2.Sterilizare şi dezinfecţie.

2. 1. Cuvinte cheie
·         Sterilizare
·         Dezinfecţie
·         Căldură umedă
·         Căldura uscată
·         Dezinfecție chimică
2. 2. Introducere (definiții)
Curățarea reprezintă îndepărtarea materiei organice de pe instrumente sau echipamente.
Sanitarizarea reprezintă reducerea numărului de agenţi patogeni din locurile publice
(restaurante, toalete publice, etc.) în vederea prevenirii transmiterii bolilor.
Septic = contaminat cu agenţi patogeni. Aseptic = lipsit de agenţi patogeni şi nepatogeni. Prin
asepsie se evită contaminarea mediului cu microorganisme și se menţine “sterilitatea”
ţesuturilor, mediilor de cultură, medicamentelor etc.
Antisepsie = îndepărtarea / distrugerea formelor vegetative bacteriene de pe țesuturi vii. Se
realizează cu ajutorul substanţelor antiseptice (substanțe chimice).
Bacteriostatic = inhibă creşterea bacteriilor fară a le distruge. Bactericid = distruge bacteriile
(fără a distruge întotdeauna și sporii). Sporicid = agent capabil să distrugă sporii. Fungicid =
agent chimic capabil să distrugă fungii. Virucid = agent chimic capabil să distrugă virusurile.
2. 3. Sterilizarea
Prin sterilizare se distrug toți agenţii (patogeni, nepatogeni, forme vegetative sau spori) de pe
o suprafaţă sau din orice tip de mediu.
2. 3. 1. Sterilizarea prin căldură
Căldura este o metodă fizică prin care se distrug agenţii patogeni.
2. 3. 1. 1. Sterilizarea prin căldură uscată
Mecanism = oxidarea, denaturarea proteinelor sau carbonizarea structurilor bacteriene.
Sterilizarea prin încălzire la incandescenţă (“la roşu”) reprezintă menţinerea în flacăra
becului Bunsen, până la înroşire, a obiectului care urmează a fi sterilizat. În acest mod se
sterilizează ansa bacteriologică (cu buclă sau fir); exersăm la LP.
Flambarea reprezintă trecerea prin flacără (de 2-3 ori) a unui obiect, fără a se atinge
temperatura de incandescenţă. În acest mod se procedăm în cazul  portansei, lamelor, gâtului
unui recipient de sticlă (eprubetă, etc). Nu reprezintă sterilizare !
Incinerarea reprezintă arderea completă, la temperaturi între 870-980ºC a unor materiale de
unică folosinţă, unor materiale infectate (infectele), reziduuri organice solide, gunoi.
Incinerarea se realizează în crematorii (incineratoare).
Cuptorul cu aer cald (pupinel, etuvă, cuptor Pasteur) este o cutie metalică cu pereţi dubli
în care se obţine şi se menţine o temperatură constantă şi uniformă pentru sterilizare. Este
necesar și un sistem de ventilaţie pentru uniformizarea temperaturii în interiorul aparatului.
Temperatura este de 180ºC, iar durata o oră. Acest tip de sterilizare este recomandat pentru
obiecte de sticlă, obiecte de porţelan, pulberi inerte şi termostabile, uleiuri anhidre,
instrumentar chirurgical (preferabil sterilizat în autoclav) etc. Pupinelul nu trebuie
supraîncărcat; aerul trebuie să poată circula printre obiectele puse la sterilizat. Sticlăria şi
obiectele de porţelan trebuie spălate şi uscate complet înainte de sterilizare şi învelite în hârtie
specială. Nu se vor steriliza în pupinel soluţiile apoase, obiectele de plastic, obiectele de
cauciuc, alte materiale termolabile, materiale contaminate din laborator.
2. 3. 1. 2. Sterilizarea prin căldură umedă
Mecanism = coagularea proteinelor şi degradarea enzimelor. Se consideră a fi cea mai
eficientă metodă de sterilizare.
Fierberea se realizează la 100ºC, 30 minute; distruge formele vegetative bacteriene dar nu şi
sporii.
Tindalizarea (sterilizare intermitentă) se realizează la la 100ºC, câte 30 minute, 3 zile
consecutiv. Se pot steriliza medii de cultură şi mediile care conţin zaharuri şi gelatină. În
prima zi sunt omorâte formele vegetative bacteriene iar în a doua şi a treiazisunt omorâţi
sporii care germinează.
Pasteurizarea se realizează la trei nivele: înalt, mediu şi jos. Este o metodă de conservare a
alimentelor fără a distruge calitatea acestora. Prin pasteurizare sunt distruse bacteriile în formă
vegetativă dar nu şi sporii. Pasteurizarea joasă se realizează la 63ºC, 30 secunde. Pasteurizarea
înaltă (ultra-high-temperature / UHT), se realizează la 140ºC, 3 secunde. Se utilizează
frecvent pentruprodusele lactate.
Autoclavarea este cea mai folosită metodă de sterilizare. Foloseşte aburul sub presiune (de
ex. la o temperatură de 121ºC, 15 minute). Autoclavul este un cazan metalic de presiune care
se închide etanş cu un capac. Capacul este prevăzut cu un sistem special de închidere şi în
interiorul lui vaporii de apă sunt comprimaţi la presiunea necesară sterilizării. Vaporii de apă
ajung la 121ºC, la 1 atmosferă.
Prin autoclavare se sterilizează medii de cultură, obiecte de cauciuc, bumbac, diferite
substanţe în soluţie, unele obiecte de sticlărie, materiale contaminate din laborator,
instrumentar chirurgical (metalic), aparate de filtrat etc.
Controlul sterilizării prin autoclavare se poate realize prin metode biologice (hârtii de filtru ce
conţin o cantitate de 106 spori de Bacillus stearothermophilus; hârtiile sunt puse in autoclav
odata cu materialele ce urmează a fi sterilizate şi ulterior sunt puse la incubat pe medii de
cultură; dacă bacteria se dezvoltă în urma incubării înseamnă că sterilizarea nu a fost
eficientă).
2. 3. 2. Sterilizarea prin filtrare
Reprezintă o metodă fizică de sterilizare. Bacteriile  pot fi reţinute mecanic şi electrostatic în
porii unui filtru. De-a lungul timpului au fost utilizate o serie de filtre clasice (porţelan, sticlă
poroasă, azbest impregnat cu caolin, pământ de infuzori). Acum se folosesc mai frecvent
membrane filtrante din esteri de celuloză sau alţi polimeri precum acetatul de celuloză (pori
între 8 şi 0,025 mm). Unele dintre cele mai bune filtre de sterilizare sunt filtrele HEPA (High
Efficiency Particulate Air Filters), filtre care se utilizează pentru sterilizarea aerului în hotele
microbiologice. Sterilizarea prin filtrare este utilizată pentru decontaminarea aerului, a unor
medii de cultură (care nu se pot steriliza prin autoclavare), a unor reactivi care sunt sensibili la
temperaturile atinse în cazul sterilizării prin căldură etc.
2. 3. 3. Sterilizarea prin intermediul radiaţiilor
Se realizează prin doua tipuri de radiaţii:  neionizante (UV) sau ionizante (X etc). Mecanism =
ruperea legăturilor de hidrogen sau oxidarea legăturilor duble.
2. 3. 3. 1. Radiaţiile neionizante
Acest tip de sterilizare este similar cu sterilizarea cu aer cald; poate fi utilizat pentru a steriliza
seringi preambalate sau catetere. Se pot utiliza şi microundele.
Un alt exemplu sunt radiaţiile ultraviolete, UV. Ele au lungimi de undă diferite. Cele de 250-
260 nm sunt utile în sterilizarea suprafeţelor de lucru, a aerului, (pentru repartizarea mediilor
de cultură, alte manevre aseptice etc) în cazul în care nu există hote microbiologice cu flux
laminar. Distrug bacteriile dar nu pot penetra sticla, apa sau unele substanţe. Pot ”arde” pielea
şi ochii. Lămpile cu UV sunt numite lămpi germicide. Radiaţiile UV cu lungimi de undă de
200-390 nm  sunt cele mai eficiente.
2. 3. 3. 2. Radiaţiile ionizante
Sunt un tip de radiaţii cu putere mare de penetrare (ex. razele X, gamma şi razele cosmic).
Este o sterilizare similară sterilizării la rece. Radiaţiile gamma cu sursă Co60 sunt mai eficiente
decât radiaţiile UV. Radiaţiile ionizante se utilizează în sterilizări industriale (pentru alimente,
medicamente, mănuşi, recoltoare, plăci Petri, etc).
2. 4. Antiseptice şi dezinfectante
Dezinfecţia reprezintă distrugerea formelor vegetative bacteriene (uneori şi a sporilor) din
anumite medii (lichide, solide) sau de pe suprafeţe. Se realizează cu ajutorul unor agenţi fizici
sau cu ajutorul substanţelor dezinfectante. Este importantă atât concentrația, durata aplicării,
cât și  remanența dezinfectantului.
2. 4. 1. Hipocloriţii
·         clorinarea descoperită in Suedia (1744), din 1890 se folosește în dezinfectare;
·         soluţiile de hipoclorit se prepară proaspăt (în fiecare zi de lucru);
·         concentraţia în clor activ este poate să difere în funcţie de scopul urmărit;
·         au efect dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă, unor spori bacterieni, fungilor
(100 ppm, în o oră), virusurilor (200 ppm, în 10 minute);
·         se pot utiliza pentru purificarea apei;
·         efectul este diminuat în prezenţa substanţelor organice (ex. proteine).
2. 4. 2. Derivaţii fenolici

·       distrug membrana plasmatică, inactivează enzimele, denaturează proteinele;

·       se folosesc sub formă de derivaţi fenolici;

·       soluţiile fenolice se prepară proaspăt (în fiecare zi de lucru); efectul nu este diminuat în
prezenţa substanţelor organice;

·       au efect dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă, fungilor, unor virusuri (ex.
HIV inactivat de soluţia 0,5%).
2. 4. 3. Glutaraldehida
·         cel mai frecvent este utilizată concentraţia de 2% la un pH alcalin (efect asupra bacteriilor
în formă vegetativă, endosporilor, fungilor, virusurilor);
·         efectul nu este diminuat în prezenţa substanţelor organice;
·         se poate folosi şi la dezinfectarea suprafeţelor metalice;
·         nu poate fi folosită pentru suprafeţe (este nevoie de un timp mare de expunere pentru a fi
eficientă); ideală pentru dezinfectarea echipamentelor contaminate, imersate în containere
menţinute închise (ex. endoscoape etc).
2. 4. 4. Iodoforii
·         sunt substanţe care eliberează iodul în soluţii apoase;
·         inhibă sinteza proteică;
·         au efect dezinfectant asupra bacteriilor în formă vegetativă, unor spori bacterieni,
fungilor, unor virusuri (ex. virusuri cu înveliş lipidic);
 ·         sunt inactivaţi de substanţe organice (ex. proteice), mase plastice, detergenţi;

·         pot fi utilizaţi pentru dezinfecţia suprafeţelor, dezinfecţia pipetelor contaminate.

2. 4. 5. Dezinfectarea cu etilenoxid
·         distruge bacteriile, nu şi sporii (ex. sporii de Bacillus subtilis nu sunt distruşi);
·         se utilizează pentru materiale puţin rezistente la temperaturi ridicate sau radiaţii (ex.
materiale din cauciuc, plastic, echipament electronic etc);
·         este exploziv (pentru evitarea exploziei, de ex. utilizăm etilenoxidului în camere speciale,
cu presiune negativă);
·         pentru siguranţă trebuie respectate toate recomandările producătorului;
·         există  inconveniente (efecte carcinogenetice, efecte la nivelul sistemului nervos etc);
·         sterilizarea este influenţată de concentraţie, temperatură, umiditatea relativă şi timpul de
expunere (o dublare a concentraţiei reduce la jumătate timpul necesar).

