Lucrarea Practică Nr.

8.1. Dozarea spectrofotometrică în domeniul vizibil (VIS) a colorantului

Verde Malachit dintr-o probă de analizat
- Calcule Efectuate -

Scopul cercetării constă în determinarea cantitativă a colorantului Verde de

Malachit dintr-o probă de analizat..
Obiectivele lucrării :
- optimizarea și aplicarea unei metode spectrofotometrice de dozare în domeniul
Vizibil (VIS) a colorantului Verde de Malachit;

Cl-
C

CH3
H3C N
+
N
CH3
H3C

Fig. 1 Structura chimică a colorantului Verde de Malachit

denumirea IUPAC: 4-[(4-dimetilaminofenil)-fenil-metil]-N,N-dimetil-anilină), sau :

4-{[4-(Dimetilamino)fenil](fenil)metiliden}-N,N-dimetilciclohexa-2,5-dien-1-imină clorură
M = 364,917 g/mol, formula moleculară: C23H25ClN2 . Din punct de vedere chimic,
este un colorant triarilmetanic (trifenilmetanic) .
Principiul metodei. Principiul metodei. Verdele Malachit (Clorura de tetrametil-di-
p-amino-trifenil-carbinol) prezintă o absorbție maximă în domeniul Vizibil (VIS) la lungimea
de undă ʎ max = 617 nm și poate fi dozat spectrofotometric din ape (în cazul poluării), fluide
biologice (spută, ser, salivă, sânge, urină – în cazul intoxicațiilor acute), precum și din unele
produse farmaceutice veterinare.

1
 Reactivi necesari şi aparatură
- pulbere standard pură de Verde Malachit;
- soluţie stoc de Verde Malachit, 0,01 % (100 µg/mL)
- soluţie standard de lucru de Verde Malachit, 18 µg/mL obţinută prin diluţie cu
H2O distilată din soluţia stoc;
- 12 soluţii etalon de Verde Malachit în H2O distilată (0,18 µg/mL – 3,60 µg/mL);
- probă solidă de dozat ce conţine Verde Malachit;
- apă distilată;
- eprubete gradate de 10 mL;
- spectrofotometru UV-VIS.

Etapa 1. Calibrarea (etalonarea ) spectrofotometrului la lungimea de undă λmax. = 617

nm, pentru colorantul Verde Malachit , cu ajutorul soluțiilor etalon de Verde Malachit
(0,18 – 3,60 μg/mL), preparate din pulbere standard pură de Verde Malachit;

1.a.) Calculul concentrațiilor C (μg/mL) ale celor 12 soluții etalon de Verde

Malachit ( scrise cu bold → tabelul 1):
Din relația Ci. Vi = Cf . Vf , unde Ci = concentrația inițială a soluției standard
de lucru din care s-au preparat cele 12 soluții etalon = 18 µg/mL Cf = x = concentrația
finală din fiecare eprubetă cu soluție etalon (după completarea cu H2O distilată), ce
trebuie calculată., Vi = volumele inițiale de soluție standard 18 µg/mL ce trebuie măsurate
pentru a prepara fiecare din cele 12 eprubete etalon (coloana 2 din tabelul 1) VE = 10

mL = volumele finale de soluție obţinute după adăugarea apei distilate în fiecare eprubetă
cu soluție etalon :
Eprubeta 1. 18 . 0.1 = Cf 1 . 10 de unde Cf 1= (18 . 0,1) / 10 = 0,18 µg/mL .
Deci Cf 1 = 0,18 µg/mL
Eprubeta 2. 18 . 0.2 = Cf 2 . 10 de unde Cf 2= (18 . 0,2) / 10 = 0,36 µg/mL .
Deci Cf 2 = 0,36 µg/mL
Eprubeta 3. 18 . 0.3 = Cf 3 . 10 de unde Cf 3 = (18 . 0,3) / 10 = 0,54 µg/mL .
Deci Cf 3 = 0,54 µg/mL
Eprubeta 4. 18 . 0.4 = Cf 4 . 10 de unde Cf 4 = (18 . 0.4) / 10 = 0,72 µg/mL .
Deci Cf 4 = 0,72 µg/mL
Eprubeta 5. 19 . 0.5 = Cf 5 . 10 de unde Cf 5 = (18 . 0,5) / 10 = 0,90 µg/mL .

