Sunteți pe pagina 1din 7

Știința mediului total 763 (2021) 144587

Liste de conținut disponibile la ScienceDirect

Știința mediului total

pagina noastră de pornire: www.el sev i er .com / l ocate / sc i totenv

Ef fi detecția științifică a ARN-ului SARS-CoV-2 în fracțiunea solidă a apelor uzate


Kouichi Kitamura A , ⁎ , Kenji Sadamasu b , Masamichi Muramatsu A , Hiromu Yoshida A
A Departamentul de Virologie II, Institutul Național de Boli Infecțioase, 4-7-1 Gakuen, Musashi-murayama, Tokyo 208-0011, Japonia
b Departamentul de Microbiologie, Tokyo Metropolitan Institute of Public Health, 3-24-1 Hyakunin-cho, Shinjuku-ku, Tokyo 169-0073, Japonia

EVIDENȚE ABSTRACT GRAFIC

• Au fost evaluate ARN-urile SARS-CoV-2 din apele


uzate dintr-o gură de vizitare și două WWTP-uri
din Japonia.
• Patru metode de recuperare a virusului au fost
comparate pentru detectarea SARS-CoV-2
învelită.
• ARN-urile SARS-CoV-2 au fost ef fi detectate în
mod eficient în fracțiunea solidă a apelor
uzate.
• Sensibilitatea de detectare a fost mai mare atunci
când s-a utilizat testul duplex RT-qPCR.
• Concentrațiile virale de ARN au arătat o
corelație cu numărul de cazuri în zonele cu
prevalență ridicată.

articolinfo abstract

Istoricul articolului: În contextul pandemiei bolii coronavirus 2019 (COVID-19), supravegherea mediului pentru detectarea SARS-CoV-2 a
Primit la 1 noiembrie 2020 devenit din ce în ce mai importantă. Studiile au demonstrat că SARS-CoV-2 ARN este prezent în fecalele persoanelor
Primit sub formă revizuită 10 decembrie 2020
infectate; în plus, a fost raportată prezența sa în apele uzate. Cu toate acestea, o metodă optimizată pentru
Acceptat 12 decembrie 2020
detectarea acesteia în canalizare nu a fost încă investigată în mod adecvat. Prin urmare, în acest studiu, ef fi a fost
Disponibil online 18 decembrie 2020
investigată detecția eficientă a ARN-ului SARS-CoV-2 în fracția solidă a apelor uzate folosind două teste PCR
Editor: Damia Barcelo cantitative. În special, probele de apă uzată au fost colectate dintr-o gură de vizualizare situată în districtul comercial
al unei regiuni metropolitane din Japonia, unde COVID-19 este foarte răspândită, și două stații de epurare a apelor
Cuvinte cheie: uzate (stații de epurare). Probele au fost concentrate folosind patru metode separate, și anume, adsorbția
SARS-CoV-2 electronegativă a membranelor, precipitarea polietilenglicolului, ultra fi ltrare și precipitare solidă. Fiecare metodă a
COVID-19 dezvăluit un semn fi Concentrația cant a ARN-ului virusului piperului ușor (PMMoV), care este un virus indicator
Ape uzate pentru apele uzate. Așa cum era de așteptat, ARN PMMoV neînvelit a fost îmbogățit în fracția supernatantă astfel
Canalizare
încât au fost detectate concentrații relativ scăzute în fracția solidă a probelor de apă uzată. În schimb, concentrațiile
Supravegherea mediului
mai mari de SARS-CoV-2ARN au fost detectate în mod constant în fracțiile solide comparativ cu fracțiile supernatante
pe baza celorlalte metode care au fost investigate în acest studiu. Testele de corelație ale lui Spearman au arătat că
concentrațiile de ARN SARS-CoV-2 în probele de apă uzată de la stația de epurare erau semnificative fi corelat cantly
cu numărul de cazuri COVID-19 înregistrate în perioada de colectare a datelor. Aceste rezultate demonstrează că
recuperarea virală din fracțiunea solidă este o metodă eficientă pentru supravegherea ARN SARS-CoV-2 într-un
mediu apos.
© 2020 Autorul (autorii). Publicat de Elsevier BV Acesta este un articol cu acces liber sub licența CC BY ( http: //
creativecommons.org/licenses/by/4.0/ ).

1. Introducere

⁎ Autor corespondent la: Departamentul de Virologie II, Institutul Național de Boli Infecțioase,
filiala Murayama, 4-7-1 Gakuen, Musashi-murayama, Tokyo 208-0011, Japonia. Boala coronavirusului 2019 (COVID-19), care este cauzată de sindromul
Adresa de e-mail: kkita@nih.go.jp (K. Kitamura). respirator acut sever coronavirus 2 (SARS-CoV-2), are

https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2020.144587
0048-9697 / © 2020 Autorul (autorii). Publicat de Elsevier BV Acesta este un articol cu acces liber sub licența CC BY ( http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ ).
K. Kitamura, K. Sadamasu, M. Muramatsu și colab. Știința mediului total 763 (2021) 144587