3. Schema generală a diagnosticului de laborator

microbiologic.
3. 1. Cuvinte cheie
·         Recoltare și Transport
·         Produse patologice
·         Antibiogramă
·         Diagnostic direct
·         Diagnostic indirect
3. 2. Introducere
Diagnosticul de laborator în microbiologie este un diagnostic complex și este diferit funcție
de agentul patogen ce trebuie identificat. Astfel diagnosticul de laborator în microbiologie
poate fi direct (urmărește identificarea agentului patogen direct din produsul patologic),
bacteriologic, micologic, parazitologic, virusologic; poate fi indirect (urmărește evidenţierea
răspunsului imun la acțiunea agentului patogen), sau poate fi o ”combinaţie” între cele două
(direct şi indirect).
Principalele etape ale diagnosticului microbiologic respectă un algoritm general, logic, aplicat
pentru fiecare microorganism în parte. Înainte de a începe aceste etape este necesară o
suspiciune de diagnostic bazată pe examenul clinic obiectiv și anamneză. Coroborarea acestor
informații obiective și subiective primite de la pacient cu informații concrete provenite din
cunoașterea patologiei infecțiilor bacteriene pot direcționa tipul de diagnostic de laborator ce
trebuie efectuat.
3. 3. Diagnosticul de laborator bacteriologic / micologic
Acest tip de diagnostic cuprinde 5 etape, există însă și excepții (de exemplu în cazul
diagnosticului bacteriologic al infecțiilor cu Treponema pallidum se realizează numai primele
două etape). Iată care sunt cele 5 etape.
3. 3. 1. Recoltarea şi transportul produsului patologic (p.p.) urmează câteva reguli pe care
este foarte bine să le rețineți în această succesiune:
·         Se recoltează p.p. în care avem cele mai mari șanse să decelăm agentul etiologic (ex. urină
într-o infecție urinară, LCR în meningită etc);
·         Recoltarea se realizează rapid și cât mai aproape de debutul simptomatologiei, înainte de a
administra antibiotice, prin manevre aseptice bine determinate, corecte (vezi capitolul 4);
·         După recoltare se va eticheta corespunzător recipientul care conține p.p.;
·         Transportul p.p. se realizează cât mai rapid posibil, uneori este indicat să se folosească și
mediu de transport (dacă se depășește un anumit timp); temperatura de transport se stabiliște
în funcție de tipul produsului patologic (vezi capitolul 4) și este în cele mai multe cazuri
scăzută (container izoterm 0-4ºC); poate fi și o temperatură crescută (ex. 37°C);
·         La recoltarea p.p. se va completa un formular specific care să conțină următoarele informații:
numele, prenumele, vârsta pacientului, data şi locul recoltării (+ ora recoltării), diagnosticul
prezumtiv, natura p.p., analiza solicitată, data debutului bolii, ce medicaţie antimicrobiană a
fost administrată respectivului pacient, cine şi cum a făcut recoltarea, cum a fost asigurat
transportul p.p.
Nerespectarea tuturor acestor reguli poate justifica respingerea p.p.
3. 3. 2. Examinarea macroscopică şi microscopică a produsului patologic rămâne o etapă
foarte importantă, chiar și după apariția tehnicilor moderne.
3. 3. 2. 1. Examinarea macroscopică a p.p. poate orienta etapele ce urmează dar există şi
situaţii în care nu aduce informaţii importante.
3. 3. 2. 2. Examinarea microscopică a p.p. reprezintă uneori o etapă orientativă, utilă dar
există situaţii în care reprezintă o etapă esenţială (ex. în gonoree sau în meningita cu
meningococ). Recomandăm realizarea a minim 2 frotiuri din p.p. Un frotiu va fi colorat cu
albastru de metilen (AM) şi al doilea prin metoda Gram. În cazul în care p.p. se recoltează
mai dificil se recomandă realizarea a 3 frotiuri. în suspiciunea de tuberculoză (TB) se
realizează minim 3 frotiuri, colorate AM, Gram şi Ziehl-Neelsen. Iniţial frotiul se examinează
cu obiectivul 40x pentru o analiză mai generală şi pentru stabilirea câmpului microscopic sau
al zonei „de interes”, apoi cu obiectivul de imersie. Se vor evidenţia celulele din ţesutul
respectiv (normale sau patologice), celulele inflamatorii (ex. PMN) şi prezenţa
microorganismelor (interpretarea poate fi realizată în funcţie de experienţă). (Figurile nr. 1-3)
Există şi situaţii în care din p.p. se realizează preparate native (între lamă şi lamelă) în loc de
frotiuri fixate şi colorate, de exemplu când p.p. este reprezentat de sânge, urină sau materii
fecale. În cazul în care p.p. este reprezentat de materii fecale, se realizează coprocitograma (se
caută leucocite şi alte structuri sugestive). În cazul în care p.p. este reprezentat de urină, se va
realiza sedimentul urinar (după centrifugare), şi se va examina între lamă şi lamelă pentru
evaluarea prezenţei şi numărului de PMN/câmp, prezenţei unor celule normale sau patologice,
prezenței altor structuri (ex. cristale de oxalat, citrat, cilindrii leucocitari etc. (Figurile nr. 4-5)
În infecţiile micotice se realizează de asemenea preparate proaspete (ex. preparatul în soluţie
de KOH-glicerol 10-20%, KOH poate dizolva keratina care mascheză prezenţa fungilor),
precum şi frotiurile colorate. (Figurile nr. 6-7)
3. 3. 3. Cultivarea pe medii de cultură a p.p. se face în funcţie de situaţie (agent etiologic
presupus) respectând condiţiile de creştere ale bacteriei respective (ex. aerobioză sau
anaerobioză, o anumită temperatură, un anumit mediu de cultură).
Cultivarea se realizează prin punerea (însămânțarea) p.p. în care se presupune existenţa
bacteriei, pe un mediu de cultură adecvat, într-un incubator, la o temperatură de 35-37ºC.
Pentru fungi trebuie utilizate mediile potrivite creşterii fungilor şi o temperatură mai mică
decât cea utilizată în cazul bacteriilor (28ºC). Scopul cultivării este obţinerea unor colonii
izolate (prin „însămânţare în poligon”,(Figura nr. 8) în care să crească doar agentul etiologic
incriminat în afecţiunea studiată şi respectiv obţinerea unei culturi pure, pentru identificare.
3. 3. 4. Identificarea agentului etiologic se realizează numai pornind de la colonii izolate , în
baza caracterelor specifice fiecărei bacterii, după cum urmează.
3. 3. 4. 1. Caractere morfologice
Din colonia izolată se va realiza un frotiu; acesta va fi colorat Gram sau Ziehl-Neelsen (după
caz); examenul microscopic va evidenţia forma, dimensiunile şi tinctorialitatea (culoarea)
bacteriilor din colonie. De obicei bacteriile studiate la microscop sunt similare şi au
caracteristici comune pe frotiul examinat dar există situaţii în care pe frotiu se pot observa
aspecte morfologice diferite, de la aspecte cocobacilare până la forme filamentoase (ex.
bacterii cu polimorfism, cum ar fi Proteus spp.). În cazul levurilor, aspectul este cocobacilar,
Gram-pozitiv, de dimensiuni mai mari. (Figura nr. 9-11)
3. 3. 4. 2. Caractere de cultură
Sunt caracterele în urma cărora se poate realiza identificarea preeliminară. Se vor examina
coloniile izolate apărute pe mediile de cultură şi se va caracteriza aspectul morfologic (forma,
dimensiunea, marginile, culoarea coloniei). Coloniile pot fi de tip S pentru levuri și
majoritatea bacteriilor studiate, de tip R (ex. Mycobacterium tuberculosis şi Bacillus
anthracis) sau de tip M (la bacterii capsulate, ex. Klebsiella pneumoniae) şi respectiv un
aspect pufos în cazul mucegaiurilor. Pentru mediile lichide se va examina tipul de creştere,
modul în care tulbură mediul sau se sedimentează. (Figurile nr. 12-16)
3. 3. 4. 3. Caractere biochimice (sau metabolice)
Aceste caractere sunt foarte utile în cazul diferenţierii enterobacteriilor (introducerea în
practică a „mediilor multi-test” permite evaluarea mai multor caractere simultan, ex. mediile
TSI, MIU, citrat, etc) şi pot fi foarte variate de la o specie microbiană la alta. (Figura nr. 13)
De asemenea se pot evidenţia producerea de pigment endogen sau exogen sau producerea de
hemolizine pe agar sânge şi tipul de hemoliză. (Figurile nr. 14-15)
În cazul fungilor sunt utilizate auxanograma sau zimograma.
3. 3. 4. 4. Caractere antigenice
Caracterele antigenice pot fi evidenţiate datorită structurii antigenice a bacteriilor + capacităţii
Ag de a cupla anticorpi (Ac) specifici pereche (reacţiile Ag-Ac) (vezi cap. 9). Se utilizează Ac
cunoscuţi pentru a identifica Ag necunoscute. Reacţiile Ag-Ac folosesc principii simple în
care una din componente e cunoscută şi cealaltă necunoscută. Tehnicile utilizate pot fi
aglutinarea directă pe lamă, aglutinarea indirectă, coaglutinarea, etc. Sunt tehnici comerciale
accesibile şi eficiente, sau tehnici in house. De exemplu, prin reacţii de aglutinare directă se
pot identifica Ag din genul Shigella, Salmonella, iar prin reacţii de aglutinare indirectă se pot
detecta în p.p. streptococii de grup A sau B etc. Aceste teste se folosesc și pentru detectarea
unor Ag fungice (ex. Cryptococcus neoformans, Candida albicans, Aspergillus spp).
3. 3. 4. 5. Caractere de patogenitate (ex. testul coagulazei pentru S. aureus)
Caracterele de patogenitate evidenţiază capacitatea bacteriilor de a declanşa în organismul
gazdă fenomene morbide. Patogenitatea este un atribut de specie şi este determinată genetic.
De exemplu bacteriile pot elabora anumite substanţe cum ar fi coagulaza (o enzimă produsă
de Staphylococcus aureus) care produc fenomene patogene (in acest caz coagulaza produce
coagularea plasmei). (Figura nr. 16)
Prin inocularea unei bacterii patogene la animalul de laborator se poate declanşa infecţia
experimentală evidenţiind caracterul de patogenitate al respectivei bacterii.
3. 3. 4. 6. Lizotipie (sensibilitatea la bacteriofagi specifici)
Bacteriofagii (fagii) sunt virusuri care parazitează bacteriile. Au fost descoperiţi în 1915.
Lizotipia reprezintă stabilirea sensibilităţii la un anumit bacteriofag şi este una dintre cele mai
fine metode de identificare (inclusiv din rațiuni epidemiologice, ex. pentru determinarea
originii unei epidemii).
3. 3. 5. Antibiograma (respectiv antifungigrama) reprezintă testarea sensibilităţii la
antibiotice şi chimioterapice anti-bacteriene / respectiv anti-fungice, în vederea alegerii
tratamentului etiologic corect. Se realizează cel mai frecvent prin metode difuzimetrice. În
anumite situaţii (ex. în infecţii grave, la pacienți care au o capacitate de apărare redusă, în
infecții cu bacterii care au potențial ridicat de rezistență la antibiotice și chimioterapice) se
 vor efectua şi alte determinări, de ex. determinarea concentraţiei minime inhibitorii (CMI) şi
concentraţiei minime bactericide (CMB).
În infecţii cu potenţial fatal este necesară determinarea eficienţei antibioticului utilizat,
respectiv stabilirea nivelul de eficienţă inhibitorie (NEI) şi nivelului de eficienţă bactericidă
(NEB).
3. 4. Diagnosticul de laborator imunologic (serologic şi / sau imunobiologic)
3. 4. 1. Diagnosticul serologic urmăreşte determinarea prezenţei Ac necunoscuţi, din serul
pacientului, utilizând Ag cunoscute. Se bazează pe specificitatea reacţiilor Ag-Ac. În vederea
identificării unei infecţii acute, se determină anticorpii specifici de tip IgM. În vederea
identificării unei foste infecţii sau unei infecții cronice se determină (de regulă) Ac specifici
de tip IgG. În unele situaţii este necesar doar un test calitativ, ce va determina prezenţa sau
absenţa tipului de anticorpi dar în alte situaţii este necesară testarea cantitativă pentru a
determina titrul (”concentraţia”) de Ac din serul pacientului. Tot cu ajutorul acestor teste
cantitative vom analiza evoluţia titrului de anticorpi în dinamică. În acest sens se vor
realiza minim două determinări diferite la un interval de 7-10 zile; astfel putem să diferenţiem
o afecţiune acută (titrul Ac este mai crescut la a doua determinare, în mod clasic de 4 ori), de
o afecţiune în covalescenţă (titrul Ac la a doua determinare va fi mai scăzut) sau de o
afecţiune cronică (titrul Ac va fi asemănător sau foarte apropiat la cele două determinări
succesive). (Figura nr. 17)
3. 4. 2. Diagnosticul imunobiologic evidenţiază răspunsul imun celular, de exemplu
reactivitatea pacientului faţă de un anumit Ag. Intradermoreacţia la tuberculină (IDR cu
PPD/derivat proteic purificat), reprezintă un exemplu în acest sens.

4.Prelevarea şi transportul produselor patologice

4. 1. Introducere și cuvinte cheie
·         Recoltare
·         Transport
·         Produs patologic (p.p.)
·         Stabilitate
·         Medii de transport
Recoltarea (prelevarea) şi transportul p.p. este o etapă esenţială. Personalul din laborator îşi
concentrează atenţia asupra prelucrării corespunzătoare a probelor primite la laborator dar
ceea ce se întâmplă înainte ca proba să ajungă la laborator este cel puţin la fel de important în
obţinerea unui rezultat corect.
Există o serie de reguli care, respectate riguros, permit obţinerea rezultatelor dg. şi vindecarea
pacientului.
4. 2. Condiţii generale legate de recoltarea şi transportul p.p.
·         Instrucţiunile de recoltare şi condiţiile  de transport ale p.p. trebuie întocmite de catre
medicşi transmise ulterior persoanelor implicate - asistentelor de recoltare, respectiv
pacienţilor în cazul probelor recoltate la domiciliu. Recoltarea p.p. prin mijloace invazive
(LCR, aspiratul bronho-alveolar, aspirat medular) este efectuată strict de către medic.
·         Prelevarea p.p. trebuie să aibă loc înainte ca pacientul să primească antibiotice sau
chimioterapice (nerespectarea acestei reguli, foarte frecventă din păcate, constituie o
problemă semnificativă în diagnostic şi permite selecţia de microorganisme rezistente;  chiar
şi în cazul unei boli grave, ameninţătoare de viaţă, este suficient timp pentru recoltarea p.p.
înainte de administrarea medicamentului). În cazul pacienţilor transferaţi între diferite unităţi
spitaliceşti (pacienți care au primit antibiotice) recoltarea p.p. se face înaintea dozei următoare
în aşa fel încât în momentul recoltării cantitatea de antibiotic din organism să fie cât mai mică.
·         Recoltarea şi transportul p.p. trebuie să se realizeze cât mai rapid, în momentul optim (ex.
frisonul şi accesul febril „dictează” recoltarea sângelui pentru hemocultură).
·         Produsul patologic din care am putea izola agentul etiologic poate fi reprezentat de o
secreţie de la nivelul porţii de intrare (ex. secreţie nazală/faringiană în difterie sau secreție din
plagă în infecţii stafilococice), un produs de la nivelul căilor de eliminare  din organism (ex.
urină în infecţiile tractului urinar/ITU) etc.
·         Din p.p. se vor preleva fragmentele sau părţile reprezentative, din care avem cea mai mare
şansă de izolare a germenilor (ex. zonele cu mucus şi puroi, din materiile fecale).
·         Trebuie să recoltăm o cantitate de p.p. suficientă pentru efectuarea diagnosticului, în
condiţii de asepsie (nu trebuie infectat pacientul, nu trebuie să ne infectăm, nu trebuie să
contaminăm p.p.) respectând precauţiunile universale.
Aceste reguli este bine să fie cunoscute de toţi cei care formează comunitatea din sistemul
sanitar, dar, unele dintre recomandări sunt uşor de înţeles şi de aplicat chiar şi de persoanele
fără o pregătire medicală. Mai trebuie subliniat că:
·         Instrumentele pentru recoltare trebuie să fie sterile şi adecvate tipului de recoltare
efectuată (ex. tampon cu alginat de calciu şi nu cu vată pentru recoltarea de secreţii în care se
presupune prezenţa Bordetella pertussis).
·         Recipientele pentru recoltare şi transport trebuie să fie marcate corespunzător, iar datele
de identificare să fie riguros consemnate în registre/sistem „electronic”, formulare şi buletine
de analiză pentru a evita erori care pot fi dramatice (este cunoscut exemplul unui transplant de
organe de la un pacient HIV pozitiv, în Italia, 2007, situaţie care a fost identificată numai
după ce transplantul a avut loc la trei receptori, pentru că pe buletinul de analiză a apărut
„HIV negativ”, printr-o eroare de notificare).
·         Proba se trimite la laborator însoţită de o trimitere pe care se notează datele de identificare
ale pacientului, diagnosticul prezumtiv, tip de produs patologic şi determinările solicitate.

Produsele patologice trebuie să ajungă în laborator în cel mai scurt timp posibil. Dacă în
anumite situaţii (microorganismului nu rezistă în mediul exterior) recomandăm recoltarea şi
prelucrarea p.p. “la patul bolnavului”. Probele recoltate pe recipiente fără mediu de transport
au o stabilitate de 1-2 ore de la recoltare iar folosirea recipientelor adecvate cu mediu de
transport creşte această stabilitate la 24-48 de ore. Mediile de transport cel mai frecvent
folosite în bacteriologie sunt Amies, Cary Blair şi Stuart.
     Pentru urină există o posibilitate de „conservare”, la rece, prin menţinerea la temperatura
de +4ºC.
 
4. 3. Exemple de recoltare şi transport pentru principalelep.p.
4. 3. 1. Exsudatele otice, conjunctivale sau nazale
·         pacientul stă pe scaun, cu faţa spre sursa de lumină (preferabil lumina naturală);
·         utilizăm tampoane cu vată sterile (1 tampon pentru frotiu, 1 tampon pentru însămânţare);
·         tamponul se încarcă bine cu p.p. iar prelucrarea trebuie făcută imediat; dacă nu este
posibil, folosim un mediu de transport.
4. 3. 2. Exsudatul faringian
·         se recoltează preferabil dimineaţa (pacientul nu mănâncă, nu bea, nu se clăteşte, nu se
spală pe dinţi); stă pe scaun, cu faţa spre sursa de lumină şi gâtul în uşoară extensie;
·         ne aşezăm puţin lateral faţă de pacient (ca să nu fim infectaţi şi chiar şi în aceste condiţii
trebuie să purtăm mască şi ochelari);
 ·         apăsăm baza limbii, examinăm faringele posterior, pilierii, amigdalele şi recoltăm secreţia
(fără a atinge baza limbii sau palatul moale), în special din zonele cu puroi; utilizăm tampoane
cu vată obişnuite (folosim 1 tampon pentru frotiu şi 1 tampon pentru cultivare);
·         cel mai bine utilizăm p.p. imediat, în cel mult 1-2 ore (sau folosim mediu de transport).
4. 3. 3. Sputa
·         sputa, recoltată „pe căi naturale”, după tuse şi expectoraţie, este un p.p. contaminat;
·         p.p. care permit evitarea contaminării orofaringiane sunt aspiratul transtraheal,
transtoracic şi bronhoscopic (prin cateter protejat, lavaj bronhoalveolar, biopsie transbronşică,
biopsie pulmonară pe torace deschis etc); se pot face şi hemoculturi;
·         sputa rămâne un p.p. frecvent recoltat; pacientul trebuie să înţeleagă diferenţa dintre "a
expectora" şi "a tuşi şi scuipa"; înaintea recoltării se recomandă periajul dinţilor, clătirea gurii
şi gargara cu soluţie salină fiziologică;
·         dacă proba este în principal din salivă, trebuie să solicităm imediat prelevarea unei noi
probe (ex. mucopurulentă, în cantitate de 2-3 ml, cel puţin); p.p. ar trebui prelucrat în maxim
1-2 ore (nu se recomandă utilizarea mediilor de transport).
4. 3. 4. Puroiul
·         puroiul poate fi recoltat cu ansa bacteriologică, pipeta Pasteur, cu o spatulă, prin biopsiere
etc., sau, prin puncţie şi aspirare (folosim tampoane cu mediu de transport doar când
transportul către laborator depăşeşte 1-2 ore);
·         când suspicionăm o infecţie cu microorganisme anaerobe recoltăm şi transportăm cel
puţin în seringa care se “închide” cu dop prin care nu trece oxigenul sau transportul către
laborator se va realiza utilizând medii de transport sau containere specialepentru asigurarea
condiţiilor de anaerobioză (Figura nr. 1).
4. 3. 5. Materiile fecale
·         în multe dintre infecţiile însoțite de sindrom diareic, utilizăm coprocultura;
·         se pot recolta scaunul emis spontan (m. f. sunt eliminate într-un recipient de carton sau într-
un container din material plastic de unică întrebuinţare; utilizăm pentru prelevare linguriţa
recoltorului alegând fragmente mucopurulente, porţiuni cu sânge etc., în cantitate de circa 1
gram, suspensionat în mediul de transport), tamponul rectal (în cazul unei infecţii cronice cu
Shigella spp., atunci când suspicionăm portajul de Shigella spp. sau Salmonella spp.) sau
putem utiliza sonda Nelaton (când urmărim recoltarea p.p. de la nivelul colonului sigmoid);
·         în cazul în care p.p. nu poate fi prelucrat imediat sau în maxim 1 oră, utilizăm mediul de
transport (Cary-Blair) sau transportul la rece (+4ºC); se asigură supravieţuirea
enterobacteriilor patogene timp de 24-48 de ore, inhibând în acelaşi timp multiplicarea florei
de asociaţie; în suspicionarea V. cholerae, apa peptonată alcalină este în acelaşi timp mediu de
transport şi mediu de îmbogăţire.
4. 3. 6. Urina
·      colonizarea microbiană a uretrei distale explică motivul pentru care de regulă realizăm
urocultura cantitativă; atunci când demonstrăm prezenţa a 105 bacterii/ml, este o infecţie a
tractului urinar (ITU) în aproximativ 80% dintre cazuri;
·      dacă nu putem recolta prima urină de dimineaţă, aşteptăm 3-4 ore după micţiune;
·      recoltarea se realizează după igiena organelor genitale şi a perineului, într-un recipient steril
(Figura nr. 2) atunci când proba poate fi dusă către laborator în mai puţin de 2 ore sau într-un
recipient special ce conţine acid boric şi menţine stabilitatea probei 24 ore la temperatura
camerei (Figura nr. 3). Erorile de recoltare şi nerespectarea  timpului de transport vor conduce
la rezultate eronate);
·      recoltăm urina “din mijlocul jetului” (prin micţiune se elimină circa 100 ml urină, îndepărtând
o parte a germenilor de la nivelul uretrei distale, apoi se recoltează 20-50 ml  urină în
recipient steril, după care micţiunea continuă;
·         există şi alte tehnici de recoltare (ex. puncţie şi aspiraţie suprapubiană);
 ·         după recoltare pe recipientul fără conservant, în cazul în care urina nu este prelucrată
imediat  p.p. trebuie menţinut la temperatura frigiderului iar transportul trebuie realizat la
+4°C.
4. 3. 7. Sângele
·         se recomandă recoltarea a minim 2, preferabil 3 probe de sânge, în momente diferite, pe
parcursul a 24 de ore;
·         deoarece numărul de unităţi formatoare de colonii (UFC)/ml de sânge este redus, trebuie să
recoltăm un volum de sânge adecvat (circa 20 ml de sânge la adulţi şi 1-5 ml de sânge la nou-
născuţi, sugari şi copii mici);
·         în sânge pot exista factori antimicrobieni (diminuăm impactul acestora prin diluarea 1/10 a
sângelui cultivat în raport cu volumul mediului de cultură);
·         folosim medii de cultură lichide, îmbogăţite, în condiţii de incubare potrivite.
4. 3. 8. Lichidul cefalo-rahidian
·         se recoltează în cazul suspicionării unui sindrom meningean; suspiciunea poate fi ridicată
şi de un student bine pregătit sau de un tânăr medic, dar examenul clinic trebuie executat şi de
medicul de specialitate (boli infecţioase, neurologie etc); recoltarea se face la patul bolnavului
de exemplu prin puncţie lombară în condiţii de strictă asepsie;
·         recoltăm 5-10 ml LCR în 2-3 tuburi sterile (2 tuburi vor fi supuse centrifugării iar din al
3-lea tub realizăm teste biochimice);
·         LCR trebuie prelucrat imediat, prelucrarea p.p. trebuie să înceapă “la patul bolnavului”;
·         dacă transportul nu poate fi evitat, trebuie să se facă foarte rapid, la o temperatură
apropiată de temperatura corpului uman (nu la +4ºC).
4. 3. 9. Secreţiile recoltate de la nivelul aparatului genital
     În cazul secreţiei uretrale, la bărbat
·         recoltarea p.p. trebuie să se facă dimineaţa, înainte de micţiune, sau la cel puţin 2 ore după
aceasta; sunt necesare tampoane de vată sterile (un tampon pentru examenul microscopic şi al
doilea pentru cultivare); se observă penisul şi meatul urinar precum şi dacă există secreţie
uretrală; dacă există secreţie uretrală, aceasta este recoltată cu tamponul;
·         în cazul în care nu se evidenţiază spontan secreţia uretrală în mod, cu mâna protejată de o
mănuşă, exprimăm uretra utilizând degetul mare şi indexul şi recoltăm secreţia care apare;
·         dacă nici aşa nu putem obţine p.p. recurgem la recoltarea intrauretrală; sunt necesare
tampoane de dimensiuni mai mici (din alginat de calciu sau dacron); după introducerea blândă
(circa 2 centimetri, cu rotire intrauretral) a primului tampon, al doilea tampon va fi inserat cu
aproximativ 1 centimetru mai profund;
În cazul secreţiilor cervicale, la femei recoltarea se face preferabil în primele 10 zile după
ciclu, pe masa ginecologică, după introducerea valvelor şi examinarea vizuală a vaginului şi
colului uterin; dacă se remarcă o secreţie purulentă, cu ajutorul unor comprese sterile se
îndepărtează secreţia de la nivelui colului extern; folosim 3 tampoane sterile introduse şi rotite
uşor 1-2 centimetri, în colul uterin (2 dintre tampoane le transferăm pe frotiuri, al treilea
pentru cultivare);
·         în suspiciunea de gonoree se recomandă cultivarea imediat după recoltare pe mediul de
cultură încălzit la 37ºC; în cazul în care acest lucru nu se poate realiza, tamponul cu p.p. va fi
transmis laboratorului în mediu de transport (ex. mediul Stuart pentru Neisseria gonorhoeae
sau alte variante pentru Chlamydia spp. sau Mycoplasma spp.)
4. 3. 10. Diferite p.p. recoltate în suspiciunea unor infecţii fungice
·         în cazul leziunilor umede şi inflamate de la nivelul mucoaselor sau din zonele pliurilor
(axilar, mamar, crural) recoltarea se face cu ajutorul tampoanelor 1 tampon pentru frotiu şi 1
tampon pentru cultivare);
 ·         în micozele cutanate superficiale, raclăm tegumentul şi utilizăm pentru examinare
scuamele produse; în cazul leziunilor multiple se alege pentru recoltare un element recent,
scuamele vechi în curs de detaşare fiind de cele mai multe ori improprii pentru diagnostic;
·         împachetăm scuamele în hârtie sterilă care se introduce într-o cutie Petri şi se trimite
pentru prelucrare şi examinare în laborator (în maxim 48 de ore);
·         în micozele profunde, în funcţie de localizare, recoltăm p.p. şi îl transmitem către
laborator având grijă să prevenim deshidratarea produsului;
·         se recomandă prelucrarea şi examinarea imediată (unii fungi sunt fragili); dacă
recomandarea nu poate fi respectată, adăugăm penicilină, streptomicină şi cloramfenicol
pentru inhibarea multiplicării bacteriene şi menţinem p.p. la +4ºC.