2
Deci Cf 5 = 0,90 µg/mL
Eprubeta 6. 18 . 0.6 = Cf 6 . 10 de unde Cf 6 = (18 . 0,6) / 10 = 1,08 µg/mL
Deci Cf 6 = 1,08 µg/mL
Eprubeta 7. 18 . 0.7 = Cf 7 . 10 de unde Cf 7 = (18 . 0,7) / 10 = 1,26 µg/mL
Deci Cf 7 = 1,26 µg/mL.
Eprubeta 8. 18 . 0.8 = Cf 8. 10 de unde Cf 8 = (18 . 0,8) / 10 = 1,44 µg/mL
Deci Cf 8 = 1,44 µg/mL.
Eprubeta 9. 18 . 1,0 = Cf 9 . 10 de unde Cf 9 = (18 . 1,0) / 10 = 1,80 µg/mL
Deci Cf 9 = 1,80 µg/mL
Eprubeta 10. 18 . 1,2 = Cf 10 . 10 de unde Cf 10 = (18 . 1,2) / 10 = 2,16 µg/mL
Deci Cf 10 = 2,16 µg/mL
Eprubeta 11. 18 . 1,5 = Cf 11 . 10 de unde Cf 11 = (18 . 1,5) / 10 = 2,70 µg/mL
Deci Cf 11 = 2,70 µg/mL
Eprubeta 12. 18 . 2,0 = Cf 12 . 10 de unde Cf 12 = (18 . 2,0) / 10 = 3,60 µg/mL
Deci Cf 12 = 3,60 µg/mL
Se măsoară pe rând absorbanțele soluțiilor etalon obținute cu concentrații cuprinse
între 0,18 – 3,60 μg/mL, în funcție de H2O distilată ca martor, la lungimiea de undă λmax. =
617 nm. (tabel 1). Volumul final de soluție în cele 8 eprubete cu soluții etalon a fost Vf = 10
mL.
Tabel 1
Prepararea soluţiilor etalon de Verde Malachit şi măsurarea absorbanţelor în funcţie
de concentraţii – trasarea dreptei de calibrare a spectrofometrului
Nr. mL soluţie mL H2O Concentraţiile C Absorbanţele
det. standard de lucru, distilată (µg/mL) ale A (ʎmax. = 617 nm)
18 µg/mL soluţiilor etalon
1. 0,1 9,9 0,18 µg/mL 0,042
2. 0,2 9,8 0,36 µg/mL 0,053
3. 0,3 9,7 0,54 µg/mL 0,075
4. 0,4 9,6 0,72 µg/mL 0,105
5. 0,5 9,5 0,90 µg/mL 0,131
6. 0,6 9,4 1,08 µg/mL 0,173
7. 0,7 9,3 1,26 µg/mL 0,184
8. 0,8 9,2 1,44 µg/mL 0,224
9. 1,0 9.0 1,80 µg/mL 0,254
10. 1,2 8,8 2,16 µg/mL 0,317
11. 1,5 8,5 2,70 µg/mL 0,456
12. 2,0 8,0 3,60 µg/mL 0,612

3
 Cu valorile absorbanţelor redate în tabelul 1, s-a trasat dreapta de calibrare a
spectrofotometrului la lungimea de undă λ = 617 nm pentru colorantul Verde Malachit , ce a
fost redată în figura 1 (Fig.1). Important: Valoarea absorbanței probei trebuie să fie
cuprinsă întotdeauna între absorbanțele soluțiilor etalon, pentru ca proba să poată fi dozată
spectrofotometric în UV-VIS.

Fig. 1 Dreapta de calibrare obținută pentru soluțiile etalon de Verde Malachit

( Erori ! – liniaritate redusă a metodei, cinci dintre puncte nu se situează pe
dreptă.)

Trasarea dreptei de calibrare în Microsoft Excel – pentru cine nu știe încă (într-un
document Excel se trec, pe prima coloană în ordine crescătoare, de sus în jos, valorile
concentrațiilor C (μg/mL) iar pe-a doua coloană – valorile absorbanțelor A(λ) . Se selctează
apoi, ambele coloane în acelaşi timp, cu toate valorile trecute și se dă comanda Insert →
Scatter (partea superioară a foii Excel). Apare graficul format doar din puncte. Se dă click
dreapta pe puncta (se selectează toate punctele) apare un meniu cu Add Trendline. Se dă
click stânga pe această comandă , apare un alt meniu mare în partea dreaptă cu Format
Trendline. Se bifează în acest meniu, în partea de jos, ultimele 2 căsute (“Display
Equation on chart “ și “Display R-squared value on chart”) . Prin acest fapt, se afișează
automat ecuația dreptei de regresie și valoarea coeficientului de regresie R2. Se obține
astfel Fig.1. Astfel se procedează în toate determinările spectrofotometrice ale unor
analiți din probe , în domeniul UV-VIS.

4
Etapa 2. Prepararea, în paralel, a probei de dozat ce conțin Verde Malachit- și măsurarea
absorbanţei acestei probe AP la lungimea de undă λ = 617 nm. ( 2 soluţii probe)
S-au cântărit la balanța analitică circa a = 0,0081 g pubere Verde Malachit probă

care au fost aduse cantitativ cu apă distilată la balon cotat de volum V = 100 mL cu apă
distilată sub agitare până la dizolvare completă. Apoi s-a completat cu H2O distilată exact
până la semn. Din soluția probă astfel preparată s-au măsurat două volume v1 = 0,1 mL

soluție şi v2 = 0,3 mL soluţie probă, care au fost aduși cantitativ în două eprubete gradate

identice de volume VP1 = 10 mL, respectiv VP2 = 10 mL S-a adăugat apoi H2O distilată
exact până la 10 mL sub agitare. (9,9 mL H2O distilată, respectiv 9,7 mL H2O). S-au măsurat
absorbanțele celor două soluţii de probe la lungimea de undă ʎ max. = 617 nm față de H2 O
distilată. S-au realizat câte trei determinări și s-au calculat absorbanțele medii ale probelor
AP1 respectiv AP2 (tabelul 2).