să devină o pandemie globală continuă. Infecțiile presimptomatice și probele au fost ținute congelate la - 20 ° C până la analiză în termen de 10 zile de la
asimptomatice sunt frecvent observate în cazurile de infecție COVID-19, ceea ce colectare.
face ca supravegherea pe pacient să fie diferită fi cult. Simptomele sunt în principal
boli respiratorii; cu toate acestea, s-a raportat că unii pacienți manifestă diaree și 2.2. Metode de recuperare a virusului și extracția ARN-ului
greață ( Wang și colab. 2020 ), sugerând o infecție gastro-intestinală cauzată de
SARS-CoV-2. De asemenea, s-a raportat că enterocitele infectate cu SARS-CoV-2 din Recuperarea virusului din probele de ape uzate colectate a fost efectuată
intestinul subțire, împreună cu virusul, sunt vărsate prin fecale ( Wolfel și colab. folosind patru metode, și anume, adsorbția electronegativă a membranei,
2020 ; Xu și colab. 2020 ; precipitarea polietilen glicolului (PEG), ultra fi ltrare și precipitații solide. Mai întâi,
Zhang și colab. 2020 ). Signi fi s-au detectat copii ale ARN-ului SARS-CoV-2 în fecalele 400 mL din fiecare probă au fost centrifugate la 3000 rpm (1840 × g) timp de 30
atât ale persoanelor simptomatice, cât și ale celor asimptomatice ( Mizumoto și min. Detaliile privind separarea supernatantului și sedimentului în fiecare metodă
colab. 2020 ; Nishiura și colab. 2020 ; Treibel și colab. 2020 ), chiar și după sunt după cum urmează. 1) După pre fi lter tratament folosind un fi cu o dimensiune
recuperarea după simptome respiratorii ( Y. Wu și colab. 2020 ; Zheng și colab. 2020 ). a porilor de 1,0 μ m, 300 ml de supernatant rezultat au fost concentrați de 100 de
Prin urmare, epidemiologia pe bază de ape uzate (WBE) este considerată o ori utilizând metoda de adsorbție a membranei electronegative ( Ozawa și colab.
abordare eficientă pentru monitorizarea prevalenței SARSCoV-2 ( Kitajima și colab. 2019 ). PH-ul probelor a fost ajustat la 3,5 folosind 0,5NHCl, după care probele au
2020 ). Prezența ARN-ului SARS-CoV-2 a fost, de asemenea, detectată în apele uzate fost trecute printr-o membrană electronegativă (0,45 μ Dimensiunea Mpore). Virușii
din Australia, Italia, Spania, Olanda și SUA ( Ahmed și colab. 2020a ; La Rosa și colab. adsorbiți au fost eluați cu soluție de extract de carne de vită 3%. Mai mult, folosind
2020b ; o treime din eluția totală de 3 ml, extragerea ARN a fost efectuată utilizând kitul
Medema și colab. 2020 ; Peccia și colab. 2020 ; Randazzo și colab. 2020 ; Rimoldi și QIAamp UltraSens Virus (Qiagen, Hilden, Germania) conform instrucțiunilor
colab. 2020 ; F. Wu și colab. 2020 ). Unele dintre probele de apă uzată au arătat o producătorului. 2) În ceea ce privește precipitațiile PEG, s-au utilizat 30 ml de
corelație între concentrațiile de ARN SARS-CoV-2 în canalizare și numărul de cazuri supernatant ( Ahmed și colab. 2020b ; F. Wu și colab. 2020 ). La supernatant s-au
clinice COVID-19 ( Ahmed și colab. 2020a ; adăugat PEG8000 și NaCl fi concentrațiile nale au fost de 10% și, respectiv, 1 M) și
Medema și colab. 2020 ; Peccia și colab. 2020 ). În Japonia, SARS-CoV-2 ARN a fost fi primul
incubate la 4 ° C peste noapte cu agitare ușoară. După centrifugare la 10.000 × g timp
raportat în mediul apos din prefectura Yamanashi, deși numărul de copii detectate de 30 min, precipitantul PEG a fost dizolvat în 500 μ L de PBS. Folosind 300 μ L din
a fost foarte scăzut, deoarece zona de prelevare a avut o prevalență scăzută de această soluție, ARN a fost extras folosind kitul QIAamp de ARN viral (Qiagen)
COVID-19 ( Haramoto și colab. 2020 ). Supravegherea mediului este utilizată pe conform instrucțiunilor producătorului. 3) A realiza ultra fi Ltrarea, 24 ml de
scară largă în monitorizarea virusurilor enterice, cum ar fi norovirusul și supernatant de la centrifugarea inițială au fost concentrate prin ultra fi ltrare
poliovirusul. Acești viruși neînveliți sunt excretați și prin fecale și a fost raportată folosind Amicon Ultra-15 (greutate moleculară limită 30 kDa; Merck Millipore Ltd.
prezența lor în apele uzate în concentrații mari ( Haramoto și colab. 2018 ). Cu toate Sydney, Australia) ( Ahmed și colab. 2020b ). Probele au fost apoi centrifugate la
acestea, concentrațiile de ARN SARS-CoV-2 în apele uzate sunt considerate a fi mai 4700 × g timp de 10 minute pentru a le concentra la aproximativ 200 μ L. ARN a fost
mici decât cele ale virusurilor enterice cu un factor de 10 până la 100 ( Hata și apoi extras din probele concentrate folosind un kit RNeasy Microbiome (Qiagen)
Honda 2020 ). Au fost dezvoltate mai multe metode pentru recuperarea virușilor conform instrucțiunilor producătorului. 4) În ceea ce privește precipitațiile solide,
din apele uzate pentru virușii neînveliți, în timp ce metodele optimizate pentru ca fracțiune solidă s-a folosit sedimentul din centrifugarea inițială conținând atât
virușii înveliți, cum ar fi coronavirusurile, nu au fost încă suficiente fi cercetat cu materiale solide, cât și semisolide. Aproximativ 4 mL din fracția solidă s-au obținut
atenție ( La Rosa și colab. 2020a ). Deși virușii înveliți, inclusiv SARS-CoV-2, pot fi din 400 mL din proba inițială de canalizare și s-au folosit pentru a efectua extracția
detectați utilizând metode care sunt utilizate în mod normal pentru detectarea ARN folosind kitul RNeasy PowerSoil (Qiagen) conform instrucțiunilor
virușilor neînveliți, metode fiabile pentru ef fi cient quanti fi sunt necesare cationarea producătorului.
SARS-CoV-2 în apele uzate ( Carducci și colab. 2020 ; Rusinol și colab. 2020 ). Recent,
a fost raportată prezența ARN-ului SARS-CoV-2 în fracția solidă a apelor uzate în
plus față de fracția supernatantă care este de obicei utilizată în supravegherea
mediului poliovirus ( Institutul de Sănătate Publică al Orașului Yokohama și
Institutul Național de Boli Infecțioase 2020 ). În acest studiu, au fost analizate 32 de 2.3. Performanța testelor RT-qPCR
eșantioane de ape uzate colectate din stațiile de tratare a apelor uzate și a apelor
uzate (stații de epurare) din regiunea ametropolitană din Japonia în perioada 9 Pentru a cuantifica SARS-CoV-2 ARN, două teste RT-qPCR, NIID_2019nCoV_N (în
iunie - 19 august 2020 și au fost comparate patru metode de recuperare a ARN pe continuare, NIID_N2) ( Shirato și colab. 2020 ) și o combinație între CDC
baza a două teste cantitative de PCR pentru SARS-CoV-2 detectare. Rezultatele 2019-nCoV_N1 și CDC 2019-nCoV_N2 (CDC_N1N2) ( Centre pentru controlul și
sugerează că fracția solidă obținută după centrifugarea inițială a probelor de apă prevenirea bolilor 2020 ), au fost efectuate. Amorsele și sondele, cu secvențe listate
uzată colectate conține concentrații mai mari de ARN SARS-CoV-2 decât fracția în Tabelul S1, au fost achiziționate de la Takara Bio (Kusatsu, Japonia).
supernatantă. Amestecurile de reacție au fost preparate folosind One Step PrimeScript III
RT-qPCR Mix (Takara Bio) pentru testul NIID_N2 și SARS-CoV-2 Direct Detection
RT-qPCR Kit (Takara Bio) pentru testul CDC_N1N2. Ciclarea termică a fost efectuată
cu un ciclor termic rapid ABI 7500 (Thermo Fisher Scienti fi c, MA, SUA), iar condițiile
de ciclare termică pentru ambele teste RT-qPCR au fost după cum urmează:
2. Materiale și metode incubația inițială la 50 ° C timp de 30min și denaturarea inițială la 95 ° C timp de
5min, urmată de 45 de cicluri de denaturare la 95 ° C timp de 15 s, iar reacția de
2.1. Colectarea probelor de ape uzate recoacere și extindere a grundului la 60 ° C timp de 60 s.

