Lucrarea Practică Nr.

8.1. Dozarea spectrofotometrică în domeniul vizibil (VIS) a colorantului

Verde Malachit dintr-o probă de analizat
- Calcule Efectuate -

Scopul cercetării constă în determinarea cantitativă a colorantului Verde de

Malachit dintr-o probă de analizat..
Obiectivele lucrării :
- optimizarea și aplicarea unei metode spectrofotometrice de dozare în domeniul
Vizibil (VIS) a colorantului Verde de Malachit;

Cl-
C

CH3
H3C N
+
N
CH3
H3C

Fig. 1 Structura chimică a colorantului Verde de Malachit

denumirea IUPAC: 4-[(4-dimetilaminofenil)-fenil-metil]-N,N-dimetil-anilină), sau :

4-{[4-(Dimetilamino)fenil](fenil)metiliden}-N,N-dimetilciclohexa-2,5-dien-1-imină clorură
M = 364,917 g/mol, formula moleculară: C23H25ClN2 . Din punct de vedere chimic,
este un colorant triarilmetanic (trifenilmetanic) .
Principiul metodei. Principiul metodei. Verdele Malachit (Clorura de tetrametil-di-
p-amino-trifenil-carbinol) prezintă o absorbție maximă în domeniul Vizibil (VIS) la lungimea
de undă ʎ max = 617 nm și poate fi dozat spectrofotometric din ape (în cazul poluării), fluide
biologice (spută, ser, salivă, sânge, urină – în cazul intoxicațiilor acute), precum și din unele
produse farmaceutice veterinare.

1
 Reactivi necesari şi aparatură
- pulbere standard pură de Verde Malachit;
- soluţie stoc de Verde Malachit, 0,01 % (100 µg/mL)
- soluţie standard de lucru de Verde Malachit, 18 µg/mL obţinută prin diluţie cu
H2O distilată din soluţia stoc;
- soluţii etalon de Verde Malachit în H2O distilată (0,18 µg/mL – 1,44 µg/mL);
- probă solidă de dozat ce conţine Verde Malachit;
- apă distilată;
- eprubete gradate de 10 mL;
- spectrofotometru UV-VIS.

Etapa 1. Calibrarea (etalonarea ) spectrofotometrului la lungimea de undă λmax. = 617

nm, pentru colorantul Verde Malachit , cu ajutorul soluțiilor etalon de Verde Malachit
(0,18 – 1,44 μg/mL), preparate din pulbere standard pură de Verde Malachit;

1.a.) Calculul concentrațiilor C (μg/mL) ale celor 8 soluții etalon de Verde

Malachit ( scrise cu bold → tabelul 1):
Din relația Ci. Vi = Cf . Vf , unde Ci = concentrația inițială a soluției standard
de lucru din care am preparat cele 8 soluții etalon = 18 µg/mL Cf = x = concentrația
finală din fiecare eprubetă cu soluție etalon (după completarea cu H2O distilată), ce
trebuie calculată., Vi = volumele inițiale de soluție standard 18 µg/mL ce trebuie măsurate
pentru a prepara fiecare din cele 8 eprubete etalon (coloana 2 din tabelul 1) VE = 10 mL
= volumele finale de soluție obţinute după adăugarea apei distilate în fiecare eprubetă cu
soluție etalon :
Eprubeta 1. 18 . 0.1 = Cf 1 . 10 de unde Cf 1= (18 . 0,1) / 10 = 0,18 µg/mL .
Deci Cf 1 = 0,18 µg/mL
Eprubeta 2. 18 . 0.2 = Cf 2 . 10 de unde Cf 2= (18 . 0,2) / 10 = 0,36 µg/mL .
Deci Cf 2 = 0,36 µg/mL
Eprubeta 3. 18 . 0.3 = Cf 3 . 10 de unde Cf 3 = (18 . 0,3) / 10 = 0,54 µg/mL .
Deci Cf 3 = 0,54 µg/mL
Eprubeta 4. 18 . 0.4 = Cf 4 . 10 de unde Cf 4 = (18 . 0.4) / 10 = 0,72 µg/mL .
Deci Cf 4 = 0,72 µg/mL
Eprubeta 5. 19 . 0.5 = Cf 5 . 10 de unde Cf 5 = (18 . 0,5) / 10 = 0,90 µg/mL .

