CONSTANTIN MARICA CRISTIAN DIDILESCU VICTOR SPINU NICOLAE GALIE TUBERCULOZA PULMONARA cU GERMENI CHIMIOREZISTENTI ° EPIDEMIOLOGIE * =MECANISME; DIAGNOSTIC ‘© PRINCIPH DE TERAPIE MEDICALA ‘* PRINCIPII DE TERAPIE CHIRURGICALA EDITURA TEHNICA, Bucuresti, 2001‘= chimiorezistenja (clasificare, tipuri, relafitintre ele, bazele molecslare, boala iat ogend), tuberculostatcele in uz, mecanismele de transfer genetic, diagnos- tical de laborator ~ metode fenotipice conventionale, rapide, genice (V. Spiny; * chimioterapta tuberculozei pulmonare cu germeni chimiorezistenyi, medi- | : a | camente wilizabile, proprietit si farmacochinezie, principle terapeutice de baz, ‘cauzele de ese $f in final descrierea proiectull pilot DOTS-Plus (Cin. Maria): ‘= terapia chirurglcala, indicat tn tuberculoza chimiaresistenté (metode iiore, prewnoiray, oracoplsta,rezeee pulmonar ec) (. Gall). | Destinat nu mumai specialigtlor ci si mediclor de diverse spectati | volun constiue 0 veriabilé invite a injlegere sila actiune, motivnd efortul . ‘uturor celor implica! tn supravegherea #1 conroll uberculozei | Feliciéri $1 indreptid satisfactie eutorlor pentru, lucrul” atdt de bine CUPRINS fics. 1, Epidemiologia chimiorezistenfei bacilalut Koch Prt dr. C. Clufeen Membru titular al (dr. Cristian Didileseu) .. 6... eee eee eee c eee 11, Defi ‘Academlel de $tiinfe Medicale 12. 13, 1. 4s, 16. 111, Chimiorzistenja dobindits 141.2. Chimaorezstena primart | > 1.13, Indexul mulidrog-rezistenei dob Date generale epidemiologice . Date epidemiologice ale chimiorezistenyei BK pe contnente 1.3.1. Chimioreistenja pe contnentul american 132. Sinutiachimirezistenjel in Afica 133. Situatiachimiorezistenei in Asia 1.3.4. Chimiorezstena fn Europa alte fii 1.3.5. Proiectul Global prvind Supravegheres Chimiorezstenjeh Bacilului Koch CChinmirezisenta primar 1.4.1, Rezistenj primar le toate cle patra medicameate antituberculoase esengiale | 142, Pee MOR pie arene Orig Mondiale « Sinai... Reristenfa dobidit || 1.51, Prevalenj rezstnje dobinite (date generale). 1.52. Prevalena MDR secundare CChimiorezistenjaprimard gi secundart« M-ruberculots in Romina Bibliogrape selects 2. Mecanisme ~ diagnostic tu tubereuloza pulmonard ‘cu germeni chimiorezistenfi (dr. Victor Spinu) .. . . 4 6 2 7 31 38 2 2 8INA, HIN, H RMP,R EMB,E, ETB PZM,Z SM,S. KMK VM cM AM(A) CPX, Cx fx, Ox, 0 ETM, Et MDR-TB ABG TA Te Mt CMI CMB TGO ToP FA SNC TNF LDH ADN, PEP NIM ABREVIERI Hiidrazidl (Isoniazid) Rifampicing Etambutol Pirazinamidt Streptomicing Kanamicing Viomicing Capreomicins Amikacind Ciproftoxacina Oftoxacing Ethionamids Moltidrug-resistant uiberculosis Antibiogramd Tiacetazoné (Tiosemicarbazonf) Tiocarlida Mycobacterium tuberculosis Concentrafie minim inhibitorie Concentrafe minima bactericida ‘Transaminaza glutamic oxalaceticd ‘Transaminaza glutamic piruvied Fosfataza alealind Sistem nervos centrel Factor de necrozd tumoralé Lactic dehidrogenaza ‘Acid dezoxiritonueleic Poeumotorax extrapleurel Infecfi micobacteriene nontuberculoase EPIDEMIOLOGIA CHIMIOREZISTENTEI BACILULUI KOCH . Cristian Didilescu ‘Tuberculoza rimane in zlele ast o problem global sinitifiipublice cu un mumér estimativ de 8 pind la 10 milioane de cazuri noi gi 3 milioane de decese anual. fn toaté lumea,tubereuloza este catalogati ca find atit o maladie Social, edt si una infectiost, asocierea ei cu sirtca, promiscuitaea si malnutiia find ia mod clar demonstrat in acest context, rezstenja agentuiui etiologic, bacilul Koch, la medica- ‘mentele antituberculoase s-a dovedit a fi pe Glob o progresivd preocupant, ea privind atat pacienfii immunocompetent, cat si pe cei imunocompromisi ‘Tuberculoza rezitenté la medicamente constituie un real pericol pentru con- troful bolii, deoarece numarul de medicamente eficace impotriva M.tuberculosis este ned redus, 1.1. Definigii Tuberculoca chimiorezistenti defineste cazul de tuberculozi (de obicei ‘Pulmonard) eliminator de bacili rezistenfi la unul sau msi multe medicamente ‘antituberculose, Reztstenfi la un medicament (Mimioreztstenja) este definitt ca find diminuares susceptibiltaii im viro a tulpini de M.tuberculosis la un medi- cament cu condita ca tulpina si nu fi avut un contact anterior cu medicamentul sexpeciy. Termenul de petqeesisteml este uiilizat atunci cénd o tulpind bacilard este rezistentd doer la uiul dite cele 4 medicamente antituberculoase esemtale. Rezistenfa la mai mult de unul dintre aeste medicamente constituie polirestenja, In ceea ce priveste Eien: Aenea este definitd ca ind séaiotonjo, Simultnd, Ja INH gi RMP, insojitd sau nu de rezistenja la alte tuberculostatice4 Tuberculoca pulmonari cu germeni chimloredsenf 4 chimioterapie rata multirezistenjelor este foarte redusd, de reguld 1% sau mai putin Oricare ar fi situafia, priovitatea majort rimine tratamental coreet al ‘tuturor cazurilor noi pozitive la microscopia directé. 1n pirile cu ciidemie severd i resurse limitate antibiograma infiald nu este recomandabilé la aceste cazur, deosrece este nepracticabild, costisitoare si inutill. Antibiograma ficud: pe esantioane reprezentative de’ cazuri noi este insh necesard ca instrument de ‘monitorizare ¢ rezistenfei bacilare tn teritoriu gi ca misuri de supraveghere pidemiologicl in cadrul unui program nafional Cu toatd importanja diferenjierii chimiorezistenei primare de cea dobén- ith, prevatenta combinata a chimiorecistenfei pare s8 fie uneori util, din mai multe considerente. Astfel, prevalenja combinati a chiaiorezistenjei reprezinté 0 ‘evaluare a proportiei sproximative pentru tulpinile rezistente la toate tuberculo- staticele, wlpini ce pot exists la persoane din coletivitate la un moment da. De ssemenes, exceptind prile cu o proportie de peste 10% a cazurilr de reiratanent, chimiorezistenfa combinaths-a dovedit «fi similard valorilor cele prinhare. 