Un total de 32 de eșantioane de ape uzate (500 ml fiecare) au fost colectate Tulpina izolată anterior, JPN / TY / WK-521 (furnizată de Dr. Nagata, Institutul
săptămânal dintr-o gură de vizitare (gura de vizitare A, n = 10) și două stații de Național de Boli Infecțioase) ( Matsuyama și colab. 2020 ), a fost folosit pentru a
tratare a apelor uzate (WWTP B, n = 11 și WWTP C, n = 11) într-o regiune compara cele două teste RT-qPCR. ARN a fost extras din izolatul stocat folosind
metropolitană din Japonia din 9 iunie până în 19 august 2020, cu excepția kitul QIAampVirus RNA (Qiagen) și analizat prin teste RT-qPCR folosind seturi
eșantionului care a fost colectat în a 10-a săptămână din gura de vizitare A, care se NIID_N2 și CDC_N1N2.
află într-un district comercial caracterizat printr-o prevalență ridicată a COVID-19 și
în amonte de stația de epurare B. Eșantioanele din Stațiile de epurare au fost 2.4. Control de calitate
colectate de la fl uent, care a fost considerat ape uzate brute. Toate probele au fost
colectate în sticle de plastic sterile și transportate imediat la laborator. În timpul ARN-urile cu virusul blând al piperului (PMMoV) din probele de apă uzată au
transportului, fost cantități fi ed prin RT-qPCR folosind One Step PrimeScript ™ III RT-qPCR

2
K. Kitamura, K. Sadamasu, M. Muramatsu și colab. Știința mediului total 763 (2021) 144587

Se amestecă (Takara Bio) ca control intern ( Kitajima și colab. 2018 ). Secvențele 3. Rezultate
corespunzătoare de primer și sondă sunt listate în Tabelul S1 ( Haramoto și colab.
2013 ; Zhang și colab. 2006 ). Condițiile de ciclare termică pentru testul PMMoV 3.1. Detectarea SARS-CoV-2 ARN în canalizare din diferite locații de prelevare și
RT-qPCR au fost după cum urmează: incubația inițială la 50 ° C timp de 30 min și prin diferite metode
denaturarea inițială la 95 ° C timp de 30 s, urmată de 45 de cicluri de denaturare la
95 ° C timp de 5 s și recoacere grund și reacție de extindere la 60 ° C timp de 60 s. Dintr-un total de 32 de probe de apă uzată, ARN-urile SARS-CoV-2 au fost
Având în vedere că PMMoV este un virus neînvelit, spre deosebire de SARS-CoV-2, recuperate folosind patru metode și cantități fi folosind două teste RT-qPCR ( tabelul
rezultatele cantităților fi cation nu au fost folosite pentru a calcula ef fi eficiența 1 ). Concentrațiile de ARN de SARS-CoV-2 nule sau scăzute au fost detectate în
recuperării virusului și RTqPCR, dar pentru a verifica pierderea substanțială a probele care au fost extrase folosind adsorbția membranei electronegativ,
detectării SARS-CoV-2. precipitații PEG și ultra fi ltrare. În schimb, ARN-urile virale cu concentrații în
Toate testele RT-qPCR pentru SARS-CoV-2 și PMMoV au fost efectuate în intervalul 1,6 × 10 2 - 1,3 × 10 4 copii genice / L au fost ef fi detectat în mod conștient și
duplicate și au inclus controale standard negative și pozitive. Pentru a obține constant în fracțiunile solide. Rezultatele RT-qPCR corespunzătoare fracțiilor solide
curbele standard pentru ambele teste, a fost pregătită o serie de diluție de 10 ori a obținute folosind cele două seturi de testare NIID_N2 și CDC_N1N2 sunt rezumate
ARN-urilor standard; 5 × 10 0 - 5 × 10 2 și 5 × 10 4 - 5 × 10 6
în Fig. 1 . Ambele seturi au prezentat tendințe similare în ceea ce privește
copii / reacții genetice pentru SARS-CoV-2 și respectiv PMMoV. Limita de canti fi valoareapozitivitatea; cu toate acestea, testul CDC_N1N2 a arătat un număr mai mare de
cationului pentru SARS-CoV-2 a fost stabilită ca fi am copiat / reacție genică ( Fig. 1 ), copii comparativ cu testul NIID_N2 în aproape toate eșantioanele pozitive. Nu s-a
iar reacțiile care conțin mai puțin de patru copii ale genelor au fost ocazional ampli fi detectat ARN SARS-CoV-2 în cadrul fi primele două săptămâni din perioada de
ed într-unul dintre duplicate, care a fost considerat negativ. Pentru a evita colectare a eșantionului (9 iunie - 17) la oricare dintre cele trei site-uri de colectare. fi
contaminarea, extracția ARN și pregătirea RTqPCR au fost efectuate în laboratoare Prima detectare, care a fost făcută în a treia săptămână, pe 23 iunie, a corespuns
separate, iar amestecurile RT-qPCR au fost preparate pe o bancă curată, cu unui eșantion din gura de vizitare A. ARN-urile virale au fost detectate continuu în
excepția adăugării șablonului. eșantioanele din gura de evacuare A și WWTP B după săptămâna a treia și
respectiv a șasea. În special, stația de epurare B este în aval de gura de vizitare A și
este situată într-o zonă cu prevalență COVID-19 ridicată. În schimb, WWTP C este
2.5. Secvențierea RT-PCR și Sanger localizat într-o zonă cu prevalență scăzută a COVID 19, iar eșantioanele din această
stație de epurare rareori au arătat prezența SARS-CoV-2 ARN. În plus, pentru a
ARN-urile din probele de canalizare au fost transcrise invers cu SuperScript IV valida prezența SARS-CoV-2 ARN în fracția solidă, s-au efectuat analize de
(Thermo Fisher Scienti fi c) conform instrucțiunilor producătorului, iar ADNc-urile secvențiere folosind probe de ARN care au prezentat concentrații mari. Ampli fi fragmentele
rezultate au fost ampli fi ed prin PCR imbricat utilizând EmeraldAmp PCR Master ed din RT-PCR au fost analizate prin efectuarea secvențierii Sager, iar secvențele
Mix (Takara Bio). fi Prima și a doua condiție de PCR au fost aceleași după cum SARS-CoV-2 ale regiunilor de proteine ORF1a și S s-au dovedit a fi 99 - 100% identic
urmează: denaturarea inițială la 94 ° C timp de 1 min, urmată de 40 de cicluri de cu tulpina izolată anterioară izolată (Fig. S1). Frecvența de mutație scăzută ar putea
denaturare la 94 ° C timp de 30 s, recoacerea primerului la 56 ° C timp de 30 s și fi atribuită valorii ridicate fi delity al ARN polimerazei SARS-CoV-2.
reacția de extensie la 68 ° C timp de 60 s. Produsele PCR au fost analizate prin
secvențierea directă utilizând metoda Sanger. Secvențele primer sunt listate în
Tabelul S1 ( Shirato și colab. 2020 ).
3.2. Controlul intern al probelor de ape uzate
2.6. analize statistice
Virusul plantelor, PMMoV, este foarte abundent în apele uzate ( Kitajima și
Numărul total de cazuri COVID-19, pe baza con fi data rmării și data apariției, a colab. 2018 ). Pentru a evalua procedura de detectare a virusului, numărul de copie
fost obținută din data de fi portalul de informații financiare al guvernului PMMoV a fost, de asemenea, analizat ca un control intern al analizelor RTqPCR de
metropolitan ( Guvernul metropolitan Tokyo 2020 ) și s-au calculat medii de șapte apă uzată ( Haramoto și colab. 2013 ; Kitajima și colab. 2018 ; Rosario și colab. 2009 ; Symonds
zile. Un test de corelare a rangului Spearman a fost efectuat folosind GraphPad și colab. 2018 ; Zhang și colab. 2006 ). Rezultatele au demonstrat semnificații fi concentrațiile
Prism8. Signi fi diferența de cant de la zero a fost de fi numit ca p <0,05. cant de ARN PMMoV în toate probele testate (Tabelul S2 și Fig. 2 ), validând
metodele de recuperare a virusului, fără efecte dăunătoare care ar putea fi
atribuite inhibitorilor PCR prezenți în apele uzate. Concentrațiile de ARN PMMoV
au arătat tendințe similare pentru probele de ape uzate de la WTP-urile B și C.
Cămin de vizitare A SEAR B Stația de epurare C
Fracția supernatantă (de la absorbția electronică a membranelor, precipitații PEG
și ultra fi ltrarea) probelor din cele două WWTP au arătat concentrații mult mai mari
de ARN PMMoV (8,2 × 10 6 - 3,1 × 10 8 copii ale genei / L) decât fracțiile solide (1,6 × 10 2
- 1,0 × 10 7 copii ale genei / L). Probele din gura de vizitare A au arătat o
concentrație de ARN PMMoV care a fost cu un ordin de mărime mai mare decât
cele corespunzătoare probelor colectate din cele două stații de epurare. Această
diferență ar putea fi cauzată de apele uzate din gura de vizitare care conțin un
raport mai mare de excremente umane decât cele din fl apele uzate ale stațiilor de
epurare, care sunt situate în aval.