2
Deci Cf 5 = 0,90 µg/mL
Eprubeta 6. 18 . 0.6 = Cf 6 . 10 de unde Cf 6 = (18 . 0,6) / 10 = 1,08 µg/mL
Deci Cf 6 = 1,08 µg/mL
Eprubeta 7. 18 . 0.7 = Cf 7 . 10 de unde Cf 7 = (18 . 0,7) / 10 = 1,26 µg/mL
Deci Cf 7 = 1,26 µg/mL
Eprubeta 8. 18. 0.8 = Cf 8 . 10 de unde Cf 8 = (18 . 0,8) / 10 = 1,44 µg/mL .
Deci Cf 8 = 1,44 µg/mL

Se măsoară pe rând absorbanțele soluțiilor etalon obținute cu concentrații cuprinse

între 0,18 – 1,44 μg/mL, în funcție de H2O distilată ca martor, la lungimiea de undă λmax. =
617 nm. (tabel 1). Volumul final de soluție în cele 8 eprubete cu soluții etalon a fost Vf = 10
mL.
Tabel 1
Prepararea soluţiilor etalon de Verde Malachit şi măsurarea absorbanţelor în funcţie
de concentraţii – trasarea dreptei de calibrare a spectrofometrului
Nr. mL soluţie mL H2O Concentraţiile C Absorbanţele
det. standard de lucru, distilată (µg/mL) ale A (ʎmax. = 617 nm)
18 µg/mL soluţiilor etalon
1. 0,1 9,9 0,18 µg/mL 0,001
2. 0,2 9,8 0,36 µg/mL 0,036
3. 0,3 9,7 0,54 µg/mL 0,047
4. 0,4 9,6 0,72 µg/mL 0,091
5. 0,5 9,5 0,90 µg/mL 0,101
6. 0,6 9,4 1,08 µg/mL 0,162
7. 0,7 9.3 1,26 µg/mL 0,202
8. 0,8 9,2 1,44 µg/mL 0,230

Cu valorile absorbanţelor redate în tabelul 1, s-a trasat dreapta de calibrare a

spectrofotometrului la lungimea de undă λ = 617 nm pentru colorantul Verde Malachit , ce a
fost redată în figura 1 (Fig.1). Important: Valoarea absorbanței probei trebuie să fie
cuprinsă întotdeauna între absorbanțele soluțiilor etalon, pentru ca proba să poată fi dozată
spectrofotometric în UV-VIS.

3
 Fig. 1 Dreapta de calibrare obținută pentru soluțiile etalon de Verde Malachit
( Erori Mari ! – liniaritate redusă a metodei, cinci dintre puncte nu se situează
chiar pe dreptă, ci în imediata ei vecinătate)

Trasarea dreptei de calibrare în Microsoft Excel – pentru cine nu știe încă (într-un
document Excel se trec, pe prima coloană în ordine crescătoare, de sus în jos, valorile
concentrațiilor C (μg/mL) iar pe-a doua coloană – valorile absorbanțelor A(λ) . Se selctează
apoi, ambele coloane în acelaşi timp, cu toate valorile trecute și se dă comanda Insert →
Scatter (partea superioară a foii Excel). Apare graficul format doar din puncte. Se dă click
dreapta pe puncta (se selectează toate punctele) apare un meniu cu Add Trendline. Se dă
click stânga pe această comandă , apare un alt meniu mare în partea dreaptă cu Format
Trendline. Se bifează în acest meniu, în partea de jos, ultimele 2 căsute (“Display
Equation on chart “ și “Display R-squared value on chart”) . Prin acest fapt, se afișează
automat ecuația dreptei de regresie și valoarea coeficientului de regresie R2. Se obține
astfel Fig.1. Astfel se procedează în toate determinările spectrofotometrice ale unor
analiți din probe , în domeniul UV-VIS.

Etapa 2. Prepararea, în paralel, a probei de dozat ce conțin Verde Malachit- și măsurarea

absorbanţei acestei probe AP la lungimea de undă λ = 617 nm.
S-au cântărit la balanța analitică circa a = 0,0080 g pubere Verde Malachit probă

care au fost aduse cantitativ cu apă distilată la balon cotat de volum V = 100 mL cu apă
distilată sub agitare până la dizolvare completă. Apoi s-a completat cu H2O distilată exact

4
până la semn. Din soluția probă astfel preparată s-a măsurat un volum v = 0,7 mL soluție

care au fost aduși cantitativ într-o eprubetă gradată de volum vP = 10 mL. S-a adăugat apoi
H2O distilată exact până la 10 mL sub agitare. (9,3 mL H2O distilată). S-a măsurat absorbanța
probei la lungimea de undă ʎ max. = 617 nm față de H2O distilată. S-au realizat câte trei
determinări și s-a calculat o absorbanță medie a probei AP (tabelul 2).

