuie să fie mai
mari de 0,1mg KOH/g.
102
utilează la calculul cantităţii de hirogen pentru hidrogenizarea
lipidelor. Determinarea cantităţii legăturilor duble sau indicelui de
iod este bazată pe fixarea unei molecule de halogen (iod, clor,
brom) de o legătură dublă în condiţii cînd halogenul nu substituie
hidrogenul. Reacţia are loc după următoare schemă:
CH2 O- CO- (CH2)7- CH = CH- (CH2)7- CH3
CH O - CO- R1 + I2
CH2 O - CO- R1
I I
CH2 O- CO- (CH2)7- CH - CH- (CH2)7- CH3
CH O - CO- R1
CH2 O - CO- R2 ,
unde R1 şi R2 sînt radicalii acizilor graşi saturaţi.
Pentru determinarea indicelui de iod în industrie este
convenabilă metoda lui Margoşes. Această metodă după precizia
rezultatelor cedează metodelor standard, dar este mai rapidă,
necesită mai puţine reactive complicate şi toxice, nu se cere
calificarea înaltă a personalului.
Metoda este bazată pe reacţia acidului gras nesaturat cu
acidul hipoiodos, care se formează în rezultatul interacţiunii iodului
cu apă:
I2 +H2O─→HOI + HI
Reacţia acidului gras cu acidul hipoiodos trece în modul
următor:
CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7COOH + HOI →
CH3(CH2)7CHOH – CHI - (CH2)7COOH
Restul de iod se titrează cu tiosulfat de sodiu.
104
0,011269 – cantitatea de iod, care corespunde 1 cm3 0,1 n
soluţie Na2S2O3, g;
P – masa grăsimii, g.
105
Lucrarea de laborator nr. 15
106
Principiul metodei
Metoda se bazează pe interacţiunea substanţelor carbonilice
cu bisulfit de sodiu NaHSO3. Determinarea constituie din
următoarele etape:
• reacţia formării compuşilor bisulfitcarbonilici;
• eliminarea surplusului de NaHSO3;
• scindarea compuşilor bisulfitcarbonilici;
• determinarea cantitativă a NaHSO3 eliminat, care este
echivalent cu conţinutul substanţelor carbonilici.
Conţinutul substanţelor carbonilice se exprimă în cm3 0,1 n
soluţie de iod pentru titrarea bisulfitului de sodiu, legat cu
substanţele carbonilice din 100 g de pîine uscată.
Aparate, vase şi materiale:
• 0,15 % soluţie de NaHSO3 (0,75 g de NaHSO3
nehidratat se dizolvă în 400 cm3 de apă, se acidulează cu 2 n acid
acetic în prezenţa 3-5 picături de indicator metilrot pînă la culoarea
roz, apoi volumul se aduce pînă la 500 cm3);
• soluţie-tampon pH -8,3 (30 g de acid boric şi 5 g de
NaOH se dizolvă în 1000 cm3 de apă distilată).
107
Pentru scindarea compuşilor bisulfitcarbonilici se utilizează
soluţie-tampon, care permite de a aduce pH mediului pînă la 8,3.
Titrarea bisulfitului de sodiu eliminat se face în două etape:
̶ Titrarea de orientare
̶ Titrarea principală
,
unde :
X – conţinutul substanţelor carbonilice în cm3/100 g;
K - coeficientul de corecţie a soluţiei de iod;
V - volumul de 0,01 n soluţie de iod pentru titrarea
principală a 10 cm3 de filtrat, cm3;
10 – coeficientul de recalculare la 0,1 n soluţie de iod;
W – % de umiditate în pîine.
108
PRELUCRAREA STATISTICĂ
A DATELOR EXPERIMENTALE
109
parametrului, care se determină trebuie luată ca media aritmetică,
obţinută dint-un şir de măsurări. Ea se notează prin simbolul x:
x = (x1 + x2 + x3 + ... + xn)/n = ∑ x/n ,
Unde n este numărul de măsurări.
Devierea (abaterea). Este diferenţa dintre variantă şi
valoarea medie. Ea se notează prin litera "d":
d = (xi-x).
Devierea "d" se caracterizează prin: ∑d = 0
Devierea standard. Măsurările separate sau rezultatele
analizei sînt dispersate faşă de valoarea medie. Pentru caracteristica
statistică a acestei dispersări se foloseşte devierea standardă:
S= ∑
d2
k
unde k este numărul gradelor de libertate, egal cu n-1
Devierea standardă relativă. Sr este egală cu devierea
standardă, împărţiţi la valoarea medie
Sr = S/x
Dispersia. Devierea standardă la pătrat se numeşte dispersie
V= S2. Cu cît e mai mică dispersia cu atît e mai mică împrăştierea
datelor şi e mai corectă analiza.
d2
S=
n(n − 1)
110
BIBLIOGRAFIE
111
CONŢINUTUL
ORGANIZAREA ŞI METODICA EFECTUARII LUCRĂRILOR DE
LABORATOR, REGULILE TEHNICII DE SECIRITATE PENTRU
LABORATORUL DE BIOCHIMIE.............................. ………………..3
Lucrarea 1. DETERMINAREA AZOTULUI TOTAL ÎN PRODUSE
VEGETALE(DUPĂ METODA KJELDAHL)..........................................6
Lucrarea 2. DETERMINAREA POTENŢIOMETRICĂ A
DERIVAŢILOR FORMOLICI A α– AMINOACIZILOR......................14
Lucrarea 3. DETERMINAREA AMONIACULUI DUPĂ METODA
CONWEI ŞI BAIRN................................................................................21
Lucrarea 4. DETERMINAREA PROTEINELOR ÎN VIN DUPĂ
METODA LOURI....................................................................................26
Lucrarea 5. REACŢIILE DE CULOARE A
PROTEINELOR.......................................................................................30
Lucrarea 6. DETERMINAREA FORMEI REDUSE A
GLUTATIONULUI (ÎN LEVURI SAU GERMENII
CEREALELOR)......................................................................................36
Lucrarea 7. DETERMINAREA ACTIVITĂŢII INVERTAZEI ÎN
VINURI, SUCURI..................................................................................40
Lucrarea 8. DETERMINAREA ACTIVITĂŢII ENZIMEI
POLIIFENOLOXIDAZA.........................................................................50
Lucrarea 9. DETERMINAREA ACTIVITĂŢII ENZIMEI
LACAZA..................................................................................................56
Lucrarea 10. DETERMINAREA ACTIVITĂŢII CATALAZEI
DUPĂ A. BAH ŞI A.OPARIN.................................................................64
Lucrarea 11. DETERMINAREA PĂRŢII DE MASĂ A
AMIDONULUI........................................................................................70
Lucrarea 12. DETERMINAREA FOTOCOLORIMETRICĂ A
VITAMINEI C.........................................................................................77
Lucrarea 13. METODA CROMATOGRAFICĂ DE
DETERMINARE A CAROTENILOR ..................................................87
Lucrarea 14. DETERMINAREA INDICILOR DE CALITATE A
LIPIDELOR.............................................................................................95
Lucrarea 15. DETERMINAREA SUBSTANŢELOR AROMATICE
ÎN PÎINE ŞI ALTE PRODUSE DE
PANIFICAŢIE.......................................................................................106
PRELUCRAREA STATISTICĂ A DATELOR
EXPERIMENTALE.............................................................................109
112
UNIVERSITATEA TEHNICĂ A MOLDOVEI
BIOCHIMIE
Îndrumar de laborator
Chişinău
2007
113