3.3. Sensibilitățile celor două teste RT-qPCR la tulpina izolată și proba de apă uzată

Fig. 1. Quanti fi cation de ARN SARS-CoV-2 în fracțiunea solidă a probelor de apă uzată. Probele au Rezultatele obținute au arătat că CDC_N1N2 a detectat întotdeauna
fost colectate săptămânal din gura de vizitare A (roșu), WWTP B (albastru) și WWTP C (verde). Au concentrații mai mari de ARN SARS-CoV-2 în probele de canalizare comparativ cu
fost efectuate două teste RT-qPCR diferite, (A) NIID_N2 și (B) CDC_N1N2. Valorile sunt prezentate
NIID_N2 ( tabelul 1 și Fig. 1 ). Pentru comparație, diluțiile seriale de ARN extrase din
sub forma numărului de copii ale genei ARN SARS-CoV-2 pe așternut de apă uzată (gc / L).
tulpina izolată anterior, JPN / TY / WK-521, au fost cantități fi folosind cele două
Punctele reprezintă probe colectate săptămânal, iar liniile punctate reprezintă limita cantităților fi cation.
teste RT-qPCR. Cele două teste au prezentat sensibilități similare în ceea ce
privește ARN-ul viral izolat, chiar și la

3
K. Kitamura, K. Sadamasu, M. Muramatsu și colab. Știința mediului total 763 (2021) 144587

Cămin de vizitare A SEAR B Stația de epurare C 3.4. Asocierea între concentrația de ARN SARS-CoV-2 și numărul de cazuri de
COVID-19

În perioada de colectare a probelor, a „ al doilea val ” a epidemiei COVID19 a


fost asistată în Japonia din iunie 2020. Fig. 4 prezintă un rezumat al numărului de
cazuri COVID-19 pe baza con fi data rmației și data debutului. În special, așa cum se
arată în Fig. 4 B, numărul de cazuri raportate de COVID-19 a fost mai mic de 50 pe zi
la începutul perioadei de colectare a probelor, adică 9 iunie. Cazurile raportate au
crescut treptat până la începutul lunii august, cu un vârf de aproximativ 500 de
cazuri pe zi. Seriile temporale de concentrații de ARN SARS-CoV-2 în probe de ape
uzate din gura A și WTP B, în care au fost detectate constant ARN-ul viral, au fost
reprezentate în paralel ( Fig. 4 A). Analiza de corelație a lui Spearman a relevat un
semn fi corelație cant între numărul de cazuri COVID-19 și concentrația de ARN viral
în stația de epurare B ( Fig. 4 D). Analiza a indicat o coeficiență de corelație mai
mare fi cient (r = 0,87; p <0,001) între concentrația de ARN viral din stația de epurare
B și numărul de cazuri noi de COVID 19 pe baza datei de debut mai degrabă decât
a datei raportate (r = 0,71; p <0,01).

Fig. 2. Quanti fi cation de ARN PMMoV în apele uzate. Probele au fost colectate săptămânal din
gura de vizitare A (roșu), WWTP B (albastru) și WWTP C (verde). ARN-urile au fost recuperate 4. Discutie
folosind patru metode: adsorbție cu membrană electronegativă, precipitare PEG, ultra fi ltrare și
precipitații solide. Valorile sunt prezentate ca număr de copii ale genei ARN PMMoV pe litru de
apă uzată (gc / L). Punctele reprezintă probe colectate săptămânal. Eroarea medie și standard a
În acest studiu, au fost comparate patru metode de recuperare a virusului
mediei (SEM) sunt indicate folosind bare, iar detaliile sunt prezentate în Tabelul S2. pentru detectarea SARS-CoV-2 în probele de apă uzată. Metoda de recuperare /
concentrare a virusului care implică utilizarea membranelor electronegativ este o
procedură tipică care a fost utilizată pentru a realiza supravegherea națională a
poliovirusului în Japonia. Precipitații PEG și ultra fi Ltrarea este, de asemenea,
concentrații sub 10 copii pe reacție ( Fig. 3 ). Spre deosebire de proba izolată, eficientă în realizarea supravegherii poliovirusului, precum și a altor enterovirusuri
cantitatea de test CDC_N1N2 fi a editat un număr mai mare de exemplare pentru ( Kitajima și colab. 2020 ). Cu toate acestea, în acest studiu, aceste trei metode au
SARS-CoV-2 ARN din probele de canalizare. avut o performanță slabă în detectarea SARS-CoV-2 ARN în

tabelul 1
Quanti fi cation de ARN SARS-CoV-2 în apele uzate.

