Lucrarea Practică Nr.

8.1. Dozarea spectrofotometrică în domeniul vizibil (VIS) a colorantului

Verde Malachit dintr-o probă de analizat
- Calcule Efectuate -

Scopul cercetării constă în determinarea cantitativă a colorantului Verde de

Malachit dintr-o probă de analizat..
Obiectivele lucrării :
- optimizarea și aplicarea unei metode spectrofotometrice de dozare în domeniul
Vizibil (VIS) a colorantului Verde de Malachit;

Cl-
C

CH3
H3C N
+
N
CH3
H3C

Fig. 1 Structura chimică a colorantului Verde de Malachit

denumirea IUPAC: 4-[(4-dimetilaminofenil)-fenil-metil]-N,N-dimetil-anilină), sau :

4-{[4-(Dimetilamino)fenil](fenil)metiliden}-N,N-dimetilciclohexa-2,5-dien-1-imină clorură
M = 364,917 g/mol, formula moleculară: C23H25ClN2 . Din punct de vedere chimic,
este un colorant triarilmetanic (trifenilmetanic) .
Principiul metodei. Principiul metodei. Verdele Malachit (Clorura de tetrametil-di-
p-amino-trifenil-carbinol) prezintă o absorbție maximă în domeniul Vizibil (VIS) la lungimea
de undă ʎ max = 617 nm și poate fi dozat spectrofotometric din ape (în cazul poluării), fluide
biologice (spută, ser, salivă, sânge, urină – în cazul intoxicațiilor acute), precum și din unele
produse farmaceutice veterinare.

1
 Reactivi necesari şi aparatură
- pulbere standard pură de Verde Malachit;
- soluţie stoc de Verde Malachit, 0,01 % (100 µg/mL)
- soluţie standard de lucru de Verde Malachit, 18 µg/mL obţinută prin diluţie cu
H2O distilată din soluţia stoc;
- 5 soluţii etalon de Verde Malachit în H2O distilată (0,36 µg/mL – 3,60 µg/mL);
- probă solidă de dozat ce conţine Verde Malachit;
- apă distilată;
- eprubete gradate de 10 mL;
- spectrofotometru UV-VIS.

Etapa 1. Calibrarea (etalonarea ) spectrofotometrului la lungimea de undă λmax. = 617

nm, pentru colorantul Verde Malachit , cu ajutorul soluțiilor etalon de Verde Malachit
(0,36 – 3,60 μg/mL), preparate din pulbere standard pură de Verde Malachit;

1.a.) Calculul concentrațiilor C (μg/mL) ale celor 5 soluții etalon de Verde

Malachit ( scrise cu bold → tabelul 1):
Din relația Ci. Vi = Cf . Vf , unde Ci = concentrația inițială a soluției standard
de lucru din care s-au preparat cele 5 soluții etalon = 18 µg/mL Cf = x = concentrația
finală din fiecare eprubetă cu soluție etalon (după completarea cu H2O distilată), ce
trebuie calculată., Vi = volumele inițiale de soluție standard 18 µg/mL ce trebuie măsurate
pentru a prepara fiecare din cele 5 eprubete etalon (coloana 2 din tabelul 1) VE = 10 mL
= volumele finale de soluție obţinute după adăugarea apei distilate în fiecare eprubetă cu
soluție etalon :
Eprubeta 1. 18 . 0.2 = Cf 1 . 10 de unde Cf 1= (18 . 0,2) / 10 = 0,36 µg/mL .
Deci Cf 1 = 0,36 µg/mL
Eprubeta 2. 18 . 0.4 = Cf 2 . 10 de unde Cf 2= (18 . 0,4) / 10 = 0,72 µg/mL .
Deci Cf 2 = 0,72 µg/mL
Eprubeta 3. 18 . 0.6 = Cf 3 . 10 de unde Cf 3 = (18 . 0,6) / 10 = 1,08 µg/mL .
Deci Cf 3 = 1,08 µg/mL
Eprubeta 4. 18 . 0.8 = Cf 4 . 10 de unde Cf 4 = (18 . 0.8) / 10 = 1,44 µg/mL .
Deci Cf 4 = 1,44 µg/mL
Eprubeta 5. 18 . 2.0 = Cf 5 . 10 de unde Cf 5 = (18 . 2,0) / 10 = 3,60 µg/mL .