Tabel 2. Valorile măsurate ale absorbanțelor celor două probe și concentrațiile

probelor ce conţin Verde Malachit
Probe Concentrațiile Absorbanțele medii Z1,2 % Verde Malachit
CP1,2 (μg/mL) Ap1,2 (λmax. = 617 nm) (g % de Verde Malachit
pur)
1. 0,919 μg/mL AP1 = 0,139 (0,1 mL probă) Z1 = 113,457 %
2. 2,242 μg/mL AP2 = 0,361 (0,3 mL probă) Z2 = 92,263 %

Ap1 = 0,139 (prea mare valoarea absorbanţei → 0,1 mL probă) pentru v = 0,1 mL soluție
probă din eprubeta gradată. Pentru cea de-a doua probă, Ap2 = 0,361 pentru v = 0,3 mL
soluție probă din eprubeta gradată,

Etapa 3. Dozarea propriu-zisă a colorantului Verde Malachit din proba de analizat,

calculul concentrației procentuale (%) de Verde Malachit pur din cele a = 0.0081 g probă
solidă studiată.

a. Calculul concentrației CP (μg/mL) soluţiei probă de Verde Malachit din ecuația

dreptei de calibrare
Ecuațua dreptei de calibrare a fost de forma y = ax + b, unde y = AP = absorbanța
probei, iar x = CP = concentrația probei în µg/mL. S-a obținut AP = a.CP + b, de unde CP =

5
(AP – b) /a = concentrația soluţiei de probă exprimată în µg/mL. În ecuația dreptei de
regresie (fig. 1) : y = 0,1678 x – 0,0152, se înlocuiește y = AP și x = CP și se obține: AP1,2
= 0,1703..CP1,2 – 0,0277. Dar : AP1 = 0,139,iar AP1 = 0,361 Din ecuația dreptei de
calibrare, CP1 = (AP1 + 0,0152) / 0,1678 (1) , de unde CP1 = (0,139 + 0,0152) / 0,1678,
deci CP1 = 0,919 μg/mL, CP2 = (0,361 + 0,0152) / 0,1678, iar CP2 = 2,242 μg/mL
b. Calculul cantităților X1,2(μg) de Verde Malachit pur din VP1,2 = 10 mL soluții
probă (din eprubetele gradate).
CP1,2 µg...................................................1 mL
X1,2 µg............................................VP 1,2 mL probă (10 mL), de unde X1,2 = CP1,2 .

VP1,2 = cantităţile în µg de Verde Malachit pur din cele 2 eprubete gradate VP1,2 = 10 mL
(2).
Pentru prima soluţie probă, concret X1 = 0,919 . 10 = 9,190 µg Verde Malachit
pur. Deci, în concluzie, X1 = 9,190 µg Verde Malachit pur. Pentru a doua probă, X2 =
2,242 .10 = 22,42 µg Verde Malachit pur. Deci, în concluzie, X2 = 22,42 µg Verde
Malachit pur. X1.2 = µg de Verde Malachit pur din cele 2 eprubete gradate de volume VP1,2

= 10 mL.
c. Calculul cantităților Y1,2 (μg) de Verde Malachit pur din V = 100 mL soluție
(balon cotat).
Dar X1,2 µg......................................v 1,2 mL soluție probă (v1 = 0,1 mL şi v2 = 0,3 mL)

Y µg......................................V mL soluție (b.c.), deci Y1,2 = V. X1,2 /v1,2 =

cantităţile în µg de Verde Malachit pur (3) din V = 100 mL soluție (balon cotat). În cazul
primei probe: Y1 = 100 . 9,190 / 0,1 = 9190 µg de Verde Malachit pur. Y1 = 9190 µg de

Verde Malachit pur. În cazul celei de-a doua probe: Y2 = 100 . 22,42 / 0,3 = 7473,33 µg

de Verde Malachit pur. Y2 = 7473,33 µg de Verde Malachit pur

d. Calculul concentrațiilor procentuale Z1,2% de Verde Malachit pur din cele a =
0,0081 g probă solidă luată în studiu .
Y1,2 µg.............................................................a g probă (0,0081 g)
Z1,2 %........................................................100 g probă solidă de analizat, de unde:

Z1,2 = (100. Y1,2) /a = concentrațiile procentuale exprimate în µg % (4) de Verde

Malachit pur din a = 0,0081 g pulbere solidă de probă Se transformă automat µg % în g %

6
Verde Malachit pur din cele a = 0,0081 g probă solidă de analizat; se ţine cont că 1 µg =
10-6 g: Z1,2 = (100.Y1,2.10-6) /a.

Pentru prima probă, Z1 = (100. 9190. 10-6)/ 0,0081 = 0,9190 / 0,0081 = 113,457

g % Verde Malachit pur. În concluzie, Z1 = 113,457 % Verde Malachit pur (113,457

g % Verde Malachit pur din cele a = 0,0081 g probă solidă de analizat).
Pentru cea de-a doua probă, Z2 = (100. 7473,33. 10-6)/ 0,0081 = 0,747333 /
0,0081 = 92,263 g % Verde Malachit pur. În concluzie, Z2 = 92,263 % Verde
Malachit pur (92,263 g % Verde Malachit pur din cele a = 0,0081 g probă solidă de
analizat).