Locul de prelevare Data eșantionării Metoda de concentrare și testul RT-qPCR (copii ale genei / L)

Fracție solidă Membrana electronegativă Precipitații PEG Ultra fi ltrare

NIID_N2 CDC_N1N2 NIID_N2 CDC_N1N2 NIID_N2 CDC_N1N2 NIID_N2 CDC_N1N2

Cămin de vizitare A 9-iunie-20 nd nd nd nd nd nd - -


16-iunie-20 nd nd nd nd nd nd - -
23-iunie-20 1.8.E + 03 9.2.E + 03 nd nd nd nd nd nd
2-iul-20 2.2.E + 02 7.4.E + 02 nd nd - - - -
7-iul-20 4.6.E + 02 2.4.E + 03 nd nd nd nd nd nd
14-iul-20 1.7.E + 03 7.0.E + 03 nd nd 2.0.E + 03 4.1.E + 03 - -
21-iul-20 4.9.E + 02 9.0.E + 03 nd nd - - nd nd
28-iul-20 5.5.E + 02 4.4.E + 02 nd nd - - nd nd
4 august 20 1.0.E + 03 3.4.E + 03 nd nd nd nd - -
18-aug-20 7.0.E + 02 2.0.E + 03 nd nd - - nd nd
SEAR B 10-iunie-20 nd nd nd nd nd nd - -
17-iunie-20 nd nd nd nd nd nd - -
24-iunie-20 nd nd nd nd nd nd - -
3-iul-20 nd 2.5.E + 02 nd nd - - - -
8-iul-20 1.6.E + 02 nd nd nd nd nd nd nd
15-iul-20 nd 1.3.E + 04 nd nd nd nd - -
22-iul-20 nd 3.1.E + 03 nd nd - - nd nd
29-iul-20 1.8.E + 03 5.7.E + 03 nd nd - - nd nd
5 august 20 7.0.E + 02 1.7.E + 03 nd 3.9.E + 02 1.7.E + 03 nd nd nd
12-aug-20 3.4.E + 02 1.1.E + 03 nd nd nd 1.0.E + 03 nd nd
19-aug-20 5.1.E + 02 1.0.E + 03 nd 1.1.E + 02 - - nd nd
Stația de epurare C 10-iunie-20 nd nd nd nd nd nd - -
17-iunie-20 nd nd nd nd nd nd - -
24-iunie-20 nd nd nd nd nd nd - -
3-iul-20 nd nd nd nd - - - -
8-iul-20 nd nd nd nd - - nd nd
15-iul-20 nd nd nd nd nd nd - -
22-iul-20 nd nd nd nd - - nd nd
29-iul-20 nd nd nd nd - - nd nd
5 august 20 nd 4.6.E + 02 nd nd nd nd nd nd
12-aug-20 nd 3.2.E + 02 nd nd nd nd - -
19-aug-20 nd nd nd nd - - nd nd

nd: nu a fost detectat.


-: nu este testat.

4
K. Kitamura, K. Sadamasu, M. Muramatsu și colab. Știința mediului total 763 (2021) 144587

ARN PMMoV a fost detectat în probele de supernatant obținute în urma acestor


trei metode, indicând faptul că concentrația mai mică de SARS-CoV-2 nu se
datorează eșecului recuperării virusului sau prezenței materialelor inhibitoare PCR
în apele uzate. De fapt, datele colectate au indicat faptul că fracțiunea solidă
conținea ARN PMMoV mai mic și ARN SARS-CoV-2 mai mare. Acest lucru ar putea fi
explicat prin absența unui plic pentru PMMoVRNA și prezența unui plic pentru
SARS-CoV-2. În
fi primul raport privind detectarea SARS-CoV-2 în apele uzate din Italia, adăugarea
fracției solide din procesul inițial de centrifugare la precipitantul PEG a dus la ef fi detecția
științifică a ARN-ului viral ( La Rosa și colab. 2020b ). Cel mai recent, a fost raportată
detectarea numărului mare de copii ale ARN-ului SARS-CoV-2 în nămolul primar de
la stațiile de epurare, chiar dacă rezultatele corespunzătoare fl apele uzate și
nămolurile provenite din aceeași stație de epurare nu au fost comparate ( Peccia și
colab. 2020 ). Un alt coronavirus, și anume virusul hepatitei de șoarece, se
raportează că se adsorbe rapid pe fracția solidă ( Voi și colab. 2016 ). În plus, doar
1% din virusul SARS însămânțat poate fi recuperat folosind metoda de adsorbție
electronegativă ( Wang și colab. 2005 ). Aceste studii publicate susțin ideea că
fracția solidă este un ef fi resursă importantă pentru detectarea SARS-CoV-2 în
Fig. 3. Comparația testelor RT-qPCR (NIID_N2 și CDC_N1N2) pe baza numărului copiei. Cercurile
apele uzate.
magenta reprezintă fracțiile solide ale probelor colectate săptămânal din cele trei situri de
colectare a probelor. Pătratele gri reprezintă o serie de diluție a ARN-ului din izolatul SARS-CoV-2.
Valorile sunt prezentate ca numărul de copii ale genei ARN SARS-CoV-2 per reacție a testelor Cele mai sensibile seturi de grund / sondă pentru detectarea SARS-CoV-2 în
RT-qPCR. apele uzate nu au fost încă determinate, având în vedere că discrepanțele dintre
teste cu seturi diferite de grund / sondă au fost observate în studiile anterioare ( Medema
și colab. 2020 ; Randazzo și colab. 2020 ). Testul CDC_N1N2 care a fost utilizat în
acest studiu a cuprins două seturi de grund / sondă, CDC 2019-nCoV_N1 și CDC
ape uzate. În metoda de adsorbție a membranei electronegative, pH-ul probei a 2019-nCoV_N2 (a se vedea
fost ajustat la 3,5; astfel, este posibil ca pH-ul scăzut să aibă un efect asupra Sectiunea 2 , Materiale și metode). Rezultatele au indicat faptul că acest test qPCR
integrității virusurilor învelite, rezultând o rată redusă de recuperare. În duplex a arătat o sensibilitate mai mare în detectarea SARSCoV-2 în canalizare
precipitațiile PEG și ultra fi Metode de ltrare, volumul probei a fost limitat. Prin decât setul unic de NIID_2019-nCoV_N (NIID_N2) ( Fig. 3 ). O astfel de diferență nu a
urmare, a fost diferit fi cult pentru a detecta ARN-ul viral dacă concentrația este fost observată în diluțiile seriale ale probei de ARN din tulpina izolată, implicând
scăzută. În special, aceste trei metode de recuperare a virusului au început cu posibilitatea degradării ARN-ului în proba de apă uzată. Această posibilitate a fost
supernatantul de la centrifugarea inițială. Datele au sugerat că SARS-CoV-2 a fost sugerată și într-un alt studiu ( Rimoldi și colab. 2020 ). Încercările de a izola
adsorbit pe fracția solidă. Prin urmare, orice metodă care începe cu supernatantul SARS-CoV-2 de probele de apă uzată cu un număr de copii chiar mai mare nu au
va arăta concentrații mai mici de ARN SARS-CoV-2. Un semn fi cant nivel de avut succes (datele nu sunt prezentate). Aceste observații sugerează

