TP de Microbiologie

Travaux Pratiques 2

de Microbiologie 1ère Année Filière Ingénieur : Coloration Gram

positif/Gram négatif

1. Principe :

Certains genres de bactéries ont en commun une membrane qui retient certains colorants. Ces
genres forment le groupe des bactéries Gram positif (Gram+). Toutes les autres bactéries soit
qu'elles n'ont pas de membrane soit que la nature de leur membrane est totalement différentes
se laissent décolorer par la méthode de Gram. Elles sont dites Gram négatif (Gram-).

2. Matériel utilisé :

La manipulation est réalisée par groupe d’étudiants. Chaque groupe doit avoir un prélèvement
du sol, une lame dégraissée, une pince à lame, un Bec Bunsen, pissette d’alcool absolu,
pissette d’éau, Microscope biologique avec immersion, colorants. La blouse blanche et les
gans sont obligatoires pour chaque étudiant.

 Préparation des colorants :

Violet phéniqué (Nicole) :

On mélange 1 gramme de violet de gentiane (cristal violet) avec 10 ml d’alcool absolu dilué
avec 90 ml d’eau phéniquée à 1%.

Liquide de Lugol (IKI) :

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1 g d’iode et 2 g d’iodure de potassium sont dilués avec 300 ml d’eau distillée.

Solution de Fuchsine :

Une solution de fuchsine saturée dans 10 ml d’alcool est mélangée avec 90 ml d’eau distillé

3. Protocole expérimental

1.1. Etalement :

L'étalement doit se faire en couche mince, sur une lame dégraissée.

1.2. Dessiccation :

Il faut laisser sécher l’échantillon à l'air libre.

1.3. Fixation :

Passer trois fois rapidement dans la flamme du bec Bunsen la face de la lame opposée à
l'étalement. Ne pas trop insister sous peine de carboniser le prélèvement.
On peut également fixer en laissant évaporer quelques gouttes d'alcool méthylique versées
directement sur le prélèvement. A ce stade, les germes ne sont plus considérés comme
contaminants.

1.4. Coloration de Gram :

ETAPE 1 : coloration par le violet de gentiane

L’action combinée du violet de gentiane et du lugol (appelé mordanceur car il renforce

l'action du violet de gentiane) forme un complexe chimique qui colore le cytoplasme de
toutes les bactéries en violet.

ETAPE 2 : décoloration par l’alcool

La paroi bactérienne de Gram positif est imperméable à l'alcool les bactéries restent
colorées en violet.

La paroi bactérienne Gram négatif est perméable à l'alcool (du fait de sa constitution chimique
différente et d'une différence d'épaisseur): l'alcool pénètre dans les bactéries et décolore leur
cytoplasme: les bactéries deviennent "incolores".
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ETAPE 3 : Récoloration par la fuchsine

Les bactéries à paroi imperméable à l'alcool « ne prennent pas » la fuchsine, elles

restent colorées en violet et sont dites à Gram positif.

Les bactéries à paroi perméable à l'alcool, qui ont été décolorées, sont recolorées par la
fuchsine. Elles sont colorées en rose et sont dites à Gram négatif.

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4. Travail demandé pour le compte rendu

A la fin de la dissection, chaque groupe d’étudiants doit avoir un compte rendu contenant:

1- Titre de l’expérience
2- Objectif de l’expérience
3- Matériel utilisé pour la réalisation de l’expérience
4- Méthode utilisée pour réaliser l’expérience
5- Description détaillée des résultats obtenus
6- Conclusion