2
Deci Cf 5 = 3,60 µg/mL
Se măsoară pe rând absorbanțele soluțiilor etalon obținute cu concentrații cuprinse
între 0,36 μg/mL – 3,60 μg/mL, în funcție de H2O distilată ca martor, la lungimiea de undă
λmax. = 617 nm. (tabel 1). Volumul final de soluție în cele 5 eprubete cu soluții etalon a fost
Vf = 10 mL.
Tabel 1
Prepararea soluţiilor etalon de Verde Malachit şi măsurarea absorbanţelor în funcţie
de concentraţii – trasarea dreptei de calibrare a spectrofometrului
Nr. mL soluţie mL H2O Concentraţiile C Absorbanţele
det. standard de lucru, distilată (µg/mL) ale A (ʎmax. = 617 nm)
18 µg/mL soluţiilor etalon
1. 0,2 9,8 0,36 µg/mL 0,048
2. 0,4 9,6 0,72 µg/mL 0,093
3. 0,6 9,4 1,08 µg/mL 0,130
4. 0,8 9,2 1,44 µg/mL 0,192
5. 2,0 8,0 3,60 µg/mL 0,427

Cu valorile absorbanţelor redate în tabelul 1, s-a trasat dreapta de calibrare a

spectrofotometrului la lungimea de undă λ = 617 nm pentru colorantul Verde Malachit , ce a
fost redată în figura 1 (Fig.1). Important: Valoarea absorbanței probei trebuie să fie
cuprinsă întotdeauna între absorbanțele soluțiilor etalon, pentru ca proba să poată fi dozată
spectrofotometric în UV-VIS.

Fig. 1 Dreapta de calibrare obținută pentru soluțiile etalon de Verde Malachit:

(0,36 μg/mL – 3,60 μg/mL)

3
 ( Erori ! – liniaritate redusă a metodei, două dintre cele 5 puncte sunt uşor mai
distanţate faţă de dreaptă, nu se află chiar pe dreaptă.)

Trasarea dreptei de calibrare în Microsoft Excel – pentru cine nu știe încă (într-un
document Excel se trec, pe prima coloană în ordine crescătoare, de sus în jos, valorile
concentrațiilor C (μg/mL) iar pe-a doua coloană – valorile absorbanțelor A(λ) . Se selctează
apoi, ambele coloane în acelaşi timp, cu toate valorile trecute și se dă comanda Insert →
Scatter (partea superioară a foii Excel). Apare graficul format doar din puncte. Se dă click
dreapta pe puncta (se selectează toate punctele) apare un meniu cu Add Trendline. Se dă
click stânga pe această comandă , apare un alt meniu mare în partea dreaptă cu Format
Trendline. Se bifează în acest meniu, în partea de jos, ultimele 2 căsute (“Display
Equation on chart “ și “Display R-squared value on chart”) . Prin acest fapt, se afișează
automat ecuația dreptei de regresie și valoarea coeficientului de regresie R2. Se obține
astfel Fig.1. Astfel se procedează în toate determinările spectrofotometrice ale unor
analiți din probe , în domeniul UV-VIS.
Etapa 2. Prepararea, în paralel, a probei de dozat ce conțin Verde Malachit- și măsurarea
absorbanţei acestei probe AP la lungimea de undă λ = 617 nm.
S-au cântărit la balanța analitică circa a = 0,0081 g pubere Verde Malachit probă

care au fost aduse cantitativ cu apă distilată la balon cotat de volum V = 100 mL cu apă
distilată sub agitare până la dizolvare completă. Apoi s-a completat cu H2O distilată exact
până la semn. Din soluția probă astfel preparată s-a măsurat un volum de probă de v = 0,3

mL care au fost aduşi cantitativ cu H2O distilată într-o eprubetă gradată de volum VP = 10
mL. S-a adăugat apoi H2O distilată exact până la 10 mL sub agitare. (9,7 mL H2O). S-a
măsurat absorbanța soluţiei de probă la lungimea de undă ʎ max. = 617 nm față de H2O
distilată. S-au realizat câte trei determinări și s-a calculat absorbanța medie a probei AP
(tabelul 2).
Tabel 2. Valorile măsurate ale absorbanțelor celor două probe și concentrațiile
probelor ce conţin Verde Malachit
Probe Concentrațiile Absorbanțele medii Z % Verde Malachit
CP1,2 (μg/mL) Ap1,2 (λmax. = 617 nm) (g % de Verde Malachit
pur)
1. 2,92979 μg/mL AP = 0,352 (0,3 mL probă) Z = 120,567 %

4
Ap1 = 0,352 (prea mare valoarea absorbanţei → 0,3 mL probă) pentru v = 0,3 mL soluție
probă din eprubeta gradată de volum VP = 10 mL.