Tabel 2. Valorile măsurate ale absorbanței AP și concentrației probei de Verde

Malachit
Probe Concentrația CP Absorbanța Z % Verde Malachit
(μg/mL) Ap (λmax. = 617 nm) (g % de Verde Malachit
pur)
1. 0,762 μg/mL AP = 0,100 (0,7 mL probă) Z = 13,607 %

Ap = 0,100 (cam mică valoarea) pentru v = 0,7 mL soluție probă

Etapa 3. Dozarea propriu-zisă a colorantului Verde Malachit din proba de analizat,

calculul concentrației procentuale (%) de Verde Malachit pur din cele a = 0.0080 g probă
solidă studiată.

a. Calculul concentrației CP (μg/mL) soluţiei probă de Verde Malachit din ecuația

dreptei de calibrare
Ecuațua dreptei de calibrare a fost de forma y = ax + b, unde y = AP = absorbanța
probei, iar x = CP = concentrația probei în µg/mL. S-a obținut AP = a.CP + b, de unde CP =
(AP – b) /a = concentrația soluţiei de probă exprimată în µg/mL. În ecuația dreptei de
regresie (fig. 1) : y = 0,1844 x – 0,0406, se înlocuiește y = AP și x = CP și se obține: AP =
0,1844..CP – 0,0406. Dar : AP = 0,100. Din ecuația dreptei de calibrare, CP = (AP +
0,0406) / 0,1844 (1) , de unde CP = (0,100 + 0,0406) / 0,1844 , deci CP = 0,762 μg/mL

b. Calculul cantității X(μg) de Verde Malachit pur din vP = 10 mL soluție probă

(din eprubeta gradată).
CP µg............................................1 mL
X µg....................................... vP mL probă (10 mL), de unde X = CP. vP =

cantitatea în µg de Verde Malachit pur din vP = 10 mL (din eprubeta gradată) (2).

5
 Pentru probă, concret X = 0,762 . 10 = 7,62 µg Verde Malachit pur. Deci, în
concluzie, X = 7 ,62 µg Verde Malachit pur.
c. Calculul cantității Y(μg) de Verde Malachit pur din V = 100 mL soluție (balon
cotat).
Dar X µg....................................v mL soluție probă (v = 0,7 mL)
Y µg...................................V mL soluție (b.c.), deci Y = V. X / v = cantitatea

în µg de Verde Malachit pur (3) din V = 100 mL soluție (balon cotat). În cazul probei: Y =

100 . 7,62 / 0,7 = 1088,571 µg de Verde Malachit pur. Y = 1088,571 µg de Verde Malachit
pur.
d. Calculul concentrației procentuale Z% de Verde Malachit pur din a = 0,0080 g
probă solidă luată în studiu .
Y µg..........................................................a g probă (0,0080 g)
Z %.....................................................100 g probă solidă de analizat, de unde:

Z = (100. Y) /a = concentrația procentuală exprimată în µg % (4) de Verde Malachit

pur din a = 0,0080 g pulbere solidă de probă Se transformă automat µg % în g % Verde
Malachit pur din cele a = 0,0080 g probă solidă de analizat; se ţine cont că 1 µg = 10-6 g:
Z = (100.Y.10-6) /a = (100. 1088,571. 10-6)/ 0,0080 = 0,1088571 / 0,0080 = 13,607 g %
Verde Malachit pur. În concluzie, Z = 13,607 % Verde Malachit pur (13,607 g % Verde
Malachit pur din cele a = 0,0080 g probă solidă de analizat)

Etapa 4. Calculul unor parametri statistici ai dreptei de regresie (de calibrare).-

liniaritatea metodei
Liniaritatea unui proces de analiză constă în capacitatea de a conduce, în interiorul
unui interval dat, la rezultate direct proporţionale cu concentraţia substanţei analizate, dintr-
un anumit eşantion. Întensitatea semnalului analitic (absorbanţa măsurată) este variază direct
proporţional cu concentraţia, pentru un anumit domeniu. Valoarile acceptate pentru
coeficientul de corelaţie este : r ˃ 0,999, iar pentru coeficientul de regresie liniară r2 ≥