Fig. 4. Rezumatul cazurilor COVID-19 și a concentrațiilor de ARN SARS-CoV-2 în apele uzate. (A) Concentrațiile de ARN SARS-CoV-2 în gura de vizitare A și stația de epurare B. Noi cazuri zilnice de
COVID-19 pe baza datei (B) raportate și (C) datei de debut într-o regiune metropolitană din Japonia. Cercurile roșii și pătratele albastre indică concentrații de ARN SARS-CoV-2 în probe obținute din gura
de vizitare A și, respectiv, din stația de epurare B. Barele gri și liniile negre reprezintă cazuri noi în fiecare zi și, respectiv, media pe șapte zile. (D) Corelația dintre cazurile COVID-19 (media pe șapte zile) și
concentrațiile de ARN SARS-CoV-2 analizate folosind testul de corelație a rangului Spearman. * p <0,05, ** p <0,005.

5
K. Kitamura, K. Sadamasu, M. Muramatsu și colab. Știința mediului total 763 (2021) 144587

că SARS-CoV-2 din apele uzate este degradat astfel încât să devină neinfecțios. În Date suplimentare la acest articol pot fi găsite online la https: // doi. org /
plus, acumularea de SARS-CoV-2 în fracția solidă implică faptul că tratamentul cu 10.1016 / j.scitotenv.2020.144587 .
nămol activat ef fi îndepărtează cu atenție SARS-CoV-2 din apele uzate.
Declarație privind contribuția autoriei CRediT
Probele din gura de vizitare din districtul comercial, cu o prevalență ridicată a
infecțiilor, au prezentat o sensibilitate mai mare în detectarea ARN-ului SARS-CoV-2 Kouichi Kitamura: Conceptualizare, investigație, metodologie, analiză formală,
decât probele de la stațiile de epurare Fig. 1 ). Concentrația mai mare de ARN achiziție de finanțare, scriere - proiect original. Kenji Sadamasu: Investigație,
PMMoV în probele de gura de vizitare a indicat un raport mai mare de excremente Scriere - revizuire și editare. Masamichi Muramatsu: Administrarea proiectului,
umane față de probele obținute din stația de epurare în aval Fig. 2 ); acest lucru Scriere - revizuire și editare. Hiromu Yoshida: Conceptualizare, investigație,
explică sensibilitatea mai mare a acestor probe la detectarea SARS-CoV-2. metodologie, analiză formală, achiziție de finanțare, scriere - revizuire și editare.

