MICROBIOLOGIE GENERALĂ

Laborator 3

MEDIILE DE CULTURĂ

Mediile de cultură oferă condiţii de creştere şi dezvoltare asemănătoare celor naturale.

Ele se folosesc pentru determinarea cantitativă şi calitativă a microorganismelor, pentru izolarea
lor şi păstrarea în cultură pură.
Mediile de cultură fi clasificate după mai multe criterii:
După natura substanţelor organice:
- medii naturale (cartof, morcov, lapte, bilă, urină);
- medii artificiale simple sau complexe (apă peptonată, bulion nutritiv, geloză, gelatină).
După complexitate:
- medii simple sau uzuale, folosite pentru cultura unui spectru larg de specii microbiene;
pot fi solide (geloza simplă, gelatina) sau lichide (bulion, apa peptonată);
- medii complexe, folosite pentru izolarea şi cresterea preferenţiala unor organisme care se
dezvoltă greu sau deloc pe mediile simple (bulion-ser, bulion-sânge, bulion-glucoză,
agar-ser etc);
- medii speciale, care permit creşterea preferenţială a unor specii microbiene, pun în
evidenţă anumite caracteristici metabolice sau alte scopuri precise;
După compoziţie:
- medii albuminoase (de ex: mediul Dorset);
- medii zaharate (de ex: mediul Drigalski).
După scopul pentru care se întrebuinţează:
- medii de îmbogăţire: favorizează dezvoltarea anumitor specii;
- medii selective: conţin substanţe bacteriostatice care inhibă dezvoltarea anumitor specii şi
favorizează creşterea altora;
- medii elective - sunt medii fără substanţe bacteriostatice, a căror compoziţie oferă
condiţii de dezvoltare unor specii care cresc mai rapid decât alte specii asociate;
- medii diferenţiale sau de identificare, care conţin indicatori pentru punerea în evidenţă a
unor procese biochimice caracteristice pentru metabolismul unei specii;
- medii de conservare folosite pentru menţinerea în viaţă a unei culturi.
După prezenţa sau absenţa oxigenului:
- medii pentru microorganismele aerobe;
- medii pentru microorganismele anaerobe.
Un mediu de cultură trebuie să îndeplinească următoarele condiţii:
să ofere microorganismului substanţele nutritive specifice (o sursă de carbon, o sursă de
azot, elemente anorganice, factori de creştere);
să aibă un anumit grad de aciditate sau alcalinitate;
prezenţa oxigenului în cazul germenilor aerobi şi absenţa acestuia în cazul celor anaerobi;
să fie steril;
să fie clar, limpede pentru a permite studiul caracterelor culturale.

Tehnica preparării mediilor de cultură simple

Pentru numeroase medii de cultură substanţa nutritivă de bază o reprezinta maceratul de
carne. Deşi există produse standard ce înlocuiesc acest macerat (extract de carne produs de
diferite firme) se pot folosi şi tehnicile clasice de preparare a maceratului de carne.
1
 Prepararea mediilor de cultură uzuale lichide
Bulionul de carne
Reprezintă mediul de bază în microbiogie. El se prepară în două etape: obţinerea
maceratului şi prepararea bulionului.
Maceratul : Din 500 g de carne slabă de vită sau de cal, curaţată de tendoane, aponevroze şi
grăsimi, se toacă şi se macerează la rece în 1000 ml apa de robinet, timp de 12-24 de ore. In acest
interval se realizează autoliza ţesuturilor şi solubilizarea produselor de autoliză în apă. Se fierbe
apoi maceratul timp de 10 minute pentru a acentua dizolvarea substanţelor solubile şi a coagula
albuminele insolubile. După răcire se filtrează prin hârtie de filtru sau vată pentru a opri
grăsimile. Se repartizează apoi zeama de carne în flacoane sterile care se închid cu dopuri de vată
şi tifon. Se sterilizează 30 minute la 120 ºC .
Pentru a produce un bulion de calitate superioara, maceratul se poate autoclava la 2
atmosfere, proteinele fiind degradate până la stadiul de aminoacizi şi peptone, devenind mai
accesibile.
Bulionul: La 1000 ml zeamă de carne se adauga la cald 10g peptonă şi 5g NaCl, se
amestecă totul şi se încălzeşte până la dizolvarea completă a peptonei. Se lasă să se răcească, se
determină şi se corecteaza pH-ul.
După această operaţie mediul se autoclavează 15 minute la 120 ºC. Se filtrează prin
hârtie de filtru, apoi se repartizează steril în baloane sau eprubete sterile, care se închid cu dopuri
şi se sterilizează 20 minute la 115 ºC.
Pentru prepararea bulionului din extract de carne (extract Difco), la 1000 ml de apă
distilată se adaugă 3g extract de carne, 10g peptonă şi 5g NaCl.

