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MANUAL de (5 2) Sete “EL FILIPINO’ Histotocia HUMANA A. Fractura Ambas caras de facture de ta | rosmbtene externa de fa envolluia nuclear! Cuchita ( | \ | _ B. Gra lbaclo Citoplasma Grabado i Particuia / Lasuperficie externa de ta i infamernbrana » frembrana plasmatica y de ia organeia rodeacio por membrana Hielo | BOOYD SICMINW soyUNBaig 09’ § JO|WUAly jap 10)D,\, En venta en Liprarias Martinez: Junin 941 y Lmental: Paraguay 2066 = E-Mal manuales@ciudad.com.ar 6° edicidn - 1999 Mites ee MART AR DE HISTOLOGIA Indice: L MICROSCOPIA__ A. Nivsies de organizaci6r ©. Crofractura para microse Electronica__22 us Fungamentos quimicos de le color: B. Histologia Hematoxilina y Eosin: © Mirassoie 8 1 Colorantes bésicos 1 2, Colorantes deigos, Metscrornasia., b) Otros tins de Microse Setieos__ 1 Benmaebend €) Microscopie electronica Eis 4. Quimicos, ne ©. Formacion de ta imagen 8 2, Fisloos oa U. TECNICA HISTOLOGICA 7 3 Otros tipo A Examen inmadiato ein vivo 17 a) Racicavtograti 2 B Examen meciato opost mortem. 18 areerpeeeete 1. Obtencion deta muestra 8 ©) Fravcionemicnte celular 2 Flacion 3) Cunivo cotuter 3. rets6r, Hi interpretacién de cortes de tefidos___ 32 a} Deshiaratacién, 1 Artefactos__ by Agiaracion_ 7 2. Imerpretecion tridimensional Mi, Bitliograt NV Muitiate Choice ©} brelusion 4, Corte Se terming de intorimir en abrit de 1989, en Talleres Graficos “El Apunto” Junin 979, Buenos Aires, Argentina, ISBN Obra Complots 950-42-9815.5, ISBN 990-43.9511-4 Autor: Alejandro Gonzalez, aa Mecdnico, incluiyendo 10s sistertas: de fotdcépias, registro rtaghsties 6 ds almacenamisnta y alimentasién de datos, sin expresa consentimieito de los autorés, Hecho 8! depseite que establave fa ley 41.725, Bienvenido! Estés cando los primeros pasos en la cofradia de los arissanos de Is salud Deniro de un tiempo, que aunque parezea lejano veras que se pasa rapido, te convertiés en un miembro de los profesionaies del arte de curr En este camino tendras que ejercersacrificios, pero también disfruterés de unicas oo indescriptibies. Séio ef que lo vive sabe fo que se siente retirarse de ta facultad luego de haber meio un final. Ni que hablar de fa sensacién de tener el itimo examen de le carrera firmado en ta libreta, Pero todo eso ya llegard Por ahora tenés enfrente dos coiosos por derriber: Anatomia @ Histologia, Embriologta, Biologia Celular y Genética Sabemos la magia que produce en les primeras semanas el contacto con los huesos y los cadéveres y el desencanto y el aburrimiento que se sure at hablar de fa fecundacién y 10s tipos de lentes que posee un microscopic, ;pero que tus instintos ne te jueguen en contra! Asi la mayor parte de tos estudiantes de medicina se embaien con le anatomia y el parcial de histologia, embriologia, biologia celular y NIC ‘ica los encuentia en ayunas nda que en cuatro dies el Parcial se prepara. jError! Para demostraro basta decir que la | mayor parte de los alurmnos quedan fiores (y pierden ei efio) en ef primer parcial de hislologia mientras que son eruditos en los | plexos venosos dei dedo meflique. No te dejes estar, que el estudio para ef parcial no sea mas que un paseo par fo que ya viste a lo largo e ta cursada, En esto te podemos ayudar. Los manuales de Histologia, Embrioiogia, Biologia Celuler y Genética te ayudan a llegar a Ja clase con el tema leido sacar mayor provecho de la misma ‘en forma clara, amena y concisa fe explican cada tema sin entrar en tecnicismos —innecesarios nt términos rebuscados. Es por todo esto que queremos offecerte una solucion para que puedas enfrentar tu primer afio de Medicina y no te Gefraudes en ia camera’ Los Manvales de Histologia Humana, Embrictogia Humana, Biologia Celular y Genética. Traen tode fa informecion que necesités para saber la matera y, lo que no es mencs importante, aprobar los exémenes. Aqui encontrarés las GICA ¥ MICROSCOPE cosas que no $6 encuentran en fos libros mas nuevos, porque nos actualizamos aflo {ras afio en un lenguaje franco y amen obviando tecnicismos compleos. «sy desceriando lo que escepa 8 los contenidos de la materia Te aporiamos la informecién que no podés dejar de saber, resaitando lo que es realmente importante, en forma ordenada para que no te pierdas en los indices de los libros, aliandndote de esta manera el camine para que puedas acosder més faciimente a tos concepios que tenés que incorporar pera saber la materia. También los chismes que suelen aperecer en los exdmenes, con el material unificado para ewiar controversias entre las ves, ctedras, Encontrards cuadros que resumen y ordenan las ideas de ty cerebro, ademas de figuras que te ayudarén a comprender jos temas, Por uitimo, te brindamos al final de cada Manual un cuesiionario de autoevaluacién multiple choice, que ademés de eyuderte 2 redondear el tema y resaltar los Puntos importantes para ef examen, fe iran familiarizando con los parciales que vendrén, que esperamos aprobaras con nuesira ayuda, V ESTE AKIO CON LA MISMA NOVEDAD DE TODOS Los Atios: MAS HAS FIGURAS, HAS CUADROS, MAS FOTOGRAFIAS, MAS ESQUEMAS, MAS MAQUETAS, MAS INFORMACION A Niveles de Organizacién 2 materia que integra a todo el universo, desde tune moiéeule de agua hasta un rinoceronte, & encuentra formada por elementos que se combinan entre si Estos elementos se ‘denominan étomos y corresponden a los que fueron enumerados y clasificados en la tabla perésica de Mendeleviev. Podemos de esta forma mencioner como atomos al: Oxigeno, el Hidrogeno, el Fosforo, etc El hecho ce que cualquier componente organico 0 Inorganic que existe, esté formado por fos Stomos que conccemos, no exolies claramente las lferencias (néodables} gus hay entre una piedra y Un perro o cuelquier ‘otra objeto que mes comparar. La explicacién a tan aparenta disparate reside en entender come se organizan progreswamento estos atomos, conformando otro nivel diferente al denominado nivel atémico (este ditimo caracterza a cada alomo en particular). Efectivamente un cuando esté solo tiene un ‘stomnoe de Hidrogeno, en cuyo caso formar una moiéeula de agua En este ultimo ejemplo destacamos entoncss que si los tomes se asocian dan origen 2 las cuye case constituyen el denorninado nivel Molecular (ver cusdro 1 Hemos dafinido un nivel atémico, eonformade por los elementos que constituyen ia tabla periddica, pero no debernos oividernos que estes surgen de la interaccion de electrones, piotones y neuirones, Cada uno de estos tres ‘componentes constituye cio nivel de organizacion que recive el rombra de nivel substémico (ver cuadro 1). Un concepto importante a tener en cuenta, es qua hay distintos niveles de organizacién de la materia, esto Permit explicar porque nos rodean abjetos y organismos an diferentes pero con algunos Stomos en comiin. El primer nivel 2 definir es ef subatémico, que como hemos dicho, esta representaco por las particulas denominadas electrones, pictones y neutrones. Cuando estas (iimas se agrusan surven los stomos, de esta forma se consttuye el nivel atémico. Posteriormente estos elementos (los Afomos) se organizan y agrupan de diferentes. modos, dando origen a tas moléeuias, surgiendo asi el nivel molecular (el nivel molecular surge de fa combinacién de los diferentes dtomos entre si}. De todas jas motéculas que se originan en este nivel nos Interesan especialmente cusiro, porque a partir de elias suigira la materia vive, Estes son io8 lipides, Hidrates de Carbono, Proteins y Acidos Nucleloos, que susten recibir ta denominacién de molaculas de la vita {biomoléculas). Estas ‘cuatro molécules se hallan presentes en todas las formas de vida, desde las més elemeniales como virus © bacterias, hasta tas mas complejas como los organismos pluricelularas, entre ellos, nosotros, Estas cuatro moléculas de la vida se agrupan entre si formando un nivel de organizacion més complejo que denominamos nivel celular. +2 céluls, considerada como '@ minima unidad de vide ests tormads por nidreios de carbono, lipides, proteinas y dcidos ructeicos. Debemos destacar que fo son los unicos componenies de una célul, aunque si son ios fundamentals, Sule describise oro nivel ete el enolacutar y et ee celular, | Serorinado nivel | macromolectle. |Euige 2 la union de molécuias mas pequenas entre si i Las céiulas buscaron una mejor adeptacion 2 los iferentes as ban, de esta = forms surgioron las agrucaciones celulares que storgaban mayor superwencia. Es decir surgieron fos organismos plurteelutares, luego cada célule se fue especiaizando en una determirada funci6n, surgiendo te esta manera organos y aperatos para constituir los individuos que conocemos hoy. Suadre 4: Esqvema sobre ise riveree de organiaaciin, En siniesis, al nivel colular lo sigue © Hsular {tejidos), formado por la agrupacién de células con ciertas ‘caracteristicas en comin, Los diferentes te/dos suelen der ofigen @ determinados Grganos (por ejempic el rien), Los diferentes Grganos comienzan a funcionar de manera coordinata y con fines en comin surgienda un aparato Aparato urinario formado por fifén, vellga, ureter) Finalmente tenemos @ un individuo que resulta de la interacoién de los distintos aparatos que lo constituyen (Aparatos respirator, digestivo, cireulatori, ete.) TECNICA HISTOLOGICA ¥ MICROSCOPIA ‘Ao ince de estos manvales haremos rcferenalr « manera especie! @ uno ce estos niveles de orgerizacion, al que Aeros cenominado nivel tisular (Kejidos). 