UNIVERSITATEA DE STAT DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE

“NICOLAE TESTEMIȚANU”

Facultatea Farmacie

Plante medicinale implicate în

linii industriale de producere
a principiilor active prin
biotehnologii in vitro
 CUPRINS

1. Introducere
2. Fenomenul de totipotență
3. Noțiunea de calus
4. Cultura in vitro pentru obținerea substanțelor biologic
active
5. Etapele biotehnologiei de producție a metaboliților
secundari în culturi in vitro
6. Caracteristica fiecărei etape
7. Exemple de plante crescute prin biotehnologii in vitro
8. Bibliografie
 INTRODUCERE
 Biotehnologia celulară
se bazează pe capacitatea
celulelor de a exista și a se
reproduce in vitro.
 Biotehnologia celulară
reprezintă un sistem de
procese tehnologice, la
baza cărora se află metoda
cultivării celulelor sau
țesuturilor izolate pe medii
nutritive, în condiții
aseptice, în afara
organismului. Această
metodă, numită cultură in
vitro, actualmente se
folosește pe larg în
biotehnologie.
Rolul culturii țesuturilor și celulelor izolate a plantelor în
biotehnologie poate fi apreciat în conformitate cu următoarele
aspect:
Cultura in vitro pentru obținerea substanțelor biologic
active
Posibilitatea utilizării unor specii de plante, care în condiții locale
nu pot fi cultivate
Tehnologiile celulare pentru însănătoșirea și clonarea
CELULEI LA PLANTE
BIOTEHNOLOGIA plantelor
Metoda microclonării plantelor oferă posibilitatea să fie obținute
pînă la 1 milion de plante de la o singură meristemă. De asemenea,
ea nu depinde de condițiile climaterice și oferă posibilitatea de a
obține producție în decursul întregului an.
Tehnologii celulare auxiliare, care accelerează
procesul de selecție a plantelor agricole:
crioconservarea, obținerea haploizilor, etc.
Tehnologii celulare utilizate pentru extinderea diversității genetice la
plantele agricole: hibridarea somatică, variabilitatea somaclonală
Heterogenitatea genetică a celulelor în cultură in vitro (fenomen de variabilitate
somaclonală) dă posibilitatea ca ele să fie folosite în ameliorarea celulară. Pentru
acesta se selectează celulele rezistente la diferiți factori nefavorabili ai mediului
ambient: secetă, salinitatea solului, tenperaturi joase, patogeni, etc, de semenea,
se selectează și celulele care posedă a productivitate înaltă. asemenea, se
selectează și celulele care posedă a productivitate înaltă.
 Fenomenul de totipotență

• La baza metodei culturii de celule se află fenomenul de totipotență.

Totipotența este însușirea celulelor de a realiza informația genetică a nucleului care asigură înmulțirea,
diferențierea și dezvoltarea lor pînă la regenerarea în cultură a unui organ sau a întregului organism. În anumite
condiții, totipotența poate să se manifeste și la celulele somatice.

În condiții naturale, totipotența nu se manifestă la toate grupele sistematice ale plantelor, Astfel, multe specii de
plante din clasa monocotiledonatelor au pierdut capacitatea de a regenera. Însă, în procesul cultivării țesuturilor
sau oraganelor (explantelor) pe mediile nutritive artificiale in vitro, și la aceste plante este posibilă realizarea
totipotenței, care în condiții naturale este supresată.
! Celulele ce se cultivă in vitro,
Se disting următoarele obiecte vegetale de joacă un rol primordial , deoarece
izolare in vitro în funcție de: ele apar ca un obiect direct al
1.) Tipul de organe : cultura embionului, manipulării genetice, sau ca o
cultura rădăcinilor, meristemelor, lăstarilor, etapă specială a tehnologiilor, care
etc. se realizează
2.) Tipul de țesuturi: cultura țesuturilor de
calus, cultura țesuturilor tumorale;
3.) Tipul de celule: cultura de suspensie,
cultura celulelor separate ,cultura
protoplaștilor separați;
 Noțiunea de calus

Din fiziologia plantelor se știe, că în condiții naturale fiecare celulă

vegetală trece 3 faze de dezvoltare:
 Diviziune
 Extindere
 Diferențiere
Celulele diferențiate (specializate) în componența plantei nu sunt capabile
să se divizeze. Deci, este clar, că totipotența lor este joasă. Din această S
cauză multe specii de plante au pierdut capacitatea de regenerare directă O
din celule sau fragmente ale țesuturilor, chiar în condiții in vitro. L
U
Pentru ca celulele diferențiate să capete din nou capacitatea de a se Ț
diviza, e necesar să se producă dediferențierea, adică celulele să se
reîntoarcă din nou în stare meristematică. În acest scop savanții au folosit I
fenomenul care se întîlnește în natură – formarea țesutului de calus A

