Sunteți pe pagina 1din 13

Curs 5 Analiza si Controlul Medicamentelor

CROMATOGRAFIA

METODE CROMATOGRAFICE APLICATE IN CONTROLULMEDICAMENTELOR


CROMATOGRAFIA

este una din ramurile vaste ale analizei (instrumentale) medicamentului,cu aplicatii
largi in separarea, detectia si determinarea substantelor chimice in general si
inanaliza si controlul medicamentelor in particular.Tehnicile cromatografice de
analiza sunt in primul rand tehnici de separare, dintre cele maiselective si eficiente,
inclusiv pt urme de substante si asociate cu metode de detectie. Suntcapabile sa
sesizeze cantitati infime de substante, ceea ce le confera o mare
sensibilitate,selectivitate si eficienta.Se poate spune ca toate tehnicile
cromatografice au ca elemente comune o faza stationara si ofaza mobila iar
componentii unui amestec de analizat sunt antrenati in lungul coloanei de unflux
de faza mobila, gazoasa sau lichida, cu viteze diferite, ceea ce constituie
procesulfundamental al separarii.Pe de alta parte, la baza tuturor metodelor
cromatografice de separare, stau 4 procesefundamentale:a.

Adsorbtia pe suporturi solide b.

Repartitia intre faza stationara si cea mobilac.

Schimbul ionicd.

Excluderea, difuzia.Prin urmare, principiul separarii poate fi diferit, dar etapele


analizei cromatografice suntaceleasi:-

Pregatirea fazei stationare-

Fixarea initiala a analitilor, in capul coloanei, pe faza stationara, dupa


introducereasolutiei de proba-

Deplasarea selectiva, caracteristica a analitilor, antrenati de faza mobila, in


cadrul procesului de elutie, developare.-

Identificarea analitilor separati, pe masura ce acestia ies din coloana separatoare si


trec indetector.-
Inregistrarea cromatogramelor, calcularea ariilor pick-urilor si a altor parametri
sidozarea analitilor corespunzatori, concomitent cu evaluarea statistica a
rezultatelor.

2
Tinand cont de natura fazelor stationare si a celor mobile se poate realiza o
clasificareacceptabila si rezonabila a metodelor cromatografice:

Cromatografia in faza gazoasa

Cromatografia in faza lichida-

Planara
o

Pe hartie
o

Pe strat subtire (css)-

Pe coloana
o

De adsorbtie solid-lichid
o

De repartitie lichid-lichid
o

De schimb ionic
o

De excludere-difuzieAlegerea fazelor stationare



se face in functie de masa moleculara a analitilor, de solubilitatealor in solventi
organici si apa, de caracterul lor (nepolar, polar sau ionic).In cromatografia de
absorbtie, faza stationara este un suport solid (oxid de aluminiu)

care are proprietati absorbante.In cromatografia de repartitie faza stationara este o
pelicula de lichid fixata pe un suport solid,cele 2 faze nefiind miscibile.In
cromatografia de schimb ionic

faza stationara

un compus macromolecular care contine unnr mare de grupari functionale, acide
sau bazice, capabile sa schimbe cationi (care sunt grupariacide) sau anioni mai grei
si cu sarcina mai mare. Aceste macromolecule schimbatoare de ioni

se mai numesc si rasini cationice sau cationiti si anionice/anioniti.In cromatografia
de excludere sterica sau de excludere-difuzie, faza stationara

un gel

care secomporta ca o sita moleculara, fixand anumite molecule si eliminand altele,
in functie demarimea si masa lor.In afara de aceste tipuri fundamentale exista si
unele procedee cromatografice specifice,caracteristice unor specii chimice:-

Cromatografia chirala, de absorbtie sau de repartitie; se caracterizeaza prin


structura chiralaa fazei stationare sau a fazei mobile

ceea ce permite separarea selectiva a analitilor chirali.-

Cromatografia cu lichide super-critice, care exploateaza solubilitatea analitilor intr-


un fluidsuper-critic; ex: CO2

ca atare sau modificat (+ metanol); - metoda asigura extragereaanalitilor din
matrice si ulterior separarea cromatografica.-

Electro-cromatografia capilara micelara



o tehnica hibrida care imbina cromatografia cuelectroforeza;

3
In functie de procedeul practic utilizat:
o

Cromatografie pe coloana

in care faza stationara este plasata pe o coloana, tub demetal, sticla, silice
o

Cromatografie planara/de suprafata



pe hartie sau pe strat subtireIn functie de migrarea fazei mobile

se disting:

