Referat pentru Controlul Fitosanitar

Determinarea Salmonella
în conformitate cu prevederile EN
ISO 6579
 2020-2021
Introducere:
Datorită patogenitătii acestora pentru om şi a faptului că, contaminează frecvent cele mai
diverse produse alimentare, bacteriile din genul Salmonella prezintă interes deosebit pentru
microbiologia alimentelor, în special a celor de origine animală.
Salmonella poate fi prezentă în următoarele produse:
 carne și produse din carne
 lapte și produse lactate
 produse din ouă
 legume, fructe și produse din legume și fructe
 produse pescărești
Specii mai frecvent implicate în contaminarea alimentelor : S. enteritidis, S.
typhimurium, S. gallinarum, S. pullorum, S. infantis, S. taksony, S. newport, S. saintpaul S.
berta, S. thompson, S. virchow şi altele.
Majoritatea serovariantelor care cauzează infectii la om şi animale apartin subspeciei
enterica. Serovariantele altor subspecii sunt obişnuit izolate de la animale poichiloterme
(cum sânge rece) şi din mediul ambiant. De asemenea doar câteva serovariante ale S.
arizonae au fost asociate cu îmbolnăviri la păsări şi oi.
Aparatură folosită:
 Termostat 35 oC; 37o ±0,5 oC; 42 oC – pentru dezvoltarea microbiană;
 Etuvă 160 – 180 oC - asigură sterilizarea cu căldură uscată a obiectelor de sticlă,
porţelan, hârtie, vată, instrumente metalice la temperatura de 180oC timp de 30-60
minute;
 Autoclav - realizează sterilizarea prin încălzire cu vapori prin presiune. Temperatura
este de 121oC timp de 20-30 minute;
 Lampă U.V. - radiaţii U.V. cu efect bactericid pentru sterilizarea aerului încăperilor
şi a suprafeţelor de lucru;
 Balanţă analitică - balanţă electronică cu reglare automată funcţie de temperatura
camerei;
 Sterilizator electric pentru instrumente;
 Stomacher 1000 ml, pungi de material plastic pentru stomacher, turmix tip Atomix
de înaltă turaţie (15-20.000 7/min), cu cupe sterilizabile;
 Baie de apă reglabilă la temperatură 35oC sau 37oC, 45oC, 55oC şi 70oC;

2
 Sticlărie folosită:
 Cutii Petri sterile din material plastic cu diametrul de 90-100 mm;
 Pipete gradate sterile de 1 ml+- 0,02 ml sau de 10 ml +- 0,2 ml;
 pH metru cu compensare de temperatură cu exactitate 0,1 unităţi de pH la 25o C;
 Anse bacteriologice cu bucla cu diam de 3 mm din platină-iridiu sau nichel-crom ;
 Eprubete de 16 x 160 mm sterile;
 Flacoane pentru medii de cultură;
 Eprubete cu diam de 8/160 mm;
 Pipete cu scurgere totală cu capacitate nominală de 1 ml şi 10 ml;
 Mojar cu pistil, sterile;
 Eprubete gradate;
 Baloane erlenmayer cu capacitatea de 90, 150 şi 250 ml.
Metodologia de diagnostic
Detecţia Salmonella spp. se efectuează în conformitate cu standardul ISO 6579/2003
AC/2006 "Microbiologia alimentelor şi a hranei pentru animale – Metoda orizontală de
cercetare a Salmonella spp.
Detecţia Salmonella spp. necesită parcurgerea a patru faze succesive:
I. Preîmbogăţirea în medii lichide neselective: apa peptonată tamponată se inoculează
la temperatura camerei cu proba pentru analiză, apoi se incubează la 37ºC ± 1º C timp
de 18 h ± 2 h. Preâmbogăţirea este necesară pentru resuscitarea germenilor distruşi.

II. Îmbogăţire în medii selective lichide: Mediul Rappaport-Vassiliadis cu bullion RVS

şi bulionul Muller-Kauffmann tetrationat/novobiocină (bullion MKTTn) se inoculează
cu cultura obţinută în urma inoculării apei peptonate. Bulionul RVS se incubează la
41,5º C ± 1º C timp de 24 h ± 3 h şi bulionul MKTTn la 37 º C timp de 24 h ± 3 h.
Aceste medii conţin substanţe inhibitorii pentru bacterii non-Salmonella.