Etapa 3. Dozarea propriu-zisă a colorantului Verde Malachit din proba de analizat,

calculul concentrației procentuale (%) de Verde Malachit pur din cele a = 0.0081 g probă
solidă studiată.

a. Calculul concentrației CP (μg/mL) soluţiei probă de Verde Malachit din ecuația

dreptei de calibrare
Ecuațua dreptei de calibrare a fost de forma y = ax + b, unde y = AP = absorbanța
probei, iar x = CP = concentrația probei în µg/mL. S-a obținut AP = a.CP + b, de unde CP =
(AP – b) /a = concentrația soluţiei de probă exprimată în µg/mL. În ecuația dreptei de
regresie (fig. 1) : y = 0,1168 x + 0,0098, se înlocuiește y = AP și x = CP și se obține: AP =
0,1168.CP + 0,0098. Dar : AP = 0,352, Din ecuația dreptei de calibrare, CP = (AP - 0,0098)
/ 0,1168 (1) , de unde CP = (0,352 - 0,0098) / 0,1168, deci CP = 2,92979 μg/mL
b. Calculul cantităților X (μg) de Verde Malachit pur din VP = 10 mL soluție probă
(din eprubeta gradată).
CP µg....................................................1 mL
X µg................................................VP mL probă (10 mL), de unde X = CP . VP =

cantitatea în µg de Verde Malachit pur din eprubeta gradată VP = 10 mL (2).

Pentru soluţia probă, concret X = 2,92979 .10 = 29,2979 µg Verde Malachit
pur. Deci, în concluzie, X = 29,2979 µg Verde Malachit pur din eprubeta gradată de volum
VP = 10 mL.
c. Calculul cantității Y (μg) de Verde Malachit pur din V = 100 mL soluție (balon
cotat).
Dar X µg............................................v mL soluție probă ( v = 0,3 mL)

Y µg..........................................V mL soluție (b.c.), deci Y = V. X /v = cantitatea

exprimată în µg de Verde Malachit pur (3) din V = 100 mL soluție (balon cotat). În cazul
probei: Y = 100 . 29,2979 / 0,3 = 9765,966 µg de Verde Malachit pur. Y = 9765,966 µg
de Verde Malachit pur din V = 100 mL soluție (balon cotat)..

5
 d. Calculul concentrațiilor procentuale Z % de Verde Malachit pur din cele a =
0,0081 g probă solidă luată în studiu .
Yµg..............................................................a g probă (0,0081 g)
Z %........................................................100 g probă solidă de analizat, de unde:

Z = (100. Y) /a = concentrațiile procentuale exprimate în µg % (4) de Verde Malachit

pur din a = 0,0081 g pulbere solidă de probă Se transformă automat µg % în g % Verde
Malachit pur din cele a = 0,0081 g probă solidă de analizat; se ţine cont că 1 µg = 10-6 g:
Z = (100.Y.10-6) /a.
Pentru probă, Z = (100. 9765,966. 10-6)/ 0,0081 = 0,9765966 / 0,0081 = 120,567

g % Verde Malachit pur. În concluzie, Z = 120,567 % Verde Malachit pur (120,567 g

% Verde Malachit pur din cele a = 0,0081 g probă solidă de analizat).

Etapa 4. Calculul unor parametri statistici ai dreptei de regresie (de calibrare).-

liniaritatea metodei

Liniaritatea unui proces de analiză constă în capacitatea de a conduce, în interiorul

unui interval dat, la rezultate direct proporţionale cu concentraţia substanţei analizate, dintr-
un anumit eşantion. Întensitatea semnalului analitic (absorbanţa măsurată) este variază direct
proporţional cu concentraţia, pentru un anumit domeniu. Valoarile acceptate pentru
coeficientul de corelaţie este : r ˃ 0,999, iar pentru coeficientul de regresie liniară r2 ≥

0,999.
S-au determinat parametrii statistici ai dreptei de regresie cu ajutorul softului
Microsoft Office Excel 2016., redaţi în tabelul 3.
Limita de detecţie (LD) reprezintă cea mai mică cantitate de analit dintr-o probă ce
poate fi detectată într-un eşantion față de un martor, în condiţii experimentale stabilite. Se
exprimă în aceleaşi unităţi ca şi concentraţia analitului şi se calculează folosind următoarea
formulă: LD = 3 . SE/ Panta (A)
Limita de cuantificare (LC) este dată de cea mai mică concentrație de analit dintr-o
probă, ce poate fi determinată cantitativ (cuantificată) cu o precizie și acuratețe acceptabilă,
în aceleași condiții experimentale date. Valoarea ei s--a exprimat în aceleaşi unităţi ca şi