5. Preparate microscopice, frotiuri și principalele colorații

utilizate în microbiologie. Examenul microscopic.
5. 1. Cuvinte cheie
·         preparat microscopic nativ
·         frotiu
·         colorații
·         Albastru de metilen
·         Gram
·         Ziehl-Neelsen
·         fluorescență
5. 2. Introducere
Pentru a putea vizualiza microorganismele, avem nevoie de o putere de mărire de cel puțin
900-1000X, întrucât acestea au dimensiuni de ordinul micronilor. În mod practic, nu este
suficient să vizualizăm simpla prezență a microorganismelor la locul de infecție (unele făcând
parte din flora normală), ci să încercăm să demonstrăm implicarea lor în boala suspectată.
Astfel, avem nevoie să evidențiem atât microoganismele cât și răspunsul pacientului față de
acestea (ex. prezența celulelor inflamatorii), pregătind diferite preparate microscopice.
5. 3. Preparate microscopice proaspete (între lamă și lamelă)
Este de preferat să folosim lame și lamele noi. Pentru a îndepărta orice murdărie lamele pot fi
curățate în prealabil cu alcool și degresate suplimentar prin flambare. În mod practic, vom
avea grijă să atingem lama doar pe margini. Vom trece lama prin flacăra becului Bunsen
aprins de 2-3 ori. Depunem pe lamă o picătură din produsul care urmează a fi studiat:
·         p.p. cu consistență lichidiană (ex. urină, materii fecale, LCR, etc) vor fi descărcare
utilizând de ex. ansa microbiologică sau pipeta Pasteur direct pe lamă; putem adăuga o
picătură de albastru de metilen, lugol, etc;
·         p.p cu consistență solidă (ex. dintr-o colonie microbiană) - întâi folosim un pipetor pentru
a pune o picătură de soluție salină fiziologică pe lamă și apoi o ansă microbiologică pentru a
descărca din colonia respectivă.
          Acoperim cu o lamelă produsul patologic descărcat și presăm ușor lamela pentru a
elimina bulele de aer.
          În microscopia optică (câmp luminos) așezăm preparatul pe platina microscopului și
examinăm inițial cu obiectivul 10X, apoi cu obiectivul 40X (Figurile nr. 1-2).
5. 4. Frotiuri (preparate fixate și colorate)
          Reexaminând schema generală a diagnosticului de laborator (vezi cap. 3) vom observa
că efectuăm examinarea frotiurilor în două momente; astfel, putem realiza frotiuri din p.p. sau
din culturi efectuate pe mediul solid sau lichid. Trebuie să ne asigurăm că avem la bancul de
lucru toate ustensilele necesare [p.p. sau cultură de interes, bec Bunsen, ansă microbiologică,
lame și lamele, etanol, apă distilată (AD) și/sau soluție salină fiziologică (SSF), pipetor dar și
trusă pentru colorare] și le organizăm pentru a le avea la îndemână (Figura nr. 3). Frotiul
trebuie bine întins, în strat subțire (preferabil un singur strat).
NB: Nu vom purta mănuși datorită riscului atunci când lucrăm lângă becul Bunsen.
Vom avea grijă să atingem lama doar pe margini. Dorim să subliniem faptul că tehnica
prin care fixăm frotiul depinde de tehnica de colorare pe care dorim să o aplicăm (vezi 5. 5.).
Fixarea are rolul de a inactiva germenii de pe lamă și a le crește aderența de lamă.
5. 4. 1. Frotiuri din p.p. cu consistență lichidă sau din culturi în mediu de cultură
lichid (Film nr. 1)
·       flambăm lama (o trecem de 2-3 ori prin flacăra becului Bunsen și o așezăm cu partea
flambată în sus pe stativul din trusa de colorație);
·         sterilizăm ansa bacteriologică și așteptăm să se răcească;
·         prelevăm aseptic p.p./cultura și depunem în centrul lamei;
·         întindem prin mișcări de “hașurare”, pe axul lung al lamei p.p./cultura, în strat cât mai
subțire, fără a ne apropia de marginile lamei (scădem riscul de contaminare);
·         lăsăm lama să se usuce, pe un alt stativ, lângă becul de gaz;
·         fixăm frotiul prin căldură (îl trecem prin flacără cu partea opusă de 3 ori);
·         suntem gata să începem procesul de colorare.
5. 4. 2. Frotiurilor din p.p. cu consistență solidă sau din culturi în mediu de cultură solid
(Film nr. 2)
·         flambăm lama (ca la 4. 4. 1.);
·         depunem în centrul lamei o picătură de SSF sau AD;
·         sterilizăm ansa bacteriologică și așteptăm să se răcească;
·         prelevăm aseptic p.p./un fragment din colonie și depunem produsul în picătura de
fluid de pe lamă;
·         folosim ansa pentru a omogeniza p.p./fragmentul din colonia de interes foarte bine (în
așa fel încât să rezulte o picătură tulbure omogen);
·         întindem prin mișcări de “hașurare”, pe axul lung al lamei p.p., în strat cât mai
subțire, fără a ne apropia de marginile lamei;
·         lăsăm frotiul să se usuce lângă flacără;
·         fixăm frotiul prin căldură (îl trecem prin flacără cu partea opusă de 3 ori);
·         suntem gata să începem procesul de colorare.
5. 5. Colorarea frotiurilor
Există numeroase metode de colorare, dar acest capitol nu își dorește o prezentare exhaustivă
a acestora. Este necesară o trusă pentru colorare (stativ de colorare, coloranți, AD pentru
spălare, stativ de uscare). Pentru colorarea frotiurilor din produs patologic folosim cel mai
frecvent colorațiile cu albastru de metilen (A.M.), Giemsa, Gram și după caz, Ziehl-Neelsen.
Chiar și colorația cu A.M. se poate realiza în mai multe variante (ex. o colorație A.M.
specială pentru bacilul difteric).
5. 5. 1. Colorația cu albastru de metilen
Examenul frotiului colorat cu albastru de metilen relevă informații de bună calitate privind
citologia frotiului (se pot observa detalii privind tipul de celule eucariote surprinse pe frotiu,
relația dintre acestea, eventualele anomalii morfologice ale citoplasmei și nucleului). Este o
colorație de uz general, fiind folosită alături de colorația Gram pentru a oferi o imagine de
ansamblu a frotiului.
·         fixarea frotiului se face prin căldură
·         acoperim frotiul cu soluție A.M., 3-4 minute; spălăm cu apă distilată;
·         așezăm frotiul în stativ pentru uscare;
 ·         examinăm la microscop, notăm observațiile, interpretăm.
Fiind o colorație simplă, în care se utilizează un singur colorant, vom putea observa celule
eucariote (epitelii pavimentoase, leucocite, limfocite, etc.) cât și microorganisme (coci, bacili)
colorați în albastru. (Figura nr. 4)
5. 5. 2. Colorația Giemsa
Este o altă colorație în care structurile celulare pot fi decelate facil, în special în ceea ce
privește celulele inflamatorii. Astfel, putem clasifica leucocitele în neutrofile, bazofile,
eozinofile. Se pot observa și microorganisme (coci, bacili) colorați în albastru-violet. (Figura
nr. 5)
5. 5. 3. Colorația Gram
În primul rând, ne asigurăm că avem toate componentele necesare pentru efectuare colorației,
în special:
·           fucsină diluată (1/10);
·         amestec alcool-acetonă (1 parte acetonă/3 părți alcool de 96º);
Pașii care trebuie urmați pentru efectuarea colorației:
·         fixarea frotiului se face prin căldură, trecând lama de 3 ori prin flacăra becului Bunsen (cu
partea opusă frotiului);
·         acoperim frotiul cu violet de metil, 1-3 minute; scurgem colorantul;
·         acoperim frotiul cu lugol (fixator), 1-3 minute; îndepărtăm lugolul;
·         acoperim frotiul cu un amestec de alcool-acetonă, rapid, 7-8 secunde;
·         spălăm insistent cu apă distilată;
·         acoperim frotiul cu fucsina diluată pentru 1 minut; spălăm cu apă distilată;
·         așezăm frotiul în stativ pentru uscare;
·         examinăm la microscop, notăm observațiile, interpretăm.
Colorația Gram este cea care oferă informații privind structura microorganismelor.
Nucleul și citoplasma celulelor eucariote sunt colorate în roșu
·                     celulele cu citoplasmă bogată roșu-pal și nucleu cu dimensiuni reduse, tahicromatic
sunt epitelii pavimentoase.
·                     celulele cu citoplasmă relativ restrânsă, cu un nucleu de dimensiuni considerabil mai
mari, polilobate, cu multiple septuri fine, sunt leucocite.
Microorganismele sunt colorate, în funcție de structura lor:
·           violet – bacterii Gram pozitive;
·           roz-roșu – bacterii Gram negative. (Figura nr. 6)
5. 5. 4. Colorația Ziehl-Neelsen
Este o colorație utilă în identificarea prezenței de bacili acid-alcool rezistenți (BAAR). În
primul rând, ne asigurăm că avem toate componentele necesare pentru efectuare colorației, în
special:
·           fucsină bazică nediluată (filtrată proaspăt)
·           amestec acid-alcool (3 ml acid clorhidric concentrat / 97 ml alcool etilic 90-95º);
Pașii care trebuie urmați pentru efectuarea colorației:
·         punem frotiul uscat și fixat prin căldură pe un suport situat deasupra tăviței de colorare;
acoperim complet lama cu fucsină bazică nediluată;
·         trecem becul de gaz aprins pe sub lamă, până la emiterea de vapori; 
·         pe parcursul a 10 minute repetăm de 3 ori operația de încălzire a lamei până la emiterea
de vapori; adăugăm colorant, la nevoie;
·         spălăm insistent cu apă distilată;
·         adaugăm amestecul decolorant acid-alcool, 2-3 minute; spălăm cu apă distilată;
·         recolorăm cu albastru de metilen, 1 minut; spălăm cu apă distilată;
·         așezăm frotiul în stativ pentru uscare;
·         examinăm la microscop, notăm observațiile, interpretăm.
 Microorganismele BAAR sunt roșii, în timp ce cele non-AAR sunt albastre. Celulele
eucariote sunt și ele colorate în albastru. (Figura nr. 7)
5. 5. 5. Colorații fluorescente
Există mai multe variante. Spre exemplu, „colorația fluorescentă” cu auramină O (A.O.) este
utilă în vizualizarea BAAR.
·         colorăm cu soluție de A.O. (A.O./alcool etilic/fenol/A.D.), 15 min.; spălăm cu A.D.;
·         decolorăm cu amestec de acid-alcool, timp de 5 minute; spălăm cu apă distilată
·         „contracolorăm” cu soluție de permanganat de potasiu, timp de 2 minute;
·         spălăm cu apă distilată;
·         așezăm frotiul în stativ pentru uscare;
·         examinăm la microscop, notăm observațiile, interpretăm.
Microorganismele acid-alcool-rezistente au o culoare galben-roșiatică. Deși colorația cu
auramină nu este la fel de specifică pentru BAAR precum colorația Ziehl-Neelsen, aceasta
este mai ieftină și prezintă o sensibilitate mai bună, fiind utilizată ca o variantă de screening.
5. 6. Tehnica examenului microscopic
Microscopul este strict necesar în diagnostic microbiologic direct. Cel mai frecvent utilizat în
laboratorul de microbiologie este microscopul optic. Există și alte tipuri de microscoape: cu
fond negru, cu contrast de fază sau cu fluorescență, etc.
5. 6. 1. Microscopul optic; microscopia în câmp luminos(Figura nr. 8)
          Microscopul optic permite formarea unor imagini virtuale, mărite și răsturnate ale
obiectului cu ajutorul unui sistem de lentile obiectiv și de lentile ocular. Distanța minimă
dintre două puncte ale unui obiect care mai pot fi văzute separat unul de celalalt prin
microscop respectă o formulă, în funcție de lungimea de undă a radiației folosite, indicele
de refracție al mediului străbătut de radiație între obiect și ocular și unghiul dintre axa
optică și razele cele mai îndepărtate de axă care mai pătrund în obiectiv. Pentru a micșora
această distanță (pentru a îmbunătăți performanțele microscopului) putem utiliza radiații cu
lungime de undă mai mică (ex. radiația ultravioletă) sau un mediu (între obiect și obiectiv) cu
un indice de refracție cât mai mare (ex. în cazul microscopului cu imersie).
5. 6. 1. 1. Părțile componente ale microscopului optic
Microscopul optic include:
-                 Piciorul microscopului (masă metalică cu rol de susținere, pe care se sprijină platina
microscopului; pe platină așezăm preparatul microscopic / lama / frotiul). Prin orificiul central
al platinei trec razele luminoase. Platina se poate deplasa pe 2 direcții perpendiculare.
-                 Tubul microscopuluisusține ocularul și obiectivul. La capătul superior al tubului montăm
ocularele (de ex. cu puterea de mărire 10x).
-                 Obiectivul se monteaza în revolver, situat la capătul inferior al tubului. Obiectivul este
compus dintr-un sistem centrat de lentile așezate într-un tub metalic care se înșurubează la
revolver. Există obiective „uscate” (ex. 10x sau 40x) și cu imersie (ex. 90x sau 100x).
Dispozitivul de iluminare este format din oglindă și condensator.
-                 Oglinda are rolul de a dirija razele de la sursa de lumină spre axul optic.
-                 Condensatorul este format din 2-3 lentile cu ajutorul cărora lumina reflectată de oglindă
este concentrată asupra obiectului; fascicululul paralel de raze de lumină care cade pe
condensator devine convergent.
-                 Razele de lumină, înainte de intrarea în condensator, trec printr-un suport de filtre și o
diafragmă iris (diafragmă de apertură). Condensatorul contribuie în mod esențial la
luminozitatea imaginii.
5. 6. 1. 2. Examinarea folosind microscopul optic în câmp luminos
          A. Examinarea unui preparat proaspăt (între lamă și lamelă)
Depunem pe lamă o picătură din produsul de examinat, acoperim cu o lamelă, așezăm pe
platina microscopului și fixăm cu ajutorul “cavalerilor”. Plasăm condensatorul la 1,5 cm sub
 platină, diafragmul semi deschis și coborâm obiectivul 40x până deasupra lamelei. Privim
prin oculare, rotim foarte încet macroviza până vedem câmpul microscopic. Clarificăm
imaginea cu ajutorul microvizei și sistemului luminos. Putem examina sedimentul urinar,
materii fecale provenind de la un pacient cu diaree, suspensii de bacterii care se presupune că
sunt mobile, preparate umede recoltate din micoze cutanate superficiale etc, spre exemplu:
·         în sedimentul urinar vedem celule epiteliale, leucocite, hematii, cilindrii urinari, cristale
urinare, levuri etc. (Figura nr. 9)
·         în preparatul montat în soluție KOH vedem levuri, blastoconidii, atroconidii etc.
·         în preparatul colorat cu tuș de India vedem levuri capsulate (cu halou) etc.
·         pentru a diferenția mobilitatea microorganismelor de mișcarea browniană urmărim
diferite repere din câmpul microscopic. (Film nr. 3)
B. Examinarea unui preparat fixat și colorat
Punem frotiul pe platină și fixăm cu ajutorul “cavalerilor”. Centrăm zona de examinat.
Procedăm așa cum am arătat, utilizând inițial obiectivul 40x; după ce am ales un câmp
ridicăm tubul microscopului, punem o picătură de ulei de cedru pe lamă. Ridicăm
condensatorul până sub platină; diafragmul este deschis.
Privind din lateral, folosim macroviza și coborâm (cu multă grijă) obiectivul cu imersie (90x
sau 100x) până atingem suprafața lamei realizând contactul și cu uleiul de cedru. Privim prin
oculare și rotim foarte încet macroviza ridicând foarte încet tubul microscopic; prindem
imaginea; clarificăm imaginea cu ajutorul microvizei.
Examinăm morfologia celulelor din p.p., prezența și aspectul PMN, prezența bacteriilor și
dispunerea acestora (în „grămezi”, în „lanțuri” etc), poziția față de PMN (intra sau extra-
leucocitar), morfologia microorganismelor etc., cu mici diferențe în funcție de colorație.
(Figura nr. 10)
5. 6. 1. 3. Întreținerea microscopului
La pornirea microscopului, ne asigurăm că potențiometrul care controlează sursa de lumină
este la minim. Pornim sursa de lumină și o ajustăm în funcție de necesar.
După terminarea examenului microscopic:
·         închidem sursa de lumină;
·         ridicăm cu tubul microscopului;
·         coborâm condensatorul;
·         scoatem lama de pe platină.
Este obligatoriu ca după examinare produsele nefixate (preparate între lamă și lamelă) să fie
puse în flaconul cu amestec dezinfectant.
Frotiurile interesante pot fi păstrate (trecute inițial prin xilol, apoi uscate și stocate într-o cutie
specială).
Ștergem lentila obiectivului cu imersie cu pulpa degetului sau cu o hârtie specială, pentru a o
curăța de uleiul de cedru (periodic, ștergem această lentilă cu tifon foarte curat, îmbibat în