0,999.
S-au determinat parametrii statistici ai dreptei de regresie cu ajutorul softului
Microsoft Office Excel 2016., redaţi în tabelul 3.
Limita de detecţie (LD) reprezintă cea mai mică cantitate de analit dintr-o probă ce
poate fi detectată într-un eşantion față de un martor, în condiţii experimentale stabilite. Se

6
exprimă în aceleaşi unităţi ca şi concentraţia analitului şi se calculează folosind următoarea
formulă: LD = 3 . SE/ Panta (A)
Limita de cuantificare (LC) este dată de cea mai mică concentrație de analit dintr-o
probă, ce poate fi determinată cantitativ (cuantificată) cu o precizie și acuratețe acceptabilă,
în aceleași condiții experimentale date. Valoarea ei s--a exprimat în aceleaşi unităţi ca şi
concentraţia analitului şi s-a calculat astfel: LQ = 10 . SE / Panta (B), unde SE a reprezentat
eroarea standard a dreptei de regresie.
Din meniul situat în pareta de sus a paginii în Excel se face click stânga pe DATA →
DATA ANALYSIS. (Dacă nu aveți în meniu DATA ANALYSIS se descarcă : Excel
Option – Add In) Apare o mică fereastră cu o înșiruire de funcții . Se caută funcția
REGRESSION, se selectează și apare alt meniu (Regression). Imput Y range (se selectează
toată coloana cu valorile numerice ale lui Y – absorbanțele), apoi Imput X range se
selectează toată coloana cu valorile lui X – concentrațiile . Se dă OK și apar încă o foaie
Excel cu mai multe tabele (SUMMARY OUTPUT, cu subtitlul primului tabel: Regression
Statistics). Se ia primul tabel din foaie:

Tabel 3 . Valorile unor parametri statistici ai regresiei liniare

Parametrii statistici ai regresiei liniare (Regression Statistics)
Coeficientul de corelaţie R 0,988780
Coeficientul de regresie lineară R2 0,977686
Coeficientul de regresie R2 adjustat 0,973967
Eroarea standard (SE) a dreptei de regresie 0,013266
Observaţii (valori ale absorbanţelor măsurate) 8

Ecuaţia dreptei de regresie a fost: y = 0.1844 x – 0,0406 , sau Ap (λ) = 0,1844. Cp –

0.0406 (μg/mL) . Intersecţia cu ordonata a fost 0.0406 (-), iar panta dreptei a fost 0,1844.
Coeficientul de regresie R2 = 0,977686, iar coeficientul de corelaţie R nu s-au situat în
limitele normale de valori , S-au situat sub valoarea minimă admisă (0,999) . (tabelul 3), S-a
constatat variaţia neproporţională a absorbanţelor măsurate ale soluţiilor etalon cu
concentraţiile acestora (liniaritate slabă a metodei). . Eroarea standard (SE) a dreptei de
regresie a avut valoarea 0,013266 (valoare cam mare !) (tabel 3)
Limita de detecţie. LD = 3 . 0,013266 / 0,1844 = 0,2158 μg/mL, Limita de
cuantificare. LQ = 10 .0,013266 / 0,1844 = 0,7194 μg/mL. (valori foarte bune !)

7
 Concluzii
Metoda aplicată pentru dozarea spectrofotometrică în vizibil (VIS) a colorantului
Verde de Malachit dintr-o probă nu a fost liniară pe întreg domeniul de concentraţii ales
0.18 – 1,44 μg/mL; (din fig. 1 se observă că cinci puncte sunt destul de îndepărtate de
dreaptă ) coeficientul de regresie liniară : R2 = 0,977686, iar cel de corelaţie R = 0,988780,
nu s-au încadrat în intervalul normal de valori : R2 ≥ 0,999; R > 0,999). . Eroarea standard a
dreptei de regresie a fost SE = 0,013266. (valoare cam mare ! ) Limita de detecţie, LD =
0,2158 μg/mL și limita de cuantificare, LQ = 0,7194 μg/mL s-au încadrat în limitele
normale de valori, valori mici, foarte bune (panta dreptei de regresie a fost mare , a avut o
valoare foarte bună: 0,1844). Concentrația procentuală de Verde Malachit din a = 0,0080 g
probă luate în lucru a fost Z = 13,607 g % Verde Malachit pur = o valoare foarte mică,
destul de îndepărtată de valoarea reală, de referinţă (97% - 98%). Se admite o eroare
relativă maximă de ± 5% faţă de valoarea oficială, de referinţă.