6
concentraţia analitului şi s-a calculat astfel: LQ = 10 . SE / Panta (B), unde SE a reprezentat
eroarea standard a dreptei de regresie.
Din meniul situat în pareta de sus a paginii în Excel se face click stânga pe DATA →
DATA ANALYSIS. (Dacă nu aveți în meniu DATA ANALYSIS se descarcă : Excel
Option – Add In) Apare o mică fereastră cu o înșiruire de funcții . Se caută funcția
REGRESSION, se selectează și apare alt meniu (Regression). Imput Y range (se selectează
toată coloana cu valorile numerice ale lui Y – absorbanțele), apoi Imput X range se
selectează toată coloana cu valorile lui X – concentrațiile . Se dă OK și apar încă o foaie
Excel cu mai multe tabele (SUMMARY OUTPUT, cu subtitlul primului tabel: Regression
Statistics). Se ia primul tabel din foaie:

Tabel 3 . Valorile unor parametri statistici ai regresiei liniare

Parametrii statistici ai regresiei liniare (Regression Statistics)
Coeficientul de corelaţie R 0.998544
Coeficientul de regresie lineară R2 0.997090
Coeficientul de regresie R2 adjustat 0.996120
Eroarea standard (SE) a dreptei de regresie 0.009272
Observaţii (valori ale absorbanţelor măsurate) 5

Ecuaţia dreptei de regresie a fost: y = 0.1168 x + 0,0098 sau Ap (λ) = 0,1168. Cp +

0,0098 (μg/mL) . Intersecţia cu ordonata a fost 0,0098 (+), iar panta dreptei a fost 0,1168.
Coeficientul de regresie R2 = 0,997090, iar coeficientul de corelaţie R nu s-au situat în
limitele normale de valori , S-au situat sub valoarea minimă admisă (0,999) . (tabelul 3), S-a
constatat variaţia neproporţională a absorbanţelor măsurate ale soluţiilor etalon cu
concentraţiile acestora (liniaritate redusă a metodei). Eroarea standard (SE) a dreptei de
regresie a avut valoarea 0,009272 (valoare bună, acceptabilă !) (tabel 3)
Limita de detecţie. LD = 3 . 0,009272 / 0,1168 = 0,23815 μg/mL, Limita de
cuantificare. LQ = 10 .0,009272 / 0,1168 = 0,79384 μg/mL. (valori bune !)

7
 Concluzii
Metoda aplicată pentru dozarea spectrofotometrică în vizibil (VIS) a colorantului
Verde de Malachit dintr-o probă nu a fost liniară pe întreg domeniul de concentraţii ales
0.36 – 3,60 μg/mL, a prezentat o lniaritate redusă; (din fig. 1 se observă că două puncte
dintre cele cinci sunt piuţin distanţate de dreaptă, nu se situează chiar pe dreaptă.),
coeficientul de regresie liniară : R2 = 0,997090 iar cel de corelaţie R = 0.998544, nu s-au
încadrat în intervalul normal de valori : R2 ≥ 0,999; R > 0,999. . Eroarea standard a dreptei
de regresie a fost SE = 0,009272. (valoare bună! ). Eroarea standard SE a dreptei de
regresie trebuie să fie cât mai mică posibil, mult subunitară. Limita de detecţie, LD =
0,23815 μg/mL și limita de cuantificare, LQ = 0,79384 μg/mL s-au încadrat în limitele
normale de valori, valori mici, bune (panta dreptei de regresie a fost mare, a avut o valoare
foarte bună: 0,1168). La fel limitele de detecţie LD şi de cuantificare LQ trebuie să fie cât
mai mici, subunitare.
Concentrația procentuală de Verde Malachit din a = 0,0081 g probă luate în lucru au
fost: pentru soluţie probă, Z = 120,567 g % Verde Malachit pur = o valoare mult
prea mare, îndepărtată de intervalul normal de valori reale, de referinţă (97% - 98%),
din cauza absorbanţei prea mari a probei AP = 0,352 (pentru numai v1 = 0,3 mL soluţie
probă analizată, adusă cu H2O în eprubetă gradată de 10 mL).
Se admite o eroare relativă maximă procentuală de ± 5 % faţă de valoarea oficială,
de referinţă. Prin urmare, valoarea concentraţiei găsite practic (120,567 %) nu s-a încadrat
în intervalul normal de valori, cu o eroare relativă maximă procentuală mult prea mare,
cuprinsă între 22,567 - 23,567 %., a depăşit cu mult limita maximă admisă de ± 5 % .