xilol). Curățăm platina și lentila condensatorului cu tifon curat îmbibat în xilol. Acoperim
microscopul cu o husă (îl ferim de praf). Ar fi recomandabil ca microscopul să fie ținut în
ambalaj de polietilenă împreună cu o substanță desicantă (ex. silicagel).
5. 6. 2. Microscopul cu fond întunecat
Folosim un microscop la care s-a adaptat o sursă de lumină cu intensitate mare și un
condensator cardioid. Condensatorul pentru câmp întunecat oprește accesul spre obiectiv al
razelor de lumină directe iar obiectul este iluminat oblic. Obiectul studiat apare luminos pe
fondul întunecat al câmpului. (Figura nr. 11)
Obiectul este imersat într-o peliculă de glicerină pentru a evita reflexia totală a razelor.
Lamele trebuie să aibă grosimea de 1 milimetru.
Tehnica de examinare
 Examinăm inițial frotiul în folosind condensatorul pentru câmp luminos, uitându-ne cu
obiectivul cu mărire 10x pentru a repera structurile de interes. Înlocuim apoi cu condensatorul
cardioid (cu diafragma închisă). Ridicăm condensatorul până la nivelul platinei și punem pe
lentila condensatorului o picătură de glicerină.
Pregătim preparatul între lamă și lamelă și îl plasăm pe platină astfel încât să vină în contact
cu glicerina de pe lentila condensatorului. Fixăm preparatul cu ajutorul “cavalerilor”.
Examinăm inițial cu obiectivul 10x, apoi 40x coborât până aproape de suprafața lamelei;
clarificăm imaginea cu ajutorul microvizei. Când obținem „imaginea curgerii unui curent de
lichid” știm că suntem în câmpul microscopic. Utilizăm microviza și clarificăm detaliile.
Utilizăm acest microscop pentru examinarea morfologiei și mobilității Treponema pallidum
în serozitatea din șancru sau pentru alte spirochete (p.p. sau cultură).
5. 6. 3. Microscopul cu fluorescență
Acest microscop are o sursă de radiații (ex. o lampă care emite radiații UV), setul de filtre
(caloric, de excitație, de baraj), condensatorul pentru fond întunecat. Sursa de radiații emite
atât radiații UV cât și radiații calorice. Filtrele absorb radiațiile calorice emise și permit
trecerea spre preparat a radiațiilor cu lungime de undă mică (ex. UV) care sunt radiațiile de
excitație. Filtre de baraj asigură protecția ochiului celui care examinează, fără a permite
trecerea radiațiilor de nocive. Alegem filtrele (de excitație și baraj) în funcție de fluorocromul
utilizat astfel încât lumina emisă de fluorocromi să poată trece. Lichidul de imersie utilizat
pentru examinare prin obiectivele speciale trebuie să nu aibă fluorescență (ex. glicerină
tamponată neutră), iar lamele folosite să aibă grosimea de 1 milimetru.
Examinarea folosind microscopul cu fluorescență
Compușii organici care prezintă proprietatea ca după iradiere cu radiații ultraviolete să
absoarbă radiația excitantă, intră în stare de excitație iar, atunci când revin în starea normală
pierd energia acumulată și emit radiații luminoase se numesc flurocromi. Există mai mulți
fluorocromi, spre exemplu auramina O, acridin-oranj R, rhodamina B, tripaflavina etc.
Culoarea luminii emise depinde de fluorocromul (ex. culoarea este galbenă pentru auramina
O, galben-portocalie pentru combinația de auramină O - rhodamină B etc). Pentru
examinarea cu ajutorul microscopului cu fluorescență, preparatele trebuie să fie tratate cu
fluorocromi.
Substanțele (fluorocromi) care se pot lega covalent de anticorpi. Astfel, definim:
·         imunofluorescența directă, caz în care folosim anticorpi țintiți împotriva unor antigene
(componente bacteriene de interes) marcați cu fluorocromi;
·         imunofluorescența indirectă, caz în care folosim o reacție ce are loc secvențial. În primă fază,
folosim un anticorp țintit către antigenele de interes. În a doua fază, folosim anticorpi marcați
cu substanțe fluorocrome împotriva primilor anticorpi.
Aceste complexe Ag-Ac pot fi foarte utile în diagnosticul microbiologic, atât în prima etapă
(frotiu din p.p.) cât și în identificare. Dacă marcajul se realizează cu izotiocianat de
fluoresceină, lumina emisă va avea culoare verde; dacă marcajul se realizează cu lisamin-
rhodamină, lumina emisă va avea culoare portocalie.
Putem utiliza microscopia cu fluorescență în diagnosticul microbiologic al tuberculozei,
leprei, tusei convulsive etc.
 6. Medii de cultură. Cultivarea microorganismelor.
6. 1. Cuvinte cheie
• Colonie
• Cultură
• Însămânțare
• Inoculare
6. 2. Introducere
Cultivarea microorganismelor are ca scop obținerea de colonii izolate pentru a identifica (pe
baza a diferite caractere), agentul infecțios dintr-un anumit produs patologic (p.p.) recoltat de
la un pacient cu o boală infecțioasă.
Coloniile izolate alcătuiesc cultura pură (bacteriană, fungică) (Figura nr. 1) care se obține
însămânțând p.p. pe diferite medii de cultură (solide sau lichide) ce asigură substanțele
nutritive și conditiile necesare creșterii și multiplicării microbiene.
Obţinerea coloniilor izolate mai este utilă şi pentru testarea sensibilităţii la antibiotice şi
chimioterapice.
6. 3. Medii de cultură
Mediile de cultură se clasifică după diferite criterii. Aşa cum am explicat şi în volumul
Microbiologie Medicală, acestea pot fi: necelulare (artificiale, medii de cultură) şi celulare
(includ celule vii de ex. animale de laborator, ouă de găină embrionate sau culturi de celule).
Majoritatea bacteriilor şi fungilor se pot cultiva pe medii de cultură (necelulare, artificiale).
Există şi microorganisme (ex. virusuri, Rickettsii, Chlamydii) care nu se pot cultiva decât pe
gazde vii.
6. 3. 1. Medii celulare (vii)
Din categoria mediilor celulare (vii) (Figura nr. 2) fac parte: animalele de experiență, oul de
găină embrionat și culturile de celule.
Animalele de experienţă pot fi utilizate pentru inocularea produselor patologice care includ
microorganisme ce nu se dezvoltă în alte condiții; totodată mai pot fi utilizate în studii de
patogenitate (ex. şoarecele alb, cobaiul, şobolanul, hamsterul, iepurele etc.). Această metodă
necesită un cost ridicat deoarece e nevoie de existența unei biobaze care să respecte regulile
GMP (Good Manufacturing Practices).
Oul de găină embrionat are un cost mai scăzut (dar mult mai mare decât prețul unui ou
obișnuit), este steril (produs în condiţii de GMP), nu prezintă factori antimicrobieni în primele
6-14 zile de incubaţie. Se examinează la ovoscop
(evaluarea stării embrionului) (Figura nr. 3) și se poate inocula intraembrionar, la nivelul
membranei chorioalantoidiene, în sacul alantoidian sau în sacul amniotic (Figura nr. 4). Se
introduce în incubator (37ºC) timp de una sau mai multe zile.
Putem utiliza şi culturi de organ sau culturi de celule (de ex. culturi primare). Culturile
primare derivă din dispersia celulelor unui organ proaspăt recoltat şi pot fi menţinute in vitro
3-5 pasaje.
6. 3. 2. Medii necelulare (artificiale)
Acestea sunt mai ieftine, se prepară uşor și sunt cel mai frecvent folosite (Figura nr. 5).
Ele trebuie să fie sterile, nutritive, să aibă un anumit pH (de regulă 7,2-7,6), să aibă umiditatea
favorabilă multiplicării germenilor etc.
6. 3. 2. 1. Clasificarea mediilor de cultură artificiale
Mediile de cultură artificiale se pot clasifica astfel:
• după starea de agregare [solide (agar/geloză, agar-sânge, AABTL, Bordet- Gengou, Löffler,
Löwenstein, Mueller-Hinton, Sabouraud etc.), lichide (apă peptonată alcalină, bulion Mueller-
Hinton, bulion-sânge etc.), semisolide (MIU, MILF etc.)];
• după compoziţie [simple (agar, bulion simplu etc.), complexe (agar-sânge, geloză-
chocolat, agar cu factori X şi V, Mueller-Hinton etc.)];
• după scopul urmărit [de transport (Cary-Blair etc.), de izolare (Bordet-Gengou, Löwenstein,
Sabouraud etc.), de identificare (TSI, MIU etc.), de conservare];
• există şi medii speciale [elective (Löffler etc.), selective (agar-sânge, BSA, Chapman, Mac
Conkey, medii cu antibiotice etc.), de îmbogăţire (apă peptonată alcalină, bulion selenit,
O.C.S.T. etc.), diferenţiale (AABTL, agar-sânge, MIU, TSI etc.).
Mediul electiv conţine substanțele care sunt cele utile pentru multiplicarea unei bacterii (de
exemplu mediul Lőffler pentru bacilul difteric). Mediul selectiv inhibă dezvoltarea unor
bacterii, dar permite multiplicarea bacteriei pe care dorim să o izolăm. Putem folosi medii în
care includem antibiotice (de ex. dacă Mycobacterium tuberculosis este rezistent la penicilină
și dorim să izolăm această bacterie, putem pune în mediu penicilina la care alți germeni sunt
sensibili). Mediul de îmbogăţire favorizează înmulţirea anumitor bacterii, în timp ce inhibă
dezvoltarea altor microorganisme din p.p. Mediul de îmbogățire este în același timp mediu
selectiv şi mediu electiv. Mediul diferenţial permite diferențierea bacteriilor/fungilor (după
caz). De ex. mediul geloză-sânge permite diferențierea în funcție de tipul hemolizei. Alte
medii diferențiale conţin un substrat (ex. lactoză / glucoză etc.) care poate fi sau nu
metabolizat; mai conțin și un indicator de pH. Dacă zaharul este metabolizat va avea loc
modificarea pH-ului şi respectiv a culorii (pentru că indicatorul de pH are culori diferite la pH
neutru, pH alcalin sau la pH acid. De ex., agarul cu albastru de brom- timol lactozat (AABTL)
permite diferenţierea bacteriilor lactoză-pozitive (ex. E. coli) de bacteriile lactoză-negative
(Shigella, Salmonella etc.) (Figura nr. 6). Alte exemple sunt TSI (3 zaharuri şi fier), MIU
(mobilitate indol uree) etc.
Mediile de cultură pot fi preparate în laborator conform unor reţete, se pot cumpăra medii
deshidratate (rehidratate cu apă distilată, demineralizată etc.) dar există şi medii gata pentru
utilizare, condiţionate în plăci Petri, tuburi etc. Toate mediile sunt supuse controlului de
calitate, pentru fiecare lot în parte. Mediile pe care urmează să le folosim trebuie să fie sterile.
Mediile de cultură pot fi stocate pentru un timp la frigider (+4ºC), în folie de plastic închisă
ermetic. Mediile pentru creştere în anaerobioză (bulion tioglicolat, alte medii) se păstrează în
dulapuri, la întuneric şi la temperatura camerei.
6. 3. 2. 2. Câteva exemple de medii de cultură
Agar-sânge: mediul conţine agar care se dizolvă la temperatură în apă distilată sterilă;
autoclavăm (15 minute la ) şi răcim până la . Fără a se răci în continuare, adaugăm 5% sânge
defibrinat de animal. Distribuim aseptic mediul în plăci Petri.
Agar-chocolate: până la obţinerea amestecului de agar-sânge procedăm exact ca mai sus. În
continuare avem nevoie de o baie de apă la care temperatura e stabilită la . Introducem
flaconul cu agar-sânge în baia de apă şi menţinem timp de 10 minute (eritrocitele se lizează şi
eliberează factori nutritivi). Când temperatura revine la turnăm mediul în plăci Petri.
Amies: este un mediu de transport. Conţine agar, tioglicolat de sodiu, cărbune
neutru (permite supravieţuirea microorganismelor sensibile, ex. Neisseria gonorrhoeae) şi o
soluţie tamponată de săruri anorganice. Poate fi stocat timp de 12 luni la +4ºC.
Apă peptonată alcalină: este un mediu utilizat atunci când suspectăm prezenţa Vibrio
cholerae. Conţine peptonă şi clorură de sodiu dizolvate prin încălzire în apă distilată, cu
ajustarea pH-ului la o valoare de 8,6-9,0. Este repartizat în tuburi. Sterilizăm prin autoclavare
(15 minute, ). Poate fi stocat timp de 6 luni la +4ºC.
Cary-Blair: este un mediu de transport de ex. pentru germeni Gram negativi. Conţine agar,
tioglicolat de sodiu şi o soluţie tamponată de săruri anorganice dizolvate (prin încălzire şi
agitare) în apă distilată. Poate fi stocat mai multe luni la +4ºC.
Löwenstein-Jensen: este utilizat pentru izolarea Mycobacterium tuberculosis.
Conţine o soluţie de săruri şi amidon, soluţia de verde malachit şi omogenizat de ouă. După
filtrare mediul se repartizează în tuburi (cu capac înşurubat). Este coagulat în pantă.
Mac Conkey: este un mediu slab selectivo-diferenţial. Componentele sunt dizolvate în apă
distilată şi autoclavate 15 minute la . Stocarea poate dura 4 săptămâni la +4ºC.
Mediul Sabouraud: este un mediu pentru fungi. Conţine glucoză, digestie pancreatică de
cazeină şi agar. Se aduce la pH 5,6 urmând fierberea, filtrarea şi repartizarea în plăci Petri.
Înainte de utilizare, plăcile cu mediu Sabouraud pot fi stocate la temperatura frigiderului circa
2 luni. Prin adăugare de antibiotice (ex. cloramfenicol etc.) obţinem mediul selectiv.
6. 4. Tehnici de cultivare
Prin cultivare urmărim să obţinem o populaţie microbiană necesară și suficientă pentru
diagnostic. În timpul cultivării nu este permisă contaminarea p.p. Coloniile bacteriene izolate
dintr-un produs patologic se obţin prin „epuizarea” inoculului pe medii de cultură, folosind
ansa bacteriologică, pipeta Pasteur, tamponul de vată sau alte tehnici.
6. 4. 1. Obţinerea coloniilor izolate folosind ansa bacteriologică (Film nr. 1)
Însămânţarea “în pentagon deschis” pornind de la un p.p. adus în laborator se desfăşoară
lângă becul de gaz, în următoarele etape:
• notăm pe placa cu mediu datele de identificare;
• sterilizăm ansa (bucla și firul) „la roşu” şi flambăm portansa;
• luăm eprubeta cu p.p. în mâna stângă, scoatem dopul eprubetei utilizând degetele 4-5 de la
mâna dreaptă; flambăm gura eprubetei (trecere prin flacără de 2-3 ori);
• introducem ansa în eprubetă fără să atingem partea superioară și răcim bucla pe pereţii
interiori în vecinătatea p.p., încărcăm bucla cu p.p. şi scoatem ansa încărcată, fără să atingem
pereţii sau gura eprubetei;
• flambăm gura eprubetei; punem dopul eprubetei și aşezăm eprubeta în stativ; cu mâna
stângă luăm o placă Petri pe care o aşezăm pe masă cu capacul în jos şi mediul în sus; prima
latură a unui viitor pentagon deschis; apoi închidem placa Petri;
• reluăm procedura de sterilizare, flambare şi răcire a ansei (ex. atingem mediul într-o zonă
neînsămânţată, pe interiorul plăcii Petri);
• nu mai încărcăm ansa cu p.p. şi trasăm a doua latură a pentagonului intersectând-o pe prima;
sterilizăm din nou ansa; repetăm pentru următoarele laturi şi avem grijă să nu se unească
ultima latură cu prima latură;
• punem placa Petri însămânţată în termostat, la 35- ( pentru fungi); după circa 18-24 ore de
incubare, pe prima latură rezultă o cantitate mare de cultură, în timp ce pe următoarele laturi
cultura e în cantitate din ce în ce mai mică şi pe ultimele laturi, sau cel puţin pe ultima latură a
“pentagonului deschis” vedem colonii izolate (Figura nr. 7).
6. 4. 2. Însămânţarea cu ansa calibrată
• putem utiliza anse de platină sau anse de unică folosinţă cu calibrul de 0,01 sau 0,001 ml,
pentru urocultură; urina se omogenizează prin „răsturnarea” de câteva ori a recipientului de
recoltare închis etanş; apoi înclinăm recipientul astfel încât să putem tot cu mâna stângă
deschidem placa iar cu ansa încărcată cu p.p. trasăm câteva linii ca un “zig-zag” (fără să
ridicăm ansa de pe mediul de cultură); rezultă astfel pune bucla ansei, paralel pe suprafaţa
urinei şi să prelevăm p.p.;
• descărcăm p.p. în striu, pe unul dintre diametrele unei plăci Petri, epuizăm inoculul pe toată
suprafaţa plăcii în striuri perpendiculare pe primul striu (prin mişcări în zig-zag);
• după incubare, în următoarea zi numărăm coloniile apărute (şi înmulţim numărul de colonii
cu 1.000 dacă am utilizat pentru însămânţare ansa de 0,001 ml).
6. 4. 3. Însămânţarea prin înţepare a mediului turnat în tuburi/eprubete
• metoda se poate utiliza pentru conservarea culturilor pure ale tulpinilor de colecţie sau
pentru însămânţarea unor medii multitest (TSI, MIU etc.);
• preferăm utilizarea unei anse-fir;
• spre exemplu dacă facem cultivarea pe mediul TSI:
 • utilizăm tuburi de dimensiuni mici (3 ml mediu pentru un tubuşor);
• însămânţăm „partea dreaptă” prin înţepare, fără a se atinge baza tubului;
• apoi însămânţăm „partea înclinată” prin realizarea unor striuri în zig-zag, atingând suprafaţa
mediului.
Studenţii vor urmări demonstrarea modului în care se execută tehnicile de însămânţare și vor
executa unele dintre aceste tehnici.