Etapa 4. Calculul unor parametri statistici ai dreptei de regresie (de calibrare).-

liniaritatea metodei
Liniaritatea unui proces de analiză constă în capacitatea de a conduce, în interiorul
unui interval dat, la rezultate direct proporţionale cu concentraţia substanţei analizate, dintr-
un anumit eşantion. Întensitatea semnalului analitic (absorbanţa măsurată) este variază direct
proporţional cu concentraţia, pentru un anumit domeniu. Valoarile acceptate pentru
coeficientul de corelaţie este : r ˃ 0,999, iar pentru coeficientul de regresie liniară r2 ≥

0,999.
S-au determinat parametrii statistici ai dreptei de regresie cu ajutorul softului
Microsoft Office Excel 2016., redaţi în tabelul 3.
Limita de detecţie (LD) reprezintă cea mai mică cantitate de analit dintr-o probă ce
poate fi detectată într-un eşantion față de un martor, în condiţii experimentale stabilite. Se
exprimă în aceleaşi unităţi ca şi concentraţia analitului şi se calculează folosind următoarea
formulă: LD = 3 . SE/ Panta (A)
Limita de cuantificare (LC) este dată de cea mai mică concentrație de analit dintr-o
probă, ce poate fi determinată cantitativ (cuantificată) cu o precizie și acuratețe acceptabilă,
în aceleași condiții experimentale date. Valoarea ei s--a exprimat în aceleaşi unităţi ca şi
concentraţia analitului şi s-a calculat astfel: LQ = 10 . SE / Panta (B), unde SE a reprezentat
eroarea standard a dreptei de regresie.
Din meniul situat în pareta de sus a paginii în Excel se face click stânga pe DATA →
DATA ANALYSIS. (Dacă nu aveți în meniu DATA ANALYSIS se descarcă : Excel

7
Option – Add In) Apare o mică fereastră cu o înșiruire de funcții . Se caută funcția
REGRESSION, se selectează și apare alt meniu (Regression). Imput Y range (se selectează
toată coloana cu valorile numerice ale lui Y – absorbanțele), apoi Imput X range se
selectează toată coloana cu valorile lui X – concentrațiile . Se dă OK și apar încă o foaie
Excel cu mai multe tabele (SUMMARY OUTPUT, cu subtitlul primului tabel: Regression
Statistics). Se ia primul tabel din foaie:

Tabel 3 . Valorile unor parametri statistici ai regresiei liniare

Parametrii statistici ai regresiei liniare (Regression Statistics)
Coeficientul de corelaţie R 0.994025
Coeficientul de regresie lineară R2 0.988085
Coeficientul de regresie R2 adjustat 0.986894
Eroarea standard (SE) a dreptei de regresie 0.019683
Observaţii (valori ale absorbanţelor măsurate) 12

Ecuaţia dreptei de regresie a fost: y = 0.1678 x – 0,0152 , sau Ap1,2 (λ) = 0,1678.
Cp1,2 – 0.0152 (μg/mL) . Intersecţia cu ordonata a fost 0.0152 (-), iar panta dreptei a fost
0,1678. Coeficientul de regresie R2 = 0,988085, iar coeficientul de corelaţie R nu s-au
situat în limitele normale de valori , S-au situat sub valoarea minimă admisă (0,999) .
(tabelul 3), S-a constatat variaţia neproporţională a absorbanţelor măsurate ale soluţiilor
etalon cu concentraţiile acestora (liniaritate slabă a metodei). Eroarea standard (SE) a dreptei
de regresie a avut valoarea 0,019683 (valoare cam mare !) (tabel 3)
Limita de detecţie. LD = 3 . 0,019683 / 0,1678 = 0,3519 μg/mL, Limita de
cuantificare. LQ = 10 .0,019683 / 0,1678 = 1,173 μg/mL. (valori foarte bune !)