Cromatografie prin developare



in care analitii raman pe faza stationara sau suntlocalizati pe aceasta; in functie de
directia de migrare, ascendenta sau descendenta,

Cromatografie de elutie, in care analitii sunt eluati (spalati) pana la iesirea


lor completa din coloana, fiind posibila culegerea succesiva a fractiunilor de analiti
siin acest caz detectia se face in eluenti.Pentru intelegerea corecta a proceselor
cromatografice

trebuie precizati parametri saumarimile care definesc procesele cromatografice de
separatie.Ex: o proba cu 2 analiti.Pe coloana pregatita in prealabil se introduce un
volum din proba, se adauga faza mobila, putincate putin, incepe developarea, adica
migrarea analitilor cu viteze diferite. Se produce elutia,adica extragerea din
coloana a fiecarui analit, iar la aparatele moderne de croma

eluentul seconduce direct la detector, in care se face detectia analitilor separati.Se
observa ca procesul de separare se produce treptat intre faza stationara si faza
mobilaexistand un echilibru

determinat de concentratiile fiecarui analit in cele 2 faze si a caror raportreprezenta
coeficientul de repartitie sau de distributie (
k
d
).Pentru un amestec de analiti este posibil sa se utilizeze un detector plasamt cat
mai aproape deiesirea eluentului din coloana si care inregistreaza continuu
semnalul analitic, semnal proportional cu variatiile concentratiilor analitilor
separati si eluati, care traverseaza coloana,obtinandu-se cromatograma
corespunzatoare, inregistrata de un inregistrator care face parte dinansamblul
instrumentului de analiza cromatografica.Fiecarui analit ii corespunde un pick pe
cromatograma care se inregistreaza intr-un sistem decoordonate.
4
Parametrii/marimile de retentie cromatografica sunt:-

timpul-

volumul-

distanta-

factorul/raportul de retentie, acestia fiind legati de coeficientul de distributie (


k
d
) intrefaza stationara si cea mobila.
Timpul de retentie

t
r
= timpul scurs de la introducerea probei de analit in coloana si momentulin care
apare maximul pick-ului din coloana.
t
0
sau
t
m
= timpul mort = timpul necesar ca faza mobila sa ajunga la detector si se
datoreaza parcursului obligatoriu al fazei mobile prin spatiile fazei stationare.De
regula, eluentul iesit din coloana este detectat printr-un semnal sau pick al
detectorului, sidin acest moment, se masoara timpul de retentie al analitului, numit
timp de retentie corectat
.
Volumul de retentie

V
r
= reprezinta volumul de faza mobila necesar pentru a aduce analitul cuconcentratia
sa maxima in detector.Similar timpului de retentie, volumul de retentie corectat. (V
r
’=V
r
-V
0
)Raportul de retentie se exprima prin raportul dintre viteza medie de deplasare a
analitului siviteza medie de deplasare a fazei mobile.
R
r

Factorul de retentie se exprima prin raportul dintre cantitatea de analit care se


gaseste in fazastationara (Q
s
) si cantitatea de analit care se gaseste in faza mobila(Q
m
).
5
Curs Analiza si Controlul Medicamentelor
CROMATOGRAFIA PE HARTIE (C.H.)
Realizeaza separarea sau distribuirea componentelor dintr-un amestec intre:

o faza stationara, constituita din hartia cromatografica (de regula celuloza 95-
99%)impregnata cu un solvent polar (apa, solutii tampon)

o faza mobila, constituita dintr-un sistem de solventi de polaritate opusa, adica


nepolari.Procesul de separare are la baza in general un mecanism de repartitie dar
se pot intalni simecanisme de absorbtie, schimb ionic, reactii chimice.Aparatura
este dependenta de procedeul ales pentru developare.In general se utilizeaza
camere sau bac-uri cromatografice din sticla sau metal (de regula inox),cu
posibilitatea de inchidere etansa (cu vizoare), de forma cilindrica sau
paralelipipedica, prevazute cu un dispozitiv de fixare a hartiilor cromatografice si
cu o cuva care in cazul tehniciiascendente se fixeaza pe fundul vasului
cromatografic, iar in cazul tehnicii descendente sefixeaza la partea superioara a
vasului.Benzile de hartie cromatografica sunt specificate in monografia respectiva,
sorturile utilizate(Watmann, Munktel, Schull) fiind caracterizate prin:-
viteza de migrare a solventului-