7. Examinarea caracterelor fenotipice. Teste de

identificare.
7. 1. Cuvinte cheie
·         Colonii de tip S, R, M
·         Fenomenul de invazie și linia de demarcație
·         ”Cap de meduză”/ “coamă de leu”
·         Pigmentogeneză și hemoliză (α, α′, β, γ)
·         Teste fenotipice
·         Auxanograma
7. 2. Introducere
Coloniile izolate se pot obţine prin diferite tehnici. Majoritatea speciilor bacteriene se
multiplică şi formează culturi în 18-24 de ore de incubare la temperatura optimă de dezvoltare
(ex. 35-37°C). Pentru bacteriile care necesită 3-5% CO2, plăcile se pun în exsicator, împreună
cu o lumânare aprinsă. Pentru bacteriile strict anaerobe este necesară incubarea în
anaerobioză. Fungii se dezvoltă la 28-30°C.
Examinarea coloniilor izolate este foarte utilă. Se poate realiza cu ochiul liber şi cu ajutorul
unei lupe sau a unui stereomicroscop (dacă sunt foarte mici).
7. 3. Aspectul culturilor pe medii lichide
Bacteriile şi fungii facultativ anaerobi se vor dezvolta în toată masa de lichid, iar mediul va
deveni tulbure. În schimb, bacteriile strict aerobe se dezvoltă la suprafaţa mediului (Figura nr.
1). Ca și idee generică, în majoritatea cazurilor, tulpinile care pe mediile solide formează
colonii de tip “S” tulbură omogen mediul în timp ce tulpinile care formează colonii de tip “R”
realizează o tulburare mai puţin omogenă. “Variantele R” pot lăsa mediul limpede, formând
flocoane care se depun sau un strat (văl) la suprafaţa mediului (ex. Mycobacterium
tuberculosis) (Figura nr. 2).
Exemple de creştere pe medii de cultură lichide (Tabelul nr. 1):
·         mediul este tulburat omogen (ex. Staphylococcus spp.);
·         mediul este clar, cu depozit grunjos pe pereţi şi la baza tubului (ex. Streptococcus
pyogenes);
·         mediul este clar, cu văl la suprafaţă (ex. Vibrio cholerae);
·         mediul este clar, iar la suprafaţă se dezvoltă o membrană groasă, plisată (ex.
Mycobacterium tuberculosis).
7. 4. Aspectul culturilor pe medii solide
Aspectul coloniilor variază în funcţie de microorganismul cercetat, dar nu este atât de specific
încât să permită un diagnostic. Există un caracter orientativ.
7. 4. 1. Atunci când descriem coloniile ar trebui să notăm diferite proprietăți:
·         dimensiunea
o   coloniile pot fi mari (ex. Klebsiella pneumoniae sau levuri) (Figura nr. 3)
o   medii (majoritatea bacteriilor studiate)
o   mici, sub (ex. Streptococcus viridans)
o   foarte mici (ex. Mycoplasma spp., Ureaplasma spp.);
·         marginile - regulate, neregulate, circulare, zimţate, ondulate, lobate, filamentoase,
acoperite cu miceliu pufos, etc. (Figura nr. 4);
·         forma - punctiformă, circulară, neregulată, filamentoasă, etc. (Figura nr. 5);
·         relieful - plat, convex, ombilicat, papilat (Figura nr. 6);
·         suprafaţa - netedă, lucioasă, mată, rugoasă, mucoidă, pufoasă (Figura nr. 7);
·         culoarea - pigment la nivelul coloniei sau/şi al mediului (Figura nr. 8);
·         opacitatea - transparente, semitransparente, opace (Figura nr. 9);
·         consistenţa, aderenţa la mediu (Figura nr. 10).
7. 4. 2. Tipuri de colonii
Colonia S (smooth) are suprafaţa bombată şi netedă, iar marginile sunt circulare.
Microorganismele din colonie păstrează structura antigenică; nu aglutinează spontan cu
soluţie salină fiziologică. Germenii capsulaţi își păstrează capsula. Virulenţa este conservată.
Majoritatea bacteriilor studiate formează colonii de tip S (Staphylococcus aureus,
Streptococcus pyogenes, E. coli, Candida albicans etc) (Figura nr. 11).
Colonia R (rough) este plată, mată, uscată, cu margini crenelate (zimţate) și o suprafaţă ce
prezintă rugozităţi. Structura antigenică și capsula nu sunt păstrate. Virulenţa nu este
conservată (excepţii Bacillus anthracis, Mycobacterium tuberculosis, Corynebacterium
diphteriae) (Figura nr. 12).
Colonia M (mucoid) este mare, strălucitoare, umedă, mucoasă, cu aspect de curgere pe
mediu. Este produsă de bacteriile care prezintă capsulă (ex. Klebsiella pneumoniae) (Figura
nr. 13).
7. 4. 3. Aspecte particulare
Datorită mobilității, Proteus spp. formează pe mediile solide colonii cu un aspect
particular. În funcție de tehnica de însămânțare pot fi observate
·         fenomenul de “invazie”: o tulpină din genul Proteus însămânțată la periferia unei plăci cu
mediu de cultură simplu se va dezvolta în valuri concentrice pe toată suprafaţa mediului
(Figura nr. 14)
·         fenomenul “liniei de demarcaţie”: prin cultivarea a 2 tulpini diferite de Proteus, în 2
puncte diametral opuse, vom observa „invazia” până în apropierea unei linii de întâlnire,
denumită “linie de demarcaţie” (Figura nr. 15)
·         fenomenul de “căţărare”: cultivăm un produs patologic (în care există o tulpină de
Proteus spp.) la baza unui tub cu geloză înclinată, iar cultura se va dezvolta pe tot mediul din
tubul respectiv (Figura nr. 16).
Bacillus anthracis produce colonii în “cap de meduză” sau în “coamă de leu”, de tip R:
mari, culoare alb-cenuşiu, cu prelungiri ondulate în periferie (Figura nr. 17).
7. 5. Caractere metabolice
7. 5. 1. Pigmentogeneza
Pigmentogeneza poate fi utilă în identificare. Uneori este necesar să respectăm unele condiţii
speciale de cultivare pentru a obține pigmentarea coloniilor.
Bacteriile pot produce un pigment care colorează colonia bacteriană (ex. pigmentul auriu la S.
aureus); sau pot colora și coloniile și mediul (pigmentul este difuzibil în mediu- ex. la
Pseudomonas aeruginosa) (Figura nr. 18).
Și fungii pot produce pigmenţi. Coloniile de Candida albicans au culoare albă, în schimb
mucegaiurile produc o varietate mult mai mare de pigmenţi: Aspergillus flavus - colonii
galben verzui până la verde închis, dar privite pe partea cealaltă a plăcii apar roşii-brune, A.
fumigatus - colonii iniţial albe care devin albastre-verzui sau albastre, iar privite pe cealalaltă
parte a plăcii sunt colorate brun sau în alte culori, A. niger - colonii iniţial albe, devin brun
negre, iar privite pe cealalaltă parte a plăcii sunt colorate în galben etc (Figura nr. 19).
7. 5. 2. Producerea de hemolizine
 Unele microorganisme produc enzime (hemolizine) care lizează hematiile din mediile de
cultură cu sânge. Hemoliza poate avea aspecte diferite (Figura nr. 20):
·         α hemoliză (hemoliză viridans): produc liza incompletă a hematiilor și culoarea verzuie (ex.
Streptococcus viridans, Streptococcus pneumoniae);
·         β hemoliză: hematiile sunt complet lizate, zona de hemoliză fiind clară (ex. Streptococcus
pyogenes, Bacillus cereus, Listeria monocytogenes).