Apa peptonată
La 1000 ml apa distilata se dizolvă, la cald, 10-20g peptonă, şi 5g NaCl. Se ajustează pH-
ul la 7,8 -7,9. Se filtrează prin hârtia de filtru. Se repartizează în baloane sau eprubete şi după ce
s-au închis cu dopuri de vată se sterilizeaza 30 minute la 120 ºC.

Bulionul glucozat
Se prepară pornind de la bulionul propriu-zis, la care se adaugă glucoza în proporţie de
0,5-1%. Sterilizarea se face prin tindalizare la 100 ºC, 30 minute, 3 zile consecutiv.

Bulionul glicerinat
La bulion se adauga glicerol în proporţie de 1% , respectiv 5%. Sterilizarea se face la
110 ºC, 20 de minute.

Prepararea mediilor uzuale solide

Geloza simplă sau bulion-agar
La 1000 ml bulion se adaugă 20g agar-agar (fibre tăiate în bucăţi mici). Fibrele de agar-
agar sunt lipsite de proprietăţi nutritive, ele servind numai pentru solidificarea mediului. Agarul
este o substanţă coloidală hidrofilă (un polizaharid) extrasă din alge roşii, cum ar fi de exemplu
Gelidium corneum. Constituientul principal este esterul sulfuric al galactanului linear capabil să
formeze un gel apos care nu este atacat de marea majoritatea a bacteriilor care rămâne solid până
la circa 90 de ºC. Când se încălzeşte cu exces de apă până la 100°C, agarul formează un sol (se
lichefiază), solidificându-se apoi la 45°C. Diferitele tipuri de agar diferă în ceea ce priveşte
proprietăţile fizice, chimice şi biologice, în funcţie de sursa originală şi tratamentele la care au
fost supuse.

2
 Bulionul împreună cu fibrele de agar-agar se încălzeşte fie pe baia de apa, până la
lichefierea completă a fibrelor de agar sau în autoclav la 120 grade Celsius, timp de 30 minute.
Apoi se filtrează prin vată la cald, eventual în autoclavul deschis. Filtratul se repartizează în
eprubete sau baloane după care se închid cu dopuri de vată şi se sterilizează la autoclav la 120
grade Celsius, 30 minute. Geloza nutritivă este transparentă, de culoare galbuie. Se foloseşte sub
formă de geloză înclinată în tuburi sau turnată în cutii Petri. Mediul preparat nu se poate pastra
mult timp in laborator, deoarece prin evaporare se usucă.

Mediul cu gelatină
La 1000 ml bulion încălzit la 80 ºC se adaugă gelatina - 12-15g. Se agită până la
lichefierea gelatinei. Când gelatina este complet lichefiată, nu trebuie să depăşească 80 ºC, se
alcalinizeaza cu NaOH 10%, apoi se lasă să se răcească la 55 ºC. In acest moment se adaugă un
albuş de ou dizolvat în 10-20 ml de apă distilată., mediul împreună cu albuşul de ou se agită
puternic, se autoclavează apoi 30 de minute la 115 ºC. Se filtrează, apoi se repartizează în tuburi.
Tuburile se închid cu dopuri de vată şi se autoclavează la 110 ºC, 20 minute. Mediul se lasă să se
răcească în poziţie verticală.