Calusul reprezintă o masă neorganizată de celule parenchimatice proliferate, care prin

cultivare formează focare de celule meristematice, elemente de sisteme conducătoare, celule
pigmentate.
Inducția și activarea totipotenței se înfăptuiește, mai repede, în condițiile transferării celulei din
stare deferențiată în stare dediferențiată. De aceea, ulterior, în calus poate să se producă
diferențierea secundară cu formarea țesuturilor și organelor specializate.
Ciclul de creștere
 Cultura in vitro pentru obținerea
substanțelor biologic active
METABOLISMUL

PRIMAR
Formarea și descompunerea
acizilor nucleici, proteinelor și
precursorilor săi, de asemenea
majoritatea glucidelor, a unor
acizi carbonici.
SECUNDAR
Formarea de compuși specifici
numai pentru unele specii, iar
produsele lor se numesc produse ale
metabolismului secundar sau
substanțe secundare

Metaboliții secundari pot fi obținuți pe mai multe căi:

 Extracția din plantele cultivate sau din flora spontana
 Semisinteza chimică, care necesită identificarea în plante a moleculelor, de la care se
poate continua sinteza în reactor; cei mai mulți compuși din această categorie sunt, însă
greu de sintetizat
 Cultivarea in vitro a celulelor care sintetizează metaboliți secundari. Pe
acestă cale pot fi obținuți compușii doriți , la nivelurile calitative și cantitatice constante.
 Etapele biotehnologiei de producție a
metaboliților secundari în culturi in vitro
În ultimii ani au fost propuse principiile generale ale programului de producere a metaboliților
secundari prin cultura in vitro (Badea, Săndulescu, 2001).

1. Alegerea speciei și chemotipului

Se pornește de la raționamentul, că genurile/speciile care sintetizează un metabolit secundar în
cantități mari vor genera culturi in vitro foarte productive.

De exemplu, genurile Scopolia, Duboisia și Atropa sintetizează alcaloidul atropină. Speciile

genului Duboisia sunt cele mai bune surse de atropină, însă nu sintetizează acest compus in vitro.
În schimb, în aceleași condiții, în culturile derivate din speciile genului Atropa este detectată
atropina.

În continuare, în cadrul speciei respective, se selecționează plante foarte productive, exploatîndu-

se variabilitatea genetică naturală.
 2. Obținerea unei colecții de calusuri

Se inițiază culturi de calus.

Scopul: Extinderea variabilității genetice prin efectul mutagen al culturii per se. Sunt luați în
considerație toți factorii implicați în controlul fenomenului:
 Tipul de explant – se folosesc explante foarte variate, provenite din frunze, tuplini, rădăcini,
inflorescențe, etc.
 Tipul mediului de cultură – se folosesc diferite doze de săruri minerale și surse de nergie,
diverși hormoni
 Condițiile de cultură – se aplică diferite temperaturi, fotoperioade, etc.
Colecția de calusuri este menținută prin subcultivări, repetate la intervale regulate de timp. În
cursul acestor repicări, sunt selecționate variațiile de interes ( culoare, aspect, consistență,
viteză de creștere).
Liniile celulare identificate sunt izolate și multiplicate în condiții de cultură bine stabilite.
 3. Selecția liniilor celulare înalt
productive
La această etapă sunt necesare o serie de tehnici foarte eficace de extracție și de
dozare a metabolitului. Tehnicile utilizate în cazul plantelor întregi nu sunt
ăntotdeauna aplicabile culturilor in vitro. În absența unor organe specializate pentru
acumulare, pot fi selecționate tipurile celulare care “rezolvă” acesată problemă.
Exemple
Celulele de busuioc și Metaboliții colorați Pentru toți ceilalți se
de mac acumulează (șikonine, antociani) sau poate utiliza întreaga
terpenoizi sub formă de cei care sunt fluorescenți gamă de metode
glucozide și, respectiv, în ultraviolet (serpentina, biochimice cunoscute:
alcaloizi conjugați cu acidul rozmarinic), se  Colorimetrice
molecule cu greutate selecționează cel mai  Cromatografice
mare. Tot în absența ușor - vizual  Imunologice (ELISA =
organelor specializate, enzyme-linked
este posibil ca immunosorbent assay,
metabolitul secundar să RIA = radio-
fie eliberat în mediu immunoassay )
(prin liza celulelor,
difuziune sau extracție). Metodele de detectare trebuie să fie rapide, sensibile, fiabile,
reproductibile și aplicabile atît celulelor, cît și mediului.
 4. Obținerea unei suspensii celulare
stabile și înalt productive
Pentru utilizarea tehnologiilor industriale Producerea comercială a șikoninelor
este necesar trecerea culturilor în mediul (compuși colorați antimicrobieni,
lichid. Trecerea se face treptat, începîndu-se evaluați la aprx. 4000 USD/kg) se
cu vase de 250 ml. Noile condiții de cultură
pot determina însă modificări ale capacității
realizează în 2 etape:
de biosinteză, impunînd o nouă selecție 1. o etapă, cu durata de 9 zile, în
pentru izolarea unor cloni cu randament care se produce biomasa
stabil. 2. o etapă de producție a
Odată obținută, o linie stabilă în mediu lichid, metaboliților, cu durata de 5 zile,
se poate trece la optimizarea producției. ce se desfășoară într-un mediu
Exemplu
Astfel spus, la stabilirea factorilor chimici și îmbogățit în azot și calciu (
fizici care determină cele mai înalte niveluri
ale producției compusului vizat. Se studiază
creșterea conținutului de calciu de
efectele modificării: 30 de ori determină creșterea
- Surselor de elemente minerale (azot, producției de metaboliți de 3 ori),
fosfor) și/sau enegie din mediu dar lipsit de vitamine și citokine
- Valorii pH
- Condițiilor de mediu ( temperatura,
calitatea luminii, etc)
Trebuie determinat, de asemenea, momentul Suspensiile celulare stabile și foarte productive
sintezei metabolitutlui. Frecvent, se stabilesc trebuie conservate la temperaturi scăzute,
condiții potime de creștere a culturii și de eventual în azot lichid.
sinteză a metaboliților, care pot să nu
coincidă.
 5. Producția la scara industrială