1.1.3. Indexul multidrog-rezistenfei dobandite Tndexul multidrogtezistnfe dobiadite rel din saris boli cazurlor cu Punzitor cu nivetul implementiii Programelor de Control al Tuberculozei. {In special, rispindireatulpinilorrezistente la doud din cele mai importante ‘medicament Isoniazida (INH) si Rifampicina (RMP), ar putes avea repercusinni serioase asupra epidemiologiei si controlului tuberculozei. Nu poate fi omis nici faptul c& bolnavii infectaji cu tulpini rezistente la rasi multe medicamente, pe angi cl au ganse mai pufine de fi vindecafi, sunt nevoii a suporta un tratament cu medicamente antituberculoase de linile a H-a gi a T-e, mult mai toxic gi costisitor decattratamentel administat in condifii de sensbilitate pastath Asupra.snetodelor, i crteiilor de apreciere a rezistenfei micobacteriene e-a lungul timpului au existat opinii deosebite de la o fark la alta gi de ly un Inborator la alt ‘Anchetsintemafionalé realizaté de Rist gi Crofton in anu 1957 pe 4341 cazui din 17 fini a aritat ef foarte greu s-au putut gisi laboratoare care sf utilizeze aceeasi tehnict de testare a chimiorezistentei gi acelagi criteria de interpreta, {In ultimi. 25 de ani, tehnicile gi criterile de interprtare s-au apropiat treptat, rnumeroasele cercetiri si studit cooperative permiind fn cele din uri stantar” dizarea acestortehaici Determinarea sensibilititit la egenfii antimicrobieni este de important clinick considerabii, Principiul pe care se bazeazd toate metodele de antibiogramd este sabilirea concentrajiei minime de tuberculostatic care adiugat mediului de cultur inhiba ‘nmuljirea bacililor. Pentru a aprecia nominal de colonii viabile se prepark dil Epidemiologia chimdoreistenjel baculut Koch, 15 din inocul ite, inoculeazi. pe mediul de control faré antituberculoase (mediu mattor). Frecyenfa mutanjilor rezistenji la o,anumité concentratie de tuberculo- static se cleuleq2prin-comparatea numdnly de colonia martorulu cu numrul de colonii: dezvoltate, pe, mediul ce confine antituberculoase. ” Rezistenja este;‘in genera), considerats atunci cand cresterea pe mediul cu tuberculostatic este de 1%, sau mai mul, fap de crsterea pe medi de control Pentru: ficcare tuberculostatic. s-au. stabilit concentrajii si proporfii critice care permit dferenjons ine fupinle rezistente si cele sensiile, Concentafiacriticd inhib complet exester,talpni, sensibil, tas tulpinacezistenté care congine o propori-de. germeni rezistenf seal san msi mare decat proportia eric nu este Ibias ae ae ; -Projectul Global a ariat of att metodele standard, cat si cea radiometricd BACTEC 460° au condus Is aceleas rezuliate -Cele mai molte anomaly celtteor de ttiese in cal INH, datorith \unor bulpini rezistentela acest antituberculos major, respectiva rezisteajd fiind la limita, Pa Standardizarea h'lumed'thireagt'«' regimuror terapeutice antitubereu- Joase, aprayiziongrea cu medicament i aligurarea une infrastroctri in domeniul ‘Hodtbireprezintl iniloace de prevenit a chimioréisteje.Introducerea in 1996 4 chimioterapiet stindardizate de curt rad a fost urmatl de o scldere a ‘revalenfei chimiorezistenyei dobtindite, iar procentul de 10% al chimsorezistenje! primar a siz, prin tiizaea tierce fra niall wtxamenta, In Algeria, intodlcerea dupa 1967 a repimtvlorterapeutice cu duratl de 12 luni « avut ca rezultat scideres rapt pfevatentéimmbelortipuri de chimiorezistena (dol 82% In 61,3% pentru cea dobltd gi de la 1546 1a 10% pentru cea primar). Intfoducerea in'anol 1980 a regimiulo standardizate de chimioterapie de scurts loratd« fost wimath de "educere preven chimioreaistenei dobindite pnd la 21% 5 a cell primate pind In 5.2% abestorezultate find objinute tn absenfa unui Progra detratament sb direct observate: + In ile industralizate; impacto strategie tratamentelor a fost demonstrat la New ‘York unde‘ti'1991,199% dinscaaurile do. TBC pocitive in cuturi s-0u dovedita-avea- chimionedistentlJarINH- si RMP. Reotganizarea Programtl antituberculos a ficut ca numaral anual al cazurilor MDR-TB si scada cu 75% {inte 1992 si 1995. Studie din Kolin-Ceboslovacia i cele recente dn Baltimore, New Yorks ‘Texas au demonstrat cf terapia sub, direct, observafe are o influenfhpozitiva asupra nivelului chimiorezitenei, ‘asiguedprotectic impotriva dezvotén ‘ispindiriichimiorezitenei, Chimioterapia standardizath de scurts durati este, de ‘semeneaasociatl oucele mai mic nivetri de MDR-TB, ‘act tratamental sub directacobservajc nu poate fi realizatintotdeauna, in Schimb tabletele canginind medicamenteantituberculoase in combinafii de doze fixe contribue a prevenirea monoterapici. ‘ullaara tbletelor conjnand comblna In doze fxe de anttuberculoase, recomandaté de OMS gi IUATLD/UICTMR inci din 1988, urmareste mu numa ‘area monoterapic, dar gi accepiares mai ujoarS a tratamentlu de cite paciet.18 Tuberculoca pulmonard cu germen chimcrezstnsi BR ______ibereatoza pulmonard eu germenichimiereistent Cercetirile efectuate la Hong Kong (1971-1972) au urmait s8 determine impactal pe care rezistenja primar le medicamentele antituberculoase i! are asupra rezaltatelor chimioterapii tn condipii de program. A rezultat ci pentru rile cu o frecveags a rezistenjei primare cuprinse intre 4 si 10%, practicarea antibiogramei 5i adaptarea terapiei in raport cu datele ei, nu previne mei mult de 7% din egecurte imputabile tratamentului neconcordant cu sensibiltatea ‘germenilor. Experimental de la Hong Kong a fost efectuat in condiile-optimale, caracteristce oricdrui experiment tehnic. Extrapolarea rezultatelor iui in practica combateri tuberculozei din diferite teritori mu @ pura fi fScuts fled in stadiy prealabil al conditilor operajionale locale Un studiu al Organizajiei Mondiale a Stnataii ce a analizat un namar de (63 anchete asupra chimiorezistenjei bailului Kock, efectute intrun numa semai- ficetiv de piri in intervalul 1985-1994 a relevat valor: interesante ale incidenjei rezistenjei la medicamentele antituberculosse (fig, |.1) ww 1 10. 