8
 8.2. Dozarea spectrofotometrică în domeniul vizibil (VIS) a colorantului
MetilOranj dintr-o probă de analizat
- Calcule Efectuate -

Denumirea IUPAC: 4-[(4-dimetilamino)fenildiazenil] benzen-4-sulfonat de sodiu.

Scopul cercetării constă în determinarea cantitativă a colorantului MetilOranj

dintr-o probă studiată..
Obiectivele lucrării :
- perfecţionarea și aplicarea unei metode spectrofotometrice de dozare în domeniul
Vizibil (VIS) a colorantului MetilOranj;
Principiul metodei. MetilOranj (sarea acidului 4-[4 (dimetilamino)fenilazo]benzensulfonic)
prezintă o absorbție maximă în domeniul Vizibil (VIS) la lungimea de undă ʎ max. = 465 nm
și poate fi dozat spectrofotometric din ape reziduale sau cursuri de apă (în cazul poluării),
respectiv din fluide biologice (spută, ser, salivă, sânge, urină – în cazul intoxicațiilor acute),.
Reactivi necesari şi aparatură
- pulbere standard pură de MetilOranj ;
- soluţie stoc de MetilOranj, 0,01 % (100 µg/mL)
- soluţie standard de lucru de MetilOranj, 18 µg/mL, obţinută printr-o diluţie cu H2O
distilată din soluţia stoc;
- soluţii etalon de MetilOranj (0,18 μg/mL – 1,44 μg/mL);
- probă solidă de dozat ce conţine MetilOranj;
- apă distilată;
- eprubete gradate de 10 mL;.
- spectrofotometru UV-VIS.

9
Etapa 1. Calibrarea (etalonarea ) spectrofotometrului la lungimea de undă λmax. = 465
nm, pentru colorantul MetilOranj , cu ajutorul soluțiilor etalon de MetilOranj (0,18 – 1,44
μg/mL), preparate din pulbere standard pură de MetilOranj;

1.a.) Calculul concentrațiilor C (μg/mL) ale celor 8 soluții etalon de MetilOranj ( scrise cu
bold → tabelul 4):
Din relația Ci. Vi = Cf . Vf , unde Ci = concentrația inițială a soluției standard
de lucru din care s-au preparat cele 8 soluții etalon = 18 µg/mL Cf = x = concentrația
finală din fiecare eprubetă cu soluție etalon (după completarea cu H2O distilată), ce
trebuie calculată., Vi = volumele inițiale de soluție standard 18 µg/mL ce trebuie măsurate
pentru a prepara fiecare din cele 8 eprubete etalon (coloana 2 din tabelul 1) VE = 10 mL
= volumele finale de soluție obţinute după adăugarea apei distilate în fiecare eprubetă cu
soluție etalon :
Eprubeta 1. 18 . 0.1 = Cf 1 . 10 de unde Cf 1= (18 . 0,1) / 10 = 0,18 µg/mL .
Deci Cf 1 = 0,18 µg/mL
Eprubeta 2. 18 . 0.2 = Cf 2 . 10 de unde Cf 2= (18 . 0,2) / 10 = 0,36 µg/mL .
Deci Cf 2 = 0,36 µg/mL
Eprubeta 3. 18 . 0.3 = Cf 3 . 10 de unde Cf 3 = (18 . 0,3) / 10 = 0,54 µg/mL .
Deci Cf 3 = 0,54 µg/mL
Eprubeta 4. 18 . 0.4 = Cf 4 . 10 de unde Cf 4 = (18 . 0.4) / 10 = 0,72 µg/mL .
Deci Cf 4 = 0,72 µg/mL
Eprubeta 5. 19 . 0.5 = Cf 5 . 10 de unde Cf 5 = (18 . 0,5) / 10 = 0,90 µg/mL .
Deci Cf 5 = 0,90 µg/mL
Eprubeta 6. 18 . 0.6 = Cf 6 . 10 de unde Cf 6 = (18 . 0,6) / 10 = 1,08 µg/mL
Deci Cf 6 = 1,08 µg/mL
Eprubeta 7. 18 . 0.7 = Cf 7 . 10 de unde Cf 7 = (18 . 0,7) / 10 = 1,26 µg/mL
Deci Cf 7 = 1,26 µg/mL
Eprubeta 8. 18. 0.8 = Cf 8 . 10 de unde Cf 8 = (18 . 0,8) / 10 = 1,44 µg/mL .
Deci Cf 8 = 1,44 µg/mL