Creșterea numărului de cazuri COVID-19 în timpul valului inițial de infecții în


Declarație de interes concurent
Japonia a fost mult mai lentă decât cea din alte țări din Europa, precum și din SUA ( Gloeckner
și colab., 2020 ), și o tendință similară a fost observată în timpul celui de-al doilea
val. Într-adevăr, SARS-CoV-2 ARN în canalizare a fost rar detectat în acest studiu Autorii declară că nu au niciun concurent cunoscut fi interesele nanciare sau
atunci când precipitațiile PEG sau ultra fi s-au folosit ltrarea. Acest fi ndingul este în relațiile personale care ar fi putut apărea în fl rezultă munca raportată în această
concordanță cu rezultatele raportate pentru diferite zone din Italia sau Olanda, cu lucrare.
o prevalență mai mare a infecției ( La Rosa și colab. 2020b ; Medema și colab. 2020 ).
Utilizarea ef fi detectarea eficientă a fracției solide, linia de timp a creșterii Mulțumiri
concentrației de ARN SARS-CoV-2 în apele uzate ar putea fi rezumată. Aceste date
au indicat existența unei corelații între concentrațiile de ARN SARS-CoV-2 în Mulțumim lui T. Wakita și H. Shimizu de la Institutul Național de Boli
canalizare și numărul de cazuri de COVID-19. Mai mult, testele de corelație Infecțioase (NIID) pentru evaluarea critică a manuscrisului, T. Osaka (NIID) pentru
Spearman au evidențiat un semn fi corelația cant între concentrația de ARN asistență tehnică și N. Nagata (NIID) pentru furnizarea tulpinii izolate SARS-CoV-2.
SARS-CoV-2 în apele uzate de la WTP B și numărul de cazuri COVID-19 în raport cu Acest studiu a fost parțial susținut de Ministerul Sănătății, Muncii și Bunăstării din
data debutului ( Fig. 4 ). Acest rezultat indică faptul că metoda propusă în acest Japonia [numărul grantului 20HA2009] și Agenția japoneză pentru cercetare și
studiu are aplicații potențiale în monitorizarea prevalenței COVID-19, chiar dacă dezvoltare medicală [numărul grantului JP20fk0108066].
estimările absolute ale prevalenței pe baza concentrației de ARN SARS-CoV-2 sunt
încă diferite fi cult de realizat. Prin urmare, sunt necesare cercetări suplimentare
pentru a dezvolta metode prin care ef fi se poate realiza extracția virală a ARN-ului Referințe
din fracțiile solide și este necesară, de asemenea, dezvoltarea seturilor de primer /
Ahmed, W., Angel, N., Edson, J., Bibby, K., Bivins, A., O ' Brien, JW, și colab., 2020a. Primul con-
sondă sensibile pentru testul multiplex qPCR. fi detectarea rms a SARS-CoV-2 în apele uzate netratate din Australia: o dovadă a conceptului
pentru supravegherea apelor uzate a COVID-19 în comunitate. Știință. Mediu total 728,
138764. https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2020.138764 .
Ahmed, W., Bertsch, PM, Bivins, A., Bibby, K., Farkas, K., Gathercole, A., și colab., 2020b. Com-
În Japonia, sistemul național de supraveghere a mediului a fost introdus
eliminarea metodelor de concentrare a virusului pentru recuperarea pe bază de RT-qPCR a
pentru poliovirus în 2013 ( Organizația Mondială a Sănătății 2013 ). Pentru a detecta virusului hepatitei murine, un surogat pentru SARS-CoV-2 din apele uzate netratate. Știință.
poliovirusul, se folosește supernatantul de la centrifugarea inițială a apelor uzate. Mediu total 739, 139960. https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2020.139960 .
Carducci, A., Federigi, I., Liu, D., Thompson, JR, Verani, M., 2020. Making waves: corona-
Metoda în două faze din protocolul OMS pentru supravegherea de mediu a
detectarea, prezența și persistența virusului în mediul acvatic: stadiul tehnicii și nevoile de
poliovirusului a fost aplicată fracției supernatante ( Organizația Mondială a cunoștințe pentru sănătatea publică. Apă Res. 179, 115907. https://doi.org/
Sănătății 2003 ). Prin urmare, fracția solidă poate fi ușor utilizată pentru 10.1016 / j.watres.2020.115907 .
supravegherea COVID-19 după ce a fost colectată proba pentru supravegherea Centre for Disease Control and Prevention, 2020. 2019-roman coronavirus (2019-nCoV)
grunduri și sonde de panouri rRT-PCR în timp real. Centrele SUA pentru Controlul și
poliovirusului. Astfel, va fi benefică combinația de supraveghere COVID-19 cu Prevenirea Bolilor https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-panel-primerprobes.html
supravegherea de mediu a poliomielitei, care este deja disponibilă fi cial în termeni .
de rentabilitate. Gloeckner S, Krause G, Hoehle M. 2020. https://doi.org/10.1101/2020.03.18.20037473 . Haramoto,
E., Kitajima, M., Kishida, N., Konno, Y., Katayama, H., Asami, M., și colab., 2013. Oc-
curența virusului piperului blând în sursele de apă potabilă din Japonia. Aplic. Mediu
Microbiol. 79, 7413 - 7418. https://doi.org/10.1128/AEM.02354-13 .
5. Concluzii Haramoto, E., Kitajima, M., Hata, A., Torrey, JR, Masago, Y., Sano, D., și colab., 2018. O recenzie
privind progresele recente în metodele de detectare și prevalența virusurilor enterice umane
în apă. Apă Res. 135, 168 - 186. https://doi.org/10.1016/j.watres.2018.02.004 .
• Acest studiu a demonstrat posibilitatea de a detecta SARS-CoV-2 ARN în probele Haramoto, E., Malla, B., Thakali, O., Kitajima, M., 2020. Prima supraveghere a mediului pentru
de apă uzată din gaură și WWTP-uri din regiunea ametropolitană din Japonia. prezența SARS-CoV-2 ARN în apele uzate și în apele râurilor din Japonia. Știință. Mediu total
737, 140405. https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2020.140405 .
Hata, A., Honda, R., 2020. Sensibilitatea potențială a monitorizării apelor uzate pentru SARS-CoV-2:
• Rezultatele con fi a confirmat că probele de ape uzate reprezintă o sursă mai comparație cu cazuri de norovirus. Mediu Știință. Tehnologie. 54, 6451 - 6452. https: // doi. org
sensibilă pentru supravegherea ARN-ului SARS-CoV-2 decât probele de ape / 10.1021 / acs.est.0c02271 .
uzate de la WTP. Kitajima, M., Sassi, HP, Torrey, JR, 2018. Virusul piperului blând ca o calitate a apei în
dicator. npj Apă curată, 1 https://doi.org/10.1038/s41545-018-0019-5 .
• Fracția solidă reprezintă o sursă eficientă pentru detectarea ARN-ului
Kitajima, M., Ahmed, W., Bibby, K., Carducci, A., Gerba, CP, Hamilton, KA, și colab., 2020.
SARS-CoV-2 în apele uzate în comparație cu utilizarea fracției supernatante. SARS-CoV-2 în apele uzate: starea cunoștințelor și nevoile de cercetare. Știință. Mediu total
Astfel, se sugerează adsorbția SARS-CoV-2 pe fracția solidă a apelor uzate. 739, 139076. https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2020.139076 .
La Rosa, G., Bonadonna, L., Lucentini, L., Kenmoe, S., Suffredini, E., 2020a. Coronavirus în
medii de apă: metode de apariție, persistență și concentrare - o analiză a scopului Apă Res.
• Testul Taqman qPCR duplex (amestec de CDC 2019-nCoV_N1 și CDC 179, 115899. https://doi.org/10.1016/j.watres.2020.115899 .
2019-nCoV_N2) a prezentat o sensibilitate de detectare mai mare decât testul La Rosa, G., Iaconelli, M., Mancini, P., Bonanno Ferraro, G., Veneri, C., Bonadonna, L., și colab.,
singleplex (NIID_2019-nCoV_N), ceea ce implică faptul că SARS-CoV-2 tinde să se 2020b. Prima detectare a SARS-CoV-2 în apele uzate netratate din Italia. Știință. Mediu total
736, 139652. https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2020.139652 .
descompună în apele uzate.
Matsuyama, S., Nao, N., Shirato, K., Kawase, M., Saito, S., Takayama, I., și colab., 2020. En-
• Utilizarea ef fi detectarea eficientă a SARS-CoV-2 ARN în fracția solidă utilizând izolarea continuă a SARS-CoV-2 de către celulele care exprimă TMPRSS2. Proc. Natl. Acad. Știință.
testul duplex, un semn fi nu s-a observat o corelație între numărul de cazuri SUA 117, 7001 - 7003. https://doi.org/10.1073/pnas.2002589117 .
Medema, G., Heijnen, L., Elsinga, G., Italiaander, R., Brouwer, A., 2020. Prezența SARS-
COVID-19 și concentrația de ARN viral în probele de ape uzate de la WTP în
ARN coronavirus-2 în canalizare și corelația cu prevalența raportată a COVID-19 în stadiul
zonele cu o prevalență ridicată a bolii. incipient al epidemiei din Olanda. Mediu Știință. Tehnologie. Lett. 7, 511 - 516. https://doi.org/10.1021/acs.es
.