02 °. wet aan gga Fig. 1.1. Rezistena primar g secundars la moticamenterberculesatice (1985-1998), won none Conchuziile care s-au desprins fn urma acestui studi au fost remumate astfel: ~ nivelul cimiorezistenfeiréméne mic in yrile ie care prevalenf tuber- ccolozei este joast, iar Programele de Conttol al Tuberculozei sunt corespuncitor implementate (cazal unos firi din Europa de Vest st Oceania); ~ in flrile ou prevalenjé ridicat, dar to care existé programe cores: PunzAtoare de tratament, nivelul chimiorezistenjei la medicamentele antizuberculoase s€ menjine, de asemenea, coborit (Tanzania, China, Brazilia i Bénin); Epideniologiachimiorezsiente!bactului Kock » = in cazul firlor unde nu existi Programe de Control al Tuberculozei suficient de susjiute, nivelul chimiorezistenjl la INH depigeste 10% (dia, Fiipine, Pakistan Haiti... 1.3. Date epidemiologice ale chimiorezistentei bK pe continente 1 {In S.U.A,, tubereuloza eu germeni chimiorezisteni ers, in trecut, aproape necunoscuti. Dupd anul 1950, odat& eu institurea regimurlor de chimioterapie antituberculoasi cu INH, SM gi PAS, s-a constatat of o recistenf natural la cel putin unul din aceste tuberculostatice a aplrut la 1-2% din germenil izolfi (seman M. si colab., 1989). Tratamentul neregult sau incorplet al tubereulozei active sau provenienfa dintr-o jard cu o prevalent crescuté a germenilorrezistenti Ja medicamente sunt principal factori de'risc pentru tuberculoza rezistent la ‘medicamente in 8.U.A. (Bares P-F. $i colab., 1987; Riley LW. si colab,, 1989). De altfel,tratamentul inadecvat sau incomplet al tuberculozei in $.U.A., ca $i in alte fri, a dus gi la dezvoltarea MDR-TB. Studi asupa prevalenteiinfectiei tuberculosse la contacfii persoanelor cu ‘tuberculozii cu germeni chimmiorezistenji la medicamente, precum gi tumeroasele cazuri de MDR-TB au dovedit ci germenii rezistenti la medicamentele antitu- bereuloase pot transmite infecia gi boala de lao persoand Ia alta. Un alt factor care 4 determinat propagarea bacililor chimiorezistenti la medicamentele antituber- culoase este asocierea infectiei TBC cu imunosupresia la indiviaiiinfoctagi cu HIV si consumatori de droguri injectable. Ultima categorie de persoane este cunoscutit ca avind o mare incidengé a infecjiei TBC (Reichman LB gi colab., 1991), Aceasti situafie a generat un grup numeros de persoane cu mare risc de a contacta 0 tuberculozi activ, cu un grad ridicat de noncomplianfa la tratament, coca ce are 10°) a demonstrat prezenfa bacililor rezistenti in absenja expunerii la snibiotice, dar cilvai in maforitateachimiosensibils, mtsurp diversificeii tuberculostticeor utlizate, s-a putut constata stan elt neal prin ont eogote sy Explicaiafeno- ‘menulu a apérut odatd cu inelegerea chimiocezstenfei ca expresie fenotipicd ‘unor modificari ale genomului micobacterian, Existenja modificirilor la nivelul ‘unor locusuri dferit, in functie de antibiotic, explic, in ultima instanl, absent recistenjei tnerucgate. Prin aceasta datele moderne au confirmat obserajia mai veche conform clea gansa de aparife a unui germen rezitent la toate tuberculo- staticele este infim i proportionalé cu produsul probsbilitflor individuale de aparifie @ mutangilorreaistenfi penta fiecare antibiotic. Astfl sansa de eparjie « unai germen INH; RMP; PZM; SM - rezistent este de | din 10° 108 x 10° x I din 10° germeni (ceea ce, ct msi bacteriand este echivalentul greutii corpo- tale, si oricum ci multe ordine de mlsine mai mare decit orice populatic lezionsta), Totus, selectia mutanilor chimiorezistenfi se face in curs terpei, in misura in care modificrile de genoi micobacterian care conferk rezisten}d nu constitic, prin ele insele, un avant} adapativ in afara contactului cu antbioticele (Ori de céte ori se ereeszi condi de monoterapic sau de monoterapie ,,nascati" (tsociere de tuberculostatice aparent suficient, dar ln care cel pufin in parte, tulpina respective este rezstent) baci sensiili sunt elimina iar cei rezsteni {igi continul muliplicarea. Clinic gi bacteriologic rispunsul poate pares iniial favorabil, dups care sitafia se agraveazA (ions: fal and rise). Adiionarea Ie schema inijalé neeficienté @ unui singur antibiotic sau a unei asocieri de antibiotice la care talpina este in parte sau complet reistenté poate duce 1a achizitionaree ,.pas cu pas“ chimiorezstenfelor. Emergenfetubercaloze chimiorezistenteintr-o populate a fost ascciatl cu factori multipli, jintod de pacient, de furizoral de serviii medica gi de exdral ‘aa larg fixat de progransulanttuberculos ‘Nedacomplinays-paticnmiti(consderenja la tratamentul prescris) coatri= buie la dezvoltarea chimiorezistenjei. Prezicerea ei tn funeie de anumite carecte- ristici demografice gi socic-etonomice este dificil, dar fenomenul este mai putin ‘obabil in eadral programelor care impun eficient strategia DOT (tratamentl sub directdobservare) Mecantsme - diagnostic ntberculozapulmonara cu germenichimoresteni___47 ‘Mascompliaa wediculps (nonaderenja la prevederile oficializate de