8
 Concluzii
Metoda aplicată pentru dozarea spectrofotometrică în vizibil (VIS) a colorantului
Verde de Malachit dintr-o probă nu a fost liniară pe întreg domeniul de concentraţii ales
0.18 – 3,60 μg/mL; (din fig. 1 se observă că cinci puncte nu se situează pe dreptă.),
coeficientul de regresie liniară : R2 = 0,988085 iar cel de corelaţie R = 0,994025, nu s-au
încadrat în intervalul normal de valori : R2 ≥ 0,999; R > 0,99. . Eroarea standard a dreptei de
regresie a fost SE = 0,019683. (valoare cam mare ! ) Limita de detecţie, LD = 0,3519
μg/mL și limita de cuantificare, LQ = 1,173 μg/mL s-au încadrat în limitele normale de
valori, valori mici, foarte bune (panta dreptei de regresie a fost mare , a avut o valoare
foarte bună: 0,1678).
Concentrațiile procentuale de Verde Malachit din a = 0,0081 g probă luate în lucru au
fost: pentru prima soluţie probă, Z1 = 113,457 g % Verde Malachit pur = o valoare
mult prea mare, destul de îndepărtată de intervalul normal de valori reale, de referinţă
(97% - 98%), din cauza absorbanţei prea mari a primei probe AP1 = 0,139 (pentru
numai v1 = 0,1 mL soluţie analizată).
Pentru a doua soluţie probă, Z2 = 92,263 g % Verde Malachit pur = o valoare
bună, destul de apropiată de intervalul normal de valori reale, de referinţă (97% -
98%),
Se admite o eroare relativă maximă procentuală de ± 5 % faţă de valoarea oficială,
de referinţă. Prin urmare, valoarea concentraţiei găsite practic (92,263 %) se încadrează cam
la limită în intervalul normal de valori, cu o eroare relativă maximă procentuală tolerabilă,
cuprinsă între 4,737- 5,737 % faţă de intervalul normal de valori de referinţă (97% - 98%).

9
 8.2. Dozarea spectrofotometrică în domeniul vizibil (VIS) a colorantului
MetilOranj dintr-o probă de analizat
- Calcule Efectuate -

Denumirea IUPAC: 4-[(4-dimetilamino)fenildiazenil] benzen-4-sulfonat de sodiu.

Scopul cercetării constă în determinarea cantitativă a colorantului MetilOranj

dintr-o probă studiată..
Obiectivele lucrării :
- perfecţionarea și aplicarea unei metode spectrofotometrice de dozare în domeniul
Vizibil (VIS) a colorantului MetilOranj;
Principiul metodei. MetilOranj (sarea acidului 4-[4 (dimetilamino)fenilazo]benzensulfonic)
prezintă o absorbție maximă în domeniul Vizibil (VIS) la lungimea de undă ʎ max. = 465 nm
și poate fi dozat spectrofotometric din ape reziduale sau cursuri de apă (în cazul poluării),
respectiv din fluide biologice (spută, ser, salivă, sânge, urină – în cazul intoxicațiilor acute),.
Reactivi necesari şi aparatură
- pulbere standard pură de MetilOranj ;
- soluţie stoc de MetilOranj, 0,01 % (100 µg/mL)
- soluţie standard de lucru de MetilOranj, 18 µg/mL, obţinută printr-o diluţie cu H2O
distilată din soluţia stoc;
- 10 soluţii etalon de MetilOranj (0,54 μg/mL – 4,50 μg/mL);
- probă solidă de dozat ce conţine MetilOranj;
- apă distilată;
- eprubete gradate de 10 mL;.
- spectrofotometru UV-VIS.

10
Etapa 1. Calibrarea (etalonarea ) spectrofotometrului la lungimea de undă λmax. = 465
nm, pentru colorantul MetilOranj, cu ajutorul soluțiilor etalon de MetilOranj (0,54 – 4,50
μg/mL), preparate din pulbere standard pură de MetilOranj;

1.a.) Calculul concentrațiilor C (μg/mL) ale celor 10 soluții etalon de MetilOranj ( scrise
cu bold → tabelul 4):
Din relația Ci. Vi = Cf . Vf , unde Ci = concentrația inițială a soluției standard
de lucru din care s-au preparat cele 10 soluții etalon = 18 µg/mL Cf = x = concentrația
finală din fiecare eprubetă cu soluție etalon (după completarea cu H2O distilată), ce
trebuie calculată., Vi = volumele inițiale de soluție standard 18 µg/mL ce trebuie măsurate
pentru a prepara fiecare din cele 10 eprubete etalon (coloana 2 din tabelul 1) VE = 10

mL = volumele finale de soluție obţinute după adăugarea apei distilate în fiecare eprubetă
cu soluție etalon :
Eprubeta 1. 18 . 0.3 = Cf 1 . 10 de unde Cf 1 = (18 . 0,3) / 10 = 0,54 µg/mL .
Deci Cf 1 = 0,54 µg/mL
Eprubeta 2. 18 . 0.4 = Cf 2 . 10 de unde Cf 2 = (18 . 0.4) / 10 = 0,72 µg/mL .
Deci Cf 2 = 0,72 µg/mL
Eprubeta 3. 19 . 0.5 = Cf 5 . 10 de unde Cf 3 = (18 . 0,5) / 10 = 0,90 µg/mL .
Deci Cf 3 = 0,90 µg/mL
Eprubeta 4. 18 . 0.6 = Cf 4 . 10 de unde Cf 4 = (18 . 0,6) / 10 = 1,08 µg/mL
Deci Cf 4 = 1,08 µg/mL
Eprubeta 5. 18 . 0.7 = Cf 5 . 10 de unde Cf 5 = (18 . 0,7) / 10 = 1,26 µg/mL
Deci Cf 5 = 1,26 µg/mL
Eprubeta 6. 18 . 0.8 = Cf 6 . 10 de unde Cf 6 = (18 . 0,8) / 10 = 1,44 µg/mL
Deci Cf 6 = 1,44 µg/mL
Eprubeta 7. 18 . 1,0 = Cf 7 . 10 de unde Cf 7 = (18 . 1,0) / 10 = 1,80 µg/mL
Deci Cf 7 = 1,80 µg/mL
Eprubeta 8. 18. 1,2 = Cf 8 . 10 de unde Cf 8 = (18 . 1,2) / 10 = 2,16 µg/mL .
Deci Cf 8 = 2,16 µg/mL.
Eprubeta 9. 18. 1,5 = Cf 9 . 10 de unde Cf 9 = (18 . 1,5) / 10 = 2,70 µg/mL .
Deci Cf 9 = 2,70 µg/mL.
Eprubeta 10. 18. 2,5 = Cf 10 . 10 de unde Cf 10 = (18 . 2,5) / 10 = 4,50 µg/mL .
Deci Cf 10 = 4,50 µg/mL.