0) rcionamiento def cuerpo humane y pestariormente cuando y porque se ve fenfermmo}, es necesario tener olaros conocimientas de la composicién normal. Nosotr referencia solo al nivel tisular, que es 10 que co: histologia, la que se define como el estudio de tos rio, B Histologia Los tejidos son unidades histologicas de 2do. ‘orden, formados por eélulas que son unidades histolégicas de ter. Orden, Definimos entonces un telide como: [Conjunto de obiulas y sustancia intercelvlar earecteristions y Tunciones en coman Insistimos, podriamos entonces definir @ un tejido como un coniynto de células_y_sustancia intercelular. Las eéiulas se agiupan de acuerdo a funciones en comin {por ejemplo, [ae células museuiares son contractles) y caracteristicas morfol6gicas de las célulss (ias células det tejido nervioso denominadas_—_neuronas tienen prolongaciones derominadas axones y dendritas). La sustancia intercelular se halla entre una y otre célula o entre grupos dé alias, siendo fibrosa © amorfa (con o sin fibras respectivemente) Es muy importante que se tenga el concepto sobre los componentes que conforman un tejido: UN TEJDO SIEMPRE ESTARA FORMADO POR CELULAS Y SUSTANCIA INTERCELULAR, Como fo hemes mencionado queremos iniciar el estudio de ios tejidos, pero esto no es una tarea sencilla. En primer jugar debernas plantearnos las dimensiones de io Que queremos observar. Es decir que si nos alcanza la imagen que captan nuestros jos 0 se requieren insttumentos mas sofislicados para que nuestros ojos puecan "vor Pera que se comprenda con mayor claridad fa idee Imire ©} euadro que sige @ continuacién y preste atencién en el modo en el que pueden ser visualizados, es decir si se Fequieren sis propias ojos o de algdn ctto instrumento que “agrande” a imag ‘Aqui hemos llegado @ un punto importente que s° debe destacar, y eS que hay distinins nivoes de observacidn, Esto quiere decir que el cjo th tere limite para ver las imagenes con nitidez 0 clarided, como ssi tambi6n ese limite fo tienen Ie lupa, @! mictoscopio de hz y todos los elementos a ser utiizades en la observacion. Ese limite de observacion es conocido como limite de resolucién, det cual hablaromes en la seccién de ‘microscopfa. Por ahora podemos adelantar que: TSE DEFINE COMO LitiiTe DE RESOL MINIMA DISTANCIA QUE TIENE QUE HABER ENTRE DOS PUNTOS PARA QUE PURDAN SER VISTOS Com: SUPERENTES. om Hagamos un ejercicio para que le pueda comprender Su elemento de cbservacdn serén sus propios Ojos, nuestra tarea ehora es encontrar el limite de ‘observacion de éstos. Tome lapiz y papel y dibuje un punto fen ei extremo derecho y otro en el zquierdo, usted podré Comprobar que sus ojos estan viendo des puntos aiferentes, uno. en cada extremo. Repita este operacion pero ‘acercéndolos cada vez més, Como actividad fina trate de fescribir fos dos puntos uno junta al otro, pero hagalo de ‘at forma que sus ojos no puedan darse cuenta que hey dor puntos 0 que les resulle dificutoso vsualizerlo. En este momento estamos frente al fimite de resolucion. Es cecir que nuestros ojas, coma cualquier otro medio de ‘bservacion, necesitan une cistanc'a minim que los sepere pera que esos dos puntos pueden ser vistos como diferentes, si esa minima distancia no es la adecusda, se vverdn como un soto punto. Anteriormente hablamos de niveles de observacién, estos niveles se definen teniendo en cuenta el Hite de Fesolucion de los medios de observacién. En el cuadro 3 ‘enumeramos Jos niveles, con sus medios de observacin y limites de resolucién respectivos, Cuando dimos el valer de! limite de resolucion de los distintos medios de cbservacion {recordamas que es fe minima distancia que tiene que haber entre dos puntos pare que puedan ser vistos como diferentes y que varia con los distinto medios de observacién) ufiizamos unidades que probablemente el lector las desconozca, por lo tanto en el ‘cuadro 4 presentamos las equivalencias Tome un palo = ss cuore soneluda para somelero | a. su obsenmeicn A conlimuecién cen la mano © con tna Ageiie d= || pinza trate de observar of didtnette del polo, al hacero Resecion. | comprobar& que e= muy pequefto. El diémetro aproximado ae Ge! mas fine de tos pelos es de 0.26 mm, (esto quiere decir | 0.200,1 mn que entra dentco ee) imite de resolucion del ojo humana) er ee ee aproximadamente podria toner ante | Meroronio te Seager O28 ek Ara ied vosaes ak eases aatanst det 250 um. Por otra pette, una de fas células de fa sangre campo oscuro, de | eonecida como gidbuio rojo mide aproximadamente 8 amy cee uones, 3 Tegenemee 4 mato tau aus ted | urate y | Geen ne wetee ate ol de Ooteany Oe eseatan : ———] sun oonoats sets give te Boe Sangurong | cata Wore arta os in entece aqua oes Eeretan sy peace oie Microscopio de | || Polenizeion y | mmicrosenpio | etecttonico, Ya sabemos como esté formado un tejido y ademas, 85 evidente que nuestros ojos por si solos Ro son muy apropiados pare abordar su estudio. Por esta razon, ‘vemos a comenzar el desarrollo de los distintos elernentos y “ifraccion de | oo trates que e tenon en cuenta pore el od de ie erin a eee eee ni Guadrod : Unidades de medida. Para poder damos una idea mas. completa del tomato que ropoorion cals inidedes vemos Tefen a a ne seco, i poeseeeeSt feejeciso, eet [r metro 1000 Mitmetios 11000000 ym 1.000.000.000 nm | 10.000.000.060.A imetro 0,001 Metro 1000 um | 1.000.000 rm 10.000.900 A 1 T T tT Ee 1 0.000001 wee |o.001 mm 7000 am Toooa | T,o00 000.001 0.000008 men 0001 wm | 9,000.000.000.1 M [0000001 mm 0.0001 jum, C.Microscopia ‘Como hemos analizado en pérrafos anteriores, 1a ‘Ya tenemos les dos caractertsticas del Microscopio: finalided del uso del microscopio es hacer visible 1o' que — AMPLIFIGACION Y RESOLUCION. nuestros ojos ne pueden ver. {Qué significa esto? Estamos hablanco que una de las propiedades del Microscopio, que es EO es la de ampliftear fa imagen. eee as Lins ds las prop tie! wiorosobpio o: la ampilticacion: Si retornamos 2 la definicién de mite de A continuaolén ote pregunta que ¢! lector potria esoluelén: (jjPregunta de parcial), hacerse es : Esta amplificscior es Indefinida?. El mejor modo de responder a esta pregunta es con un ejemplo. ‘Todos alguna vez deben haber inflado un globo, recuerde uno de esos que dicen feliz cumpleafios, Camience @ Infliario. La ampliacién de fa imagen, que tiene impresa ese globo, €6 indetinida?. Obviamente el lector diré que na por os rez0nes : primero porque ei globo se revients y segundo porave la imagen pierde nitidez, ya que se va perdiende la La vision distinta se refcre, por ejemsio, que en el efinicion de le figura eriginal. El presentar una imagen con aso de nuestros ojos para que puedan capter la imagen, la_meyor fielded posible, © oon .sitidez (como Jo ésta debe ubicarse como minino a 26 0 20 om, a8 lo menciondramos anierormente}, es Jo que se denomina en contrario ser borrosa y poco definida. Con el resto de los microscepie RESOLUCION, instrumentos de observacién oourre lo mismo, los elementos a observer se deben ubicar a una distancia determinada; de —~ Ea oes y oe oe fo contrario no podremos obtener ninguna imagen mite de Resolucién: 1. Tipos de Microscopio: En términos generales podemos dividie alos icroscoplos en’ dos grandes grupos: el MICROSCOPIO COMUN, 0 lamado también OPTIGO O DE LUZ y el MICROSCOPIO ELECTRONICO, Cada uno de estos grupos presenta variantes a) Microscopie Optico o de Luz: So tsa para estudiar a través do iluminacién por transparencia preparaciones coloreadas. ‘Se distinquen Microscopios Simple © Lupe: Consta de un solo sistema de lentes convergentes que dan una imagen ampificada de objeto , virtual y derecha. E} aumento es de hasta 20 Compuesto © Comin: Consta de dos sistemas de lentes convergentes situacas en un mismo eje y a cierta distancia una ge le ctra. El aumento es heste 1C00 veces, resultande una imagen virtual ¢ invertida. Se pusde sumar Un tercer sistema de lentes convergentes que tiene como Fnalided concentrar ia tz En el Microscopie distinguimos: + Porte Mecénica + Parte Optica. Sugerimes que para mayor comprension de la desctizcién tenga en cuenta fa Figura N°t PARTE MECANK Base o Pie Es amplia, sélida y pesada ya que ‘sostione ef meirumente. ‘olumns 0 Potencla: Destinada a sostener el tubo y los mecanismos de movimiento de éste, comonmente aiticulada con la base. La columna tiene cos pettes, una que apoya sobre la base y va hasta la bisagra (chaneia) que se denomina pillar, y el resto de la columna que se ubica por arriba que se denomina braze. ‘Tybo:_Es un cilindro hueco unido @ fa columna: mediante une cremallere, presentando en su extremo ‘superior ef ocular. y en el inferior una plaze en forme de casquete (revlver) en donde se ubican de 2 a 4 objetivos de diversos aurnenios. E| tubo se conecta con los sistemas cde movimiento réipido y lento, aocionados por una cabeza de tomo denominados macrométrico y micrométrico respectivamente, Estos fomnitos permniten ajustar el enfoque ‘ree NCA HISTOLOGICA ¥ MICROSCOEA, fina: Diepuicsta pespendicuiarmente ai eje Optica del microscopic, tiene por f ones al obieto que se rayos. prooscer empleo de tornilos reoorrer metdicame: dos laminas 0 pinzas. Si I= face de este sistema de deslizamiento se la ‘ocancce como piatina fi, en 3s contrario se trate de une pistins mévi ermite 12 sostenide por Subpletins Pocee un sistema de lentes denominada conden: que come bien dijimos ‘anteriormente, conceniea sabre ef preparads ios Tayos luminosos que le refia el espelo (0 fa témpete de tuz) situsdo ¢absjo de &. Esta retenio en un avo, fo que le permite ser despiazado en sentico vertical El condensador sdemés lleva un disfragma para regular la entrada de luz y un anillo portafitiros en el cuat 5 posible eolocar fitros de vidio de color, que permiten pasaje de los rayos de luz des color slegico. PARTE OPTICA: Est compuesta por cos do lentes convetgentes: ebjetiva y ocular que intervienes ea la formacién de la imagen micrascépica definitiva, ‘Ademas, estos dos sisternas, se complemectan con un tereero que s6 denomina condensscor que tambien esta formado por lentes convergentes, pero con une funcion ‘iferente a fa que tienen ef objetiva y ocular, Estos uitimes participan en la formacion de Ia imagen, e! condensador solo actiia concentrando los rayos. El condensador forma parte de lo que se denomina aparato de ilunsinacién. sister | i | | + Seco fuerte | 4 contri igure 4s Eequerna de un microscope 6c. Qbletive: Compuesto por un si convergertes moriacas en un tubo metética; éste da una imagen aumentada, reel ¢ invetic Ge distinquen los siguientes tings de objetivo: 4) Objetivos a seco: Una cape de aire se interpone contre te lente frontal de objetivo y el preparado. Por su 7 MANUAL DE HISTOLOGIA Gapeoidad de aume™ pusden ser débiles (eumentan 10 veces el tamatio de le imagen) o fuertes (aumentan 40 veces 4! tamatio de la imagen -1os més utilizados-) 2 Objetives de inmersién: Una capa de liquid transparente se interpone entre el preparado y el objetivo. Pueden ser de inemersion on agua (0:1,33 indice de refracci¢n), inmersion en aceite (n: 1,518) y de inmersién en monobromuro de nettaieno (n: 1,66) Las lentes de los objetivos se hallan corregidas en aborraciones cromaticas y de estericidad: Aber: stiog Se ofigina debido a la imposibilidad de una lente simple, de concentrar en un mismo punto todos los rayos de diferente fongitud de onda, forméndose una imagen borrosa y coloreada, Se corrige con objetivos