pro- gzamele anituberculosse) se poate exprima prin inadecvares schemelr, ipsa reounoasteri unor tratamente anterioare,ignorarea importanjsiregimurilorstan- ardizte, prin adifia wou singur tuberculostaic la scheme anerioareineficient, prin degnteresulfapd de monitorizarea cazuhu {in sfrgit, un element crucial in emergenja chimiorezistenfei este repre- zentat de. s ple Pinter. de. i at # suprestegbere fixat de ,,programul antiruberculos”, dar adesea lipsit de finanjare adeovall. Din acest motv, nivel chimiorezistnf int-o populate este unul din indicat de eficenf i orictrui program nafonalanituberculos* 2.6. Bazele moleculare ale chimiorezistentei M.tuberculosis Jn ultimii ani, cercetirile genetice gi moleculare au limiurit, el pufin in parte, mecenismele implicate in dobindirea chimiorezistenfei de citre M.tuberculosis concomitent cu dezvoltarea unor tehnici moleculare de detecie rapid ¢ acesteia {n continuare expunem céteva din cunostnjele actuale din domeniu. 2.6.1. Tuberculostaticele principale 2.6.1.1. Isoniazida Impreund cu Rifampicina, Isoniazid constiuie fandamentslchimiotea- pieidescurtd dura, uilizat tn prezent fn rogramele de control al tuberculoze Caracterstic, ae 0 ‘mare specifics, find active aproape exclsivtmpotriva membrilor complexului M.tuberculosis, la niveluri foarte mici-de CMI (0,02- 0,06 ug/ml). Antibiotic sintetic, pare a avea mai multe finte la nivelul peretelui microbian. Mecenismal de atiune al INH, casi mecaniameleapariiichimiore- ~stenfl a INBL sunt complete si incomplet injlese. Datlesugereazi ch INH -tinleasacilor mmvoici din. structure pereeli, flcind micobacteria. suscepibill la radical de oxigen al factor de media care o distr. Activaea INH la un intermediareletrofil instal, dervat cu mare capacitate bactriid, presupune prezenta nei enzimc, catalza- peroxidaza (KarG) gi a unui donor de éleciton, peroxide bidrogen, KaiG este codifcath de gene katG, find singura enzims capabilé st activeze INH si, 2 urmare tulpiaile cu muta la nivel gee! gi expesiei sale fenotipice,enzima, prezni invari velun inate de rezstenf a INH. Feno™ renal a fost sesizat ick din 1954 de cle Middlebrook, ulterior acesta demon string ocorlare invers intre CMI a INH si activate catalaze = peroridazel Mai malt, studi genetce au demonstrat fapelc, la tlpni INF-rezstente de Mnberetdons i Mamegmats reasformate Pin ineludcrer genet hat tn genom ca reapaifacalalaei - perordaae se restnurezd sensible, argument peri {in favoare ipotezei conform creiadeleja kG poate induce INFe-veristeofa la50 <_ Tuberculosa pulmonari cu germeni chimiovenisanti 0 a treiaproteinkasociatl cu INH-rezstenga este codiicatl de gea ap. AbpC este 0 alkyi-hiperoxiperoxidazoreduciazd.implicat in raspunsul celular 1a stresul oxidativ. Relaiadintreexpresia in exces (overexpression) a AhpC si INH- retistenjl este complex Studie inifial au fost efectuste pe M.smegmats.Into- ducerea in genomul celular anai mulio opi ale gene akpC a dus la ereerea de 5 ori a CMI pentru INE. ‘Acelagi luc efecrut pe tlpini de M.tubereulosis nu a resi sk demon- streze o erestere semnifietvé a CMI penira INH, acing fn dscufie rola direct 21 AbpC tn achiaiia INH-rezistenei, ipotez altel tentantdin cone fn care ma {niotdeauna modifickrile la nivelul genelor amintite coreleaz8 cu INE-reistenya exprimaté fenotipic, ceea ce ridied problema existenci gia altor mecanisme neidentficate pin in prezent. De altel, sensibiltatea PCR-SSCP a difertelor gene pe izolatele INHL-rezistente este de numai 78%, dovadd indirect a sfirmatii de mai sus Ponderes mutspilor asociate INH-ezistenjei este de aproximaiv 60% pentru hatG, 20% peatra ink, restul de 20% find acopert de mutai I nivell fenei ofp (acuabil), aap ruliple kat ink) si de ,mecanismlnecuncut. pls, ia mod particular ega de problema INB-rerstenje, ol rretelu celular al M tuberculesis ca important barierk de permeabilitae trebuie explorat supimentar. 2.641.2. Rifempicina Inirodusi Id nceputi anilor 70 ca medicament antitubereulos s-a dovedit ‘extrem de eficientd impotriva Mtuberculoss Ia CMI de 0,1-0,2 wll. Datoritt iunii sale bactericide, a devenit, alaturi de INH, clement indispensail al chit we eel ual pcos ade nee ipalimeraza ADM deppsiienth, Desi rar, redutenja la RMP este tn creglere darth uli sale pe sark mae, ades inadecvats. In acest context RMP-reistna ete considers urkersuoget™ pentru MDR-TB, Deqvoliares redistenjel ummeazd mode” .repei unos” Gingestep) eu man rexinent pha sponan a populi nesipse arora tntbiote, cao feevenp preci in 10° 'ARN polineraza este un oligomer complex, aut din 4 subunit cB 168, codiicate de locsule rpof, "p08, rp0C spoD, complex bine conserva Dire mci acne, Cert ep ro cl hl La ely emer ‘specific cu subunitatea B a ARN polimerazei, sténjenind transcrip fa princi mae a nivel lous rod Induce reife confrmainale la nvelulsibankapi cu afecres legit antibiosnu implicit RMP-reiteat. Uleror, local rpol a fot complet carci pentru M.tuberculosis fiind identificate mutafiile care confer’ rezistena. DDeoarece eisenjs a RMP a suneroase ijn de col ea lar lept de uta le nivel genei yoB, Telenti& al» clonat gf identfioetsloteirs regiunit echivalente a Mtuberculosis pornind gi de la informatie disponibile pentru gena rpoB a Mleprae: Dupii ce formules2i amorse (primers) pentru amplificarea ‘Mecanisme- diagnostic in werculoza pulmonari cu germeni chimiorexisteni___S ‘genic identifick secvenja bazelor unui fragment de 411 perechi de baze a rpoB pentru 66 tulpini RMP-resistente gi 56 tulpini RMP-sensibile recuperate de pe mai ‘multe continente, Descrie 15 mulafi dstincte prezente la 64 din