11
 Se măsoară pe rând absorbanțele soluțiilor etalon obținute cu concentrații cuprinse
între 0,54 – 4,50 μg/mL, în funcție de H2O distilată ca martor, la lungimiea de undă λmax. =
465 nm. (tabel 4). Volumul final de soluție în cele 10 eprubete cu soluții etalon a fost Vf = 10
mL.
Tabel 4
Prepararea soluţiilor etalon de MetilOranj şi măsurarea absorbanţelor în funcţie de
concentraţii – trasarea dreptei de calibrare a spectrofometrului
Nr. mL soluţie mL H2O Concentraţiile C Absorbanţele
det. standard de lucru, distilată (µg/mL) ale A (ʎmax. = 465 nm)
18 µg/mL soluţiilor etalon
1. 0,3 9,7 0,54 µg/mL 0,035
2. 0,4 9,6 0,72 µg/mL 0,050
3. 0,5 9,5 0,90 µg/mL 0,063
4. 0,6 9,4 1,08 µg/mL 0,074
5. 0,7 9,3 1,26 µg/mL 0,088
6. 0,8 9,2 1,44 µg/mL 0,099
7. 1,0 9,0 1,80 µg/mL 0,113
8. 1,2 8,8 2,16 µg/mL 0,141
9. 1,5 8,5 2,70 µg/mL 0,161
10. 2,5 7,5 4,50 µg/mL 0,359

Cu valorile absorbanţelor redate în tabelul 4, s-a trasat dreapta de calibrare a

spectrofotometrului A = f (C ) la lungimea de undă λ = 465 nm pentru colorantul MetilOranj
, ce a fost redată în figura 2 (Fig.2). Important: Valoarea absorbanței probei trebuie să fie
cuprinsă întotdeauna între absorbanțele soluțiilor etalon, pentru ca proba să poată fi dozată
spectrofotometric în UV-VIS.

Fig. 2. Dreapta de calibrare obținută pentru soluțiile etalon de MetilOranj

12
 (patru puncte distanţate de dreptă, dintre care ultimele 2 puncte la distanţă mare de
dreaptă– liniaritate foarte slabă a metodei)

Trasarea dreptei de calibrare în Microsoft Excel – pentru cine nu știe încă (într-un
document Excel se trec, pe prima coloană în ordine crescătoare, de sus în jos, valorile
concentrațiilor C (μg/mL) iar pe-a doua coloană – valorile absorbanțelor A(λ) . Se selctează
apoi, ambele coloane în acelaşi timp, cu toate valorile trecute și se dă comanda Insert →
Scatter (partea superioară a foii Excel). Apare graficul format doar din puncte. Se dă click
dreapta pe puncta (se selectează toate punctele) apare un meniu cu Add Trendline. Se dă
click stânga pe această comandă , apare un alt meniu mare în partea dreaptă cu Format
Trendline. Se bifează în acest meniu, în partea de jos, ultimele 2 căsute (“Display
Equation on chart “ și “Display R-squared value on chart”) . Prin acest fapt, se afișează
automat ecuația dreptei de regresie și valoarea coeficientului de regresie R2. Se obține
astfel Fig.2. Astfel se procedează în toate determinările spectrofotometrice ale unor
analiți din probe , în domeniul UV-VIS.

Etapa 2. Prepararea, în paralel, a probei de dozat ce conțin MetilOranj și măsurarea

absorbanţei acestei probe AP la lungimea de undă λ = 465 nm.
S-au cântărit la balanța analitică circa a = 0,0093 g pubere MetilOranj probă care au

fost aduse cantitativ cu apă distilată la balon cotat de volum V = 100 mL cu apă distilată
sub agitare până la dizolvare completă. Apoi s-a completat cu H2O distilată exact până la
semn. Din soluția probă astfel preparată s-au măsurat două volume v1 = 0,4 mL , respectiv

v2 = 0,5 mL soluție probă care au fost aduși cantitativ în două eprubete gradate identice de
volume VP1 = 10 mL respectiv VP2 = 10 mL. S-a adăugat apoi în ambele eprubete
gradate H2O distilată exact până la 10 mL sub agitare. (9,6 mL H2O distilată, respectiv 9,5
mL H2O). S-au măsurat absorbanţele soluţiilor de probe la lungimea de undă ʎ max. = 465 nm
față de H2O distilată ca martor. S-au realizat câte trei determinări pentru fiecare din cele două
soluţii de probe și s-a calculat la fiecare câte o absorbanță medie a probelor AP1 şi AP2
(tabelul 5).