7. 5. 3. Producerea altor enzime

·         catalază (ex. Staphylococcus spp.);
·         gelatinază (cultura microbiană lichefiază gelatina, ex. Clostridium perfringens);
·         lecitinază (ex. Bacillus anthracis, Clostridium spp.);
·         oxidază (ex. N. meningitidis, N. gonorrhoeae, P. aeruginosa, V. cholerae).
7. 5. 4. Alte caractere metabolice
·         toleranţa la un anumit pH (ex. V. cholerae se multiplică la pH alcalin);
·         toleranţa la o anumită concentraţie de NaCl (ex. Staphylococcus aureus);
·         sensibilitatea la optochin (ex. S. pneumoniae) sau la bacitracină (ex. S. pyogenes).
7. 6. Caractere de patogenitate
Caracterele de patogenitate pot fi evidenţiate in vitro sau in vivo.
7. 6. 1. Teste efectuate in vitro
·         Examinarea coloniilor cu rol orientativ (majoritatea speciilor bacteriene sunt patogene în
forma “S”; excepţie bacilii antraxului, difteric şi tuberculos);
·         Efectuarea anumitor teste biochimice ori metabolice cu rol orientativ (ex. fermentarea
manitei, testul coagulazei, producerea de hemolizine);
·         Evidenţierea producerii unor toxine (endotoxine, ex. prezenţa endotoxinei produce
gelificarea unui lizat de Limulus polyphemus) sau exotoxine.
7. 6. 2. Teste efectuate in vivo
Sunt utilizate animale de laborator sensibile faţă de infecţia experimentală cu diferiţi germeni
sau faţă de anumite toxine microbiene.
7. 6. 2. 1. Toxinotipia în cazul suspicionării unei toxiinfecţii alimentare (TIA) cu Clostridium
botulinum
Inițial, se obţine un supernatant după triturarea și centrifugarea alimentelor incriminate. În
continuare se vor utiliza 2 preparate: supernatantul rezultat şi supernatantul menținut timp de
15 minute la 100°C (toxina botulinică este termolabilă, urmărindu-se astfel obținerea unui
martor negativ). Cele 2 preparate se vor inocula în următoarele variante la 4 loturi de şoareci
(0,5 ml/ şoarece) sau cobai (1 ml/ cobai): lotul 1-supernatant ca atare, lotul 2- supernatant
inactivat, lotul 3- 0,1 ml ser antitoxină A, urmat de adăugarea supernatantului (după 30
minute), lotul 4- 0,1 ml ser antitoxină B urmat de adăugarea supernatantului (după 30 minute).
Dacă, spre exemplu, animalele din loturile 1 şi 4 mor, iar animalele din loturile 2 şi 3
supravieţuiesc, în produsul patologic există toxină botulinică de tip A. (Figura nr. 21)
7. 6. 2. 2. Testarea patogenităţii unor levuri (ex. pentru Candida albicans)
Pornind de la o cultură de 24 de ore în mediul Sabouraud lichid, se separă sedimentul,
urmată de realizarea unei suspensii 0,2% a acestuia în soluţie salină fiziologică sterilă. Se
inoculează preparatul în venele cozii la un lot de şoareci (câte 0,2-0,8 ml pentru fiecare
animal) şi se urmărește evoluţia animalelor timp de 4-10 zile. Dacă este implicată o tulpină de
C. albicans patogenă, animalele vor muri după circa 1 săptămână, fiind posibilă evidenţierea
unor abcese miliare după disecție.
7. 7. Câteva exemple de teste de identificare
Este interesantă atât studierea exemplelor cât şi înţelegerea necesităţii controlului intern de
calitate, prin utilizarea martorilor (pozitiv şi negativ) pentru fiecare test.
7. 7. 1. Utilizarea unui carbohidrat ca unică sursă de carbon (auxanograma)
 Principiu Levurile prezintă un echipament enzimatic care le permite să utilizeze un anumit
carbohidrat ca sursă unică de carbon. Dezvoltarea unei levuri pe un mediu în care este inclus
un singur carbohidrat demonstrează utilizarea acestuia. Similar se poate verifica asimilarea
unor substanţe azotate, de către levuri.
Tehnica de lucru Se efectuează o suspensie din cultura microbiană în apă distilată sterilă.
Mediul de cultură se încălzește până la topire şi apoi se răcește la 50°C pentru asimilarea
carbonului. Într-un tub steril se introduc 20 ml de mediu, 2 ml soluţie de vitamine şi 0,25 ml
din suspensia levurică, iar apoi se toarnă amestecul într-o placă Petri sterilă, aşteptându-se
solidificarea.
Se depun 5 rondele din hârtie de filtru, una în centru şi 4 spre periferia fiecărui cadran al plăcii
şi imediat, utilizând o ansă cu diametrul buclei de , se depun pe fiecare dintre rondele
prelevatele din diferite (5) soluţii de carbohidraţi, cel puţin din glucoză. După incubarea la 28-
30°C pentru 24-48 ore se urmărește apariţia culturii în jurul rondelelor. (Figura nr. 22)
Interpretare Dacă testul s-a efectuat corect, ar trebui să existe multiplicare levurică (cultură
prezentă) în jurul rondelei pe care s-a depus soluţie 5% glucoză, deoarece toate levurile pot
folosi glucoza drept unică sursă de C. Apoi se notează dezvoltarea culturii în jurul celorlalte
rondele, urmată de stabilirea speciei implicate.
Control de calitate
·         tulpina de referinţă de Cryptococcus laurentii
·         tulpina de referinţă de Candida pseudotropicalis.
7. 7. 2. Testul sensibilităţii la bacitracină
Principiu Multiplicarea a 99% din streptococii de grup A este inhibată de bacitracină
(antibiotic produs de Bacillus licheniformis).
Materiale necesare colonii β-hemolitice izolate pe geloză-sânge şi microcomprimate de
bacitracină cu 0,04 U şi cu 0,1 U.
Tehnica de lucru Prelevăm 3-4 colonii β-hemolitice şi însămânţăm omogen pe o jumătate
de placă Petri cu geloză-sânge. Plasăm în centrul ariei însămânţate un microcomprimat cu
bacitracină şi incubăm pentru 18-24 ore la 35-37ºC.
Interpretare Testul este pozitiv (bacteria este sensibilă la bacitracină) în cazul în care
rezultă o inhibiţie a creşterii bacteriene (indiferent de diametru), în jurul microcomprimatului
cu 0,04 U bacitracină sau rezultă o inhibiţie a creşterii bacteriene cu diametrul ³ , în jurul
microcomprimatului cu 0,1 U. (Figura nr. 23)
Control de calitate
·         Martor pozitiv – Streptococcus pyogenes
·         Martor negativ – Streptococcus agalactiae.
7. 7. 3. Testul bilolizei (Neufeld)
Principiu Pneumococii (Streptococcus pneumoniae) capsulaţi sunt lizaţi în prezenţa bilei
sau sărurilor biliare prin activarea unei enzime autolitice (Figura nr. 24).
Materiale necesare Colonii izolate a-hemolitice, soluţie de dezoxicolat de sodiu 10%,
soluţie salină izotonă, apă distilată.
Tehnica de lucru Se prepară în soluţie salină fiziologică o suspensie pornind de la
coloniile a-hemolitice izolate. Apoi se repartizează câte 0,5 ml din suspensie în 2 eprubete de
sticlă. În primul tub se adaugă 0,5 ml dezoxicolat de sodiu, iar în al doilea tub 0,5 ml apă
distilată. Se incubează timp de 2 ore la 35-37ºC.
Interpretare
·         Test pozitiv: clarificarea suspensiei doar în tubul în care s-a adăugat dezoxicolat (bacteriile au
fost lizate, fiind S. pneumoniae);
·         Test negativ: ambele tuburi au rămas opace.
       Control de calitate
·         Martor pozitiv – Streptococcus pneumoniae
·         Martor negativ – Streptococcus viridans.
7. 7. 4. Testul producerii de catalază
Principiu Catalaza descompune peroxidul de hidrogen în apă şi oxigen.
Materiale necesare Colonii izolate dezvoltate pe medii fără sânge, soluţie de peroxid de
hidrogen 3%, apă distilată.
Tehnica de lucru Se realizează o suspensie bacteriană densă în 1-2 ml de apă distilată la
care se adăugă 1-2 picături de soluţie de peroxid de hidrogen. Se observă imediat şi după
trecerea a 5 minute apariţia bulelor de oxigen. (Figura nr. 25).
Interpretare
·         Test pozitiv: apariţia bulelor de gaz (bacteria produce catalază)
·         Test negativ: absenţa bulelor de gaz.
Control de calitate:
·         Martor pozitiv – Staphylococcus aureus
·         Martor negativ – Streptococcus pyogenes.
7. 7. 5. Testul coagulazei
Principiu Stafilococii coagulază-pozitivi produc o enzimă care activează coagularea
plasmei. Există 2 tipuri de coagulază: coagulaza liberă şi coagulaza legată de peretele celular
(“clumping factor”). Stafilococii coagulază pozitivi sunt consideraţi Staphylococcus aureus.
Materiale necesare Colonii izolate pe mediu neselectiv ale tulpinii care urmează să fie
testată, plasmă de iepure, lame, tuburi.
Tehnica de lucru este diferită în funcție de suportul utilizat.
7. 7. 5. 1. Testul coagulazei pe lamă (Figura nr. 26).
Se verifică prezenţa coagulazei legate. Pe o lamă se depune o picătură de apă distilată,
urmată de adăugarea a 1-2 colonii, de suspensionarea şi omogenizarea acestora până la
obținerea unui lichid tulbure omogen.
Dacă după aproximativ 10 secunde se observă apariţia unei eventuale ”autoaglutinări”, nu
mai putem continua și în acest caz în care se va efectua testul coagulării în tub. Dacă picătura
rămâne tulbure omogen se adaugă 1 picătură de plasmă şi se urmărește apariţia “coagulilor”
timp de 10-15 secunde.
Interpretare
·         Test pozitiv: apariţia “coagulilor” în 10-15 secunde
·         Test negativ: absenţa “coagulilor”.
NB: 5% din S. aureus dau reacţii fals negative.
7. 7. 5. 2. Testul coagulazei în tuburi (Figura nr. 27).
Se verifică prezenţa coagulazei libere. Se pipetează 0,5 ml de plasmă într-un tub steril.
Apoi se prelevează o colonie care se descarcă în plasma din tub. Se incubează tubul timp de 4
ore la 35-37°C, perioadă în care acesta va fi examinat prin înclinare, din 30 în 30 de minute.
Dacă reacţia este negativă la 4 ore, se reincubează până la 24 ore.
Interpretare
·         Rezultat pozitiv: formarea unui cheag
·         Rezultat negativ: absenţa cheagului.
Control de calitate
·         Martor pozitiv – S. aureus
·         Martor negativ – S. epidermidis.
7. 7. 6. Testul filamentării (pentru Candida albicans)
Principiu După cultivare în ser uman, ser bovin, ser de berbec ori altele timp de 2-4 ore,
la 35-37°C, blastoconidiile individuale de C. albicans produc filamente scurte (tubi
germinativi) (Figura nr. 28).
 Materiale necesare Colonii izolate, în scopul identificării, ser uman, ser bovin, ser de
berbec, ser fetal de viţel ori serumalbumină bovină, aplicatoare de lemn sau pipete Pasteur
sterile cu vârful efilat, lame şi lamele, tuburi mici.
Tehnica de lucru Într-un tub de dimensiuni mici se introduc 0,5-1 ml de ser uman sau alt
tip de ser. Cu un aplicator steril (ca un beţigaş) se atinge colonia care trebuie identificată, iar
apoi aceasta se introduce în tub. Se incubează timp de 2-4 ore, la 35-37°C și se examinează la
microscopul optic preparatul între lamă şi lamelă.
Interpretare
·         Test pozitiv: prezenţa unor tubi germinativi cu un calibru mai îngust, dar cu o lungime de
3-4 ori mai mare decât diametrul celulei de origine, care continuă direct, fără nici o
strangulare sau sept blastoconidia;
·         Test negativ: absenţa aspectului menţionat mai sus sau prezenţa unor pseudotubi
germinativi care sunt delimitaţi printr-o strangulare şi un sept de blastoconidie.
Control de calitate
·         Martor pozitiv – C. albicans
·         Martor negativ – C. tropicalis.
7. 7. 7. Mediul multitest MIU (mobilitate indol uree)
Principiu: MIU conţine uree, triptofan, roşu fenol (indicator de pH) şi este condiţionat în
tuburi de dimensiuni mici. Geloza este moale permiţând mobilitatea microorganismului
însămânţat; hidroliza ureei va duce la alcalinizarea mediului cu modificarea culorii de la
galben la roşu; producerea de indol din triptofan va fi indicată de înroşirea reactivului Ehrlich
(Figura nr. 29).
Materiale necesare Tuburi cu mediul MIU, hârtiuţe indicator cu reactiv Ehrlich, colonii
de identificat (colonii izolate), ansă fir etc.
Tehnica de lucru Seutilizează pentru însămânţare ansa fir. După ce se prelevează o probă
dintr-o colonie izolată pe un mediu neselectiv, se însămânţează mediul prin înţepare,
încercând să se realizeze o însămânţare în “linie dreaptă”. Apoi, se fixează de dop hârtiuţa
indicator în aşa fel încât să ajungă deasupra coloanei de mediu, fără să o atingă. Se incubează
la 35-37°C timp de 24 ore. În cazul în care nu are loc virarea culorii mediului, se prelungește
durata de incubare până la 48 de ore.
Interpretare
·         Mobilitate prezentă: opacifierea este uniformă în coloana de mediu
·         Mobilitate absentă: opacifierea apare numai pe traiectul de însămânţare
·         Urează negativ: culoarea coloanei rămâne galbenă
·         Urează pozitiv: culoarea coloanei devine roşie
·         Indol pozitiv: schimbarea culorii hârtiei la roşu-violet
·         Indol negativ: hârtia rămâne albă.
Control de calitate
·         Martor pozitiv – Proteus mirabilis M+ U+ I+
·         Martor negativ – Shigella spp. M- U- I-.
7. 7. 8. Mediul multitest TSI (triple sugar iron)
Principiu Mediul este agarizat şi condiţionat în două “zone” relativ distincte ale coloanei:
baza şi panta. Mediul conţine glucoză (în raport de 1/10 faţă de celelalte zaharuri), lactoză,
zaharoză, citrat feric şi un indicator de pH (roşu neutru). Partea dreaptă (coloana) nu vine în
contact cu aerul şi oferă condiţii relative de anaerobioză. Partea înclinată (panta) oferă condiţii
de multiplicare în aerobioză.
Concentraţia glucozei este mai mică, pentru ca fermentarea acestui zahar să poată fi
detectată chiar dacă este singurul zahar metabolizat. Dacă o bacterie se dezvoltă în partea
dreaptă vor fi eliberaţi aminoacizi, care în zona aerobă vor fi decarboxilaţi oxidativ şi vor
modifica pH-ul spre alcalin. În cazul în care lactoza şi/sau zaharoza nu sunt fermentate,
cantitatea de acid produsă prin fermentarea glucozei (toate enterobacteriile fermentează
glucoza) este suficient de mică pentru ca pH-ul de la nivelul pantei să revină rapid la neutru.
În acelaşi timp, pH-ul rămâne acid (şi culoarea mediului rămâne galbenă) la nivelul coloanei
pentru că în condiţii de relativă anaerobioză nu are loc decarboxilarea oxidativă. Dacă
zaharurile de la nivelul pantei sunt fermentate, cantitatea de acid produsă este suficient de
mare pentru ca pH-ul de la acest nivel să rămână acid şi respectiv culoarea pantei să rămână
galbenă. Prezenţa citratului feric, în cazul în care bacteria produce H2S duce la apariţia unei
culori negre (se formează sulfit feros). La nivelul coloanei se înregistrează şi producerea de
gaz (apariţia unor bule pe traseul de însămânţare, fragmentarea sau “ruperea” coloanei etc)
(Figura nr. 30).
Materiale necesare tuburi de dimensiuni mici cu mediul TSI; colonii de identificat
(colonii izolate); ansă fir etc.
Tehnica de lucru Se utilizează pentru însămânţare ansa fir. Se prelevează din colonia
izolată pe mediu neselectiv, iar apoi se însămânţează coloana prin înţepare, urmată de
retragerea ansei şi de trasarea unui “zig-zag” la suprafaţa coloanei. Se incubează la 35-37°C
timp de 24 ore.
Interpretare
·         Glucoză pozitiv: culoarea coloanei este galbenă
·         Glucoză negativ: culoarea coloanei rămâne roşie (glucoza nu este fermentată, iar
microorganismul nu este o enterobacterie)
·         Fermentarea glucozei poate fi însoţită de producere de gaz
·         Lactoză/zaharoză pozitiv: culoarea pantei devine galbenă
·         Lactoză/zaharoză negativ: culoarea pantei rămâne roşie
·         Producere H2S: culoare neagră la nivelul coloanei.
Control de calitate
·         Martor pentru pH acid la nivelul coloanei şi pantei, fără producere de H2S – E. coli
·         Martor pentru pH acid la nivelul coloanei, pH neutru la nivelul pantei şi producere de H2S
– Salmonella typhimurium.
7. 7. 9. Testul producerii de citocrom oxidază
Principiu: Unele bacterii produc citocrom oxidază (lipseşte la bacteriile strict anaerobe).
Aceasta acţionează asupra tetra-metil p-fenilendiaminei rezultând un compus de culoare
purpurie. Dintre bacteriile oxidază-pozitive amintim Vibrio spp., majoritatea speciilor de
Pseudomonas, Alcaligenes spp, Neisseria spp. (dintre germenii Gram negativi) şi
Micrococcus spp. (dintre germenii Gram pozitivi).
Materiale necesare Soluţie apoasă de tetra-metil p-fenilendiamină 1% conservată în sticlă de
culoare brună (în frigider) sau fâşii de hârtie indicator impregnate în reactiv, hârtie de filtru,
ansă cu fir de platină sau pipetă Pasteur (cudată), colonii izolate dezvoltate pe agar-sânge,
agar Mueller Hinton etc.
Tehnica de lucru Într-o cutie Petri se așează un fragment de hârtie de filtru pe care se depun
1-2 picături de soluţie apoasă de tetra-metil p-fenilendiamină 1%. Se prelevează dintr-o
colonie izolată şi se descarcă ansa pe hârtia de filtru prin mişcări circulare de mică
amplitudine. Se urmărește apariţia unei reacţii de culoare în primele 10 secunde.
Interpretare (Figura nr. 31)
·         Test pozitiv: apariţia unei zone de culoare purpurie în 10 secunde
·         Test negativ: absenţa culorii purpurie.
NB Apariţia zonei colorate mai tardiv nu permite interpretarea testului (probabil este un
rezultat negativ).
Control de calitate
·         Martor pozitiv – Pseudomonas aeruginosa
·         Martor negativ – Escherichia coli.
 7. 7. 10. Testul sensibilităţii la optochin
Principiu Majoritatea tulpinilor de pneumococi (Streptococcus pneumoniae) sunt sensibile la
concentraţii scăzute (< 5 µg/ml) de optochin (hidroclorid de etil-hidrocupreină) (Figura nr.
32).
Materiale necesare Discuri cu optochin (5 µg / disc), cu diametrul de 6 milimetri, plăci cu
agar-sânge, tampoane sterile, colonii α-hemolitice izolate, care urmează a fi testate.
Tehnica de lucru Seprelevează cu un tampon steril 2-3 colonii, urmată de însămânţarea pe
jumătatea unei plăci cu agar-sânge, în aşa fel încât să rezulte o cultură confluentă. Se plasează
un disc cu optochin în centrul zonei însămânţate, presându-l uşor pentru ca discul să adere
uniform. Se incubează timp de 18-24 ore la 35-37°C în atmosferă de 5% CO2.
Interpretare
·         Test pozitiv: apariţia unei zone de inhibiţie cu diametrul mai mare de 14 mm
·         Test negativ: absenţa inhibiţiei în jurul discului.
Control de calitate
·         Martor pozitiv – Streptococcus pneumoniae
·         Martor negativ – Streptococcus viridans.
Testele prezentate reprezintă doar câteva exemple. Testele fenotipice utilizabile în
diagnosticul de laborator microbiologic sunt mult mai numeroase.
Înţelegerea principiilor şi mai ales a necesităţii controlului intern de calitate, necesar
pentru orice test şi în orice laborator, sunt foarte utile.