porozitate-

aspectul suprafetei-

grosime-

si eventual, utilizarea ei

care deriva din pretratare (ex: hartia hidrofobizata, in scopulsepararii subst
hidrofobe)Tehnica de lucru: daca nu se prevede altfel, cu 24 h inainte de
determinarea cromatografica,vasul cromatografic se satureaza cu toate
componentele fazei mobile (adica a developantului),introduse in cristalizoare la o
temperatura de 20-25gradeC.Tehnica cromatografica ascendenta, descendenta,
pregatirea benzilor de hartie cromatografica,developantul, modul de preparare al
solutiilor de aplicat (proba si etalonul), volumele aplicate sidistanta parcursa de
developant sunt prevazute in monografia respectiva.Linia pe care se aplica solutiile
= linie de start

trebuie sa fie situata la o distanta de 5-6 cm demarginea benzii de hartie pt tehnica
ascendenta si de 10-12 cm pt tehnica descendenta.Distanta dintre punctele
marginale si latura hartiei trebuie sa fie de cel putin 2,5 cm.Solutiile se aplica pe
hartia cromatografica, daca nu se prevede altfel, cu micropipete,microseringi, in
puncte circulare cu diametru de cel mult 6 mm. Daca este cazul, solutia seaplica in
mod repetat asteptand de fiecare data evaporarea solventului.
6
Dupa ce developantul a parcurs distanta prevazuta, hartia cromatografica se scoate,
se usuca sise pun in evidenta petele conform prevederilor din monografie.Se trece
la identificare, evaluare semi-cantitativa si dozare. Dozarea se mai poate efectua
sidupa decuparea petei si eluarea acesteia cu un solvent potrivit conform
prevederilor.Aplicatii ale cromatografiei pe hartie:-

metoda oficiala pt determinarea puritatii radiochimice a substantelor radioactive-

identificarea si dozarea fenobarbitalului din comprimate-

identificarea si puritatea maleatului de ergometrina


7
CROMATOGRAFIA PE STRAT SUBTIRE C.S.S.
Este o metoda ce permite separarea componentelor unui amestec pe baza diferentei
lor dedeplasare de-a lungul unui strat absorbant care acopera o placa de sticla,
metal sau polimer subactiunea unui sistem de solventi.Stratul absorbant constituie
faza stationara si poate avea o grosime de 0,2-0,3 mm pentru scopcalitativ si 1-2
mm pentru scop cantitativ.Separarea evidentiaza un mecanism de adsorbtie,
repartitie, schimb ionic, s.a.Cei mai uzuali adsorbanti ce alcatuiesc faza stationara,
utilizati in C.S.S. sunt:-

silicagelul-

celuloza-

oxidul de Al-

kieser......????Tehnica de lucru: asemanatoare C.H., iar particularitatile sunt


prevazute in monografiarespectiva.In C.H. sau C.S.S. zona de migrare este definita
prin R
f


care reprezinta raportul dintredistantele de migrare ale componentelor si frontul
fazei mobile.Pentru indentificarea substantelor se compara pe aceiasi
cromatograma valoarea R
f
, culoarea sifluorescenta petei obtinute cu solutia probei, cu valoarea R
f
, si culoarea si fluorescenta peteiobtinute cu solutia etalon

a

distanta parcursa de substanta de la pc de aplicate al solutiei pana la centrul petei in
cm b

distanta parcursa de developant de la punctul de aplicare al solutiei si pana la
frontuldevelopantului, trecand prin centrul petei.De obicei, punerea in evidenta a
punctelor de pe cromatograma se efectueaza prin examinareaacestora ca atare, sau
dupa tratarea cu reactivi potriviti in lumina vizibila sau UV.Dozarea substantelor
separate pe cromatograma se efectueaza dupa razuirea petelor respectivesi eluarea
substantelor de pe absorbant cu un solvent potrivit prin spectrometrie.
Comparareavizuala a dimensiunii petelor si a intensitatii coloratiei sau
fluorescentei se foloseste ptevaluarea semi-cantitativa a impuritatilor.Aplicatii:
identificarea teofilinei si papaverinei din supozitoare-

identificarea fenacetinei, cofeinei, aspirinei din comprimate-

determinarea puritatii palmitatului de cloramfenicol, care admite cel mult


2%cloramfenicol neesterificat-

determinarea impuritatilor din tetraciclina


8
CROMATOGRAFIA DE GAZE C.G.
Este o metoda fizico-chimica de separare cromatografica in care faza mobila este
un gaz (gaz purtator), iar faza stationara este un solid sau un lichid cu care este
impregnat un suport solid,inert, aflata intr-o coloana cromatografica, confectionata
de obicei din sticla sau din otelinoxidabil. Faza mobila se deplaseaza continuu prin
coloana, iar la iesire, gazul purtator trece prin detector.Cromatografia de gaz este o
varianta a cromatografiei pe coloana si permite atat separarea substvolatile, cat si a
celor care in urma unor reactii chimice pot fi transformate in derivati volatili
sistabili.Cromatograful de gaze este compus din urmatoarele parti principale:-