8
 8.2. Dozarea spectrofotometrică în domeniul vizibil (VIS) a colorantului
MetilOranj dintr-o probă de analizat
- Calcule Efectuate -

Denumirea IUPAC: 4-[(4-dimetilamino)fenildiazenil] benzen-4-sulfonat de sodiu.

Scopul cercetării constă în determinarea cantitativă a colorantului MetilOranj

dintr-o probă studiată..
Obiectivele lucrării :
- perfecţionarea și aplicarea unei metode spectrofotometrice de dozare în domeniul
Vizibil (VIS) a colorantului MetilOranj;
Principiul metodei. MetilOranj (sarea acidului 4-[4 (dimetilamino)fenilazo]benzensulfonic)
prezintă o absorbție maximă în domeniul Vizibil (VIS) la lungimea de undă ʎ max. = 465 nm
și poate fi dozat spectrofotometric din ape reziduale sau cursuri de apă (în cazul poluării),
respectiv din fluide biologice (spută, ser, salivă, sânge, urină – în cazul intoxicațiilor acute),.
Reactivi necesari şi aparatură
- pulbere standard pură de MetilOranj ;
- soluţie stoc de MetilOranj, 0,01 % (100 µg/mL)
- soluţie standard de lucru de MetilOranj, 18 µg/mL, obţinută printr-o diluţie cu H2O
distilată din soluţia stoc;
- 6 soluţii etalon de MetilOranj (1,80 μg/mL – 10,80 μg/mL);
- probă solidă de dozat ce conţine MetilOranj;
- apă distilată;
- eprubete gradate de 10 mL;.
- spectrofotometru UV-VIS.

9
Etapa 1. Calibrarea (etalonarea ) spectrofotometrului la lungimea de undă λmax. = 465
nm, pentru colorantul MetilOranj, cu ajutorul soluțiilor etalon de MetilOranj (1,80 –
10,80 μg/mL), preparate din pulbere standard pură de MetilOranj;

1.a.) Calculul concentrațiilor C (μg/mL) ale celor 6 soluții etalon de MetilOranj ( scrise cu
bold → tabelul 4):
Din relația Ci. Vi = Cf . Vf , unde Ci = concentrația inițială a soluției standard
de lucru din care s-au preparat cele 6 soluții etalon = 18 µg/mL Cf = x = concentrația
finală din fiecare eprubetă cu soluție etalon (după completarea cu H2O distilată), ce
trebuie calculată., Vi = volumele inițiale de soluție standard 18 µg/mL ce trebuie măsurate
pentru a prepara fiecare din cele 6 eprubete etalon (coloana 2 din tabelul 1) VE = 10 mL
= volumele finale de soluție obţinute după adăugarea apei distilate în fiecare eprubetă cu
soluție etalon :
Eprubeta 1. 18 . 1.0 = Cf 1 . 10 de unde Cf 1 = (18 . 1,0) / 10 = 1,80 µg/mL .
Deci Cf 1 = 1,80 µg/mL
Eprubeta 2. 18 . 1.5 = Cf 2 . 10 de unde Cf 2 = (18 . 1.5) / 10 = 2,70 µg/mL .
Deci Cf 2 = 2,70 µg/mL
Eprubeta 3. 18 . 2.5 = Cf 5 . 10 de unde Cf 3 = (18 . 2,5) / 10 = 4,50 µg/mL .
Deci Cf 3 = 4,50 µg/mL
Eprubeta 4. 18 . 4.0 = Cf 4 . 10 de unde Cf 4 = (18 . 4,0) / 10 = 7,20 µg/mL
Deci Cf 4 = 7,20 µg/mL
Eprubeta 5. 18 . 5,0 = Cf 5 . 10 de unde Cf 5 = (18 . 5,0) / 10 = 9,00 µg/mL
Deci Cf 5 = 9,00 µg/mL
Eprubeta 6. 18 . 6.0 = Cf 6 . 10 de unde Cf 6 = (18 . 6,0) / 10 = 10,80 µg/mL
Deci Cf 6 = 10,80 µg/mL

Se măsoară pe rând absorbanțele soluțiilor etalon obținute cu concentrații cuprinse

între 1,80 – 10,80 μg/mL, în funcție de H2O distilată ca martor, la lungimiea de undă λmax. =
465 nm. (tabel 4). Volumul final de soluție în cele 6 eprubete cu soluții etalon a fost Vf = 10
mL.