Acromaticos (lentes de diferente poder dispersive) y . con objetivos Apocromiétions (2 diferencia del anterior que corrige un solo color en éste se corrigen dos colores). Los objetives monccrométicss estan corregidos para radiaciones ultraviolstas, siendo asa su tnica utilidad (ver gura 2). ienie Pasiiva~ Figura 2: Eequema en ol cual se oxpica ta aberracion cromitioa, lane focal repreeents e! io en el cua! deberfa formaree is imagen, Dero coma hay rayoe de diferente longitud de onda esta se forma en Sierentes planos. Loe reyos de mayor longtud de onda (jos), se esvian menoe y frman eu foco antes dal piaro focal a diferencia de tos de menor longtud de onda voleta} que se desvian mas y forma ls Imagen detrés del plano fooal. Por esa razén las imdgenes formadas son borasas y coloreedas. Aberracion de Estericidad: Esta_aberracién ocurte cuando los rayos que inciden periféricaments @ la lente lo hacen en forma proporcional més reftactados que los que estén préximos at «je Sptioo. Como consecuencia se forma un espacio focal en lugar de un foco puntitorme y la imagen resultante es borrosa, Este defecto también se observa si se usa luz monccromatics (ver fgue 3). Se corrige con objetivos aplaniticos (combinacén de lentes convergentes y divergentes). Rayos Pertfericos » Figura.2: Esqueme que explca le abarracién do esfericidad, donde los ‘ayoe periférces euffen un mayor grado de refiaocién que fos rayos ‘entroles, determinendo fnaimente a formacién de una imagen borrosa poresta separacién aurentada ent los rayos en la peel En este punto croamos que es necesario definir determinades conceptos para posteriormente entender la formaciéa de la imagen Distancia fore! del objetivo: Esta distancia (la cistancia frontal) es més corta cuanto mayor es el aumento del objetivo. Aumente propio de un objetivo: Qcularee: El ocular recoge la imagen dada por el objetivo, de la que se origina uns imagen mayor (aumentads de ‘tamatio}, virtual y derecha. El ocular acta como una lupa Como a Imagen de! objetivo es invertida, ta imagen final to seguiré siendo porque el ocular no vuelve a invertiria, En al dispositive binocular ta imagen dada por el objetivo la recibe un sistema de prismas que permite la observacion por dos oculares, Aparato de ilumingcién: Se halla debajo de ta platina, formséo por el espelo, el condensador y el diafragma. Espejo: Poses una cara plana y una cara oéneava: estinadas 2 proyectar el faz de rayos que fa de iluminar el objetc, La cara plana es utilizada cuando la fuente luminoso » TECNICA HISTOLOGICA Y MICROSCOPIA 3 natural, mientras que le care concave se utiliza para fa luz artificial Condensador: Se encuentra constituido por un sistema de lentes convergentes que proyectan sobre el preparado et haz de luz que io atraviesa en forrna de amptio cone. Diafragma: Permite graduar Ja cantidad de rayos tuminosos que ingresardn ai condensador. La fuente do luz puede ser natural (mediante luz que ingresa por intermedio del espejo) o artificial (luz de {amparita que itumina directamente) DETERMINACION DEL __AUMENTO DEL MICROSCOPI E! método mas sencillo para obtener el aumento total de un microscopic consiste en muttipticar el aumento del objetivo por ef aumento del ocular: Campo reat. Es la superficie def preparado que se abarca en la observacion microscépica, sin desplazar el portaodjetos Este campo es menor cuando aumenta la combinacion Optica empleada, vale decir que es inversamente proporcional al aumento del mictos cular 10 x Objetive 10 100 veces. | 1.8mm. | (1500um). | ‘Ocular 10 x Objetive 40 = 400 veces 0,375 mm. i (375 ym). | Ocular 40 x Objetive 90 = 900 veces | 0,17 mm. | (970 pm). | cular 10 x Objetive 100= 1000 veces. | 0,15 mm. | El microscopic realiza una amplificacién de la imagen en dos niveles: en primer lugar lo hace por un ‘complejo sistema de lentes que forman ef objetivo y en segundo lugar, por las lentes que forman el ocular. Como of objetivo es el que toma la imagen directamente det preparado, seré ef mayor responsable de la resolucién de la imagen. La funcion mas destecable del ocular es ta de amplificar la imagen, En este momento usted probabtemente ya 0 quiera oir hablar mas de limite de resolucién, pero es necesario hacerlo nuevamente para ampliar un poco mas et concept, En fo que probablemente usted y yo estemos de acuerdo es que et limite de resolucién es ta minima stancia que tiene que haber entre dos puntos pars que puedan verse como diferentes. Phora 'e que lector podria plantearse es. Jel microscopia tvabsja. siempre con el menor limite de Tesolucién’?. La respuesta seria no, ya que para abtener el menor limite de resolucion se deben tener en cuenta una serie de varables que no siempre asian presertes, Para ser mas clates, trabajando con et microscopio Sptico ef limite de resoiucion es de 0.25 um, pero no siempte el microscopio tiene fa positilidad de alcanzar ese valor, por esta razon se uliza olf connepio que es el de PODER DE RESOLUCION. (jjPregun aparecer en los parcialillos!! PODER DE RESOLUGION: la que suele La diferencia con of limte de resolucién, es quo el poder se rafiere a ta capacidad que tiene el microscopio para distinguir dos puntos como diferentes, y of limite de resolucién habla de una distancia minima que tiene que haber entre dos abjetos. Recordar: [ee Existe una formula para calcula el imite de resolucion ER= 0610 AN Donde: x significa multiptoacién, LE Limite de resolucion 0,61: Constante de contraste minimo que se puede detectar. 2: Longitud de onda del medio utlizaco. Apertura Numéric: | ANes la capacidad del objetivo |e utitzar un mayor © menor nimero | de rayos luminosas en ta formacién | deta Le Apertura numérica so celeuls: AN: a x sen de alta. jon mieroscos ANS nxsen a Esto nos dice que es igual af Indice de retraccién del medio (n} inlerpuesto entra of objeto que se observa y fa lente frontal do! objetivo, mutipicado por ef sano del semiéngulo de abertura (Seno de aifs) del cono de luz que ponetra en fa lante frontal dl objetivo (ver figura 4 Resmplezando AM en la férmule de LR tenemos Analmente quo la férmula do LR os: (EI que no sabe esto para el parcial que se vaye camblando de carrera porque el 9 M NUAL DE HISTOLOGIA parcial seguro qua ho fo aprueba, Le sugerimas loenciatura jancias orlentales como una carrera de gran posvenir): oe Teniendo on cuenta tg formula se pueden deducir cuales son las maneras de hacer descender el limite de resolucion. A la persona qua va a utilizar et ricroscopio fe inocosa que ei linite de resoluclon desclonda, es decir que pueden verse os objetos que estén separades por la menor distancia posible, Por lo tanto también se deduce que se reguiere que ol microscopia tenga mayor pader de resotucién, en otras palabras que tongs mayor capacided para poder visuaizar dos objeios con e| manor limite de ‘Separacién entre ellos (limite de resolucié), Haz Luminoee nto de Elguca 4; Eoquema en ef quo se puede observer el éngulo ulizade para oblener ef seno de ail. En primer loger se debe ublear ef éngulo e aperture, que eo of coresporaisete al cone de hz que viene del corderisador€incide sobre la lente del objetivo, a continaacdéa se toma lermtad de éste (erianguo de apertura) y se obtene ef Seno ce ata para caluar fs epsrture numérica ‘poder de resolucién, menor lite de resokicion y Si lp que Ud. quiere es AUMENTAR EL PODER DE RESOLUCION DEBO DISMINUIR EL LIMITE DE RESOLUGIGN. Lo que es posibie hacer se deduce de la formula © Dismninuir el numerador. ‘2 Aumentar ef denominador. fiur=hostxn fox son) En primer lugar es posible hacer es disminuir fa Jongitud de onda, que en ta luz comin as de 550 nim y el de Ja luz ultravioleta es de 250 nm, Colocendo fittros azules 8 factibie hacer descender el valor de la longitud de onda, tra posibidad consiste en aumentar fa Apertura Numérica (n x 5en a}. Para ello to que se debe hacer es aumentar el indice de refraccién (n), esto se logra por ejemplo utilizando aceite de inmorsién, Finalmente lo que se podria realizar es aumentar ‘f somiéngulo de apertura que corresponde a cono de luz proyectado en la lente frontel. Colocando objetivos de Pequofia distancia focal o con lentes de gran apertura. b) Otros Tipos de Microscopios Opticos: Modificando algunos componentes del Microscopic ‘ptico se obtienen una serle de microscopios, de lo que solo vamos a considerar su fundamento y para que tivo de estudio se utilzan, + sMicnoscorio oe WONTASTE De EASE: | Permits Ja observacién directa de células vivas, Esto se debe @ que los componsntes celuiaies al recibir la iuz alteran en forma diferencial Ja faze de sus ondas lurninosas , ye que esias estructures. no absorten iuz, sino que fa retrasan, y fo hacen tante mayer sea <0 tadiGe de Tatraccion, 16 gue “bcutre “porque a muestra. ho esta Goloreada, Esto pioitoce que los reybs luminesos'hiego de “Biisiésat los distintos componentos de la preparacién, presenten entre si diferencias de fase que e ojo humano no puede percibir (ve gua). Este tipo de microscopic exagera {as diferencias, recombinando las ondas con diferencias de fase, éstes se aumentan o anuian entre si, resultando que estas diferencias pasan a ser de intensidad © britio, que pueden ser percibidss por e! ojo humana. El material a ser observado no requiere de tincién, por 10 tanto et objeto lransparente aparecers con diversos. tones do gris, dependiendo de su espesor y dela diferencia de su indice de reffeccién con respecte ai del medio. TECNICA HISTOLOGICA ¥ MICROSCOPIA, _Onda de luz incident _Trayecto Teérico Onda desfasada objeto “Onda con amplitud | disminuida el Figura n'& A, Se puede observar el recoxtido normal de una onda de luz (onda slectromagnética), en la que si no <0 intpone hingGén material w objeto en su treyecto, mantended un recomndo Constante en ampitud (altura) y frecuencia (ndmero de cclos,pleos y vales). En el punto la onda de luz atrvesa un material transparent tue fens un indice de elracein dtcente a del aie, I que prowoca un retarde 9 sminuciéa on le veiockied de la onda pero po une lsminucon de Su ampitud. Luego de atraveear el obo la velocidad ce recupera. En fines punteada se marca el recorico que debe haber ‘Soqulo la onda de sino ulese tenia ningin material nterpuest. C Lin objeto similar ol anterior pero se myer grosor provaca um relardo (camblo de fase) 0 sestasajo mucha mayor, D, Esto case Corresporde aun objeto que adems de car transparent, es absorbers, lo cual no solamerte provacs un retardo de fa onda sine ‘aonb une dkeinuoisn de omits. 