sursa de gaz-

camera de evaporare-

coloana cromatografica-

termostatul-

detectorul-

sistemul de inregistrare.Gazul purtator



se deplaseaza cu o viteza constanta prin camera de evaporare, preia proba
deanalizat si o introduce in coloana cromatografica, unde se realizeaza separarea
componentelor.La iesirea din coloana cromatografica, gazul purtator trece
impreuna cu componentele separate prin detector care emite un semnal electric
proportional cu concentratia componentei din fazagazoasa.Detectorul este conectat
la sistemul de inregistrare, iar rezultatele se prezinta sub forma unuigrafic
semnal/timp.Deoarece probele de analizat dizolvate intr-un solvent trebuie sa fie
aduse in stare de vapori,camera de evaporare este incalzita la o temperatura
suficient de ridicata pt a asigura o evaporarerapida si fara a produce o degradare
termica a probelor.Cu ajutorul termostatului in timpul determinarii, temperatura
coloanei cromatografice estementinuta constanta.Faza mobila este constituita dintr-
un gaz inert (He, neon, argon, H) = numite si gaze vector sau purtatoare, care
antreneaza substantele de determinat.Viteza de deplasare a componentelor de-a
lungul coloanei este diferita, fapt ce duce la separareasi la eluarea lor din coloana
intr-o anumita ordine.La iesirea din coloana componentele eluate succesiv de gazul
vector sunt decelate de un aparatde masura (detector) care deosebeste proprietatile
componentelor de cele ale gazului vector si produce un semnal, care se
inregistreaza.
9
Se traseaza o curba in clopot analog unei curbe de distributie Gauss. Varful
cromatografic sau pick-ul corespunde componentei separate, iar inaltimea lui este
proportionala cu concentratiacomponentului in faza gazoasa.Detectia
componentelor din gazul vector se realizeaza cu ajutorul unor
detectoareuniversale/specifice, adica sensibile numai la anumite elemente chimice,
grupe functionale saulegaturi chimice.La baza detectiei sta in principiu orice
proprietate care deosebeste componenta de detectat deeluant.
pectrom
Setruldm as
(m.s.)

cuplat la un gaz cromatograf ofera posibilitatea detectarii unuinr mare de compusi
dintr-un amestec omplex, fiecare compus fiind identificat prin spectrul saude masa,
obtinut prin introducerea eluantului direct in camera de ionizare a spectrometrului
demasa.
G az-cromatogrful


se utilizeaza atat in determinari calitative cat si cantitative; la bazadeterminarilor
cantitative sta relatia de proportionalitate intre aria de sub pick-ul cromatograficsi
cantitatea componentului eluat.
10
CROMATOGRAFIA DE LICHIDE DE INALTA PERFORMANTA(HPLC)
Sub aceasta denumire sunt descrise principalele si cele mai frecvent aplicabile
metode deanaliza cromatografica bazate pe repartitie lichid-lichid, adsorbtie lichid-
solid, schimbator deioni, procese de excludere-difuzie.Cromatografia de lichide
clasica-
pe coloana-

pe strat subtire-

pe hartie

necesita o aparatura simpla dar este destul de lenta cu o capacitate de
separarerelativ mica; detectia componetelor este dificila, costisitoare si necesita
cantitati mari desolvent si pregatiri tehnice laborioase.Cromatografia de gaze s-a
impus ca o metoda rapida, sensibila si a cunoscut o mare extindere prin cuplarea
gaz-cromatografului cu spectrometrul de masa, limitele metodei, insa, fiindimpuse
de conditia volatilizarii produsilor sau a transformarii lor in derivati volatili si
stabilitermic, aspecte ce fac posibile determinari ale unui nr scazut de substante
organice (aprox 15%).Cunostintele dobandite in gaz-cromatografie, transpuse in
practica cromatografiei de lichide aucondus la o tehnica de inalta performanta,
moderna, care se realizeaza cu o viteza mare, sielimina dezavantajele
cromatografiei de gaze, utilizand absorbanti cu o structura fina, semareste
rezistenta la curgere a fazei mobile, si o data cu scaderea vitezei de curgere cresc
timpiide retinere a componentelor pe coloana.In aceste conditii pt realizarea unei
separari eficiente in timpi scurti de analiza trebuie realizate presiuni mari care desi
impun dificultati tehnice legate de o aparatura adecvata, permit separarianalitice,
imposibil de realizat prin alte metode.Aceasta noua tehnica se numeste
cromatografie de lichide la inalta performanta, sau la inalta presiune,sau la inalta
viteza, HPLC.Denumirea la inalta performanta se refera la viteza analizei,
capacitatea de separare,sensibilitatea metodei.In HPLC sunt necesare presiuni mari
de cateva sute de atmosfere pt a asigura debitecorespunzatoare ale fazei
mobile.Avand in vedere ca granulatia fazei stationare in HPLC moderne este foarte
mica, (diametrul particulelor = 3