10
 Tabel 4
Prepararea soluţiilor etalon de MetilOranj şi măsurarea absorbanţelor în funcţie de
concentraţii – trasarea dreptei de calibrare a spectrofometrului
Nr. mL soluţie mL H2O Concentraţiile C Absorbanţele
det. standard de lucru, distilată (µg/mL) ale A (ʎmax. = 465 nm)
18 µg/mL soluţiilor etalon
1. 1,0 9,0 1,80 µg/mL 0,138
2. 1,5 8,5 2,70 µg/mL 0,219
3. 2,5 7,5 4,50 µg/mL 0,356
4. 4,0 6,0 7,20 µg/mL 0,576
5. 5,0 5,0 9,00 µg/mL 0,712
6. 6,0 4,0 10,80 µg/mL 0,930

Cu valorile absorbanţelor redate în tabelul 4, s-a trasat dreapta de calibrare a

spectrofotometrului A = f (C ) la lungimea de undă λ = 465 nm pentru colorantul MetilOranj
, ce a fost redată în figura 2 (Fig.2). Important: Valoarea absorbanței probei trebuie să fie
cuprinsă întotdeauna între absorbanțele soluțiilor etalon, pentru ca proba să poată fi dozată
spectrofotometric în UV-VIS.

Fig. 2. Dreapta de calibrare obținută pentru soluțiile etalon de MetilOranj

(1,80 µg/mL– 10.80 µg/mL)

(dintre cele şase puncte, ultimele două puncta nu se situează pe dreaptă, sunt
distanţate faţă de dreaptă, dintre care ultimul punct este situat la distanţă mai mare
faţă de dreaptă– liniaritate foarte slabă a metodei)

11
 Trasarea dreptei de calibrare în Microsoft Excel – pentru cine nu știe încă (într-un
document Excel se trec, pe prima coloană în ordine crescătoare, de sus în jos, valorile
concentrațiilor C (μg/mL) iar pe-a doua coloană – valorile absorbanțelor A(λ) . Se selctează
apoi, ambele coloane în acelaşi timp, cu toate valorile trecute și se dă comanda Insert →
Scatter (partea superioară a foii Excel). Apare graficul format doar din puncte. Se dă click
dreapta pe puncta (se selectează toate punctele) apare un meniu cu Add Trendline. Se dă
click stânga pe această comandă , apare un alt meniu mare în partea dreaptă cu Format
Trendline. Se bifează în acest meniu, în partea de jos, ultimele 2 căsute (“Display
Equation on chart “ și “Display R-squared value on chart”) . Prin acest fapt, se afișează
automat ecuația dreptei de regresie și valoarea coeficientului de regresie R2. Se obține
astfel Fig.2. Astfel se procedează în toate determinările spectrofotometrice ale unor
analiți din probe , în domeniul UV-VIS.

Etapa 2. Prepararea, în paralel, a probei de dozat ce conțin MetilOranj și măsurarea

absorbanţei acestei probe AP la lungimea de undă λ = 465 nm.
S-au cântărit la balanța analitică circa a = 0,0093 g pubere MetilOranj probă care au

fost aduse cantitativ cu apă distilată la balon cotat de volum V = 100 mL cu apă distilată
sub agitare până la dizolvare completă. Apoi s-a completat cu H2O distilată exact până la
semn. Din soluția probă astfel preparată s-a măsurat un volum v = 1,0 mL soluție probă

care au fost aduși cantitativ într-o eprubetă gradată de volum VP = 10 mL. S-a adăugat
apoi H2O distilată exact până la 10 mL sub agitare. (9,0 mL H2O distilată). S-a măsurat
absorbanţa soluţiei de probă la lungimea de undă ʎ max. = 465 nm față de H2O distilată ca
martor. S-au realizat câte trei determinări și s-a calculat o absorbanță medie a probei AP
(tabelul 5).
Tabel 5. Valorile măsurate ale absorbanței AP și concentrației probei de MetilOranj
Probe Concentrația CP Absorbanța Z % MetilOranj
(μg/mL) Ap (λmax. = 465 nm) (g % de MetilOranj
pur)
1. 7,8186 μg/mL AP = 0,643 (1,0 mL probă); Z = 84,071 %

AP = 0,643 (1,0 mL probă); → absorbanţă puţin cam mică a probei pentru un volum v =
1,0 mL probă măsurată adus în eprubetă gradată de volum VP = 10 mL cu H2O
distilată