13
 Tabel 5. Valorile măsurate ale absorbanței AP și concentrației probei de MetilOranj
Probe Concentrația CP Absorbanța Z % Verde Malachit
(μg/mL) Ap (λmax. = 617 nm) (g % de Verde Malachit
pur)
1. 4,583 μg/mL AP1 = 0,341 (0,4 mL probă); Z = 123,199 %
AP2 = 0,426 (0,5 mL probă);

Ap = 0,426 (o valoare foarte mare pentru v2 = 0,5 mL soluție probă, în eprubetă

gradată de 10 mL cu H2O distilată). Din tabelul 4 se observă că cea de-a doua absorbanţă
medie (corespunzătoare celei de-a doua soluţii de probă) este mult prea mare, nu se
încadrează între absorbanţele soluţiilor etalon preparate, ci le depăşeşte . A doua probă nu
poate fi dozată ci numai prima soluţie de probă , a cărei absorbanţă este AP1 = 0,341
(obţinută pentru un volum v1 = 0,4 mL probă adus cu H2O distilată la VP1 = 10 mL) şi care
se încadrează între absorbanţele soluţiilor etalon măsurate. AP1 = 0,341 deşi se încadrează
între absorbanţele soluţiilor etalon, totuşi este prea mare (pentru un volum v1 = 0,4 mL
soluție probă, în eprubetă gradată de 10 mL cu H2O distilată) şi va avea va rezultat o valoare
prea mare a concentraţiei de MetilOranj pur din probă, de peste 100% ( a = 0,0093 g probă
solidă studiată)

Etapa 3. Dozarea propriu-zisă a colorantului MetilOranj din proba de analizat, calculul

concentrației procentuale (%) de MetilOranj pur din cele a = 0.0093 g probă solidă
studiată.
a. Calculul concentrației CP (μg/mL) soluţiei probă de MetilOranj din ecuația
dreptei de calibrare
Ecuațua dreptei de calibrare a fost de forma y = ax + b, unde y = AP = absorbanța
probei, iar x = CP = concentrația probei în µg/mL. S-a obținut AP = a.CP + b, de unde CP =
(AP – b) /a = concentrația soluţiei de probă exprimată în µg/mL. În ecuația dreptei de
regresie (fig. 2) : y = 0,0775 x – 0,0142, se înlocuiește y = AP1 și x = CP1 și se obține: AP1
= 0,0674 .CP1 – 0,0304. Dar : AP1 = 0,341. Din ecuația dreptei de calibrare, CP1 = (AP1 +
0,0142) / 0,0775 (1) , de unde CP1 = (0,341 + 0,0142) / 0,0775 , deci CP1 = 4,583 μg/mL
b. Calculul cantității X1(μg) de MetilOtanj pur din VP1 = 10 mL soluție probă (din
eprubeta gradată).
CP µg............................................1 mL
X µg....................................... VP1 mL probă (10 mL), de unde X1 = CP1. VP1 =

cantitatea în µg de MetilOranj pur din VP1 = 10 mL (din eprubeta gradată) (2).

14
 Pentru probă, concret X1 = 4,583 . 10 = 45,83 µg MetilOranj pur. Deci, în
concluzie, X1 = 45,83 µg MetilOranj pur.
c. Calculul cantității Y1(μg) de MetilOranj pur din V = 100 mL soluție (balon cotat).
Dar X1 µg.......................................v mL soluție probă (v1 = 0,4 mL)
Y1 µg...................................V mL soluție (b.c.), deci Y1 = V. X1 / v1 =
cantitatea în µg de MetilOranj pur (3) din V = 100 mL soluție (balon cotat). În cazul probei:
Y = 100 . 45,83 / 0,4 = 11457,50 µg de MetilOranj pur. Y = 11457,50 µg de MetilOranj
pur.

d. Calculul concentrației procentuale Z% de MetilOranj pur din a = 0,0093 g probă

solidă luată în studiu .
Y µg..........................................................a g probă (0,0093 g)
Z %.....................................................100 g probă solidă de analizat, de unde:

Z = (100. Y) /a = concentrația procentuală exprimată în µg % (4) de MetilOranj

pur din a = 0,0093 g pulbere solidă de probă Se transformă automat µg % în g %
MetilOranj pur din cele a = 0,0093 g probă solidă de analizat; se ţine cont că 1 µg = 10-6
g:
Z = (100.Y.10-6) /a = (100. 11457,50. 10-6)/ 0,0093 = 1,145750 / 0,0093 =
123,199 g % MetilOranj pur. În concluzie, concentraţia procentuală Z = 123,199
% MetilOranj pur (123,199 g % MetilOranj pur din cele a = 0,0093 g probă solidă de
analizat)

Etapa 4. Calculul unor parametri statistici ai dreptei de regresie (de calibrare).-

liniaritatea metodei

Liniaritatea unui proces de analiză constă în capacitatea de a conduce, în interiorul

unui interval dat, la rezultate direct proporţionale cu concentraţia substanţei analizate, dintr-
un anumit eşantion. Întensitatea semnalului analitic (absorbanţa măsurată) este variază direct
proporţional cu concentraţia, pentru un anumit domeniu. Valoarile acceptate pentru
coeficientul de corelaţie este : r ˃ 0,999, iar pentru coeficientul de regresie liniară r2 ≥

0,999.