10
μ)
aparatura utilizata este mai complicata si foarte scumpa.Avantaje HLPC

comparativ cu C.G.:-

substantele de analizat nu trebuie sa fie volatile-

majoritatea separarilor se pot efectua la temperatura obisnuita-

timpi scurti de analiza


11
-

conditii de lucru simple pt pregatirea probelor, efectuarea analizei si prelucrarea


datelor -

polaritatea fazei mobile si a fazei stationare poate fi variataIn HPLC



separarea componentelor dintr-un amestec se bazeaza pe distribuirea lor intre 2
faze,iar mecanismele care stau la baza separarii definesc si tipurile de HPLC:-

HPLC de absorbtie-

HPLC Cu faze inverse-

HPLC de repartitie-

HPLC prin schimb ionic-

HPLC prin ecluziune molecularaTehnica de lucru: in fiecare monografie care


utilizeaza tehnica HPLC sunt prevazutecaracteristicile coloanei cromatografice
(tipuri, lungimea, diametrul interior, natura fazeistationare, dimensiunea
particulelor etc) si conditiile de cromatografiere (concentratia solutieide analizat,
concentratia solutiei standard, volumele de injectat din fiecare solutie, compozitia
sidebitul fazei mobile, temperatura, modul de lucru, sistemul de detectare).Cu
ajutorul solutiilor sandard se regleaza aparatul si se determina volumul solutiilor de
injectat pentru a obtine un raspuns convenabil al detectorului. Se determina
suprafata si inaltimea pick-urilor componentelor, iar din valorile obtinute se
calculeaza concentratiacomponentei/componentelor de determinat.Gradul de
separare a 2 suprafete intr-o cromatograma se defineste prin notiunea de
rezoluti
.(
R
s
)

alt parametru.Aplicatii HLPC:-

standardizarea si verificarea medicamentelor (puritate, stabilitate, analiza


cantitativa sicalitativa)

la analgezice, aspirina, fenacetina, acetaminofen, anestezice, procaina,lidocaina,
tetracaina, antihistaminice, pseudoefedrina, clorfeniramin, steroizi, prednisolon,
corticosteron, progesteron, narcotice si metabolitii lor, antibiotice(tetracicline)-

izolarea principiilor active din produsele vegetale-

determinarea concentratiei medicamentelor in sange si urina.


12
SPECTROMETRIA DE MASA (M.S.)
Metoda de analiza care se bazeaza pe fragmentarea moleculelor substantelor
organice la energiimari de pana la 100 V, iar numarul, sarcina si masa fragmentelor
rezultate dau informatii asuprastructurii si identitatii substantelor cercetate.De
regula, detectia compusilor organici, inclusiv medicamentosi, nu se face prin
sepctrometriede masa decat daca ei se afla in stare pura.Din aceste considerente,
spectrometria de masa se utilizeaza in cuplaj cu H.P.L.C. sau/si C.G.legand capatul
de iesire al coloanei cromatografice la camera de ionizare a unui spectrometru
demasa. In acest fel se poate analiza fiecare fractiune (pick) care iese din coloana
cromatografica pe masura ce avanseaza elutia, inclusiv in cazul urmelor de
substante existente in proba.Fragmentarea moleculelor

este determinata de acumularea de energie care produce rupereaunor legaturi
interatomice, proces din care rezulta mai ales ioni pozitivi, rar negativi, radicali
simolecule neutre.Deoarece fragmentarea produce mai ales ioni pozitivi,
fragmentele sunt purtatoare de sarcina,au masa determinata si se pot caracteriza
prin raportul dintre masa lor si sarcina. (m/z)Pentru a putea produce fragmentarea
moleculelor, substanta care trebuie analizata se aduce instare gazoasa, se introduce
intr-o camera de ionizare, in care se produce fragmentarea, iar fragmentele sunt
accelerate de un camp electric si supuse unuiproces de separare, in functie
devaloarea raportului m/z si concentrata pe un colector inregistrandu-se abundenta
lor relativa.Toate operatiunile se efectueaza in vid inaintat.