3
 Fig.1. 1. Mediu Fig.1. 2. Müller –Kauffman
Rappaport –Vasilliadis înainte şi după incubare
înainte şi după incubare

III. Izolare şi identificare: din culturile obţinute în urma inoculării RVS şi MKTTn, se
inoculează două medii selective solide: agar xiloză-lizină-dezoxicolat; orice alt mediu
selectiv solid complementar cu agarul XLD şi potrivit în special pentru izolarea
Salmonellei lactoză-pozitivă (de exemplu Rambach). Agarul XLD şi mediul Rambach
(recomandat a fi ales) se incubează la 37ºC ± 1ºC şi se examinează după 24 h ±3 h.
Acestea permit diferenţierea salmonelelor de alte enterobacterii.

Fig. 1 pe
Fig.1. 3. Colonii de Salmonella .4. Colonii de Salmonella pe
mediu XLD mediu Rambach

Fig. 1 5.Colonii de Salmonella pe

mediu Cromogen

4
IV. După izolarea tulpinilor în cultură pură, confirmarea se face prin diverse teste
biochimice şi serologice. Salmonelele posedă antigene somatice (O), flagelare (H) şi
de virulenţă (VI) ce pot fi identificate prin serotipizare, iar serovariantele pot fi
identificate după formula lor antigenică, conform schemei Kauffman–White.
Teste biochimice pentru confirmarea prezenței Salmonella
Agar TSI - se însămânţează coloana agarului TSI prin striere, iar panta prin trasare.
Se incubează la temperatura de 35o - 37oC timp de 24 h. Se interpretează modificările care se
produc în mediu în modul următor:
Baza mediului:
 galbenă – glucoză pozitiv (fermentarea glucozei);
 roşie sau nemodificată – glucoză negativ (lipsa fermentării glucozei);
 neagră – formare de hidrogen sulfurat;
 bule de gaz sau fisuri-formare de gaz din glucoză:
Panta mediului:
 galbenă – lactoză şi/sau zaharoză pozitiv;
 roşie sau nemodificată lactoză şi zaharoză negativ (neutilizarea lactozei şi a
zaharozei).
Culturile tipice de Salmonella corespund unei pante alcaline (roşie) cu formare de gaz şi a
unei baze acide (galbenă) cu formarea (90% din cazuri) hidrogenului sulfurat (înnegrirea
agarului. Atunci când se izolează o Salmonella lactoză pozitiv panta agarului TSI este
galbenă, În consecinţă o confirmare preliminară a culturilor de Salmonella nu trebuie să se
bazeze doar pe rezultatele obţinute pe agarul TSI.

Fig. 1 .6. Test TSI

5
 Agar cu uree
Se însămânţează panta agarului în striuri. Se incubează la 35 o sau 37oC timp de 24 h şi se
examinează din când în când. În cazul reacţiei pozitive descompunerea ureei produce
degajarea amoniacului, făcând să vireze roşu de fenol la roz apoi la roşu închis Reacţia este
deseori vizibilă după 2 până la 4 h.
Mediu pentru decarboxilarea L-lizinei
Se însămânţează mediul lichid sub suprafaţă. Se incubează la 35 o sau 37oC timp de 24 h. O
culoare violet apărută după incubare indică o reacţie pozitivă. O culoare galbenă indică o
reacţie negativă.

Fig. 1 .7.Reacție pozitivă și negative pentru

decarbocilarea L-lizinei

Evidenţierea betagalactozidazei
Se dispersează o ansă din colonia suspectă într-o eprubetă ce conţine 0,25 ml soluţie salină, se
adaugă o picătură de toluen şi se agită eprubeta. Se introduce eprubeta în baie de apă reglată
la 35o sau 37oC şi se lasă să stea câteva minute. Se adaugă 0,25 ml reactiv pentru evidenţierea
betagalactozidazei şi se amestecă. Se reintroduc eprubetele în baia de apă la 35 o sau 37oC şi se
lasă 24 examinându-le din timp în timp. O culoare galbenă indică o reacţie pozitivă, deseori
reacţia este vizibilă în 20 minute. În cazul folosirii discurilor de hârtie gata preparate se
respectă instrucţiunile fabricantului.
Mediu pentru reacţia VP
Se dispersează o ansă din colonia suspectă într-o eprubetă conţinând 0,2 ml VP, se incubează
la 35o sau 37oC (conform acordului) timp de 24 h. După incubare se adaugă 2 picături din
soluţia de creatină, 3 picături din soluţia alcoolică de l-naftol şi apoi 2 picături din soluţia de

6
hidroxid de potasiu agitând după adăugarea fiecărui reactiv. Formarea unei coloraţii roz până
la roşu aprins într-un interval de 15 minute indică o reacţie pozitivă
Mediu pentru evidenţierea indolului
Se însămânţează o eprubetă ce conţine 5 ml mediu triptonă-triptofan cu colonia
suspectă Se incubează la 35o sau 37oC timp de 24 h. După
incubare se adaugă 1 ml reactiv Kovacs. Formarea unui inel roşu
indică o reacţie pozitivă. Formarea unui inel galben brun indică o
reacţie negativă.