cele 66 tulpini [RMP-rezistente gi la nici una din tulpinile RMP-sensbile si semnaleaza faptul cB 12 80% din tulpiile rezistente, substiujile de aminoacizivizau una din pozitile 526 si 531. Consecinfa, evidenfiatl mai tirziu, a acestor mutafi la nivelul genei ‘poB este cresteres CMI pentru RMP ia valori de peste 8 ue/ml Kapeer & al. utilizeazd procedee automate dt secventializare ADN pe 128 izolate din care 121 RMP-recistente, pentru. determinarea polimorfismulti nei regiuni de 350 perechi de baze dn rpoB, conjinnd o bands de 69 perechi de ‘baze (23 codoni), ups alii de 27 de codoni (81 perechi de baze) defini core- region Rif-R, zondin care se produce marea majoritae & mutafilor responsable de RMP-rezistenih (fig. 23). Fig. 23. Mutaile responsable de rifampicin-rzisen si ponderes lor relativi in ‘core-repion RIF (codonul 507-9833) 2 nei rpoB a M. tuberculosis. Datele objinute prin polimorfism (PCR-SSCP) au confirmat c& peste 97% in tulpinile RMP-rezistente su modificri de secven(d in regiunea menfionatd ‘Un element important desprins din studile amintite a fost si faptul ci onderea mutaillor semnalate a fost diferité. Astfl,tulpinile cu modificii ale ‘codonului 526 de tipul CAC-+TAC, antrenind fenotipic substtujia His-Tir aveau ‘© pondere de 30% in colectia de tulpini Kaperr gi numai 12% in colecyia Telent ‘Mautatile codonului $31 de tip TCG-9TTG. antrenind substitutia Ser—>Leu aveau pondere de 47% si, respectiv, 25% in studiile amintte. Excluzind biasurile de ‘antionare,aceste diferenfe atrag atenia asupra unor importante varia tegionale.M Tuberculoca pulmonar cu germenichinioezistent 2.6.4. Streptomicina Aminoglicozid cu spectre lrg, a fost primul antibiotic uilizat pe scart ‘mare fn watamentultubercalozi.Aplical fn monoterape, a dus rep le apariia muafilrrezisteg. Buzele moloculare ele SM-rezistenoi au fost extensiv studi la uncle becterigialge, unde mectaisma responssbil sft identifica a mutailegenclot codificdnd subunitiileribozomale. Mecanisul de acfiune pent Mtuberculasis (exirepoat dels Z.colt) are ca it principléprveina $12, component a subuni- taj 30S ibozomue, ia ce fect fal - pertubarea snteze povenelr, Sa mai putt consata eX majriatea bacterilor au mai multe cop ale operonilor ARN in tmp ce micobacerilecucrstere lets de tip M.bereulosis, av o singurd cope, itr cele cu crestere rapid de tip Mamegmiats,doud cop Innplicafia practic a cestei observa ese clo molficare uni sespective poate induce fenotip de SM-rezistenfl Is Mauberculoss, in timp ce la Ecol, bacteie cv 7 copi ale genei 16S ARNr, modificarea unessingwe gene ni confer rezisenkt Un tip rispindit de SM-rezistenté prin acetilarea enzimaticd « antibiot- cali nu a putt pus in eviden la Maubereubsis, ‘SM-rezstenfa la M tuberculosis este atibuts, cel puta in parte, matafilor survenite in proteins ribozomelé $12, codificaté de gena pei elo dia operon 1775 codificind 16S ARNr. Se considera locul principal a muapilr este gena ‘psL, coificind protcina vibozomalé $12, struct’ pistraté emarcail In flo- ‘kenca nti ce alteriile la nivel 16 ARNr, care interacfoneazs ca proteina $12, sunt un loc secundar. Pe izolate SM-rezistente, mapping-l mutailor la nivel geni pst (fig. 24) a demonstatafectarea predominants a coconut 43, ude se produce substitu lisine’ prin arginind si uneor treonind ia codonulul 88 unde se price substnujalisin! prin arginin sau glutamind. Mutfile la Fig. 24. Reprezentares schematcl 8 major localiza tn gena rps asriate cu ‘seeptomicin-eristeja la Mruberculaes | Mecanisme - diagnostic ik ruberculoza pulmonardicu germenichimiorezistey! 88 nivelul genei 7psZ sunt responsable pentru mai mult de dou treimi din cazurile de SM-rezistens, {In unele izoiate, SM-rezistenja este indusf de mutai la nivelul 16S ARNe, codificatl de operonul rrs. Mapping-ul locusului rs (fig. 2.5) a permis descrieres rmodificdrilor la nivelul a dou regiuni, ansa 530 gi regiunea 915. La nivelul ansei 530 inloeurile tui C ~ 491 prin T, C ~ 512 prin T, A ~513 prin C/T, C- $16 prin TT se insofesc de exprimarea fenotipului de SM-rezisten{s. Acelagilueru insojete 4i substituyia C - 904 prin A/C sau A - 905 prin G, deci modificiri la nivelul regiuaii 915, wah Lhernces! Fig. 2.5, Mute la nivel operonulu rs asociate cu sueptomicin-rcisenis la Mtubereulosis. ‘S-a putut astfe! coneluziona ci SM-rezistenfa in cazul Miuberculosis fete consecinfa modificrilor la nivelulfintei antibiaticului (drug target) gi mu a ‘modificdrii acestuia. ‘Sau descrs si anomalii ample, asociind transversiuni AVG in pozifia. 904 8 locusului rrs, codificind 168 ARNr cu transversiuni A->C in gena rpsL, codificdnd proteina ribozomalé §12, la tulpini eu un inalt nivel al SM-rezistenfs (CMI> 60 ig/ml Ia 0 definite a pragului rezistenjei de 4-6 ug/ml). Pe de alld pare, le un numar semnifcatlv de izolate SM-rezistente mu s-24 pPutut pune in eviden|# anomali la nivelul locusurilor rps. gi vrs. Mai ult, ulpini cu rezistenfl intrinsecd la SM de M.gordonae, M.szulgae, M.avium, au prezinté ‘modificiri la nivelul genelor rpsL sau rrs. Aceste observafit au ridicat problema ‘oui al treilen mecanism necunoscut, operational lao trcime din tpini, Tulpinile amintite prezinté constant un nivel mult mai mic al SM-eaistenjei, Dack se ‘determin’ CMI, aceste tulpini prezintd rezistenil la niveturi mult mai mici ale8 Tuberculoxa pulmonari cu germeni chimioresistens codoni in pozifiile amintte, dferte de cele ale tulpinilor sensibile valoarea prog ‘propusl pentru ciprinol find de 2 win. ‘S-au mai identficat mutafii grupate intr-o mick zond de 40 aa in spropierea Tir122 (aumbeitoare E cot). S-au