12
Etapa 3. Dozarea propriu-zisă a colorantului MetilOranj din proba de analizat, calculul
concentrației procentuale (%) de MetilOranj pur din cele a = 0.0093 g probă solidă
studiată.
a. Calculul concentrației CP (μg/mL) soluţiei probă de MetilOranj din ecuația
dreptei de calibrare
Ecuațua dreptei de calibrare a fost de forma y = ax + b, unde y = AP = absorbanța
probei, iar x = CP = concentrația probei în µg/mL. S-a obținut AP = a.CP + b, de unde CP =
(AP – b) /a = concentrația soluţiei de probă exprimată în µg/mL. În ecuația dreptei de
regresie (fig. 2) : y = 0,0849 x - 0,0208, se înlocuiește y = AP și x = CP și se obține: AP =
0,0849 .CP - 0,0208. Dar : AP = 0,643. Din ecuația dreptei de calibrare, CP = (AP +
0,0208) / 0,0849 (1) , de unde CP = (0,643 + 0,0208) / 0,0849 , deci CP = 7,8186 μg/mL
b. Calculul cantității X (μg) de MetilOtanj pur din VP1 = 10 mL soluție probă (din
eprubeta gradată).
CP µg............................................1 mL
X µg..........................................VP mL probă (10 mL), de unde X = CP. VP =

cantitatea în µg de MetilOranj pur din VP = 10 mL (din eprubeta gradată) (2).

Pentru probă, concret X = 7,8186 . 10 = 78,186 µg MetilOranj pur. Deci, în
concluzie, X1 = 78,186 µg MetilOranj pur.
c. Calculul cantității Y (μg) de MetilOranj pur din V = 100 mL soluție (balon cotat).
Dar X µg........................................v mL soluție probă (v = 1,0 mL)
Y µg.....................................V mL soluție (b.c.), deci Y = V. X / v =

cantitatea în µg de MetilOranj pur (3) din V = 100 mL soluție (balon cotat). În cazul probei:

Y = 100 . 78,186 / 1,0 = 7818,60 µg de MetilOranj pur. Y = 7818,60 µg de MetilOranj

pur.

d. Calculul concentrației procentuale Z% de MetilOranj pur din a = 0,0093 g probă

solidă luată în studiu .
Y µg..........................................................a g probă (0,0093 g)
Z %.....................................................100 g probă solidă de analizat, de unde:

Z = (100. Y) /a = concentrația procentuală exprimată în µg % (4) de MetilOranj

pur din a = 0,0093 g pulbere solidă de probă Se transformă automat µg % în g %

13
MetilOranj pur din cele a = 0,0093 g probă solidă de analizat; se ţine cont că 1 µg = 10-6
g:
Z = (100.Y.10-6) /a = (100. 7818,60. 10-6)/ 0,0093 = 0,781860 / 0,0093 = 84,071
g % MetilOranj pur. În concluzie, concentraţia procentuală Z = 84,071 %
MetilOranj pur (84,071 g % MetilOranj pur din cele a = 0,0093 g probă solidă de
analizat)

Etapa 4. Calculul unor parametri statistici ai dreptei de regresie (de calibrare).-

liniaritatea metodei
Liniaritatea unui proces de analiză constă în capacitatea de a conduce, în interiorul
unui interval dat, la rezultate direct proporţionale cu concentraţia substanţei analizate, dintr-
un anumit eşantion. Întensitatea semnalului analitic (absorbanţa măsurată) este variază direct
proporţional cu concentraţia, pentru un anumit domeniu. Valoarile acceptate pentru
coeficientul de corelaţie este : r ˃ 0,999, iar pentru coeficientul de regresie liniară r2 ≥

0,999.
S-au determinat parametrii statistici ai dreptei de regresie cu ajutorul softului
Microsoft Office Excel 2016., ce au fost redaţi în tabelul 6.
Limita de detecţie (LD) reprezintă cea mai mică cantitate de analit dintr-o probă ce
poate fi detectată într-un eşantion față de un martor, în condiţii experimentale stabilite. Se
exprimă în aceleaşi unităţi ca şi concentraţia analitului şi se calculează folosind următoarea
formulă: LD = 3 . SE/ Panta (A)
Limita de cuantificare (LC) este dată de cea mai mică concentrație de analit dintr-o
probă, ce poate fi determinată cantitativ (cuantificată) cu o precizie și acuratețe acceptabilă,
în aceleași condiții experimentale date. Valoarea ei s--a exprimat în aceleaşi unităţi ca şi
concentraţia analitului şi s-a calculat astfel: LQ = 10 . SE / Panta (B), unde SE a reprezentat
eroarea standard a dreptei de regresie.
Din meniul situat în pareta de sus a paginii în Excel se face click stânga pe DATA →
DATA ANALYSIS. (Dacă nu aveți în meniu DATA ANALYSIS se descarcă : Excel
Option – Add In) Apare o mică fereastră cu o înșiruire de funcții . Se caută funcția
REGRESSION, se selectează și apare alt meniu (Regression). Imput Y range (se selectează
toată coloana cu valorile numerice ale lui Y – absorbanțele), apoi Imput X range se
selectează toată coloana cu valorile lui X – concentrațiile . Se dă OK și apar încă o foaie