Se măsoară pe rând absorbanțele soluțiilor etalon obținute cu concentrații cuprinse

între 0,18 – 1,44 μg/mL, în funcție de H2O distilată ca martor, la lungimiea de undă λmax. =

10
465 nm. (tabel 4). Volumul final de soluție în cele 8 eprubete cu soluții etalon a fost Vf = 10
mL.
Tabel 4
Prepararea soluţiilor etalon de MetilOranj şi măsurarea absorbanţelor în funcţie de
concentraţii – trasarea dreptei de calibrare a spectrofometrului
Nr. mL soluţie mL H2O Concentraţiile C Absorbanţele
det. standard de lucru, distilată (µg/mL) ale A (ʎmax. = 465 nm)
18 µg/mL soluţiilor etalon
1. 0,1 9,9 0,18 µg/mL 0,013
2. 0,2 9,8 0,36 µg/mL 0,022
3. 0,3 9,7 0,54 µg/mL 0,038
4. 0,4 9,6 0,72 µg/mL 0,054
5. 0,5 9,5 0,90 µg/mL 0,065
6. 0,6 9,4 1,08 µg/mL 0,077
7. 0,7 9.3 1,26 µg/mL 0,080
8. 0,8 9,2 1,44 µg/mL 0,120

Cu valorile absorbanţelor redate în tabelul 4, s-a trasat dreapta de calibrare a

spectrofotometrului A = f (C ) la lungimea de undă λ = 465 nm pentru colorantul MetilOranj
, ce a fost redată în figura 2 (Fig.2). Important: Valoarea absorbanței probei trebuie să fie
cuprinsă întotdeauna între absorbanțele soluțiilor etalon, pentru ca proba să poată fi dozată
spectrofotometric în UV-VIS.

Fig. 2. Dreapta de calibrare obținută pentru soluțiile etalon de MetilOranj

(Erori Mari ! – liniaritate foarte redusă a metodei, din cauza ultimelor două
puncte foarte îndepărtate de dreaptă)

11
 Trasarea dreptei de calibrare în Microsoft Excel – pentru cine nu știe încă (într-un
document Excel se trec, pe prima coloană în ordine crescătoare, de sus în jos, valorile
concentrațiilor C (μg/mL) iar pe-a doua coloană – valorile absorbanțelor A(λ) . Se selctează
apoi, ambele coloane în acelaşi timp, cu toate valorile trecute și se dă comanda Insert →
Scatter (partea superioară a foii Excel). Apare graficul format doar din puncte. Se dă click
dreapta pe puncta (se selectează toate punctele) apare un meniu cu Add Trendline. Se dă
click stânga pe această comandă , apare un alt meniu mare în partea dreaptă cu Format
Trendline. Se bifează în acest meniu, în partea de jos, ultimele 2 căsute (“Display
Equation on chart “ și “Display R-squared value on chart”) . Prin acest fapt, se afișează
automat ecuația dreptei de regresie și valoarea coeficientului de regresie R2. Se obține
astfel Fig.2. Astfel se procedează în toate determinările spectrofotometrice ale unor
analiți din probe , în domeniul UV-VIS.

Etapa 2. Prepararea, în paralel, a probei de dozat ce conțin MetilOranj și măsurarea

absorbanţei acestei probe AP la lungimea de undă λ = 465 nm.
S-au cântărit la balanța analitică circa a = 0,0090 g pubere MetilOranj probă care au

fost aduse cantitativ cu apă distilată la balon cotat de volum V = 100 mL cu apă distilată
sub agitare până la dizolvare completă. Apoi s-a completat cu H2O distilată exact până la
semn. Din soluția probă astfel preparată s-a măsurat un volum v = 0,4 mL soluție care au

fost aduși cantitativ într-o eprubetă gradată de volum vP = 10 mL. S-a adăugat apoi H2O
distilată exact până la 10 mL sub agitare. (9,6 mL H2O distilată). S-a măsurat absorbanța
probei la lungimea de undă ʎ max. = 465 nm față de H2O distilată ca martor. S-au realizat câte
trei determinări și s-a calculat o absorbanță medie a probei AP (tabelul 5).