4 MICROSCOPIO DE INTERFERENC! Es simitar al anterior, pero pone de manifiesio variaciones de fase aun menores, permitiende deducir ia concentracién en materies organicas de las estructures observadas y calcular su peso seco, Actualmente es muy usado un tipo de microscopic de interterencia atferencial, conocido como microscoplo de Nomarski, En él un Gnico rayo de luz atraviesa la muestra y <2t objetivo (en forma similar al microscopio comtin}, pero luego se divide en dos rayos que luego se recombinan & interfieren entre si. Finalmente ia imagen tiene un efecto de ralava y sombreado caracteristico. Una de sus principales ventajas es permitir la observacion de preparaciones mas russes que @! de interferencia, Otro heneficio esta dado por la posibilidad de acoplarie un camara de television que detecta imagenes con alta resolucion, estos datos se ‘ransfieren a una computadore permitiendo observar, por elempio, estructuras muy pequetias come los microtibulos (25 nm de didmetro} y vesiculas desplazéndose sobre su superficie, + MICROScOPIO DE CAMPO OSCUR Este micrccoplo permite observer preparactones. sin colorear, Consiste efi un mictoscopio comin al que se lea reempiazado por otto qué permite solo ta iluminecién oblicua del objeto, ya que tione un disco central que evita ei paseje de estos rayos. Al no incidir la hz directamante, 3010 Jos rayos oblicuos que son intercept=dos por cl objeto observado y desviados hacia el objetivo podiie ser observadoé: De esta forma aparece une Imagen orillarte sobre un fondo: oscuro er figura 6). Se observan on las cSlulas vivientes, como elementos brillantes destecados en al fondo oscuro det protoplasms: mitecondrias, membrana nuclear, ndcleo y vacuolas, Demuestra la existencia de pequeflas peiticulas. Estos matetises que ‘aparecen como biiliantes son més refnigentes y-cesvisn (a |uz oblicua hacia el objetivo. En medicina es muy utlizado para realizar el dlagnostice de Sifilis Primaria. Esta enfermedad esta provocadia por una bacteria conocida como Treponema ppalicizm, que en este periodo de ia enfermedad se encuentra presente y resulta visible con este mictoscopio. Su fundamento e¢ {a utlizacién de tluminacién lateral (oblicva) obtenice por medio de un condenssdor que excluye ef haz central. So utliza para el diagnostico de Sifiie primaria Aig ee ieee eee eee | ee 2 | Haz Luminose Zona Central sin fiuminacién~ | Hez Luminoso a | ‘Condensador | Figura 6: Eequera que explica el funclonaminia del microscapio de ‘campo oscure en el que puede observer como fa hz que es emia por ei condencador, e inonampida par un diese que imple el pasaje ‘Se! component central de! haz lurinogo. Solo podrin ser obesrvadas Tas sustancias que desvien ls rayos hace la ents del objetivo © MICROSCOPIO DE POLARZAGION: Este tipo de microscopio permite saber cusl es a! grado de retraccién dot material biologic a fo tergo de ilerentes ejes options MANUAL DE HISTOLOGIA Es un micron 316 convencional con dos elementos pclerizadores (cristales polaroid). El primer cristal (prisma polarizador) que se coloca debajo del condensador, descompone cada haz en dos que $e refractan en modo iferente. Uno se absorbe y el otto emerge polerizado con Ja ‘mitad de intensidad. Entre et objetivo y el ocutar se coloca otra polaroid (prisma analizador) que recoge totalmente el haz polatizado, ol cua’ ser més © menos absorbido dependiendo del angulo que formen os planos de simetria de ambos elementos. Con angulos de 0° (prismas paralelos) ¢l analizador es atravesado por todos jos rayos del polarizadcr. Cuando el angulo es de 90° (cruzados) a ‘analizador absorbe toda ta luz poiarizada y el observador ve el campo oscurecido, Si las sustancias @ observar son isétropo 0 monorrefringente, le luz no sufre modificaciones, Si en cambio observamos una sustancia._critalina 0 birrefringentes, como dijimos la luz se divide en dos rayos denominados polarizados, prillando la luz con mayor © menor intensicad dependiendo de la orientacién de la Platina. Estas sustancias enisétropas (birrefringentes), fienen poder rotatorio, hacen rater e plano de vibracién de ta uz polarizada que lac atraviesa apareciende como elementos brlantes sobre el campo oscura. * MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA: Este microscopio esta basado en la observacion de la luz visible emitida por componentes de le preparactén, ‘cuando ésta es ilumminada por onda luminosa de longitud de ‘onda muy corta (ultravioleta). Esta luz es absorbida por sustancias preexistentes (ej. vitamina A), que se denominan ‘autofluorescentes porque reciben luz de una frecuencia y la cemiten en otta frecuencia (en este caso del espectto visible) segin la compesicién quimica. Dentro de la preparacién ‘alguna de sus estructuras podran absorber la {uz ultraviolete ¥y omitir una longitud de onde mayor, pero dentro de un Fango visible (la cual va a depender del tipo de sustencia) Es un métode muy sensible y se pueden detectar cantidades minimas de sustancias sensibles a le fluorescencia. Es posible muchas veces observar material sin colorear porque algunos compuestos como fa vitemina A son autofluorescentes. En general sa introducen previaments colorantas fluorescentes que se unen a Constituyentes especifices de las céluias La mayor parte de tos microscopios de fluorescencia utilizan luz ultravioieta, pero oxisten algunos ‘compuestos quimicos que se excitan y emiten fluorescencia Por encitacién de fongitud de onda del rango visible, En este caso se filtra la uz que originé le fluorescencia y se deja pasar a fa que emits la sustancia fluorescente, Cuando fa fluorescencia es propia de le muestra se habla de autofluorescencia o fluorescencia natural, pero Si esta es inducida a través do colorantes (se denominan fluorocromes) se fo conoce como fluorescencia secundaria, Muchos de estos fluorocromos. (colorantos fluorescentes} tienen afinidad por algunos componentes colulares, io que se aprovecha pars su identificacién. Ef 12 Neranja de acridina << une al ADN y al ARN, unido al primero da una fluocrescencia verde-amarillenta y al segundo roje-amarilanta, EI microscopic de (uz polaizada tiene una Kempera de vapores de mercuric de alta presion para producir los rayos ultravioletas, © MICROSCOPIO DE LUZ ULTRAVIOLETA : Como fuente de luz utilize luz ulvavioleta, Esta tiene una Jongitud de onda muy baja, no se encuentra on of spectro visible y ademas su observacion directa dafia la retina. Por esa razén fa imagen que se forma finalmenta es registrada en una placa fotogritica, Una ceracteristice importante es la de tener un mayor poder resoluci6n que el microscopio comin (que Utiiza uz del espectro visible) porque la luz utravioleta tiene tuna fongitud de onda menor que fa luz visible. * MIGROSCOPIO CONFOCAL Es uno do los sistemas mas recientes en el que se combinan partes de un mictoscopio optico, al cual se ha adeptado un sistema fluorescente, con un sistema da ‘parrido que empiea un rayo laser (Ver Fgura 7, En una preparacién microscépica , por encima y por dabajo del plano del foco se encuentran estructuras desenfocadas, con contornos borrosos que dificultan la formacion de una imagen nitida Ei microscoplo confocal tiene la finalidad de oliminar tas imagenes desenfocadas, permitiendo obtener cortes de gran definiién. No se ilumina todo el preparado al riismo tiempo sino que se va realizando un barrido por puntos diferentes, La iluminacién del laser es convergent, 10 que provoca un Punto de barrido poco profundo sobre ‘a muestra, de este punto emerge luz que es onviada 2 un analizador (detector), Para que el detector reciba as sefales, deben ser de la imagen en foco y necesitan stravesar una abertura, (Las imagenes desenfocadas no convergen en este orificio y por fo tanto se eliminen). Un sistema de espejos mueve ef laser de a un punto por vez, luego se registran estos datos y se almaosnan en la computadora y luego se llevan @ un monitor para crear la imegen, Da una imagen de mayor jefinicién porque quita a las imagenes que estsn fuera de foo, es decir las que estan por airibe y por abajo del plano focal. Como las imagenes son almacenadas, se puede hacer una reconstruccién tridimensional, ‘NICA HISTOLOGICA Y MICROSCOPLA Aperturas Contacales Muestra~ “Tridimensional Figura Z: Esquema que expica el tuncionarionto del ticroscopio confocal. A, Inecaiante la muestra fs iuminaca a través de un ser que ingress. por la aberture (A), ego ince sobre un espejo, pase por un objetivo y converge sobre ls muss de manera puntusl A continuacin B fa muestra emfe rayos fuorescentes que 5¢ agen 8 una segunds ‘aberura (B) , que permite el posse de estos rayos ‘que forman tina imagen enfocada. En C se puede preciar como las imégenes desenfocades son flimnadas por no poder atravesar Je eberture ‘confocal c) Microscopfa Electrénica Este tipo de tecnologia revoluciond a fa ciencia en las ltimas décadas, brindando informacion sobre la composicion de las células hasta ese momento desconccida A partir del surgimiento de jste tipo de microscopla se incorpor6 el concepto de nivel ultraestructural deta célula, el cual representa a todo lo observable mediante este tipo de microscopio. Solo vamos a describir 2 dos fipos de microscopios electrénicos : el Microscopio Electronico de Transmisién y el Microscopio Electrénico de Barrido. MICROSCOPIO ELECTRONICO_DE TRANSMISION: ey, Su funcionamiento se basa en ef principio de empiear a un haz de electrones levisbes, on lugar de luz visible, para | ‘ormar una imagen, este haz de electrones, se desplaza en el vacio en linea recta y que puede ser desviado de su trayectoria y concentrado por campos magnétics 0 @ectrostaticos. De esta forma se fogran | efectos equivalentes @ los de las lentes del microscopio éptico. La longitud de onda |_____ empleada es de 0,05 Angstrom. Et Microscopio electrénico tiene componentes equivalentes ai microscopio comin, (ver figura) consta de lun fubo en el que hay un vacio casi total, que debo mantenerse por bombeo continuo’ y un filamento de Lente bith emples Je japiecner coun hey de & produur One imerer ) tungsteno (ei catodo), que al ser | caientado, emite un haz de | electrones acelerados por dferencia de potencial entre al. catodo y al ‘node. (La fuente en el microscopic pico es fa luz visible). El haz de || slectrones es coneanitade por un | campo electromagnétion que actiia | sane condannador ys localiza sobre el material exeminato. Este | se deposita sobre una finisima | | pelicula de oolodién que se coloca sobre una grilia matalica que le sirve de sostén, Una vez atrevesado ol preparado, el haz de rayos electronicos se halla someti¢o @ ta ‘accién de otro campo o lente magnético, llamado lente objetivo, que tiene como funcién aumentar el tamafio de la Figura 8: Eequema dol Mcroscopi9 Electrénico, en octal se puede aprociar a trayectorecordo por lo slocvones. En ot so destacsn Sus ‘omponentes mas importantes yadems como fnaknente la magen $= forma sobre una panfala fuorescerte, debiendo ol observador register laimegen cena sobre esta. y 3B Gn one peueste fre yeu et querer Se ratera raat pre ene pore be de misteip. Spice pero repuieres metodos + Hivos. 