6
K. Kitamura, K. Sadamasu, M. Muramatsu și colab. Știința mediului total 763 (2021) 144587

Mizumoto, K., Kagaya, K., Zarebski, A., Chowell, G., 2020. Estimarea asimptomaticului Wang, D., Hu, B., Hu, C., Zhu, F., Liu, X., Zhang, J., și colab., 2020. Caracter clinic-
proporția cazurilor de boală coronavirus 2019 (COVID-19) la bordul navei de croazieră istorice ale a 138 de pacienți spitalizați cu pneumonie nouă infectată cu coronavirus din 2019
Diamond Princess, Yokohama, Japonia, 2020. Euro Surveill. 25. https://doi.org/ în Wuhan, China. JAMA 323, 1061 - 1069. https://doi.org/
10.2807 / 1560-7917.ES.2020.25.10.2000180 . 10.1001 / jama.2020.1585 .
Nishiura, H., Kobayashi, T., Miyama, T., Suzuki, A., Jung, SM, Hayashi, K., și colab., 2020. Esti- Wolfel, R., Corman, VM, Guggemos, W., Seilmaier, M., Zange, S., Muller, MA, și colab., 2020.
raportul asimptomatic al infecțiilor cu coronavirus noi (COVID-19). Int. Evaluarea virologică a pacienților internați cu COVID-2019. Natură. 581, 465 - 469. https://doi.org/10.1038/s4
J. Infectează. Dis. 94, 154 - 155. https://doi.org/10.1016/j.ijid.2020.03.020 . .
Ozawa, H., Yoshida, H., Usuku, S., 2019. Supravegherea mediului poate urmări dinamic Organizația Mondială a Sănătății, 2003. Liniile directoare pentru supravegherea de mediu a poliovirusului
modificări ecologice în enterovirusuri. Aplic. Mediu Microbiol. 85. https://doi.org/ circulaţie. https://apps.who.int/iris/handle/10665/67854 .
10.1128 / AEM.01604-19 . Organizația Mondială a Sănătății, 2013. A nouăsprezecea reuniune a Comisiei regionale pentru
Peccia, J., Zulli, A., Brackney, DE, Grubaugh, ND, Kaplan, EH, Casanovas-Massana, A., et Certi fi cation de eradicare a poliomielitei în Paci occidentale fi c Regiunea, Manila, Filipine, 12 - 14
al., 2020. Măsurarea SARS-CoV-2 ARN în apele uzate urmărește dinamica infecției noiembrie 2013: raport de ședință. https://apps.who.int/iris/handle/10665/208784 .
comunitare. Nat. Biotehnologie. https://doi.org/10.1038/s41587-020-0684-z .
Randazzo, W., Truchado, P., Cuevas-Ferrando, E., Simon, P., Allende, A., Sanchez, G., 2020.
Wu, F., Zhang, J., Xiao, A., Gu, X., Lee, WL, Armas, F., și colab., 2020a. Titlurile SARS-CoV-2 în
SARS-CoV-2 ARN în apele uzate a anticipat apariția COVID-19 într-o zonă cu prevalență
apele uzate sunt mai mari decât se aștepta din punct de vedere clinic fi cazuri rmed. mSystems 5.
scăzută. Apă Res. 181, 115942. https://doi.org/10.1016/j.watres.2020.115942 .
https://doi.org/10.1128/mSystems.00614-20 .
Rimoldi, SG, Stefani, F., Gigantiello, A., Polesello, S., Comandatore, F., Mileto, D., și colab.,
Wu, Y., Guo, C., Tang, L., Hong, Z., Zhou, J., Dong, X., și colab., 2020b. Prezență prelungită a
2020. Prezența și infectivitatea virusului SARS-CoV-2 în apele uzate și râuri. Știință. Mediu
ARN viral SARS-CoV-2 în probe fecale. Lancet Gastroenterol. Hepatol. 5, 434 - 435.
total 744, 140911. https://doi.org/10.1016/j.scitotenv.2020.140911 .
https://doi.org/10.1016/S2468-1253(20)30083-2 .
Rosario, K., Symonds, EM, Sinigalliano, C., Stewart, J., Breitbart, M., 2009. Pepper mild
Xu, Y., Li, X., Zhu, B., Liang, H., Fang, C., Gong, Y., și colab., 2020. Caracteristicile copiilor
virusul petei ca indicator al poluării fecale. Aplic. Mediu Microbiol. 75, 7261 - 7267. https://doi.org/10.1128/AEM.00410-09
Infecția cu SARS-CoV-2 și dovezi potențiale pentru vărsarea virală fecală persistentă. Nat.
.
Med. 26, 502 - 505. https://doi.org/10.1038/s41591-020-0817-4 .
Rusinol, M., Martinez-Puchol, S., Fores, E., Itarte, M., Girones, R., Bo fi ll-Mas, S., 2020. Con-
Ye, Y., Ellenberg, RM, Graham, KE, Wigginton, KR, 2016. Supraviețuire, partiționare și
metode de centrare pentru canti fi cation de coronavirus și alte virusuri potențial pandemice
recuperarea virusurilor învelite în apele uzate municipale netratate. Mediu Știință.
învelite din apele uzate. Curr. Opin. Mediu Știință. Sănătate 17, 21 - 28.
Tehnologie. 50, 5077 - 5085. https://doi.org/10.1021/acs.est.6b00876 .
https://doi.org/10.1016/j.coesh.2020.08.002 .
Shirato, K., Nao, N., Katano, H., Takayama, I., Saito, S., Kato, F., și colab., 2020. Dezvoltarea Institutul de Sănătate Publică al orașului Yokohama și Institutul Național de Boli Infecțioase,
metode de diagnostic genetic pentru detectarea noului coronavirus 2019 (nCoV-2019) în 2020. Detectarea SARS-CoV-2 în apele uzate utilizând sistemul de supraveghere a mediului
Japonia. Jpn. J. Infectează. Dis. 73, 304 - 307. https://doi.org/10.7883/yoken.JJID.2020.061 . poliovirus (în japoneză). Infecta. Agenți Surveill. Rep. 41, 122 - 123. https: //
Symonds, EM, Nguyen, KH, Harwood, VJ, Breitbart, M., 2018. Virus piper mildmottle: www.niid.go.jp/niid/ja/diseases/ka/corona-virus/2019-ncov/2488-idsc/iasr-news/
un agent patogen vegetal cu un scop mai mare în dezvoltarea (tratării) apei uzate și 9714-485p02.html .
managementul sănătății publice. Apă Res. 144, 1 - 12. https://doi.org/10.1016/j. Zhang, T., Breitbart, M., Lee, WH, Run, JQ, Wei, CL, Soh, SW, și colab., 2006. ARN viral com-
watres.2018.06.066 . comunitate în fecalele umane: prevalența virușilor patogeni ai plantelor. PLoS Biol. 4, e3.
Guvernul metropolitan Tokyo, 2020. Actualizări privind COVID-19 în Tokyo. https: // https://doi.org/10.1371/journal.pbio.0040003 .
stopcovid19.metro.tokyo.lg.jp . (Accesat la 28 septembrie 2020). Zhang, J., Wang, S., Xue, Y., 2020. Diagnosticul specimenului fecal 2019 coronavirus nou-
Treibel, TA, Manisty, C., Burton, M., McKnight, A., Lambourne, J., Augusto, JB, și colab., 2020. pneumonie infectată. J. Med. Virol. 92, 680 - 682. https://doi.org/10.1002/ jmv.25742 .
COVID-19: screening PCR al lucrătorilor medicali asimptomatici la spitalul din Londra. Lancet.
395, 1608 - 1610. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(20)31100-4 . Zheng, S., Fan, J., Yu, F., Feng, B., Lou, B., Zou, Q., și colab., 2020. Dinamica și dis-
Wang, XW, Li, JS, Jin, M., Zhen, B., Kong, QX, Song, N., și colab., 2005. Studiu asupra rezistenței ușurează severitatea la pacienții infectați cu SARS-CoV-2 în provincia Zhejiang, China,
tensiunea coronavirusului asociat sindromului respirator acut sever. J. Virol. Metode ianuarie - Martie 2020: studiu retrospectiv de cohortă. BMJ. 369, m1443. https://doi.org/
126, 171 - 177. https://doi.org/10.1016/j.jviromet.2005.02.005 . 10.1136 / bmj.m1443 .