Tabel 5. Valorile măsurate ale absorbanței AP și concentrației probei de MetilOranj

Probe Concentrația CP Absorbanța Z % Verde Malachit
(μg/mL) Ap (λmax. = 617 nm) (g % de Verde Malachit
pur)
1. 0,698 μg/mL AP = 0,050 (0,4 mL probă) Z = 19,388 %

Ap = 0,050 pentru v = 0,4 mL soluție probă

12
Etapa 3. Dozarea propriu-zisă a colorantului MetilOranj din proba de analizat, calculul
concentrației procentuale (%) de MetilOranj pur din cele a = 0.0090 g probă solidă
studiată.

a. Calculul concentrației CP (μg/mL) soluţiei probă de MetilOranj din ecuația

dreptei de calibrare
Ecuațua dreptei de calibrare a fost de forma y = ax + b, unde y = AP = absorbanța
probei, iar x = CP = concentrația probei în µg/mL. S-a obținut AP = a.CP + b, de unde CP =
(AP – b) /a = concentrația soluţiei de probă exprimată în µg/mL. În ecuația dreptei de
regresie (fig. 2) : y = 0,0772 x – 0,0039, se înlocuiește y = AP și x = CP și se obține: AP =
0,0772..CP – 0,0039. Dar : AP = 0,050. Din ecuația dreptei de calibrare, CP = (AP +
0,0039) / 0,0772 (1) , de unde CP = (0,050 + 0,0039) / 0,0772 , deci CP = 0,698 μg/mL

b. Calculul cantității X(μg) de MetilOtanj pur din vP = 10 mL soluție probă (din

eprubeta gradată).
CP µg............................................1 mL
X µg....................................... vP mL probă (10 mL), de unde X = CP. vP =

cantitatea în µg de MetilOranj pur din vP = 10 mL (din eprubeta gradată) (2).

Pentru probă, concret X = 0,698 . 10 = 6,98 µg MetilOranj pur. Deci, în
concluzie, X = 6, 98 µg MetilOranj pur.

c. Calculul cantității Y(μg) de MetilOranj pur din V = 100 mL soluție (balon cotat).
Dar X µg....................................v mL soluție probă (v = 0,4 mL)
Y µg...................................V mL soluție (b.c.), deci Y = V. X / v = cantitatea

în µg de MetilOranj pur (3) din V = 100 mL soluție (balon cotat). În cazul probei: Y = 100

. 6,98 / 0,4 = 1745 µg de MetilOranj pur. Y = 1745 µg de MetilOranj pur.

d. Calculul concentrației procentuale Z% de MetilOranj pur din a = 0,0090 g probă

solidă luată în studiu .
Y µg..........................................................a g probă (0,0090 g)
Z %.....................................................100 g probă solidă de analizat, de unde:

13
Z = (100. Y) /a = concentrația procentuală exprimată în µg % (4) de MetilOranj pur
din a = 0,0090 g pulbere solidă de probă Se transformă automat µg % în g % MetilOranj
pur din cele a = 0,0090 g probă solidă de analizat; se ţine cont că 1 µg = 10-6 g: Z =

(100.Y.10-6) /a = (100. 1745. 10-6)/ 0,0090 = 0,1745 / 0,0090 = 19,388 g %

MetilOranj pur. În concluzie, concentraţia procentuală Z = 19,388 % MetilOranj pur
(19,388 g % MetilOranj pur din cele a = 0,0090 g probă solidă de analizat)

Etapa 4. Calculul unor parametri statistici ai dreptei de regresie (de calibrare).-

liniaritatea metodei
Liniaritatea unui proces de analiză constă în capacitatea de a conduce, în interiorul
unui interval dat, la rezultate direct proporţionale cu concentraţia substanţei analizate, dintr-
un anumit eşantion. Întensitatea semnalului analitic (absorbanţa măsurată) este variază direct
proporţional cu concentraţia, pentru un anumit domeniu. Valoarile acceptate pentru
coeficientul de corelaţie este : r ˃ 0,999, iar pentru coeficientul de regresie liniară r2 ≥