14
Excel cu mai multe tabele (SUMMARY OUTPUT, cu subtitlul primului tabel: Regression
Statistics). Se ia primul tabel din foaie:

Tabel 6 . Valorile unor parametri statistici ai regresiei liniare

Parametrii statistici ai regresiei liniare (Regression Statistics)
Coeficientul de corelaţie R 0,997298
Coeficientul de regresie lineară R2 0,994604
Coeficientul de regresie R2 adjustat 0,993255
Eroarea standard (SE) a dreptei de regresie 0,025061
Observaţii (valori ale absorbanţelor măsurate) 6

Ecuaţia dreptei de regresie a fost: : y = 0,0849 x - 0,0208, sau Ap (λ) = 0,0849. Cp

- 0,0208 (μg/mL) . Intersecţia cu ordonata a fost 0.0208 (-), iar panta dreptei a fost 0,0849.
Coeficientul de regresie R2 = 0,994604, iar coeficientul de corelaţie R nu s-au situat în
limitele normale de valori. S-au situat mult sub valoarea minimă admisă (0,999) . (tabelul
6). S-a constatat variaţia neproporţională a absorbanţelor măsurate ale soluţiilor etalon cu
concentraţiile acestora (liniaritate foarte slabă a metodei). . Eroarea standard (SE) a dreptei de
regresie a avut valoarea 0,025061 (valoare cam mare !) (tabel 6)
Limita de detecţie. LD = 3 .0,025061 / 0,0849 = 0,8855 μg/mL, Limita de
cuantificare. LQ = 10 .0,025061 / 0,0849 = 2,9518 μg/mL. (valori cam mari !)

Concluzii
Metoda aplicată pentru dozarea spectrofotometrică în vizibil (VIS) a colorantului
MetilOranj dintr-o probă nu a fost liniară pe întreg domeniul de concentraţii ales: 1.80 –
10,80 μg/mL; (liniaritate foarte slabă a metodei; din fig. 2 se observă că ultimele două
puncta nu se situează pe dreaptă , sunt distanţate faţă de dreaptă, dintre care ultimul punct
este situat la distanţă mai mare faţă de dreaptă). Coeficientul de regresie liniară : R2 =
0,994604, iar cel de corelaţie R = 0,997298 , nu s-au încadrat în intervalul normal de valori
: R2 ≥ 0,999; R > 0,999. Eroarea standard a dreptei de regresie a fost SE = 0,025061.
(valoare cam mare !) Eroarea standard SE a dreptei de regresie trebuie să fie cât mai mică
posibil, mult subunitară.
La fel limitele de detecţie LD şi de cuantificare LQ trebuie să fie cât mai mici
posibil, să aibă valori subunitare.

15
 Limita de detecţie, LD = 0,8855 μg/mL și limita de cuantificare, LQ = 2,9518
μg/mL nu s-au încadrat în limitele normale de valori, valori prtea mari (panta dreptei
de regresie a avut o valoare prea mică 0,0852, în raport cu eroarea standard SE a
dreptei de regresie care a fost prea mare 0,025061). Eroare standard (SE) mare şi
pantă mică a dreptei → LD şi LQ cât mai mari– valori ce nu sunt cele optime!
Concentrația procentuală de MetilOranj pur din a = 0,0093 g probă luate în lucru a
fost Z = 84,071 % % MetilOranj pur = o valoare cam îndepărtată faţă de valoarea
reală, oficială, de referinţă (97% - 98%). Valoarea prea mică a concentraţiei Z =
84,071 % a probei de MetilOranj s-a datorat absorbanţei puţin cam mici a probei
(Ap = 0,643 pentru un volum măsurat v = 1,0 mL probă adus cu H2O în eprubetă
gradată de 10 mL) Se admite o eroare relativă maximă procentuală de numai ± 5 % faţă
de valoarea oficială, de referinţă. În acest caz, eroarea procentiuală maximă relativă a fost
cam mare, cuprinsă între 12,929 % - 13,929 % şi nu s-a încadrat în limitele normale de
valori, s-a situat peste limita maximă admisă de ± 5 % faţă de intervalul normal de
valori de referinţă (97% - 98%).

16