8. Testarea sensibilităţii/rezistenţei la antibiotice şi

chimioterapice.
8. 1. Cuvinte cheie
·         Antibiogramă
·         Antibiotice
·         Chimioterapice
·         Concentrația minimă inhibitorie/bactericidă
·         Nivel de eficienţă inhibitorie/bactericidă
8. 2. Introducere
Testarea sensibilităţii la antibiotice și chimioterapice este necesară datorită posibilității
prezenței rezistenţei agenților patogeni la aceste medicamente. Rezistenţa poate fi naturală
(determinată genetic) sau dobândită („achiziţionată” de anumite subpopulaţii microbiene în
anumite circumstanţe).
Există diferențe între efectul medicamentelor in vitro şi in vivo. Din acest motiv, metodele de
testare a sensibilităţii pot fi diferenţiate în:
1. metode de testare a sensibilităţii in vitro;
2. metode in vivo, care ţin cont de relaţia medicament-infecţie.
8. 3. Metode de testare a sensibilităţii in vitro
Antibiograma reprezintă o metodă de laborator prin care se apreciază sensibilitatea la
antibiotice a bacteriilor după cultivare pe medii dedicate acestei analize (ex. agar Mueller-
Hinton) și izolare în cultură pură, adică după obținerea unei singure tulpini bacteriene, acea
tulpină responsabilă de îmbolnăvire. Se poate realiza prin tehnici calitative și cantitative
·         Tehnici calitative (antibiograma difuzimetrică comună, antibiograma difuzimetrică
comparativă, antibiograma difuzimetrică standardizată etc) şi
·         Tehnici cantitative (metoda diluţiilor în mediu lichid, metoda diluţiilor în agar, metoda
microdiluţiilor în agar, testul “E”, metode şi sisteme comerciale, automatizate, de testare etc.).
8. 3. 1. Antibiograma difuzimetrică comună
Această este o metodă calitativă (răspunsul este de tip ”da” sau ”nu”). Se realizează în medii
de cultură solide (ex. agar Mueller-Hinton). Cel mai frecvent însămânţarea se realizează prin
“inundarea” plăcii urmată de aspirarea aseptică a excesului de inocul bacterian dar există şi
alte variante. (Film nr. 1) Placa însămânțată se lasă pe masa de lucru 20 minute după care se
aplică discurile speciale pentru testare a susceptibilitații (sunt produse comercial); acestea
conțin medicamentul antimicrobian și sunt marcate cu o prescurtare a numelui substanței
active ce o conțin (ex. P pentru penicilină). Aplicarea discurilor se realizează cu ajutorul unui
distribuitor de discuri automat, în mod automat (antibiotic dispenser), sau cu ajutorul unei
pense. (Film nr. 2; Figura nr 1)
Într-o placă Petri de 9 cm diametru se pot pune 6 discuri cu 6 antibiotice (recomandarea este
pentru 5) diferite iar în cea de 15 cm se pot pune 12 discuri cu antibiotice. Regula este să fie
dispuse la minim 3 cm distanţă între ele şi minim 1,5 cm de marginea plăcii (Figura nr. 2).
Există o gamă largă de distribuitoare de antibiotice, de la distribuitoare unice, pentru un
singur antibiotic până la distribuitoare pentru plăci pătrate, de 12 cm latura, unde pot fi puse
chiar si 16 discuri de antibiotice. Aceste discuri cu antibiotice trebuie să vină în contact
perfect cu mediul de cultură (se presează uşor în cazul aplicării manuale). După aplicare pe
placa inoculată discurile se lasă în contact cu mediul de cultură pe masa de lucru încă 20
minute ca apoi să se incubeze peste noapte în termostat [la 28º (pentru fungi) sau la 35-37°C
(pentru majoritatea bacteriilor)].
Antibioticul din disc este eliberat și difuzează în mediu realizând zone de inhibiţie în care
coloniile microbiene nu se dezvoltă (dacă populaţia bacteriană este sensibilă). Cu cât
diametrul zonei de inhibiţie este mai mare, cu atât bacteria va fi considerată mai sensibilă.
(Figura nr. 3)
Dacă în interiorul zonei de inhibiţie (indiferent de valoarea diametrului) se dezvoltă colonii
(“subpopulații rezistente”), bacteria va fi considerată rezistentă. (Figura nr. 4)
Această metodă folosită în multe dintre laboratoarelor, permite de fapt numai eliminarea
antibioticelor complet inactive şi eventual selecţionarea antibioticelor foarte active (tehnica nu
este standardizată).
8. 3. 2. Antibiograma difuzimetrică comparativă (Stokes, Balş)
Se efectuează pentru microorganismul de testat în paralel cu un microorganism de referinţă,
din aceeaşi specie (sau o specie asemănătoare). Spre exemplu, pentru cocii Gram pozitivi
putem alege pentru comparaţie o tulpină de Staphylococcus spp. Tulpina de referinţă are o
sensibilitate cunoscută la antibioticele pe care le utilizăm (cunoaştem inclusiv concentrația
minimă inhibitorie/CMI).
Se va împărți o placă pătrată în 3 zone egale și se va  inocula  în treimea medie tulpina de
referinţă iar în treimile exterioare 2 microorganisme diferite de testat. Inoculul trebuie să fie
astfel realizat încât să conducă la apariţia după incubare a unor colonii foarte apropiate, dar
care să nu fie confluente. Discurile cu antibiotice se vor plasa pe liniile de demarcaţie dintre
culturi. Ulterior se va incuba peste noapte la 35-37°C. (Figura nr. 5)
Rezultatele se exprimă cu termenii: “sensibil”, “intermediar”, “rezistent”, în funcţie de
diametrul zonelor de inhibiţie a multiplicării microorganismelor de testat, faţă de acelaşi
antibiotic. Putem aprecia CMI (vezi şi 8. 3. 4). (Figura nr. 6)
8. 3. 3. Antibiograma difuzimetrică standardizată (Kirby-Bauer)
Reprezintă antibiograma difuzimetrică comună (8. 3. 1.) care a fost standardizată. Este
singura metodă difuzimetrică recunoscută pe plan internaţional, rezultatele sunt reproductibile
şi corelabile între laboratoare.
Elementele necesare standardizării sunt:
·         Mediul. Cel mai frecvent se utilizează agar Mueller-Hinton; pH-ul mediului este frecvent
între 7,2-7,4 iar grosimea mediului trebuie să fie de 4 mm.
·         Inoculul. Seobține prinsuspensionarea a 2-3 colonii izolate în soluție salină fiziologică,
urmărindu-se turbiditatea suspensiei. Turbiditatea poate fi apreciată cu ajutorul unui dispozitiv
portabil destinat sa măsoare turbiditatea suspensiilor microbiene conform standardelor
McFarland, (nefelometru), sau cu tuburi etalon (Figurile nr. 6 și 7; Film nr. 3). Se ajustează la
0,5 McFarland (1,5x108UFC/ml), adică trebuie să aibă o turbiditate corespunzătoare
standardului 0,5 McFarland (circa 108 unităţi formatoare de colonii/ml) în multe dintre cazuri.
·         Incubarea. Timpul de incubare în majoritatea cazurilor este 16-18 ore la 35-37°C, în cazul
germenilor pretenţioşi până la 20-24 de ore. Atmosfera de incubare este în funcţie de specia
bacteriană: în atmosfera obişnuită sau in atmosferă de CO2 (de ex.streptococi, neisserii.)
·         Concentraţia de antibiotic. Discurile cu antibiotic conțin determinate de substanță activă;
dimensiunea lor este standard (6 mm diametru).
·         Alegerea antibioticelor. Se aleg antibioticele care trebuie testate in funcţie de specia
bacteriană testată si în funcţie de localizarea infecţiei.
·         Utilizarea tulpinilor de referinţă pentru controlul de calitate.
·         Interpretarea rezultatelor (Sensibilitatea sau rezistența sunt apreciate prin citirea
diametrelor zonelor de inhibiţie. Aceste diametre se compară cu diametre standard în funcţie
de antibiotic, cantitatea de antibiotic din disc, specia bacteriană testată. Rezultatul se
raportează: sensibil (S), intermediar (I) sau rezistent (R) la antibioticul testat. Nu se raportează
diametrul citit, metoda fiind calitativă. Rezultatele citirii pot fi influențate de lumina reflectată
la citire, de apariția coloniilor izolate, de prezenţa marginilor crenelate ale coloniilor etc.
Această metodă nu permite aprecieri cantitative (nu putem afla CMI sau CMB).
8. 3. 4. Metoda diluţiilor în mediu lichid
Se realizează pentru a determina CMI (concentraţia minimă inhibitorie) pentru fiecare
antibiotic testat (la care bacteria este sensibilă). CMI reprezintă cea mai mică concentraţie de
antibiotic, în micrograme/ml, cu acţiune bacteriostatică.
Pentru fiecare antibiotic testat se utilizează mai multe tuburi cu bulion Mueller-Hinton în
concentraţii descrescânde (diluţii binare) pornind spre ex. de la 64 micrograme / ml şi până la
0,125 micrograme / ml, în total 9 tuburi, plus 2 tuburi martor, fără antibiotic (1 ml în fiecare
tub, în final). (Figura nr. 8)
Se prepară inoculul standardizat turbidimetric şi se inoculează toate cele 11 tuburi, cu câte 1
ml de inocul. Se agită tuburile pentru a omogeniza compoziția.
Se incubează cele 9 tuburi cu antibiotice şi 1 tub martor timp de 16-20 ore la 35-37°C iar al
doilea tub martor se păstrează la frigider.
Pentru controlul de calitate se utilizează şi o tulpină de referinţă (pentru care trebuie să
obținem rezultate corespunzătoare datelor oferite de producător).
Citirea și interpretarea se fac a doua zi. Deoarece se utilizează o cantitate de inocul egală cu
cantitatea de mediu, concentraţia finală de antibiotic se va înjumătăţi (de ex. în tubul în care
diluţia iniţială a fost de 64 mg / ml, diluţia finală va fi 32 mg / ml). În tubul martor menţinut la
+4°C nu trebuie să existe creştere în timp ce în tubul martor la 35-37°C creşterea trebuie să fie
evidenţiabilă. (Figura nr. 9)
În tuburile de testat, ultima diluţie care a inhibat dezvoltarea microorganismului reprezintă
CMI. Se consideră (cu diferenţe între specii diferite) că microorganismele în cazul cărora
CMI este £ 2 mg/ml pot fi eficient inhibate de către antibioticul respectiv şi in vivo.
8. 3. 5. Determinarea CMB (concentraţia minimă bactericidă)
Se bazează pe cunoașterea CMI. Se folosesc drept sursă de inocul tuburile în care dezvoltarea
microbiană a fost inhibată.
Se împarte o placă Petri (cu agar Mueller-Hinton) în sectoare, atâtea sectoare câte tuburi în
care dezvoltarea microbiană a fost inhibată (de ex. 6 sectoare dacă inhibiţia g a avut loc în
ultimele 6 tuburi). Se însămânțează din fiecare tub fără creştere microbiană, sectorul de placă
corespunzător. (Figura nr. 10)
Se incubează 16-18 ore la 35-37°C.
Interpretare: CMB corespunde ultimei concentraţii de antibiotic care a distrus
microorganismele însămânţate (sectoare de placă fără apariţia culturii). (Figura nr. 11) Se
consideră că antibioticul va fi eficient in vivo dacă în serul pacientului se pot atinge
concentraţii de antibiotic care să depăşească de 4-8 ori CMB.
Determinarea CMI şi CMB se face pentru aprecierea eficacităţii unui antibiotic asupra unei
tulpini bacteriene. Oferă date suplimentare privind sensibilitatea/rezistența. În tratamentul
infecţiilor severe (ex. endocardite, meningite, septicemii) şi la imunodeprimaţi, efectuarea
acestei metode este indispensabilă.
8. 3. 6. Determinarea CMI prin testul E (E test)
E test reprezintă o altă metodă de testare a sensibilităţii la antibiotice pentru diferite bacterii,
inclusiv pentru bacteriile pretenţioase sau anaerobe. Se aseamănă metodei diluţiei în agar; dar
este mai uşor de utilizat și  permite determinarea valorii CMI (în schimb, are un cost mai
ridicat).
Principiu
Modul de inoculare este similar. Benzile E test (langhete) conţin un gradient de antibiotic ce
„acoperă” un şir continuu de concentraţii între 0,002-32 mg/ml; 0,016-256 mg/ml sau 0,064-
1024 mg/ml. Aceste benzi se aplică după însămânţare și se incubează 16-18 ore la 35-37°C.
Dacă bacteria este sensibilă, se formează o zonă eliptică de inhibiţie (E vine de la epsilon).
Valoarea CMI se citeşte acolo unde creşterea bacteriană intersectează banda E test. (Figurile
nr. 12 și 13)
NB. Banda trebuie să fie în contact perfect cu suprafaţa mediului; odată aplicată nu se
deplasează în altă poziţie (eliberarea medicamentului are loc imediat, la fel ca şi în cazul
discurilor cu antibiotic de la antibiogramă).
Interpretarea rezultatelor
·         Rezultatele se citesc atunci când cultura este confluentă sau aproape confluentă.
·         Valoarea CMI corespunde liniuţei în care creşterea bacteriană intersectează banda E test;
pe geloză-sânge se citește zona de inhibiţie a creşterii bacteriene nu zona de inhibiţie a
hemolizei. (Figurile nr. 12 și 13)
·         Se raporteză rezultatul obţinut pentru tulpina testată numai după verificarea rezultatului
obţinut pentru tulpina de referinţă (control de calitate).
8. 4. Metode de testare a sensibilităţii in vivo şi aprecierea eficienţei terapeutice
De multe ori eficienţa terapiei cu antibiotice se apreciază clinic şi prin teste de laborator
(ex. leucogramă, sediment urinar, VSH, proteina C reactivă etc.). Dar aceasta nu este cea mai
corectă variantă.
Există două metode ce pot aprecia eficacitatea tratamentului. Acestea pot fi utilizate și
pentru evaluarea eventualei nocivităţi a antibioticelor.

1. Determinarea NEI (nivel de eficienţă inhibitorie), se realizează pentru ser, LCR (se
pot utiliza și alte umori). Se calculează asemănător CMI, doar că vom utiliza umorile
pacientului pentru a urmări care este nivelul la care (datorită antibioticului din
respectivul lichid) inhibă dezvoltarea microbiană.
2. Determinarea NEB (nivel de eficienţă bactericidă) pentru ser, LCR sau alte umori.
Puterea bactericidă a serului celor trataţi (NEB) măsoară capacitatea diluţiilor din serul
unui bolnav tratat cu antibiotice de a inactiva un inocul conţinând bacteria infectantă;
se determină diluţia cea mai înaltă de ser care mai manifestă capacitate bactericidă. Se
calculează asemănător CMB.

Utilizarea acestor metode este indicată în infecții grave (endocardite, osteomielite, fibroză
chistică sau sepsis) și la pacienţii cu variate grade de imunodepresie; produsele se recoltează
 de obicei la o oră după administrarea unei doze şi cu câteva minute înainte de administrarea
următoarei doze de antibiotic.
8. 5. Direcții de cercetare
Chiar dacă nu toate noțiunile prezentate în manualele de specialitate trebuie învățate ca atare,
în dezvoltarea pe parcursul activităților universitare considerăm că este necesar ca cititorii să
citească mai mult, pentru o cât mai bună informare. Ca atare, recomandăm câteva link-uri
corespunzătoare unor articole care pot fi studiate folosindu-se resursele World Wide Web.
1.    http://www.analimed.ro/analize-medicale/microbiologie/antibiograma/
2.    http://www.webmd.com/a-to-z-guides/antibiotic-sensitivity-test-topic-overview
3.    http://amrls.cvm.msu.edu/microbiology/detecting-antimicrobial-resistance/test-
methods/examples-of-antibiotic-sensitivity-tesing-methods
4.    http://inst.bact.wisc.edu/inst/index.php?module=book&func=displayarticle&art_id=135
5.    http://cid.oxfordjournals.org/content/49/11/1749.full
6.    http://www.biomerieux-diagnostics.com/servlet/srt/bio/clinical-diagnostics/dynPage?
doc=CNL_CLN_PRD_G_PRD_CLN_22

8. 6. Povestire adevărată (enterococii vancomicino-rezistenți)

Enterococii au atras atenția cercetătorilor în anii 1980 datorită capacității lor de a infecta omul
și animalele dar și a abilității de a prelua diverse metode de eludare a sistemului imun ale
altor bacterii. Cu toate că bacteriile din genul Enterococcus nu sunt așa celebre precum cele
din genul Staphylococcus sau specia Escherichia coli, infecțiile cu acești germeni sunt printre
cele mai frecvente infecții ”achiziționate” de către pacienții spitalizați. Enterococii pot
complica și prelungi spitalizarea pacienților. Teoretic, persoanele care pot dezvolta infecții cu
Enterococcus spp. sunt cele deja bolnave (ex. persoanele aflate în secțiile ATI, persoanele în
vârstă, bolnavii de diabet zaharat, bolnavii cu insuficiență renală cronică etc).
Dar de fapt enterococii pot fi foarte periculoși mai ales pentru că sunt capabili să dezvolte
rezistență la antibiotice, inclusiv la vancomicină, antibioticul de ultimă linie în infectiile cu
microorganisme rezistente.
Infecțiile enterococice umane cu tulpini de enterococi rezistente la vancomicină (VRE) pot fi
fatale. În cursul anului 2004 CDC a raportat că una din trei infecții achizitionată în secțiile de
terapie intensivă a fost determinată de VRE.
În 1984, enterococii au fost încadrați în genul Enterococcus. În 1986 au apărut primele tulpini
VRE în Europa iar în 1989 a fost raportat primul caz de VRE în SUA. Între 1989-1993
procentul de îmbolnăviri cu VRE a crescut de la 0,3% la 7,9%.
Cercetătorii caută noi soluții terapeutice pentru aceste infecții precum și o mai bună
înțelegere a caracteristicilor genetice a VRE și a modului în care se transmit genele de
rezistență ale enterococului către alte bacterii.
Numai în 2007 SUA au raportat șapte cazuri de infecții cu Staphylococcus aureus
vancomicină rezistent. Într- unul din cazuri, oamenii de stiință au confirmat transferul unei
gene cheie de rezistentă la antibiotice de la Enterococcus la Staphylococcus.
Riscuri ale îmbolnăvirii cu VRE
Enterococii pot supraviețui luni de zile. Habitatul lor normal este în primul rând tractul
digestiv uman și tractului genital feminin, enterococii fiind o parte semnificativă a populației
bacteriene saprofite. Cu toate acestea, colonizarea cu VRE poate progresa spre diverse
infecții, în special la persoanele cu anumiți factori de risc. Astfel se pot produce infecții ale
tractului urinar, septicemii, endocardite și meningite, precum și infecții grave ale rănilor
deschise. Persoanele cu risc sunt:
•Persoanele tratate extensiv cu vancomicină și combinații de alte antibiotice;
•Persoanele spitalizate, mai ales atunci când primesc tratament cu antibiotice pentru perioade
lungi de timp;
 •Persoanele cu un sistem imunitar slăbit, cum ar fi pacienții din unitățile de terapie intensivă,
cancer sau secții de transplant;
•Persoanele care au suferit proceduri chirurgicale;
•Persoanele cu dispozitive medicale neschimbate de mai bine de o lună, cum ar fi catetere
urinare sau catetere intravenoase centrale.
Infecțiile enterococice sunt mai frecvente la persoanele în vârstă, în special persoanele din
centrele pentru persoane în vârstă și căminele spital, deoarece acestea au mai multe șanse de a
fi expuse factorilor de risc.

8. 7. De reținut
Metodele de igienă sunt importante în profilaxia infecțiilor cu enterococi.
Programul de control al acestor infecții în spitale includ:
·         Instruirea personalului spitalului în ceea ce privește rezistența la vancomicină;
·         Depistarea precoce și raportarea promptă a rezistenței la vancomicină a enterococilor și a
altor microorganisme Gram-pozitive;
·         Implementarea imediată a măsurilor adecvate de control a infecției pentru a preveni
transmiterea VRE de la persoană-la-persoană.

9. Reacțiile de precipitare și reacțiile de aglutinare.

9. 1. Cuvinte cheie

·         antigen (Ag)

·         anticorp (Ac)