propus gi alte mecanisme ale FQ-rezistenjei de tipul modifitrilor de permeabilitate a peretelui celular sau pompa activi de eflux pentru chinolone care si explice FQ-rezistenja, de obicei joas, la izolatele fled modificdsi grr Problema FQ-rezistenfei se pune is termeni asemindtori i pentru alji reprezentanfi ai clasei de tip ofloxacind sau sparfloxacing, creditaté ¢2 cel mai ‘mare potenfil antimaicobacterian a o CMI de 0,2 g/ml 26.2.2. Ethionamida (Prothionamida) Ethionamida este un tuberculostatic de rezervi cu structurd aserinitoare cou a INH, cu actiune putemic bactericidi, majoritatea tulpinilor fine inhibate ‘in vier ln concentrafi de 10-20 p/m. Pornind de Ia observajiapieyderiscid-aleo- lorezistenfei sub acfiunes antibioticulu, s-a presupus ca mecanism de acjiune inhibares sintezi acizilor micolici din stroctura peretelui celular, Mecanismnl ETH-rezistentei este necunoseut. {n misure in care unele izolateclinice au aritat (rr) rezistenjh incrucigaté cu INH, s-au adus fa discufie ‘mula le nivelul unei regiuni din gena ind. Asemenea izolate, care au prezentat ‘mutafii la nivelul locusului ink (au gi Ia nivelul karG) au exprimat fenotipic INHl-rezistenjl joasd gi ETH-rezistenyh. Pe de alté parte, spre deoscbire de INH, activarea ETH ou implicé sistemul catalazd-peroxidaza, motiv pentra care in ‘majoritates cazurilor de INH-rezistenps se plstreazi ETH-sensibilitates, factori limitanfi ai administiri fiind hepatowoxiitatea, prowsta toleranja si raitatea rmedicamentului 2.6.2.3. Kanamicina (Amikacina) Capreomicina, Viomicina Kanamicina, Capreomicina, Viomicina sunt aminoglicozide de rezervs utilizate in cazuri de SM-rezistenfi, mecanismul de actiune presupos find inhibitia sintezei proteice. Bazele moleculare ale rezistenei la acesti compusi sunt nect- noscute, dar se crede of sunt implicate modificiri ale componentelorribozomale, ‘ceea ce ar explica gi gradul rdicat de rezistents incrucigaté observat. 2.6.24. Cicloserina CCicloserina este un inhibitor a sintezei de peptidoglycan. Se considera ci acjioneazk asupra M.tuberculosis blocind actiunea alanin racemazei, D-slanin sintetaza, iar rezisten wf eonsecinja modificdrloracestel enzime, 2.6.2.5. Macrolide (Claritromicina) CCaritromicina este un antibiotic cu activitate in vitro asupra mcobscte- riilor netuberculoase. Pare foarte eficienti pe complexul M.avium-intracellulare, ‘dar in monoterapie induce rezistenf2. Actionea74 ca bacteriostatic inhibénd regiu- | | | ‘Mecanisme - diagnostic in tuberculoza pulmonari cu germenichiniorersteni $9 ‘nea peptidyl-transferazei a subunitifii ribozomale SOS. Rezistenta este motivatd de ‘modificir la nivelul centrului peptidy|transferazei, localizatintr-o mica regiune a ARNr - 23S. Utilitatea sa in tratamentul tuberculozei chimiorezistente este pu documentats. 2.6.3. Elementele genetice mobile si mecanismele de transfer genetic in chimiorezistenta M. tuberculosis +Din cele prezentate pini acum, reiese ci rezistenja a antibiotice a ‘M.tuberculosis este legath tn mare mAsurk de mutafi cromozomiale sau dele la nivelul nor, gene existente, ceea ce sugereazi cK eltertrile acestora reprezinti ‘mecanismul principal al dezvoltirii rezistenfei micobacteriene. Situafia fn cazul ricobacterijor este semnificativ.diferiti de cazul altor specii bacteriene, la care ‘mecenismul principal este reprezentat de achizitia de noi determinanfi i rezis- tenfei,transportaji de elementele genetice mobile. {n principal mobilitatea genetic presupune: 1, deplasarea de ino bacteri Ia alta; situate exemplificaté de plasmide gi ‘acteriofagi (plasmida tipick este, de obicei, o molecullcircularé gi ocazional liniari de ADN de dimensiuni variabile, de la cBteva kb pnd la 100 kb, iar ‘bacteriofagii sunt virugi care infocteaza bacterile; 2. deplasarea de a un situs ADN la altul in cadrul genomului unei celule, ‘exemplificati de secvenfele de inserje si transpozoni. Secventa de insertie (IS) ‘consti din I-1,5 kb de ADN mirginité la fiecare capit de o secvenfi de 30 perechi de baze (inverted repeat ~IR) si de o secvensi de 3-5 perechi de baze (direct repeat DR); IS nu congin gene care s4 modifice fenotipul celular. Transpozonii (Th) su similitudini structurale cu secvenfele de inserfie, deosebirea majors constind fn eas ws He Ba an 9 ath . iit aa a ‘Ge vient terkanenys intend!” ‘mites ubovionst etn; lot (heat 28 440 ile bYasinnculare; A prebupiene” un’ tues mane ‘de tite, fifid: cdstisftoare in’ variants’ ded angle? Hit? oa eon mip eliza in rnd nue a ele, dec 8. 4 ual i ve , sleds, npontoia rezspilo . prattica eb ctor Petes bere din cele doi tupin se prepark © serie de tuburi, cu eoncentrajia de antibiotic dublinds-se de la un tub a att (ce obicet:4-8 bein concentrayi: Concettrfile fost sabilite inal prin studi COR tnt ade olin senbie| a Cire edchlaielor: ten ste det Ge dezvoltarea el pikn 20,de tease IRR) Wei Givftnd CMA a wipe tesaié pentru ang 1a Chl uline! 