Fig. 1 .8. Reacție pozitivă și

negative pentru evidențiarea
inodului

Reacţia de aglutinare rapidă, pe lamă cu ser polivalent anti-Salmonella

Cercetarea prezenţei antigenelor O Vi sau H de Salmonella se efectuează prin aglutinare pe
lamă cu seruri adecvate din colonii pure şi după eliminarea tulpinilor autoaglutinabile.
Eliminarea tulpinilor autoaglutinabile. Se depune pe o lamă de sticlă curată o picătură
de soluţie salină, se dispersează în această picătură o fracţiune din colonia de testat aşa fel
încât să se obţină o suspensie omogenă şi tulbure prin mişcarea lamei timp de 30-60 secunde.
Dacă bacteriile se adună în grămezi, tulpina este considerată autoaglutinabilă şi nu mai trebuie
supusă examinărilor ulterioare. Examinarea se face cu ajutorul unei lupe pe fond negru.
Evidenţierea antigenelor O. Dintr-o colonie pură cunoscută ca neaglutinabilă se
procedează ca mai sus, dar în locul soluţiei saline se foloseşte o picătură de antiser O. Dacă se
produce aglutinarea reacţia este considerată pozitivă. Se utilizează serurile poli şi
monovalente unul după altul.
Evidenţierea antigenelor Vi. Se procedează ca mai sus utilizând o picătură de antiser
Vi. Dacă se produce aglutinarea reacţia este pozitivă.
Evidenţierea antigenelor H. Se însămânţează un agar nutritiv semisolid cu o colinie
pură neautoaglutinabilă, se incubează la 35o 37oC timp de 24 h, se utilizează această cultură

7
pentru examenul antigenelor H
procedâmd ca mai sus, dar folosind o picătură
antiser H.Dacă se produce aglutinarea
reacţia este considerată pozitivă.

Fig. 1 .9. Reacţia de aglutinare

Alte posibilități de diagnostic

ELISA pentru S. enteritidis
Pentru detecţia de IgG (IgY) specific S. enteritidis sunt utilizate 2 sisteme de bază: ELISA
indirect (1) şi ELISA competitiv „ tip sandwich”. Reacţiile ELISA sunt uşor pretabile la
automatizare, şi prin urmare pot fi incluse în programe de testare, însă echipamentele
necesare, precum şi reagenţii sunt costisitori.
ELISA mix (sau ELISA aplicabilă pe suc de carne) este utilizată în Danemarca pentru
decelarea infecţiilor salmonelice la porci. Această variantă ELISA include antigene somatice
(O) 1, 4, 5, 6 şi 12 cu care poate detecta serologic 95% din serogrupele de salmonele
circulante la porcii din Danemarca. Pentru porcii abatorizaţi se utilizează sucul rezultat prin
congelarea şi decongelarea a 10 g de muşchi.
Interpretarea rezultatelor
Organism indicator
Alimentele gata pentru consum nu trebuie sa contina Salmonella spp. Trebuie să se
asigure masuri de control specifice in timpul producţiei, standarde de igiena adecvate, gătire
adecvată în timpul pregătirii finale pentru ca produsele finale să nu conţină organisme viabile
şi ca alimentele gătite să fie de bună calitate.
Stabilirea conformităţii probelor
Limitele stabilite conform R (CE) 2073/2005 se referă la fiecare unitate de probă
testat. Rezultatele testelor demonstrează calitatea microbiologică a lotului testat.

8
Salmonella în diferite categorii de produse alimentare:
 satisfăcătoare, în cazul în care toate valorile observate indică absența bacteriei;
 nesatisfăcătoare, în cazul în care prezența bacteriei este detectată în oricare dintre
unitățile de probă.

Bibliografie
1. http://www.biotim.ro/salmonella-in-alimente/
2. http://www.bioneks.com/en/salmonella
3. https://www.chegg.com/flashcards/microbiology-practical-exam-2-b3ac37e7-
8362-4f12-9e26-fdb1017668d9/deck