Mediile semisolide
Sunt medii obişnuite care se prepară din bulion, la care se adaugă agar-agar în proporţie
de 0,5%. Aceste medii au o consistenţă semifluidă. Se folosesc pentru cultivarea şi conservarea
bacteriilor, pentru cultivarea stafilococului producător de toxină.

II.Tehnica preparării mediilor de cultură pentru bacteriile anaerobe

Germenii anaerobi se pot cultiva şi pe mediile uzuale folosite pentru germenii aerobi,
dacă se elimină oxigenul, prin introducerea recipientelor în anaerostat.
In practică se folosesc mai frecvent două medii pentru cultivarea bacteriilor anaerobe:
bulionul cu ficat şi carne şi geloza Veillon.
Bulionul cu carne şi ficat
Compoziţia:
- ficat de viţel 250g
- carne de viţel 250g
- apă de robinet 1000ml

3
 Mod de lucru:
Ficatul şi carnea tocată mărunt se amestecă cu apa şi se fierbe apoximativ 20 minute. Se
filtrează apoi prin tifon. Amestecul de ficat şi carne rămas pe tifon se spală de 4-5 ori cu apă
distilată şi se usucă într-o bucată de pânză curată. Sub această formă se repartizeaza în tuburi
sterile, în cantitate de 3g/ tub.
Lichidul rezultat la filtrare se completeaza cu apa de robinet pana la volumul initial de
1000ml.Apoi la acesta se adauga: peptona tripsica 15g, Na Cl 5g.
Amestecul se incalzeste pana la dizolvarea acestor ingrediente, dupa care se ajusteaza
pH-ul la 8.Se autoclaveaza 20 minute la 120 grade Celsius, se adauga glucoza in proportie de
2%. Se filtreaza prin hirtie de filtru. Din filtrat se repartizeaza cite 6ml in fiecare tub care contine
3g amestec carne şi ficat. In fiecare tub se mai adauga şi 2ml ulei de vaselina steril. Se
sterilizeaza prin autoclavare la 115 °C, timp de 15 minute sau prin tindalizare la 100°C timp de
30 minute, 3 zile consecutiv. Adăugarea uleiului de vaselină nu este obligatorie, însă mediul
trebuie fiert înaintea întrebuinţării pentru îndepărtarea oxigenului.
Geloza Veillon
Are următoarea compoziţie –bulion 1000ml
- glucoză 10g
- KNO3 1g
- agar-agar 10g
Mod de lucru: se dizolvă glucoza şi azotatul de potasiu în bulion. Se adaugă agar şi se
încălzeşte până la lichefierea agarului. Se filtrează prin vată şi se repartizează în tuburi Weinberg
în aşa fel încât mediul să ocupe mai mult de jumatate din înălţimea tubului.
După închidere cu dopuri de vată se sterilizează la 115 °C timp de 15 minute. Azotatul de
potasiu se adaugă mediului datorita gazelor produse in cursul metabolismului bacterian. CO2 şi
H2 care se produc in cursul acestui metabolism sunt transformate in K2CO3 şi H2O in prezenţa
KNO3.

III. Prepararea mediilor speciale

Mediul Chapman lichid
- extract de carne 4g
- peptona Witte 10g
- NaCl 150g
- lactoza 15g
- apa distilata 1000ml
Soluţia de lactoză se prepară separat în 150 ml apă distilată. Celelalte substanţe se dizolvă
toate în restul de apă distilată, la cald, după care se corectează pH-ul la 7,6. Se autoclaveaza 30
minute la 120 °C. Se filtrează prin hârtie de filtru şi se adaugă soluţia de lactoză. Se repartizează
în eprubete sterile şi se autoclavează la 110°C timp de 20 minute.
Datorita concentraţiei ridicate de NaCl mediul inhibă microflora de asociaţie permiţând
dezvoltarea stafilococilor patogeni, rezistenţi la concentraţia respectivă.