137, considrkad alpina es! ae rezullstcl intermediate find dubitative Deaavantaie: We 5 frei * compard 2 inoculi care ar tebui 88 fe echivaleni, dar al cérorcootiny, in becl vib sagen deemumae, + denote atin, RO a aii a fn price putin 20:colonii, i * lborioast tekic prin utilizareasine game importante de concentra pentru fiecare antibiotic; ot ‘= nu permite estimerea procentajului d,bacil:sezisteng. “Metods este wilizaté seamnificativ in Anglia si une fri anglofone. Mecanisme- diagnostic in tuberculoza pulmonar cu germeni chi oT 2, .2. Metode , ,fenotipice rapide. “Antibiograma pe media fic {Un progres important fos fit odti ca ulzare fn praca lboroa- rela medilrlchide de crestere pentru micobcer, Fall's fot impos de cretrea mai rpc a bacililorn mele chide ded nce solide In 1977, Gardner Middlebrook creeazi un sistem automat de detectare radiometrctpenrucrstrea micobactetilor in medi chide selective, ceo oe In baza dezvoti tenlilor de tip BACTEC. De sil ql pan ln todocere de antibiotic fn medi de cult, in Scop testi senna upon, ase fox det on pu ; BACTEC (metoda radiometrici) Principin: un sistem comercial (BACTEC) @ fost dezvoltat tn scopul detect pesoce a creer micobcterilrprint-otenicdradiometricd. Meteda imbin rapdiatea creer baterilor in medial lichid cu smilie detect radiometrce. Mediu 78128 este un mediu Middlebrook care confine acid palmitic maryat cu '4C radioactiv. In caz de crestere & migobacteriilor, acidul palmitic este utlzat metabolic, find clberat CO, mareat cu ™C, Aer conn i tibul eo rei ch este asprat automat a Tecate 24 ore, iar canaten de COs inert este misurath Into eamert de ionzae gi convert int-un index de cence (Gi-- rows index) numeric pe o carl de a0 a999 (regres mie indo este direct proprtonald eu numdral germenilor si ca ropiditate creel eet mediu). Tntroducere uni sget inhibitor n mati determing reducerea produce de CO, in raport eu egantional mor fr iititor, principles In doer tinare enabler mieobeceree. Tebnica: exe 0 moificare a mode propotilr.Proporia se est de 1% pentru toate antbioieetexate.Concentrape eres de antbioce uss e medi solide a fst adapate pentru medial THL2B, Tnocutl poste f bjt direct din produ petologic omogeizaUdecon- turin, din cule pe media solid sendin cult pe medal Lica lind vrte te ted chide, mu pot § mamrate colo. De acca, inodll acon marr reprecintl 1% din inocu facoanelor e testa ou ania incl, Nivel de restr (AGO repent dferetele valor GI le ui tub oud nisuritor consecutive yi se constitu fat-un subst al namin colo ilor in tehnicile care utilizeazi medii solide. Dac cel putin 1% din populatia bacte- tana ‘ese resto a isoninid,cresieea 99% dm poplais napecwys oe inhbat de antibiotic! incls. Cam tubal muir et fan cn on tose reprecsitind doar 1% din cl din fabl cu anbiodeincuy nivel de epee (BG din wtimal este simitar vai mare cael din ul maton, ‘Valorle Gt depind de numara de baci vil, de omogentates ince luli, de vara altri, de propria popula rerintents, de tmpertiy de incuba, de dita in imp du lect consecutive, de jin inecan, de0 ‘Tuberedoca pulmonar cu garment chinireitent 3.extensia ADN la 72", sub acimea Tag ADN polimerazei, pomind dela morse Fntotdestna in aceeagi drei, de Ia 5 a 3% 1-3 minute. Crescénd st Sedvand ciclie temperatura, reiunea jit este amplificatt exponential, fecare lan} ‘monocatenar produs constitvindu-se fn finta urmétorului ciclu. Sensibilitatea TPetndei poste fi mint prin crsteea numirului de cicluri de amplificare su prin tehnica dervath — nested PCR®, util cnd material intl de amplificat este foarte rar, Dupi o primé amplifcare PCR, un mic egantion din produslrezitt ete adiionstuneis dus mixturi de reacfe care confine gi un nou set de amore CCind finta & fost deja amplificard de cel pujin 1 x10° ori, a dous procedurd de tunplificare fumizeazd material ADN abundent si usor detecabil. Aces tip de tehnicd permis ampifcarea de material ADN de M tuberculosis din esutl pulmonar 8! unei muni de 1000 de ani, utlizind amorse pentru secvenia de insert 5 6110. Odatd dterminatpotenfialul PCR de a genera inateia}abundent, pornind e lao sngurd molecu de ADN, + cbutatidentificaree unorsecvene fat, a Ciror amplifcare si dlecfie sé asigure au numai o mare senibiliat probe Gar go eit mai mare specficiae, Sau utlizatcafinte PCR gena exe codificd phoaphate-binding protein de 38 Ka, gona pentru heat shok prtein de 65 Kaas ‘iterfor secvenele de inserte IS 6110 3i 1S 986, pentru care au fox fabricate uorse specifce 1S 6110 este o secven} caractristicd gi repetitivl (10-16 x) a Sromozamului complexolui Mtuberculoss, care s-a impus dupk uilizara ei ca Stpligeat PCR In diverse produse biologie (spud, lichid LBA, LCR, lichid pleura, singe, win), cu o sensbilitate gi specifiitae de peste 85%. ‘Mentifcarea amplifcatului PCR utiliza ca fini se face cv ajutor sondelor de hibriizare ADN, uo lan oligonucleotide complementar eu sovenss Spesifich. Procesl de hibridizae presupune lipiree sondei de secven tint. fa plus, sondele av un marker (rdioaciv,erzimatic , chemi Fuminiscent, de culoare), a cdrui evideyiere presupune implicit idenifiare seovenel fn. ard a i, prin ea indy, o metods de identiicare a tupinilorchimiorezi- tente de Mitubereuosis, PCR sti 1s baza uoor tehnici gence denvate de mare talitate tn diagnostcul bacteriological chimiorecistenielor. ‘Polimorfiswal lungimil fragmentelor de restricie (RFLP: Restriction ‘Fragment Length Polymorphism). Metoca wilizeazi existenta. uner -ADNtepetitive, de tipul secvenjei de inserjie IS 6110, -constituité din.1355 perechil de bane, prezenth exclusiv in genomml specilor complex M.mubereulsis Numaral ssevenjelor gi poriia In eromozom sunt foarte variable. fn pus, utilizes dia I) 2) capabile sh xebamipcdrsi S2 Renmei pote posse acfionind ca adevirt foarfeci biolgice” Secvenjele de insenie cool situs de ajune a enzimelor de restric, 1 in funct gi localizarea 1S 6110, ‘Mecanisme diognostc in tuberculoza pulmonard cu germeni chimloreistenti TL Unmeazi ‘enzimelor de restricfie gi Sb | tilda aircate ‘tind, sub forma unui adevarat , * polimorfismul lungimii fragmentelor de resvcfe pent IS 6110. Aspectal este eb fleearetulpnd, constituindu-se Int-o ,amprentd* id 0 acestci, de ‘mumel generic al metodelor de acest tip, de eae saen ‘Cam polimorfismul ADN deieta prin