Se realizează pasaje succesive, în volume din ce în ce mai mari, pentru a se ajunge la condiții
industriale (75 m3). La această etapă, trebuie să se țină cont de o serie de caracteristici ale
celulelor vegetale:
1. Au timpul de dublare de 16-24h., deci cu mult mai lung decît timpul de dublare al
microorganismelor, care este de numai 1h și din acestă cauză, cantitatea de biomasă
produsă va fi relativ mai mică
2. Formează agregate in vitro, fapt ce impune agitarea puternică a culturilor ( se recomandă
utilizarea fermentatoarelor Airlift, cu bule de are care antrenează celulele, fragmentînd
agregatele)
3. Au o rată a diviziunii (mică) și o durată a unei șarje relativ mare, de cîteva zile sau
săptămîini), care sporesc pericolul apariției și răspîndirii infecției bacteriene
4. Comparativ cu microorganismele, au nevoie de mai puțin oxigen

Fermentator Airlift
 6. Extracția și purificarea

Se efectuează prin metode clasice, chimice și biochimice.

Există 2 situații:
Metabolitul secundar este Metabolitul secundar este
secretat în mediul de cultură, acumulat în celule, urmînd să fie
de unde poate fi extras extras din biomasa recoltată
Produse obținute prin culturi in vitro și comercializate
( după Chrispeels și Sadava, 1994)

Produsul Specia Compania Țara

Shikonină Lithospermum Mitsui Japonia
erythrorhizon
Berberină Coptis japonica Mitsui Japonia
Biomasă Panax Ginseng Nitto Denki Japonia
Peroxidaza Raphanus Toyobo Japonia
Geraniol Geranium spp. Kanebo Japonia
Acid rozmarinic Coleus blumei Natterman Germania
Digoxină Digitalis lannata Boeringer Germania
 Plante medicinale crescute prin biotehnologii in vitro

List of some secondary plant product produced List of some secondary plant product produced in
in suspension culture Hairy root culture
În producția industrială și-au găsit aplicare culturile celulare ale producenților naturali:
 Tutun - sursa de Ubihinon- 10, folosit în calitate de vitamină, coenzima
 BIBLIOGRAFIE

1. Andrei Palii, Galina Comarov, Angela Lozan, Vasile Scorpan. Biotehnologii moderne în
fitotehnie și biosecuritate., ch. Ministerul Ecologiei și Resurselor NaturaleșUNEP, 2004
2. Albert Sasson. Biotehnologii și dezvoltare., Ed. Tehnica, 1993
3. Altaf Hussain, Iqbal Ahmed Qarshi, Hummera Nazir and Ikram Ullah, Plant Tissue
Culture:Current Status and Opportunities, INTECH
4. http://documents.tips/documents/cultura-plantelor-in-vitro.html

5. Leena TripathiF and Jaindra Nath Tripathi.Role of biotechnology in medicinal

plants.;International Institute of Tropical Agriculture (IITA), Nigeria; C/o L. W.
Lambourn; Carolyn House, 26 Dingwall Rd,Croydon CR9 3EE, UK; Tropical Journal of
Pharmaceutical Research, December 2003
6. In vitro micropropagation of medicinal plants by tissue culture, The Plymouth Student
Scientist, 2010
7. А.В. Бабикова, Т.Ю. Горпенченко, Ю.Н. Журавлев. РАСТЕНИЕ КАК ОБЪЕКТ
БИОТЕХНОЛОГИИ., Биолого-почвенный институт ДВО РАН, г. Владивосток, 2007
Mulțumesc pentru atenție!!!