1, DE HISTOLOGIA, imagen. Finalmente el hae © slecvones es tomado por la lente de proyecién, que equivele al ocular y da de la anterior una nueva imagen aumentada, Esta, invisible a simple vista, es proyectada sobre ia pantalla fluorescente, que puede Ser observads cirectamente mediante una lupa en el ocular de vision 0 reempiazada por una pelicula fotogréfica que ser impresionada. La imagen producida por el objetivo tiene un ello poder de resolucion que permite al ‘cular aumentaria mes de 200 veces La formaci6n de ta imagen no depernde de ta esigual absorcién de luz que producon estrusturas coloreadas, sino que es el resultado de la dispersion de flectrones por esiructuras "eloctrénicamente censas* {tomes de mayor peso atémico), Las estructuras biolegicas estan compuesias bésicamente por C, H, Oy N, las cuales son poco densas y no producen dispersion de electrones, or esa razin fo tojidos que van a ser observados con est ’éonica requieren fjadores especiales que conserven mejor las estructuras como el glutaraidehiao y el telroddo de Cosmic. Asi como metales pesados que faciiten la ciapersién rones en fos aifarentes componentes celulares Resumiendo et concepto: todo ef instrumento en esencia es un tudo de rayos catédicos, en el cual se ecesita conservar al vacio por bombeo continue, porque los electrones hacen viajes cortos en el aire. Desde el cétodo tos electrones son acelerados y desplazados hacia el Snado. igure 10; Figura ene que se esqueratizan e fundamente delos microscopics 6ptco, elecrdnico de transmsién y de barrio a agen an — Peat Lente Sono | Repos cous | ! al suet “as ent 4) conser i sete | i Sonesta \ i fod Fuente eric camper) 1 Microscopic Optico rr Microscopio Electrénico De Transmision LD) | jegaltrmcts ) omer CENT Flgues_$: Esquema sobre el funelonamienlo del Microscopio Elecronioo de Berndo. En él se puede obsenar como una Faz de lecirones ince sobre la superficie dela muesra a observa, luego los clecirones se refleian y son tomados per un detecter, que ualizars ‘nelmente esta informscién para obtener una Imagen eh une pantalla delelevisn Este poses una abertura para et paso de los electrones, para ser enfocados por la lente del condensador en la pieza, los que al llegar algunos se dispersan y desvian del haz (ver figura 8). Los electrones que no son dispersos por las partes electronicodensas de la muestra son enfocados por el objetivo para producir una imagen amplificada de ésta. La imagen és ampiificsda més aun por una después por una lente de proyeccién, Finalmente la imagen se forma sobre imagen en 2 Pentate de Telee Musee sede barice Soteroide seen. ents ¥ Condenaders | 1 Anode Microscopio Electronica ‘De Bartido | tuna pantalla fluorescente + MICROSCOPIO ELECTRONICO DE BARRIDO En este tipo de microscopio elactrénico et haz de electrones rastrea la superficie de la muestra, en vez de pasar a traves de ella (es la diferencia fundamental con ede {ransmisi6n) con le finalidad de obtener luego una imagen tridimensional de la muestra. Los electrones refiejados y emitidos en forma secundaria desde le muestra que poses tun fino recubrimiento de metal pesado, se transforman en sefiales eléctricas que generan una imagen de la superficie fen una pantalla de televisién (ver figuras 9 y 10). La lente condensadora se usa para producir un haz angosto de electrones, que pasa por un espiral de rastreo que se desplaza hacia un lado y otto sobre la superficie de la muestra en movimiento rapido. En cada sitio en el que e haz incide con la muestra, se emiten electrones secunderios desde ef recubrimiento ‘de su superficie, los que son feunidos por detectores de electrones y su energia se Convierte en una sefial eléctrica, cuya intensidad se muestra fn la posicion correspondiente en una pantalla de television E| haz de rastreo sigue el mismo trayecto que el punto roductor de imagen en la pantalla de tolevisién y vieje en sineronizacion con él para generar as\ la imagen, TECNICA HISTOLOGIC Y MICROSCOPIA + ANALISIS DE RAYOS x: El haz de electrones generado por el Microscopic clectrénico de transmisién y el electronica de bartido, ‘cuando incie sobre la muestra tiene la carecteristca de generar rayos X, los que son caracteristicos de los elementos en los que ha lmpactado el haz, Para generar rayos X debe impactar sobre atomos oon masa mayor a la del Sodio. De esta forma se puede analizar el patron de rayos X de la muestra, lo que puede damos informacion ‘sobre ls concentracién y distribucion de fos elementos. el abjeto, desigual de la luz en diferentes zonas Dispersion de electrones, Lentes: Objetivo, ocular. Bobinas electromagneticas. 0,25 um, 2.2 10 Angstrom, Tubo simple con aire Tubo al vacto, Luz (Fotones) Coloreada o no Filamento incandescante ide Tungsteno electrones). Gama de grises (Usa contrastes) Células vives © muertas: del ocular 300 X a 1200 x, La retina capta los fotones, el preparado es ccaptado por ia imagen que recibe el ojo. través Células muertas. Le retina no capta jos electrones. El ojo ve una imagen del preparado proyectada en una pelicula fluorescente con capacidad de ser impresionada por electrones. Habitual: 90.000x a 60,000 x Méximo: 1.000.000 | Parafina, Celoidina Formol al 10 % 0 Nquido de Bouin + ‘Tetroxide de Osmnio o Gluteraldhide. ‘Aerlions, rosinas epoxy MicrStomo: 2.2 10 pm de espesor. UltramicrStomo: 60 2 80 nm, de espesor, Estructural Ulteeestructural 15 MANUAL DE HISTOLOGIA. D.Eormacién de ja imagen Para que sea posiole comprender como se forma ta imagen en el microscopio, ¢ continuacion explicaremos ta ‘marcha de rayos. . Como mencionéramos con anterioridad, en un micrasoopio compuesto poseeimos dos lentes: el ocular y e! objetiva. Tanto el objetivo como et ccular son les encargadas de la formacién de la imagen. Estes lentes son convergentas. Los elemenios que constituyen un lente ‘convergente son © Dos superticies esféricas. © Un contro option, '¢ Un eje Sptico: es la recta que constituye los dos centros de curvatura Dos focos: 1) ef fooo objeto (f) 2} e1 foco imagen (P*) Debemes considerar en esta punto dos leyes de ia ‘ptica muy importentes, que nos petmitirén comprender la formacién de ls imagen (ver gua 11} lov, Leni, | | ih | | [ Se Ootco, | cr x == (Dobe ua, cirancto \ ceive Sotco Foo) y | Figuca 11: Esquema en ot que se representan 2 leyes Sptioss fundemertsies que permten expla i formaciin de ia imagen. Ley Niro, Ley No.2 igs nen anes een En et microscopic ia primer lente en recibir te imagen es @l objetivo. Para que allo ocurra, la muestra debe colocarse entre el foco (f) y a doble distancia focal, obteniéndase de esta manera una imagen real, mayor & Invertida (Ver Sgura 12). Esta primera Imagen es tomada por el ocular, que ftrabaja como una iupa. El ocular se encuentra @ una distancia espectica del objetivo, permitiendo de esta forma que la imagen formada por el objetivo caiga entre el foco (f) y [a lente det ocular, Esta imagen asi formada es mayor, inveitida y virtual con respecto al objeto. Decimos que es vitsal dado que @ forma por fa proyeccién de los rayos. (Wor riguza N° 13) Fiqura 12: En esta fqure se puede observer como e objetivo lage ala fermaciin Ge fa Imagen, destzcando que la muestra se debe ubicar entre el focey ol dable foc. Figura 12: En el esquema ee puede observar is forma en que el ocular olabora en la formacién de la imagen, ademés de tener uns epresentacin global defa marcha de tayo del nicroscoplo, Figura 4: Geico que sjompliica lo que postia ovum sicalosamos et preporade al revés. Como ce observa la mucsira quedors binada tuera fie! dable foco del objeto, enionces asia lente forneria luego una Imagen que se ubaria entree feco el cable foco dl ccuisr (Para que ‘36 forme la magen defintva era necouaro que esta ce ubiaue entre el focoy el cerita Spo}. Seer | id Reply Nebo ¥ Ipons objeto ECNICA HISTOLOGICA Y MICROSCOPIA ‘Una pregunta habitual en un examen cusnde uno no fe cae muy simpatice al docente es: por colocames un preparado al revés (con ol Cubrechjefos, hecia ebai0} cuando enfecamos con el objetivo seco fuerte, no lopramos enfocar ia imagen? La respuesta est fon fa marcha de rayos Si se colooa oi preparado al revés, ia muesta queda ubicada mas lejos de fa doble distancia focal (Dfi (recuérdese que la imagen ceberia formarse entre el foo y al doble del foco). debido 2 que el espesor del ortacbjetos no le permite al iente objetivo acerearse io suficionte a ia muostra, por lo que no se llega @ hacer {oco. Por ello, la imagen que nos daré et objeiva no se uubicara ontre el fooo y fa lente dat oculer. Si permite ai ‘adecuado acercamlento dal lento a la muestra ol ‘cubreobjetos, dado que es més delgado. Veamos la explicacion gidficamente (Ver figura 14) 's un conjunto de procedimientos especiales que permiten la observackin del preparado en et micfoscoplo Previo a un andlisis de la tcnica endriamos que hacernos una serie de preguntas ara comprender mejor el por qué de todo este procesamionto. En primer jugar uno deberta tener bien claro cual 85 e! fin 0 la necesidad de procesar el material de esta forma, A asto podriamos responder que nuestra objetivo fundamental es la observacién al microscopio Optico de los diferentes tejidos. Pero un bioque de tejido posee un grosor que hace que sea dificuttasa su observacion. Por to tanto tenemos la necesidad de cortar los tejidos @ observar y ademas de colerearlos para que nos brinden mejores imagenes (si la muestra a Observar no es coloreada es muy poco lo que se podra ver), En este punto podemos ademas destacar que para que Sea posible cortario, el blogue de tejido debe poseer cierta rigidez, lo cual se logra infitrandote un materia! que se la otorgue. Este paso se