Medii selective.
Mediul Levine (EMB-eosine methylene blue)
- peptonă 10g
- KH2PO4 2g
- agar agar 15g
- apa distilata 1000ml

4
 Se fierbe până la completa dizolvare a ingredientelor. Se filtrează prin hârtie de filtru sau
vată. Dupa răcire mediul se aduce la volumul iniţial cu apa distilată. Se corectează pH-ul la 7,4.
Se repartizează în baloane de 100ml şi se sterilizeaza 30 minute la 120°C. In momentul
întrebuinţării se topeşte geloza pe baia de apă şi după răcire la 50 °C se adaugă - la 100ml mediu,
5ml soluţie sterilă de lactoză 20% (sterilizată 20 minute la 110°C), 2ml solutie apoasă de eosină
galbenă 2% şi 1,3ml soluţie apoasă de albastru de metilen 0,5%. Dupa omogenizare mediul se
toarna în cutii Petri
Mediul Levine are culoarea roşie violacee şi se foloseşte pentru analiza microbiologică a
apei. Coloniile de Escherichia coli apar negricioase cu luciu metalic, în timp ce coloniile
celorlalte enterobacteriaceae apar colorate in roz.

Medii elective - Mediul Loffer

- bulion 100ml
- glucoza 1g
- ser normal de bou (steril) 300ml
Se stabileste pH-ul bulionului la 7,5 şi se amesteca bine cu serul, apoi se repartizează
steril în tuburi 5-7ml. Se coaguleaza pe baia de nisip la 85-90 °C timp de 30 minute. Pe acest
mediu bacilul difteric se dezvolta în 8-16 ore, pe cand flora de asociaţie abia dupa 22-24 ore.

Medii diferenţiale - mediul Drigalski

- bulion de carne 1000ml
- peptona 10g
- NaCl 5g
- lactoza 15g
- turnesol solutie 10% 60ml
- agar agar 20g
Este un mediu de diagnostic diferenţial pentru genurile Escherichia şi Salmonella
Ingredientele se dizolva la cald.Se ajusteaza pH-ul la 7,4. Se autoclavează la 110°C 20 minute.
Mediul are culoarea violet deschis. Coloniile de Salmonella produc virarea culorii in albastru, iar
cele de Escherichia în roşu.

5
 Aplicaţie practică:

1. Se prepară de fiecare grupa de studenţi (grupe de doi studenţi), cate 100 ml mediu de
bulion nutritiv si 100 ml mediu de geloză.
Materiale necesare: peptona, extract de carne, apa distilată, agar, NaCl, eprubete, cilindru
gradat, plăci Petri sterile, autoclav,pH-metru sau hârtie indicatoare, becuri de gaz, balanţă
analitică
Mod de lucru: se cântăresc substanţele necesare, se vor dizolvă la cald in apa distilată, se
verifică şi se corectează pH-ul, se filtrează şi se autoclavează mediul preparat

2. Bulion nutritiv (pt 1000ml):

- peptonă 10g
- extract de carne 10g
- NaCl 5g
- Apă distilată 1000ml
Ingredientele se dizolvă la cald, iar după răcire se verifică şi se corectează pH-ul la 7,6.
Mediul se autoclavează la 121 grade 15 min. Se filtrează si se repartizeaă in tuburi şi se
autoclavează iaraşi la 121 grade timp de 15 minute.

3. Mediul de geloză
- bulion nutritiv 1000ml
- agar 20g
Amestecul se încălzeste pe baia de apă pănă la dizolvarea agarului, se filtrează se
repartizează în tuburi şi se sterilizează prin autoclavare la 121 grade, timp de 30 minute.