0,999.
S-au determinat parametrii statistici ai dreptei de regresie cu ajutorul softului
Microsoft Office Excel 2016., ce au fost redaţi în tabelul 6.
Limita de detecţie (LD) reprezintă cea mai mică cantitate de analit dintr-o probă ce
poate fi detectată într-un eşantion față de un martor, în condiţii experimentale stabilite. Se
exprimă în aceleaşi unităţi ca şi concentraţia analitului şi se calculează folosind următoarea
formulă: LD = 3 . SE/ Panta (A)
Limita de cuantificare (LC) este dată de cea mai mică concentrație de analit dintr-o
probă, ce poate fi determinată cantitativ (cuantificată) cu o precizie și acuratețe acceptabilă,
în aceleași condiții experimentale date. Valoarea ei s--a exprimat în aceleaşi unităţi ca şi
concentraţia analitului şi s-a calculat astfel: LQ = 10 . SE / Panta (B), unde SE a reprezentat
eroarea standard a dreptei de regresie.
Din meniul situat în pareta de sus a paginii în Excel se face click stânga pe DATA →
DATA ANALYSIS. (Dacă nu aveți în meniu DATA ANALYSIS se descarcă : Excel
Option – Add In) Apare o mică fereastră cu o înșiruire de funcții . Se caută funcția
REGRESSION, se selectează și apare alt meniu (Regression). Imput Y range (se selectează
toată coloana cu valorile numerice ale lui Y – absorbanțele), apoi Imput X range se
selectează toată coloana cu valorile lui X – concentrațiile . Se dă OK și apar încă o foaie

14
Excel cu mai multe tabele (SUMMARY OUTPUT, cu subtitlul primului tabel: Regression
Statistics). Se ia primul tabel din foaie:

Tabel 6 . Valorile unor parametri statistici ai regresiei liniare

Parametrii statistici ai regresiei liniare (Regression Statistics)
Coeficientul de corelaţie R 0,978197
Coeficientul de regresie lineară R2 0,956870
Coeficientul de regresie R2 adjustat 0,949682
Eroarea standard (SE) a dreptei de regresie 0,007804
Observaţii (valori ale absorbanţelor măsurate) 8

Ecuaţia dreptei de regresie a fost: y = 0.0772 x – 0,0039 , sau Ap (λ) = 0,0772. Cp –

0,0039 (μg/mL) . Intersecţia cu ordonata a fost 0.0039 (-), iar panta dreptei a fost 0,0772.
Coeficientul de regresie R2 = 0,956870, iar coeficientul de corelaţie R nu s-au situat în
limitele normale de valori , S-au situat cu mult sub valoarea minimă admisă (0,999) . (tabelul
6), S-a constatat variaţia neproporţională a absorbanţelor măsurate ale soluţiilor etalon cu
concentraţiile acestora (liniaritate foarte slabă a metodei). . Eroarea standard (SE) a dreptei de
regresie a avut valoarea 0,007804 (valoare bună !) (tabel 6)
Limita de detecţie. LD = 3 . 0,007804 / 0,0772 = 0,3033 μg/mL, Limita de
cuantificare. LQ = 10 .0,007804 / 0,0772= 1,011 μg/mL. (valori foarte bune !)

15
 Concluzii
Metoda aplicată pentru dozarea spectrofotometrică în vizibil (VIS) a colorantului
MetilOranj dintr-o probă nu a fost liniară pe întreg domeniul de concentraţii ales 0.18 –
1,44 μg/mL; (liniaritate foarte slabă; din fig. 2 se observă că ultimele două puncte sunt
foarte îndepărtate de dreaptă ) coeficientul de regresie liniară : R2 = 0,956870, iar cel de
corelaţie R = 0,978197, nu s-au încadrat în intervalul normal de valori : R2 ≥ 0,999; R >
0,999. Eroarea standard a dreptei de regresie a fost SE = 0,007804. (valoare bună ! )
Limita de detecţie, LD = 0,3033 μg/mL și limita de cuantificare, LQ = 1,011 μg/mL s-au
încadrat în limitele normale de valori, valori mici, foarte bune (panta dreptei de regresie
a avut o valoare bună: 0,0772). Concentrația procentuală de MetilOranj pur din a = 0,0090 g
probă luate în lucru a fost Z = 19,388 g % MetilOranj pur = o valoare foarte mică,
destul de îndepărtată de valoarea reală, de referinţă (97% - 98%). Se admite o eroare
relativă maximă de ± 5% faţă de valoarea oficială, de referinţă.

16