denomina inclusion De esta forma nos queda une secuencia de pasos Genominados Inclusién-corte-coloracién, @ los que posteriormente las agregaremos otros. El examen de tas distintas estructuras de células y tejidos en muy pocas ccasiones se puede hacer itectamente sobre el tefido vivo 0 una parte de éste, que aisiada sabrevive un tempo con el agregado de un colorante: vital o sin él. Esto ultimo es lo que se conace como examen al estado fresco 0 inmediato, Pero lo més frecuente es ‘que Ia observacion se haga sobre organismos (o sus partes) que han sido muertos por haber sido fijades y luego coloreados, esto se conoce como examen mediato 0 post- mortem. Cada uno de estos tipos de formas de examinar a Jos organismos tiene su indicacién precisa y su importancia {de acuerdo a fo que se quiera observar. A Examen inmediato o in vivo Examen al estado fresco: Se observa 0! material directamento sin ef agregado de sustancias que lo modifiquen. Uslizando microscopios como el de contraste de fase, Interferencia y campo oscuro es posible diferenciar distintos componentes. {Ver fundamento de cada ‘microscopio). EI material empleado para el estudio mediate este técnica consiste principalmente en animales microsconicos, células libres_de_animales _superiores, .adas dé los epitelios de revestimiento v obteniso de También calulas deserroliadas in vitro en cultvos alios especiales Examen con coloracién vital: Se emplean soluciones muy ciluidas de sustancias colorantes no téxicas, ltarradas golorentes vitales, que se introducen en el ‘organisme por le Via digestiva © por Inyeceién en el tefdo celular subcutneo o en el torrente sanguineo 0 linfético. La coloraci6n obtenida en este caso es intravital, Ejempios de Coforantes Vitales: © Litte-Carmin © Azul Pirot © Azul Tripan ® Azul brillanto de Cresifo (utitvado también para poner de manifesto, mediante una coloracion supravital, fos Teticuloctos -un fipo de glébulo rojo todavia inmaduro- de un extendido de sangre) © Azul del Nilo Los mismos colorantes pueden ser usados in vitro. haciéndoos actuar sobre cétulas libres ain vivas, colocadas fen pottaobjetos, lograndose de esia forma una coloracién supravital Ejemplos de Colorantes Supravitales: © Verde Jano © Rojo Noutro. Ww MANUAL DE HISTOLOGIA Ee opertuno dejar claro que ios colorantes son vitales, la division en supravital e intravital es por la forma fen qué son utizados. La ciasificacion de los colorantes en uno y otro tipo es por utlizacién més frecuente, os decir ol verde Jano es un colorante vital que més frecuentemente se usa como supravital, pero podria ser usade como colorante Inravitel B.Examen mediato o post mortem: Se racurren @ métados de coloracién més compiejos que exigon la muerte previa de la eélula por fijacién. ‘A continuacion vamos a mencionar posteriormante = explicar los que se consideran como pesos 2 seguir para llevar a cabo la técnica histologica eno exemien_postsmortem. Pera que i descripcien tenga un mayor entendimiento cade paso seré explicado tomando como modelo la técnica de inclusién on parafina. (Ver figuras 16 y 16) PASOS: 1 OBTENCION DE LA MUESTRA, 2 FUUACION. 3. INCLUSION: 3.4, Deshidratacién 3.2, Aclaracion 3.3, Inctusién 4 CORTE. 8. COLORACION. 6. MONTAJE FINAL. 1. Obtencién de la Muestra: Dat teido que se desea estudiar se extrac un pequetio fragmento 0 piogue, el cual es obtenido mediante un procedimiento denominado Blopsia (consiste en la extraccién de un fragmento con fines diagnésticos 0 la ablacion quirdrgica en un oigenismo vivo, 0 la toma después de muerta la persona), Para que la técnica brinde los resultados esperados el bloque de telido obtenide no debe exceder et centimetio de lado, e inmediatamente se ‘dabe realizar ei paso siguiente que consiste en coocarlo en tun fiador (ver figura 18,Peso 1). 2. Fijacién: Es un metodo Netlgln.de_aeseacin pore cbtenes proparae tadoos te seen morfoldgica_y quimica similar a la que presentaban las cee ttt cw whey cus poral eal posieriormenie los procedimientos de coioracion. (Ver figura 15,Paso 2) Se define a los fijadores como a las sustancias guimicas y agentes fisicos que tienen ese objetivo, En ‘genera’ los mas usados son los fjadores quimicos, 18 Cusfidades de_un Sfador ( ,Cual es su finalidad © para (qué 62 usa on fhador?) 1) Aetuar con rapide, matando y fijando fas célutes antes de que aparezcan los’ fendmenos post-mortem (autdlisis, desintegracion). 2) Poser alto poder de ponetracién pora asegurar ta fijacién correcta, hasta de las capas més profundas de la muestra, 3) Conservar fos detalles esiructurales que presentaba ‘cuando estaba vivo. 4) Peinitir © favorecer ef empleo de los procedimientos necesatios pare su observacion posterior (ejecucion de cortes, eoloracién, ete), 5) Impedir ta desaparicién de los elementos solubles durante la fijacién o después de ella, 66) impedir la formacién de estructuras artificiates. 7) No retrser demasiado los tejidos ni hacerios friabies 0 quebradizos No existe un fijador ideal para todo to que uno quiera observar, por esa tezén el fijador a clegir debe adapiarse a 10 que uno busca observar. (Ej. para observer luna mitocondria al microscopio electrénico requlere de un fijador en especial) Podfamos decir que ssenciaimente actdan ‘coagulando los principales componentes del protoplasma: fas proteinas, ya que de esta forma se preserva le estructura general del ndcleo y del citoplesma, 5 auth ‘Simples: una sola sustancia qulmica, © Formol al 10%. © Glutaraldehido (Muy usado en mictoscopla etectrénica) © Tetréxido de Osmio (Usado en mic, elect.) © Acetona en fro: preserva enzimas, fostatasas y lipasas. © Alcohat Metilico, utilizado para fijar extendidos de sangre o lfquido de puncién, Gompusstos o mezclas filadoras: Constituidos por varias sustancias © Liquide de Bouin (Mezcle picto-formol-acética), © Liquide de Flemming (Mezola cromo-osmio-acética).. ECNICA HIS! LOGICA ¥ MICROSCOPIA Rifién a) Deshidratacion —b) Aclaracién X\ @indusion | @Obiencién | delamuesta @) Fijacion Moesira ©) Inclusibn | EB | 7 | ec 0) © / | Esta @ Corte | | Cuchi dot Porteotietos — puestra Parafina i | r _ 2), 6), 4), €), 9. 9). BY | yy // Deseriptes en 61 | ce a) Extensién y adhesin esquema de coloracién | “delos cores } | Portabjetos, Cubreabjetos © Coloracién capt, ®© Montaje final i Eiqure 48 : Eequoma en el que e raaresentan los principales sasos de a eeisEEe PR iol ios qub en acthen con meyer pretaeden i © guide de Zenker (Mezcla bicromatosublimado- txdo correcconcente, Loe dbyjcs tenen como finaides) feoitar ta action) interprelacin adeouads de los concepts, por esa razén se deokié en tigunos casos hacer una representacien mds simpla (este 3 el caso @ Léquido de Helly (zenker-fom tel micrétom, en ef que ae retenent tan sole ala cuca) paatorreereeteceeeeereeee 19 MANUAL DE HISTOLOGIA ® Desecacién: Utiizado en extendidos de sangre. Se fectia répidamente. ® Calor Soco: Usado on bacteriolog ® Frio + No es un verdadero fijedor, detiene procssos, vitales. En cuanto deja de actuar se reinician los procesos de degradacién. © Congelacién y Desecacidn: Consisie en congelar fos telidos en aire 0 nitrogeno liquide @ -i95 grados y luego deshidratario al vacio a una temperatura de 30 0 40 grados. La ventaja de! método reside en la rapidez con que se inmunohistoquimica. L Célules: — inmunocitoquimics, | Pare e! caso de los {efidos fa inmunomarcacion se efectila sobre cortes filades y montados bistos (recuerden t€cniea Ge Inclusién en Parafina). Es importante Fefener esto, no olvidar! Método Directo Es te localizacion de un Antigeno por un. Anticuerpo. El anticuerpo deberd marcarse para que sea visible, Ejempio: Tenemos una preteina X que se distribuye or distinios teidos de un raton y as interesa saber en qué Igjidos no estaré esa protoina X Pata este raton del que ‘estamos hablando, la proteina X no representa un antigeno ya que le pertenece y 12 reconoce como propia. 1: Lo que se realiza es fa extracién o purcacion on et raton de esta proteina X a inocularseta @ un conejo. En fe! congig_posa a ser un antigen porque pare él es evra Figure 3). 2: Como la proteina X on el conejo os extrahe so producin entcvemos contra ésta, Le que @ continuacion hago cs purvicar del conejo los anticuerpos contra. la proteins X:(ver gua 24) 28 Proteina de ==> ‘Figura 25: En primes tgar se ena la pleina de rain, fa que kuego fs inccilada en un cones Aniicugtpes Proeina a “MIDE Protein, extrafe oro} conde fatnigese Se piBeveen Mahucuelf os contd seta | Lz inoculacén de una proteina edrafa en el conejo (bea det etn) prowoca la pokckn de anevereee dens comtreesta. Figure 26: Eoquema’ que muestra i conjugacién de anticuerpos, ot: A estos sigs ih scopes entuonts' co Toe SORES. Eee 2 cs traces ciaees i fcaecemenrrs ecto fluorescencia al observatlos con el microscopio de luz ultravioleta, (Ver figura 25). | Extraccién del tefido 4 ‘Técnica histolégica Preparado | elido det atom Portaobjetos a usa cei Yl 4°: Mencionamos en el primer paso que queriames saber en que taidos del ratén no tenfa proteina X. Entonces to que se realiza a continuscién os oxtrser del raton una muestra de teido, se la fia y sola incluye en paratina, luego realizo e| montaje sobre un portaobjetos. (Ver feuraz®) TECNICA HISTOLOGICA ¥ MICROSCOPIA Thora se pone 6! preparado en una cubela y se le coloca una solucién con los anticuerpos _dei_concio matcados, Si en el teido que se tomé de raion habia proteina X se le uniré el anticuerpo dal conejo marcado, Cuando observe con el microscopic de luz ultravioleta. se ara visible la luorescencia que emite et fluorocromo.(ver figura NP 27), Figura27: Se coloca ei proparado de falén, en una cuts con sotucén ‘que contiene anicuerpos contra proteina X (magen supercr). Si hay proteina (enagen inferior), resutars visite ‘Método Indirecto: En el método indirecto un antiouerpo primario no conjugado se une al antigeno buscado. Para localizar esta uuniés) es necesario un segundo anticuerpo (anticuerpo ‘secundario) que reconozca al primario, Este segundo anticuerpo debers estar marcado. Esta técnica amplfica ta sefial que identifica al antigeno. Ejemolo: Queremos encontrar ta Prote!na X por este méiodo, Repetimos la purificacién de ia proteina de! rat6n y [a Incculacién al conejo que producira enticuerpos contra esta proteina ya que le es extrafia. A continuacion el paso a seguir es purficar esos fanticuerpos de conejo ¢ inocularselos @ una cabra. Como podran imaginer esos anticuerpos serén exirafios pera la cabra, comportandose como anligencs. Al comportarse ‘como antigenos en la cabra se van a producir anticuerpos ‘contra éstos.