TS 6110, ca a gi stabilitates acest element genetic in cromozomol micobacterian sunt foarte inate, meds a fost ot ‘mai mult folositi in investigatia epidemiologicd, rezultind aajchete de filiatiune crepe, Aceon a ads elenete import de nlp tense tii oli, a raportlu reacivare endogeni/suprinfectie exogens. Fra si constiule 0 metodd direct de detemninare a chimiorezitnjelor,coincidenje polis iat ern RFL? cat lt vein de eat eu chimioreisenjkcunoscu, este un argument major $i rapid afirmare a chimiorezisteneitulpini comparae, He sre oti Spoligotyping, Metoda vutlizeaxA_prezeja uni locus i , ia, coninnd un numdr mare de secvenf, ity (Dire PEO de 36 perch de bare, ni erehi deb sui ech ores Rig OMB brass impetese cu secvene spacer de imensiuni variaile 35-41 peechi de ADN in ap-nminiarogiane DR. si 0 sill permit realizar unuaspect de tip ,cod de bare" ‘a sn cazal RFLP. Metoda poate fi pracicats cu sues pe produce biologie, fide adnan er Be as sone pees poo aie x RELP cece a see, riologit ii identiicare indirect a chimiorezistenelor. Reacfialanfurlor de polimerszi — polimorfismul conformatte tal monocatenar (PCR-SSCP ~ Pobmaase Chain Rescion = Single Stand Conformation Polymorphism). Consivico itnyentet rect de determina sla, add ses i een |, mai al fenotpui. Totdatt, deta rezstenfelor se face "pi inca procedure onsmatcae dein ae car. SSCP combink 0 Hep Bentnificlre PERI cu 0 eptde denature (ceparare) prin, cfldurt a celor dows lanjri complementare de AND. Oda separate, ‘caplii eretinaie: Prezenta unei iia en cle care nd ca cxpene och. Simrerstenp ite mn ‘enfonue, coe ce doe leo Aline lces, é + nner monocteare cu nai, comput ex mobilen sleoforetct «lnpre folate seat plats ~aununital pol ‘nea al conforma la moncsenr (i. 28) PCR SSCP « « dovedituninnrumont reat seeiemtfbipct,reciscnh consid condifiile in care, statistic, feietenpi li r1” Tuberculosa pulmonar cu germenichimioreistent strand conformation polymorphism and dideary fingerprinting. 3 Clin Microbiol 195; 3:1617-1623. 44.Floken M, Kirschner P Meler A, Wrede A, Botiger EC. ~ Molecular basis of repomyein- resistance in M,ibercloss alteration ofthe ribosomal protein S12 gene and point mutations within ¢fnctional 165 ribosomal RNA paeuielnot Mol Microbial 1993; 9: 1239-1246, 18. Grange 3M, ~ Drug resistance ond uercuoss elimination. Bull UATLD 1990; 65:57, 16. Guerrero C, Stockman 1, Marchesi F, Bodmer T, Roberts GD. Telit A. — ‘volution ofthe rpoB gene ix rifampicin - susceptible and resistant M. avium and 2M intraceldare.} Antimicrob Chemoter 1994; 33: 61-674 17, Harkin TS, Harvis BW. ~ Treaoment of muidrag-resistant uberculois, Boson USA, Litle. Brown and Ca 1996; 46 18 Helfets LB. Lindholm-Levy Pl. - Pyracinamide seritzing activity in vivo ogcinst semidormant M. tuberculosis populations An Rev Resi Dis 1992 145: 12235. 19.Hellets LB, Lindhola-Lery P3, Constock RD. ~ Clartomicin mixin! inbitory ‘ond bactericidal concentaions against M. avium. Aan Rev Respt Dis 1992; 148: 836858. ; 20,Heym B., Honore Nz Truftot-Pernot C. etal — Implication of muldrug-esistance Jor the fire of shorvcourse chemeheray of uberculess; a molecdar stay, Lance 194. 344: 293.298, 21. Heya By, Zhang ¥.Poulet S. Young D, Cole ST. ~ Characterisation ofthe iG gene cncaing a catalase peresiase rere fer he oniasdscepiby of Mera ‘Bacterial 1993; 175: 4255-4299. 122. Honore N, Cole ST. ~ Sreptompein resistance in mycobacteria, Antimicrob Agents Chemother 1994; 38: 238-242 23, Hooper DC., Wolftion JS. - Quinolone animicrobacterial agents. American Society for “Microbiology (ed), Washington. DC.1993, 14. International Union Against Tuberculosis Bulletin ofthe International Unica Against “Tuberculosis. 34; 85: 1964 35. 1seman MD, Sbarbaro JA. ~ The increasing prevalence of resistance 1 atuber- ‘alos chemetherapeutic agents implication for global tuberculosis control. CU Clin Trop lfet Dis 1992; 12: 188-204 26, Jacobs RF. ~ Maltile drug resistant tuberculosis, Chin Taect Dis 1994; 19:18 427. Thang Y., Heya B, Allen B, Young D, Cole S.~ The cazlase-perridase gee and ‘sonigidesitance of M.wbercaloi, Nature 1982; 388: $9593. 28, Kapur V, LiL Hamrick MR, Plkayts BB, Shinnick TM. Telent! A, Jacobs WR, eee Ax Cole A, Yuen KY. Claridge JE, Kreiswirth BN, Musser JM, — Rapid Mycobaciertum species asignemen! and unambigous identification of ‘mudations associated with anibite resistance in M. tuberculosis by catmated DNA sequencing. Atch Patol Lab Med 1995; 19: 131-138 28. Kochi A, Vareldzs B., StybloK. ~ Muldrug-ressont ubercadois and cour. Res ‘Miceobial 1993 144: 104-110 30. Lambregto-vau We = Brugresiscantebercuoss, Bat Resp Mn. 1997; 4 298326. 31. Lambregt-van Weetenbeck CSB, Veen J. - Control of drug-resistant tuberelot “Tuberc Lung Dis 1995, 76 435-489. 232: Middlebrook G. Cah ML, Sehacfer WT, - Studies on oad and tubercle bail: The isolation, drug suscepablliy and catalase testing of tubercle baci from ‘sonia - treated patients. Am Rey Tuberc 1954, 10: 852.872, 18 36.Mumer IM, ~ dninicobial agent rsstonce in Moboctea’ molecular genetic ‘naighs. Clin Miro Rev 1998; 496.514 36 Orley M, Suz T Sekiya T, Hayat. — Rapid and sense detection of po Iuttions and DNA polymorphisms using the pobmerate chain reaction, Garics 1985; s: 875-479, a 37. Parsons ML, Driscoll JR Taber HW., Salinger M.— Drug resixonce in berculois, a nat Dae Cho Nat pe 197, 95908, Rain P ~ Genetica generald pt umend. Eira Humanitas, Bare, 197. 59, Roberts GD. Goodin NL Hees L.~ Evolution of he Beco radon method ‘for recovery of mycabaceria and drag suscep texting of Misboraacs from FAS ‘Acid para-aminosalicile