15
 S-au determinat parametrii statistici ai dreptei de regresie cu ajutorul softului
Microsoft Office Excel 2016., ce au fost redaţi în tabelul 6.
Limita de detecţie (LD) reprezintă cea mai mică cantitate de analit dintr-o probă ce
poate fi detectată într-un eşantion față de un martor, în condiţii experimentale stabilite. Se
exprimă în aceleaşi unităţi ca şi concentraţia analitului şi se calculează folosind următoarea
formulă: LD = 3 . SE/ Panta (A)
Limita de cuantificare (LC) este dată de cea mai mică concentrație de analit dintr-o
probă, ce poate fi determinată cantitativ (cuantificată) cu o precizie și acuratețe acceptabilă,
în aceleași condiții experimentale date. Valoarea ei s--a exprimat în aceleaşi unităţi ca şi
concentraţia analitului şi s-a calculat astfel: LQ = 10 . SE / Panta (B), unde SE a reprezentat
eroarea standard a dreptei de regresie.
Din meniul situat în pareta de sus a paginii în Excel se face click stânga pe DATA →
DATA ANALYSIS. (Dacă nu aveți în meniu DATA ANALYSIS se descarcă : Excel
Option – Add In) Apare o mică fereastră cu o înșiruire de funcții . Se caută funcția
REGRESSION, se selectează și apare alt meniu (Regression). Imput Y range (se selectează
toată coloana cu valorile numerice ale lui Y – absorbanțele), apoi Imput X range se
selectează toată coloana cu valorile lui X – concentrațiile . Se dă OK și apar încă o foaie
Excel cu mai multe tabele (SUMMARY OUTPUT, cu subtitlul primului tabel: Regression
Statistics). Se ia primul tabel din foaie:

Tabel 6 . Valorile unor parametri statistici ai regresiei liniare

Parametrii statistici ai regresiei liniare (Regression Statistics)
Coeficientul de corelaţie R 0.985312
Coeficientul de regresie lineară R2 0.970839
Coeficientul de regresie R2 adjustat 0.967194
Eroarea standard (SE) a dreptei de regresie 0.016885
Observaţii (valori ale absorbanţelor măsurate) 10

Ecuaţia dreptei de regresie a fost: : y = 0,0775 x – 0,0142, sau Ap1 (λ) = 0,0775.
Cp1 – 0,0142 (μg/mL) . Intersecţia cu ordonata a fost 0.0142 (-), iar panta dreptei a fost
0,0775. Coeficientul de regresie R2 = 0,970839, iar coeficientul de corelaţie R nu s-au
situat în limitele normale de valori. S-au situat sub valoarea minimă admisă (0,999) .
(tabelul 6). S-a constatat variaţia neproporţională a absorbanţelor măsurate ale soluţiilor

16
etalon cu concentraţiile acestora (liniaritate foarte slabă a metodei). . Eroarea standard (SE) a
dreptei de regresie a avut valoarea 0,016885 (valoare mare !) (tabel 6)
Limita de detecţie. LD = 3 . 0,016885 / 0,0775 = 0,6536 μg/mL, Limita de
cuantificare. LQ = 10 .0,016885 / 0,0775 = 2,1787 μg/mL. (valori bune !)

Concluzii
Metoda aplicată pentru dozarea spectrofotometrică în vizibil (VIS) a colorantului
MetilOranj dintr-o probă nu a fost liniară pe întreg domeniul de concentraţii ales: 0.54 –
4,50 μg/mL; (liniaritate foarte slabă a metodei; din fig. 2 se observă că patru puncte sunt
mai îndepărtate de dreaptă ) coeficientul de regresie liniară : R2 = 0,970839, iar cel de
corelaţie R = 0,985312, nu s-au încadrat în intervalul normal de valori : R2 ≥ 0,999; R >
0,999. Eroarea standard a dreptei de regresie a fost SE = 0,016885. (valoare cam mare )
Limita de detecţie, LD = 0,6536 μg/mL și limita de cuantificare, LQ = 2,1787 μg/mL s-au
încadrat în limitele normale de valori, valori mici, bune (panta dreptei de regresie a avut
o valoare bună: 0,0775, în raport cu eroarea standard SE a dreptei de regresie).
Concentrația procentuală de MetilOranj pur din a = 0,0093 g probă luate în lucru a
fost Z = 123,199 g % MetilOranj pur = o valoare foarte mare, îndepărtată de
valoarea reală, de referinţă (97% - 98%). Valoarea foarte mare a concentraţei Z =
123,199 g % se datorează absorbanţei prea mari a probei (Ap = 0,341 pentru un volum
de numai 0,4 mL probă) Se admite o eroare relativă maximă procentuală de numai ± 5 %
faţă de valoarea oficială, de referinţă.

17