(Ver igure 28), Inggule enticuerpes | we ont der ceney Inccule proteina ¥ Produce anticuor contig vicaerpbs. | | delcone | ‘Eoure 28: En pemer Kiger se esr det rtén i protein a busca, a fue a contnvacicn se lees inoclada al conejo, ef cual va @ generar Produge cna EEE ‘antiouerpos ©, conta esta prosina extafta (dean). Fnaimente fl anicterpo oe conejo se inoduce en uns cabta, la que genera amicus de cabra Sonits el avioverpo de cone. Purifico estos anticuerpos de cabra que se unen a anticuespos de conejo y 10s conjugo con un fluorocromo.(Ver arene oH ' neocon ge Been | * ess i‘ i onjagacion de Ariicuerpas de Gabia con un Nuorecroro. Figura 28: Con A continuacton, se coloca en la cubela el preparado. con el telido de ratén quo tiene la proteina X. Ahora se agrega una solucién con anticuerpos de conejo contra ésta proteina, EI paso siguiente es lavar el preparado, Si habla proteina X et anticuerpo de conejo se uniré a ésta y no se pierde en o! tavado. Ahora se agrega una _solucién _conteniendo centicuerpos de cabra marcado, Si habia snticuerpo de congjo unido a prot. X el anticuerpo de cabre se podré unir fl de conejo. Como et anticuerpo de cabra esta marcado su fluorescencia podré ser visualizada con el microscopic de Juz ultravioleta. (Ver figuras 30 y 31). i | | Preparado con ae ERR RB cut le ¢ tenia de conejo PreParado cop tj de raton rotahha hse ahs anilote Elgura 30: Se coloca en ta cubeta funagen superior, lz muestra ‘con telido de ratén, que tlere una eoluciin con anticuerpes de Conejo contra la proteina buseada, uego (Imagen inferior} coloco luna oluelén. con anticuerpos ce cabra marcados, dirgidos contra los anticuerpos de conejo 29 MANUAL DE HISTOLOGIA Prissy .° ie eaeeste seggece coreg eters Fluggporome Figura ti Si habla anticuarpo ie canejo unido @ proteloe x, eb nicuerpo de cabre podré unirse af de sonajo. Como el de catra esté ‘mercado podeé visualzarce con a microscopi de luz train Sino hubiera proteina X #! anticuerpo de conpjo se pierde on et lavado, enionces cuando se agrega el anticuerpo de cabra marcada no encontrara a quien wnirse. Se vuelve @ lavar y los anticusrpos de cabra tampoco quedaran en e| preparado. Per lo tanto no se visualizan. (ver Migwre22) cape “Sea os articuernoe de cebramaccedos contra | "RURESEESE Sai pe SMS eae Lo eee! rpo.de Gereia_ ‘iguea 22: Al no haber protcine X en la muestra, el antcusrpe de Conejo no ene. Por eso cuando colscamos el anlicuerpo ce cabra, tampoco puede unise, pergle P= puede encontrar al anlicuerpo ce conejo coira el que esta cig. ‘Como vemos, a amplifeacion en cl intiracto. esuita de la unién de muchos anticuerpos marcados, @ diferoncla con el directo que se une solamente un antizuerpo marcado. Proteina X e¢ toda sustancia que se desea Investigar y que se comportaré como antigeno. ©) Fraccionamiento Celular Sabemos que les oéluias ya no son como se las concebla en ef siglo pasado similar a un huavo con un ‘icieo y un protoplasma (homologando a a yea y la clara respectivamente), Muy por ei coniario, ja oétula abarca un submundo rico. en pequefios organulos denominados corganelas tales como mitoconctias, ribosomas, aparato de Golgi, etc. Hoy en dia contemos con metadologias que nos permiten el estudio de cada uno de los compsnentes 30 Gubcelulares,siondo el mas importante ta ultracentrifugecién diferenciat, (Ver Figura 33en el Cuacro NES), Este sistema fue ideado para lograr ef estudio de los diferentes orgénulos que conforman la célula, en base & las diferencias de tamafo, peso y densidad que existen entre estos. De esta forma se dasarrcfié un instrumento que es capaz de imprimir 2 une solveién una fuerza certitaga de moco que, veriando ‘a fueza aplicada, en el fondo det recipiente sodimente un dotermmnado componente celular La ulranentrifuga. es alge similar 2 un KohicNoor, pero mas potents, Esta formacs en realidad por una carrera Tofrigerada que trabaja en vacto y un motor que gita hasta 80.000 r.p:m, Esto es responsable de generar una fuerza de secimeniacién 500.000 veces mayor a le fuem= de grevedad, De ests forma vanando la fueza de Sedimnen‘acign y el tiernpo al cual la solucién es expuesta es posible obtener en distinins niveles fos diferentes componentes celulares. Vaameos. En primer termino se debe realizar un homogenizado celular. Esto significa que la célula os rota para ‘ogrer una suspension de todos sus componentes, ‘como su nombre Io indica, hamogénea. Esta solucién se introduce en le centrifuga y se fa somete a una velocidad equivalente @ 1000 veces ia fuerza de la gravedad durante 40 minutos. Al cabo de este tiempo se obtiene una solucion que contiene nicleos, célules ontoras y las. proteinas pertenecientes al cltoesqueleto. E! sobrenadente se extrae para volverio a someter @ otf procedimiento de Centrifugacién, solo que esta ver ser 20.000 veces la ‘gravedad durante 20 minutos, De esta forma se obtiene un Sedimento con mitocondrias, peroxisomas y_lisosomas. Nuevamente ei sobrenadante 05 retiredo para volver a la centiliuga e imprimirle durante una hora 80.000 veces ta fuerza de giavedad. Bajo estas condiciones obienemos pequeties vesiculas y microsomas. Finalmente, el resto de Ja solucién es expueste durante tres horas @ una fuerza de centritugacién similar 2 150.000 veces ia gravedad. EI Tesuitado es la obtencién de ribosomas, vitus macromotéculas gigantes en el sedimentado Microsomat [Cuando un homogenizado de oélulas es centrfugedo a| 180.000 veces la gravedad durante una hora sedimentan unos pequefios cuerpos envueltos de membrana que reciben el nombre de microsomas. Estos microsomas 0 fraccién| microsomal, corresponde a les cistemas del reticulo| ‘endoplésmico que sedimentan en el fondo del tubo en forma| [de microsomas. Con esto queremos significar que tos| ‘microsomas no existen en le célula viva, sino que san el resultado det proceso de centrifugacién. Es por ello que| [decimos que los microsomas son artificio de la técnica TECNICA HISTOLOGICA ¥ MICROSCOP{A, Como se desprende del parrafo anterior. cuanto ‘més pequefia es le molécuia mas energia cinética y durante més tiempo se necesitaré para iograr que sedimente. La forma de medir fa energia necesaria para logrario se lleva ‘acabo por medio del coeficiente de sedimentacién medido en unidades Svedbeg o 8. Una unidad Svedberg equivale a 11x 10 segundos. ‘A continuaeion (ver cuadro N° 6) enumeramos el coeticiente de sedimentacién (S) que poseen los diferentes organulos calulares. ‘Guadro N° 6 Coeficiente de sedimentactin de los diferentes organelas celui. __Particula, Cosficiente S. Lisosoma 940 § Ribosoma 20s ARN ribosomal 288 ARN de 4s Homogentzado de Tei j | 1000 veces ta | Células enteras vravedas | Nistcs en | i Citoesqueleto, 1 gravedad oe? Lisosomas. 20 Minutos. *e eal Petorisomas, Co! | = 1 womrenn | . a ar | oe Pequefias Vesiculas. | 1 Hora | | | ‘s0.000vecesia | Ribosoras ae | Virus. ee | iz Macromotécules. ‘Gundro.n® 5 ; Nveies de faccionsmiento ceil d) Cultivo Celular Si un grupo de células es separada de! organismo del cuel forman parta, es posible qua sobrevivan fuera de él si las condiciones le son favorables. Esto significa que si se Ta provee de los nuffientes necesarios es posible que van, ‘crezcan y hasta oxpresen sus caracteristicas de diferenciacion en una placa de vidto. El cultivo cefular es une valiosa arma de le que se vale el investigador para estudiar el compottamiento, las Interaceionesy los efectos que causen determinadas sustancias sobre las células. 31 MANUAL DE HISTOLOGH ‘Un medio de cultive goneralmente esta formado por agua y sustancias esenciales pera la vida ceiviar, tales como giucosa, amineacidos y sales como NeCl, KCI NaHCOS, etc. También susie incluirse en el medio de cuttivo vitaminas como biotina, nicotinamide, dcido pantoténico, iamina, acido folicg, etc. Clerias’ veces susie sor imprescindibie te adicion de factores de crecimiento fespecificos como los Factores de crecimiento fibroblastico © del tejido nervioso. Los cultivos celuleres se pueden clasificer en tres grupos fundamentaies: primarios, secundarios y de lineas celulares, Los cultivos primarios se formen a partir de la obtencién de celulas vegetales o animales y su Cultivo en et medio adecuado. Las ceiuias de este tejido deben separarse mediante tipsine & alain olfo metodo adecuado. Cada una de estas célules puede ser separeda individuaimente y 2 partir de elias formar una cepa derivada de un solo tipo celular (monoctonal). E} cultivo secundario es aque! que se obtiene a partir de oétulas tomadas de un cultivo primario, “Tanto las células del cultiv primario como fas det clive secuncano, tlenan un crecimiento imitado (tienen un cierto nimero de divisiones celulares) Las fineas celulares corresponden a células adaptadas a cracimientos prolongatios, eso es debido a que fen genoral surgen a partir de células tumorales (que tienen tun numero de sivisiones indefinido). Por ejemplo tas lineas Hela En algunos casos Se puede lograr que en los cuitivos celulares lae células se fusionen y formen una solar Sélula, que, kuego de la Union, se encuentra formada por los dos otaplasmas y dos nicieos. Esta masa citoplasmétioa binucleada se denomina feferocarion. Los ndcleos que forman paite de! heterocarion es posible a su vez fusionarlos fotrmendo una oélla hibrida. Este provedimiento es sumamente atil para el estudio de los genes y su ublcacion fon los cromosornas, De esta forma fue posible esteblecer que determinados genes se alojan en un determinedo Gromosoma, como el gen responsable de una enfermedad erominada fibrosis quistica se aloja en el cromosoma 6. Debemos mencionar que merced a esta metodologia, argentino Cesar Milstein, fue capaz de sintelizar en e! faboratorio los anticuerpos monocionales. Milstein fusioné una ceélvla cancerosa, lo que signifioe que se reproduce de tal manera que es practicamente inmortl, ‘on un linfosito B, El linfocito B sintetiza unas proteinas denominades anticuerpos o inmunoglobulinas contra determinadas sustancias (contra proteinas vireles, bacterianas, proteinas que le son extrahas al organismo, etc}, Pero el linfocito B sinteliza a fo largo de su via uno y Solo un tipo de anticuerpo, de tal manera que si cultivo un linfocito obtencré un soe tipo de anticuerpo. Eso fue Io que 's0 propuso Cesar Milsteln y fusioné a le célula inmortal con. llinfosito 8 y obtuvo el beneficio de las dos células: gran Cantidad de oéluies que sintetizan un solo anticuerpo, Este escubrimiento fue lo suficientemente importante como para ‘Que ef Dr, Milstein fuera un justo merecedor del premio Nobel, Su descubrimiento se ultiza en cosas tan cotidianas: ‘como al lest de embarazo que hoy se vende en los quioscos ¥ nos anuncian ef arribo de un nuevo ser a nuestro planeta, & bien, nos deja tranquilos al saber que uno no necesita cesarse de golpe por culpa de un mal céloul. H.Interpretacién de cortes de tejidos : Antes de iniciar ef estudio de la histologia, es necesatio realizar algunas aciareciones en relacion @ lo que ‘vamos a observar en fos teidos y como interpretario 1. Artefactos Un conceptc importante a tener presente es que al estudiar un corte an ef microscopia, le estructura de las Células y los tejidos esta alterada por el procesamiento istoligico Se produce la precipitacién de proteinas y diversos cambios en las mokéculas que forman la oil, fodo producto de las distintas etapas de la técnica histologica que por accion de fijadores y aleoholes produce diferentes mocificaciones. Una de estas importantes ‘modificaciones producto de [a técnica puede generar lo que conocemos como artefactos. El artefacto es un producto arfiicial, generado durante la preparecién, que inciuye los fenomenos que se observan en el preparado pera que no fexisten en el telido vivo, Cuando les cambios producidos son ‘ecesionados por (a fijacion se habia de artefactos de fijacién Uno de fos artelgctos més comunes es la rotraceién (producto del uso de alcoholes 0 ute deshidratacién acelerada), en la que se observan grietas © ‘espacios sin estructura bioligica en ese lugar. Otro artefacto ‘es el precipitado de colorantes, son depésitos de colorante sobre el teido. Los pllegues o arrugas producto del corte Es frecuente tambien cbservar defectos en el corte por impertecciones en la cuchilla, estos se ven como une linea recta a lo largo de las estructuras a observar 2. Interpretacién tridimensional [AI observar una Imagen de un {edo uno debe tener siempre presente aunque la veamos pidimensional, que ésta es siempre tridimensional. Por ese razon @s ecesario reconstrulr mentalmante la estructura observada, Como puede observarse en la figura 34, cores a traves de tun mismo objeto (en este caso una estructura tubular), pueden adoptar una apariencia totalmente diferente, Para Que uno pueda hacer la interpretacion mas adecuada vamos a introducir algunos conceptos Figura 24: Esquema que muestra los aferentes aspectos que puede ‘adoplar una misma estructura (en este caso correspande a un tubo © ‘manguera), sagan la icidencia dai corte. En nea panteada since ‘tio dl cate, y a conkinuacién se sefaiao resultado na de ese tipo de ineidenoia En Ao cere mussira un solo tubo, a clferencia de B en fe que la imagen muestra dos, En C un corte en la cuna da la ‘sparencia de une incdencia por dos ostructuras tubulares muy Cercanas, En D el tubo parece toner una forma diferente, En C abarca Ia longitnd del tubo y nF pasa sobre a pared consttuyend lo que se denomine un core tangencia Planos de corte : Corte longitudinal es aquel que se hace paralelo @ la mayor dimension de una estructura, Cuaiquier corte perpendicular @ este se denomina transversal, Un corte entre los"dos planos se denomina ‘obiicuo, En el caso de las esferas se dice que los cortes son transversaies. Si un corte pasa muy cereano a la superficie se dice que es tangencial (ver figura 35) ‘gure 35 : Eaquema en el que so pueden epraciar lo citirtos pianos cecotte A, A\A” y 8 represontan corse ransversales, pao que da “agence ftaimente clerentee por pasar por diferentes sectores de a ‘muestra. © representa un core longitudinal, D y E cortes oblcuns ue pasan por dferenies sectoces Las imagenes mas frecuentes en el organismo ‘cuando una les observa al microscopio corresponderan a + TUBOS: En of orgenismo son numerosos y de distintos tamafos, corresponden en su mayoria a vasos TECNICA HISTOLOGICA ¥ MICROSCOPIA Sanguineos, linfticas y sovructos que utilizar las gléndulas para expulsar sus secreciones, Come hemos. apreciado en fa figura 34 ef aspecto que pueden tomar es muy variable, resultando facil eu identifeacion solo ‘cuando el corte es transversal, en los restantes pianos tal vez se requiera una teconstrucci6n tridimensional Figura 38. Esquema en el que se muestran diferentes cortes de un Tube cuvo en el que se realzaron secciones a dstiniosrivees. En e} feequera a izquerda verios como la seocién nos muestra dos tubo tortades Unidos por un tablaue, en el medio un solo tubo de mayor tdmeto y ol eaqueme de ta detecha (el corte a nivel mas infer) no ‘muestra ning tubo, porque el corte es tangenci + TABIQUES: La_mayor parte de los érganos se halian ‘lvididos en Su interior por tabiques de tejdo conectivo Muchas veces suelen separar compartimentos de tamahios similares, pero suele ocurrir que al observario, al microscopio tomen la apariencia de tener diferentes tamafies (unos mas gfandes y otros mas pequefics), esto se explica fécilmente en la figura 37, que muestra ‘como una naranja dependiendo de el tipo de plano de corte nos dara apariencias muy distintas en cuanto al tamaio de sus compartimentos (que sueien ser similares) | | Cote Longitudinal Eiqura 31: Esquerna que muosta fos dsinios aspectos que puede ‘mostrar na naranja, cependienco del plano dis corte. Recomendamos que antes de sacar conclusiones a cerca de una imagen observada, es necesario pensar en jo {que se podria encontrar por atriba y por debejo dei piano de corte, Es per eso que para tener una idea adecuada de le imagen tridimensional se realizan cortes seriados, © sucesives a través del teido a ser observado. 33 MANUAL DE HISTOLOGIA + Mariano S. H. Difiore Diagnéstico Histolégico.. Tomo | 2B Eicion, 1981. + Ham, Cormack Tretado de Histologia. 8” Edicion 11983 Ecitorial interamericana, = Cormack, Histologia de HAM.S” Euicién. 1987. Editorial Interamericane. + Bloom, Fawcett. Tratado de Histologia, 11"*Edicion, 11990, Editorial Interemericana, + dunqueira & Camelo Mistologia Bésica, 4° Edicion, 11906. Eaitorial Salvat. © Leon Welss Histologla 5 Edicién. 1986. Editorial Et Ateneo Finn Geneser. Histologia. Panamercane. + Ross, Romrel, Histologia. 2"Edicibn 1989, Editorial Panamericana 2 Eaicion 1994, Editorial 4. 4Cuales son los componenies de un tejido? a} Pooas célules y mucha sustancia intercelulr.. b) Céluias y sustancia intercelular en proporciones seqiin tipo de tejdo. fc) Muchas eélulas y poca sustencia interceluler. i) Igual cantidad de células y sustancia interceluiar, 2. LCusl es el limite de resolucion dei microscopic plion? 8) 3,25nen, b} 9,384, ©} 8,380 3} 02 3. {0UsI de las siguientes lentes se utiliza para corregit lung aberracién cromética? 3} Qculares Apocromations. b) Objetivos Acromaticos, 6) Oculares convergentes 4) Objetivos monocromations jar. © Alberts, Bray, Lewis, Rafi, Roberts, Watson, Molecular logy of the Cell-Third Editon 1994. Publishing, inc :Garland. «Alberts, Bray, Lewis, Raff, Roberts, Wetson. Biologia Molecular de fa Celula.1* Edicion. 1890. Ediciones: ‘Omega. © De Rabartis (h), Hib, Ponzio -Biologia Celular y Molecular de Eduardo P. De Robottis. 12"*Edicion 1896. Editorial El Ateneo ‘© Murray, Mayes, Granner, Rodwell. Bioquimica de Harper. “Edicion, 1988, Editorial E| Manual Moderna. = Antonio Blanco Bioquimica Humana., Edicién.1986. Ecitorial £1 Ateneo © Tohefnitchin, Histotogta, Edicion Mediterraneo, 1935, Editorial 2 Smith, Copenhaver. Histoiogia de Bailey. 11°Edicion. 1944, Editorial Lopez y Etchegoyen Libreros 4, {Oual de fos siguientes microscopios permite ver la ‘membrana plasmatica? 2) Microscopio de campo oscuro. »b) Microscopio de interferencia, ©}, Microscopio eleciténico de trnsmisien 4} Microscopio de contraste de fase 6. Como se calcula o! aumento total det microscopic? 2) Mutiplicando el aummento del couler por et aumento, dl objetivo. b) Multiplicando et aumento det objetivo por et del condensador, 9} Mediante ta formula de limite de resolucién 1d} Corresponde af aumento que praduce el objetivo. 6. {Cual de los siguientes microscopics posee mayor oder de resclucion ? 2) Microscopic de campo oscuro 5) Microscopie de tuz ultraviolet, ©} Microscopic de Nomarski 4) Microscopic electrénico de barre, TECNICA HISTOLOGICA ¥ MICROSCOPIA 7. {Gual de ios siguientes paremciros permite disminuic 21 Kimte resotutivo ? 1a) Aumentar el indice de rettaccién, b) Aumentar is longitud de onda ©}, Disminuir ef sero de atfa. ) Todas son corectas, 8. LCual de tos siguientes parametros permite disminuir limite resolutivo 7 a) Utilizar luz ultraviolet, b}_Utizar lentes de menor diametro frontal }Uiilizar aire en lugar de aceite de inmersién, )_Ninguna es correcta. 2. La apertura numérica es una propiedad de. a) El ocular. ) El ocular y et objetivo. ©) El condensadr. 4} Ei objetivo. 10. {Cui de fos siguientes microscopios permite ver csiulas vives ? a) Microscopic de campo oscuro b) Microscopic de contraste de fase. ) Microseopio de interferencia 9} Totas son correcta, 14 gOual de fos. siguientes microsoopios utiliza uz uttravioleta ? 2) Microscopio de inerérencia. b) Micrescopio confocal ¢}, Mlcroscopio de fuorescencia 4) Mccoscopio de polarizacion 12, Z0uél de tas siguientes no es una caracteristice del Microscopie electronica ? 8} Posee bobinas electromagnetic, b) Posee un tubo al vaco. ©} La ingen se forma directamente sobre is retina <) Uiliza como fuente un haz de electrones, 13 Sefiatar cual de tas siguiontes es una carscter'stica comin de tos miicroscopios éptico y electronico 3) Posean la misma fuente de energie 1b) Dan imagenes coloweadas ©} Poseen un tiie resolitivo de 0,25 um } Tienen menor limite de resolucién que et ojo humano. 14, Cua! de los siguientes es un colorante vital ? 2} Hematoxilina 8} Verde Jano. ©) Sudan black, 9), Acco Prerico 16.2Cual de los siguientes ferrocartiles lo deja en Ezpeleta 2) Ferrocart Mitre, ) Ferrocarnt Belgrano, ©) Fetrocars Roca 4) Ferrocaril Oeste de Caballo 16 Sefiaie cual de tse opciones corresponde.e un fjador simple: 2) Lguido de Flemming B) Liquide de Zerker: @) Acetone @) Liquide de Bouin 17. Ordene los pasos dela tecnica Histetegica 2} Obtencién dela. muestra-coloracion-corte. inclusién-fjanién-montaje frat 2) Obtencion de ta mueste flaciin-

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