·         precipitare

·         aglutinare

·         raport de echivalență

·         imunodifuzie
9. 2. Introducere
Reacțiile Ag-Ac sunt elemente esențiale atât în diagnosticul bacteriologic direct cât și în
diagnosticul serologic a infecțiilor (dar, bineînțeles și in vivo, în apărarea gazdei față de
infecții!). Astfel, putem evidenția în mod direct reacția dintre Ag-Ac (reacții de precipitare,
reacții de aglutinare) sau putem folosi sisteme indicator (reacția de fixare a complementului,
reacția de seroneutralizare) (vezi capitolul 10). În acest capitol vom prezenta reacțiile de
precipitare și de aglutinare utilizate în microbiologie, subliniind faptul că acestea formează o
bază a diagnosticului serologic modern.
9. 3. Reacțiile de precipitare utilizate în microbiologie
Reacția de precipitare poate avea loc în mediu lichid sau solid. Unirea Ag cu Ac specifici
conduce la formarea de complexe Ag-Ac care devin insolubile și stabile (vizibile, cu ochiul
liber). Reacția de precipitare este sensibilă și specifică pentru evidențierea prezenței Ag.
Metodele „clasice” prezentate în cadrul acestui capitol stau la baza testelor moderne folosite
în practica curentă.
NB: Pe parcursul capitolului, ne vom referi la Ag și Ac, dar cititorul este avizat că și
imunoglobulinele (de ex. anticorpii proveniți de la o altă specie) pot juca rol antigenic.
9. 3. 1. Reacții de precipitare în mediu lichid
9. 3. 1. 1. Reacții de precipitare în amestec
Reacția Ag-Ac este cuantificabilă. Permite, de ex. titrarea toxinei difterice (metoda
Ramon) punând în contact (în amestec, în tuburi), cantități egale din toxina difterică, cu
cantități variabile de Ac anti-toxină, al căror titru este cunoscut. Cantitatea maximă de
precipitat se găsește în tubul unde există raportul de echivalență. Tubul care prezintă
cantitatea cea mai importantă de precipitat se poate observa relativ ușor (Figura nr. 6).
Cunoscând titrul Ac, se află titrul toxinei (1 Lf = 1 limes floculans = cantitatea de toxină care
se combină cu o unitate de antitoxică = 1 UA). Dacă spre ex. precipitarea maximă apare în
tubul în care titrul anticorpilor este de 15 UA, titrul toxinei este de 15 Lf.
9. 3. 1. 2. Reacții de precipitare în inel
Punem în contact Ag și Ac astfel încât să nu se amestece. Reacția apare la limita dintre Ag și
Ac (inel de precipitare).
În activitatea de la LP exemplificăm prin reacția Ascoli utilizabilă pentru identificarea
prezenței Ag cărbunos (din Bacillus anthracis). Soluția de Ag se prepară din extract de organ
(ex. splină) recoltat de la un animal care a decedat cu suspiciunea de antrax (infecție
generalizată cu Bacillus anthracis). Reacția este una calitativă, prin care putem preciza doar
prezența sau absența Ag. Utilizăm 3 tuburi (1 pentru reacție și 2 tuburi martor). În primul tub
martor pipetăm 0,5 ml ser anticărbunos și 0,5 ml soluție salină fiziologică iar în al doilea tub
martor pipetăm 0,5 ml ser normal de cal și 0,5 ml soluție de Ag. În aceste două tuburi, nu
trebuie să apară precipitare, scopul acestor martori fiind verificarea reactanților. În tubul de
reacție pipetăm întâi 0,5 ml din serul anticărbunos, urmând ca soluția de antigen (în cantitate
de 0,5 ml) să fie pipetată foarte lent, pe peretele interior al tubului, în așa fel încât cele 2
soluții să nu se amestece. În cazul reacției pozitive (prezența Ag cărbunos în soluția Ag),
după circa 2-5 minute, la limita dintre cei 2 reactivi apare un “inel” de precipitare (Figura nr.
7).
9. 3. 2. Reacții de precipitare în mediu gelifiat
Utilizarea gelozei (o anumită concentrație de agar în soluție, în care cei doi reactivi pot să
migreze) permite vizualizarea reacției Ag-Ac printr-un arc / linie de precipitare.
9. 3. 2. 1. Imunodifuzia radială simplă (IDRS Mancini)
IDRS se bazează pe difuzia Ag din proba de cercetat, într-un gel care conține o cantitate
constantă de Ac. Difuzia în gel a Ag se face pornind de la godeul în care se pipetează soluția
de cercetat, care poate fi ser cu Ac (iar în gel sunt anti-Ac, IgG, IgM, IgA etc), sau un
ser/soluție cu altă substanță pe care dorim să o cuantificăm (fracțiunea C3 a complementului,
siderofilina, alfa-1 antitripsina, un antigen microbian în LCR etc.). Complexele Ag-Ac vor
precipita. Rezultă un cerc de precipitare format din puncte foarte apropiate (complexe Ag-Ac)
cu diametrul direct proporțional cu concentrația de Ag din probă. Metoda permite
determinăricantitative. (Figura nr. 8)
Sunt necesare plăcuțe în care se toarnă gelul care include Ac anti structura pe care vrem să o
determinăm. Plăcile sunt cumpărate gata turnate și prezintă mici godeuri în care punem
serurile de cercetat și serul de referință (folosit ca un etalon, întrucât cunoaștem concentrația
componentei studiate). Diluăm serurile de cercetat (ex. ¼ pentru IgG, IgA și siderofilină), la
fel și serul de referință. În fiecare godeu introducem 5 ml din fiecare reactiv (referință și
cercetat).
Ținem plăcuța pe masă 10 minute, apoi incubăm la termostat (37ºC), 48 ore pentru IgA și
IgM și 24 de ore pentru celelalte componente testate. Citim cu ajutorul unei rigle speciale, pe
care o vom utiliza la LP. Întâi măsurăm diametrul cercului de precipitare din jurul godeului în
care se află serul de referință (rezultatul trebuie să corespundă indicațiilor producătorului).
Dacă rezultatul este corespunzător, citim direct diametrelor pentru serurile de cercetat (altfel,
trebuie să facem corelarea cu rezultatul pentru martor). Înregistrăm valorile diametrelor,
comparăm cu rezultatele din tabele preformate și înmulțim valoarea cu diluția probei. Am
obținut rezultatul final. (Tabelul nr. 1)
9. 3. 2. 2. Imunodifuzia dublă radială (Ouchterlony)
În această variantă tehnică, Ag și Ac difuzează unul spre celălalt. După întâlnire complexele
Ag-Ac precipită și rezultă linii de precipitare vizibile. Prin folosirea acesteia, putem alege Ac
dintr-un stoc disponibil și nu este necesară includerea acestuia în agar.
Tehnica poate fi folosită ca o metodă de determinare calitativă sau semi-cantitativă. Astfel, ne
permite să evidențiem, de ex. prezența sau absența unei structuri proteice. Putem determina
semi-cantitativ alfa-fetoproteină, proteină C reactivă, beta-2 microglobulină, produși de
degragare ai fibrinogenului etc. În micologie putem identifica exoantigene fungice
(Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis etc), etc.
Pe o lamă de microscop se toarnă un gel de agar 1% (păstrată în cameră umedă, la frigider).
După întărirea gelului, perforăm 1-3 grupe de godeuri, 7 godeuri în fiecare grup (1 godeu
central, 6 godeuri periferice). De ex. pentru determinarea proteinei C reactivă (C reactive
protein, CRP, reactant de fază acută) la pacienți, utilizăm un ser cu Ac anti-CRP, seruri de la
pacienți și un ser de referință cu CRP. În godeul central pipetăm Ac anti-CRP, în godeurile 1
și 4 pipetăm ser de referință cu CRP, iar în celelalte godeuri pipetăm serurile de cercetat.
Incubăm (37ºC, 24 de ore) în cameră umedă.
Verificăm dacă între godeul central și godeurile 1 și 4 (martori pozitivi) au apărut linii
(arcuri) de precipitare. Dacă este așa, urmărim situația pentru serurile de testat. Acolo unde
apare linie de precipitare, rezultatul este pozitiv (Figura nr. 9).
9. 3. 2. 3. Dubla difuzie (Elek)
Este o metodă calitativă utilă pentru depistarea tulpinilor toxigene de Corynebacterium
diphteriae (apariția liniilor de precipitare demonstrează elaborarea toxinei) (Figura nr. 10).
Mediul este turnat în placa Petri, așteptăm să se întărească și apoi decupăm un șanț pe unul
din diametre. În acest șanț pipetăm 0,5 ml ser antidifteric (cu Ac anti-toxină difterică,
concentrația fiind 1.000 UI/ml). Ac anti-toxină difterică difuzează în mediu. După 2 ore
însămânțăm perpendicular pe acest șanț și de fiecare parte a șanțului, 1 tulpină toxigenă
(martor pozitiv), 1 tulpină ne-toxigenă (martor negativ) și câteva tulpini de cercetat.
Incubăm timp de 48 de ore, la 37ºC, timp în care tulpinile însămânțate se dezvoltă. Din
striurile cu tulpină toxigenă, toxina difuzează în mediu și apare reacția  de precipitare a
complexului Ag-Ac. Când examinăm placa, urmărim apariția culturii și a precipitatului (linii
de precipitare în unghiurile dintre cultură și șanțul cu Ac anti-toxină) care trebuie să apară cel
puțin la martorul pozitiv.
9. 3. 3. Reacții de precipitare în combinație cu migrarea în câmp electric
9. 3. 3. 1. Electroforeza proteică în gel
Tehnica este folosită în laboratorul de imunochimie pentru decelarea unor proteine patologice.
Deplasarea proteinelor în gel (supus câmpului electric) se face diferențiat (în funcție de
greutatea moleculară și încărcătura electrică a fiecărei proteine, în parte).
9. 3. 3. 2. Imunoelectroforeza
Electroforeza este asociată cu imunodifuzia dublă. Proteinele sunt întâi separate prin
electroforeză apoi are loc imunodifuzia dublă. Putem utiliza un ser monovalent sau polivalent,
cu Ac anti-structura a cărei prezență dorim să o determinăm. Reacția Ag-Ac devine vizibilă
sub forma unor arcuri de precipitare (Figura nr. 11).
9. 3. 3. 3. Contraimunoelectroforeza (CIE)
Este o dublă difuzie. Deplasarea Ag și Ac este accelerată de câmpul electric. Turnăm gel de
agar pe o lamă de microscop, perforăm 1-3 grupe de perechi de godeuri, față în față (ex. Ag
migrează spre anod). Astfel, în unul din cele 1-3 grupuri de godeuri pereche opuse catodului
(polul negativ) pipetăm Ac cunoscuți iar în godeurile opuse anodului (polul pozitiv) pipetăm
Ag cunoscute. Tehnica este mai rapidă și mai sensibilă decât dubla difuzie, prin amplificarea
 datorată câmpului electric. Linia de precipitare poate deveni vizibilă după 30-90 minute
(Figura nr. 12). Se poate utiliza pentru identificarea Ag K în LCR la pacienți cu meningită
acută (H. influenzae, N. meningitidis, Streptococcus pneumoniae), facilitând un diagnostic
rapid.
9. 4. Reacțiile de aglutinare utilizate în microbiologie
Reacția de aglutinare sunt similare cu reacțiile de precipitare, cu mențiunea că Ag sunt de
natură corpusculară. Aglutinareaeste mai sensibilă decât precipitarea.
Există mai multe tipuri de aglutinare:
·         Aglutinarea directă reprezintă aglutinarea Ag naturale (bacterii, celule) de către Ac
specifici. Se poate utiliza în diagnosticul bacteriologic (ex. pentru identificarea
enterobacteriilor), în diagnosticul serologic al febrei tifoide etc.;
·         Aglutinarea indirectă este o reacție în care diferite particule (hematii formolizate, latex,
cristale de colesterol etc) sunt “cuplate” in vitro cu Ag sau Ac și sunt astfel pregătite să
participe la reacția de aglutinare prin combinare cu Ac sau Ag corespunzătoare, din proba de
cercetat (ex. determinarea CRP);
·         Inhibarea aglutinării (vezi și HAI de la LP virusologie) etc.
9. 4. 1 Reacții de aglutinare utilizate în diagnosticul microbiologic direct
Executăm această tehnică (aglutinare pe lamă) pentru identificarea tulpinii bacteriene
implicate etiologic în respectiva boală infecțioasă. Se pot face și aglutinări în tuburi, pentru
confirmarea rezultatului obținut pe lamă. Unele laboratoare își pot sintetiza in house reactivii
necesari.
În cursul identificării unei tulpini enterobacteriene (Shigella spp., E. coli etc) sau a unei alte
tulpini (ex. Vibrio spp.), după cultivarea p.p. pe diferite medii (vezi capitolele 13 și 14) și
după ce obținem colonii izolate, putem face reacția de aglutinare. Așadar, avem nevoie de
cultura de identificat (cultură proaspătă, de 18-24 de ore, cu colonii de tip S), soluție salină
fiziologică, Ac cunoscuți față de Ag pe care dorim să le identificăm (Ac polivalenți, Ac
monovalenți de grup, Ac monovalenți de tip, după caz), lame de microscop, amestec
dezinfectant etc.
Pe o lamă punem o picătură de soluție salină fiziologică, în care descărcăm un fragment din
colonia de identificat, amestecăm până obținem o suspensie tulbure. Dacă picătura devine
limpede, cu grunji, înseamnă că apare „autoaglutinare” și nu mai putem să identificăm tulpina
prin reacție Ag-Ac (ar putea fi, de ex. o tulpină din colonie de tip R, care și-a modificat
structura). Dacă suspensia rămâne tulbure, putem continua aplicarea tehnicii. Pe aceeași lamă,
la cealaltă extremitate, punem o picătură de ser cu Ac cunoscuți (polivalenți). Descărcăm un
fragment din colonia de identificat în picătura de ser cu Ac și amestecăm până obținem o
suspensie tulbure. Prin înclinare, în mai multe direcții, favorizăm contactul dintre Ag-Ac mici
și apar complexe mici, apoi rețele de complexe Ag-Ac. Apar grunjii de aglutinare. Citim
reacția pe un fond negru. Lamele pe care am executat reacția de aglutinare conțin
microorganisme vii și trebuie să le introduce în amestecul dezinfectant, după examinarea
rezultatelor reacției.
Reacția de aglutinare indirectă se poate folosi pentru determinarea grupului streptococic,
pentru detectarea unor fungi (Cryptococcus neoformans, Candida albicans, Aspergillus spp.)
sau a unor virusuri și pentru detectarea prezenței Ag în lichide biologice. Tot prin tehnici de
aglutinare indirectă se pot identifica exotoxine.
9. 4. 2. Reacții de aglutinare utilizate în diagnosticul serologic
În diagnosticul serologic, în mod obișnuit, reacțiile utilizate permit detectarea prezenței Ac în
serul de cercetat dar și stabilirea titrului. Totuși există și câteva exemple de reacții de
aglutinare calitative.
9. 4. 2. 1. Aglutinarea pe lamă
 Reacția de aglutinare pe lamă (Huddleson; diagnosticul brucelozei) a intrat în istoria
medicinei. Avem nevoie de lame de microscop, Ag brucelos inactivat (colorat în violet) și ser
de cercetat. Pe lamă depunem o picătură din soluția de Ag brucelos și o picătură de ser de
cercetat. Amestecăm și omogenizăm cei 2 reactanți. Reacția este pozitivă în cazul în care se
remarcă prezența aglutinatelor. Reacția pozitivă pe lamă trebuie confirmată prin aglutinare în
tuburi.
9. 4. 2. 2. Aglutinarea în tuburi
Tehnica poate fi folosită în diagnosticul serologic al brucelozei (Wright), în diagnosticul
serologic al infecțiilor produse de Cryptococcus neoformans, în diagnosticul serologic al
febrei tifoide (reacție Widal - ca nume istoric) etc.
Pentru diagnosticul serologic al febrelor enterice vom folosi seruri recoltate în dinamică, la 7-
10 zile „distanță”, Ag cunoscute (Ag O și Ag H), 4 șiruri de eprubete (două șiruri pentru anti-
O, două șiruri pentru anti-H (pentru că vom lucra în cele două probe, în dinamică, pentru
fiecare tip de Ac). Pentru fiecare șir de tuburi diluăm binar serul de cercetat. În final, pentru
fiecare șir avem: un tub martor (tampon pentru diluție + Ag, fără ser) și tuburi cu serul diluat,
de ex. 1/40, 1/80, 1/160 etc (un șir de tuburi pentru serul recoltat de la pacient „astăzi” și altul
„la 10 zile”, pentru titrarea Ac anti-O și încă două șiruri pentru titrarea Ac anti-H). Incubăm
cele 2 șiruri de tuburi cu Ag O timp de 20 ore la 52ºC iar cele 2 șiruri de tuburi cu Ag H le
incubăm 2 ore la 52ºC plus 10 minute la temperatura camerei. Evaluarea o facem pentru
fiecare tub în parte, începând de la diluțiile mari, prin examinare și ușoară agitare, pentru a
surprinde aglutinatele. Ultimul tub care prezintă aglutinare vizibilă stabilește titrul reacției
(pentru fiecare șir de tuburi, în parte). Un titru care crește de 4 ori „în dinamică” stabilește
diagnosticul în mod cert.
În cazul unor pacienți care se află în convalescență sau în cazul persoanelor care ar putea fi
purtători încercăm să stabilim titrul Ac anti-Vi.
9. 7. De reținut
Reacțiile Ag-Ac au un rol important atât in vivo cât și in vitro, pentru diagnostic și tratament.
Există multe variante tehnice prin care aceste reacții pot fi puse în evidență. Aceste reacții pot
fi folosite atât în diagnosticul bacteriologic direct (detecția Ag prezente la nivelul unei
bacterii, utilă în identificarea microorganismului) cât și în diagnosticul serologic (detecția în
serul pacientului a Ac îndreptați împotriva unui anume Ag).

10. Reacții antigen-anticorp care nu sunt vizibile, direct.

10. 1. Cuvinte cheie
·         fixare a complementului

·         seroneutralizare

·         ASLO

·         boli poststreptococice

·         radioimunoanaliza

·         analiză imunoenzimatică

·         Imunofluorescență
10. 2. Introducere
Există și reacții Ag-Ac care nu pot fi vizualizate direct; în această situație este necesară
utilizarea unui „artificiu tehnic” (ex. utilizarea unui sistem hemolitic, etc).
10. 3. Reacții în care folosim un sistem hemolitic indicator
10. 3. 1. Reacția de fixare a complementului (RFC)
Rezultatul reacției nu este vizibil în absența folosirii un sistem hemolitic indicator. Reacțiile
Ag-Ac, așadar și RFC, se pot folosi atât pentru identificarea Ag cât și în diagnosticul
serologic (identificarea Ac). Cu toate că RFC este o tehnică laborioasă, executată corect este
foarte exactă, cu sensibilitate și specificitate ridicată.
RFC cantitativă se poate utiliza pentru diagnosticul serologic al infecțiilor produse de
Brucella spp., Treponema pallidum, Leptospira spp., Borrelia spp., Mycoplasma pneumoniae,
Chlamydia spp., în diagnosticul serologic al unor viroze, etc.

Vom lua ca exemplu RFC Bordet-Wassermann (RBW). Aceasta este o metodă calitativă de
identificare a Ac împotriva T. pallidum (atenție, Ag este nespecific!).
Principiu
Se inactivează C¢ endogen (cel prezent în serul pacientului) deoarece poate prezenta variații
cantitative (ex. în lupus eritematos sistemic; unele infecții duc la scăderea nivelului C¢; unele
neoplazii  determină nivele crescute ale C¢). Se adaugă C¢ exogen (cantitate stabilită
conform protocolului). a.Dacă în serul de cercetat există Ac specifici, rezultă un complex
Ag-Ac pe care se fixează C¢ (C¢nu va mai fi disponibil pentru a se fixa pe sistemul indicator
hematii-Ac anti-hematii, adăugat în a doua etapă). b.Dacă în serul de cercetat nu există Ac
specifici, nu se formează complex Ag-Ac și C¢ rămâne liber. După adăugarea sistemului
indicator, dacă există C¢ liber, acesta se va lega de complexele Ag-Ac ai sistemului indicator
și va conduce la apariția hemolizei.
Tehnica de lucru

Utilizăm ser de cercetat, seruri de referință (martor pozitiv și negativ), Ag cunoscut, C¢,
sistemul hemolitic indicator, baie de apă pentru inactivarea serului propriu (la 56°C) etc.
În RBW folosim 2 eprubete cu diluții diferite ale serului pacientului și eprubetele martor
(sigur pozitiv, sigur negativ, martor pentru serul de cercetat, martor pentru Ag, martor pentru
C¢, martor pentru sistemul hemolitic); în prima etapă punem în reacție serul de cercetat, C¢
și Ag cunoscut; în a doua etapă se introduce în reacție sistemul hemolitic indicator (hematii
+ Ac anti-hematie).
Interpretare
Verificăm întâi rezultatele apărute pentru martori (ex. în tubul martor sigur pozitiv nu trebuie
să apară hemoliză). (Figura nr. 1)
Testul este pozitiv atunci când în tuburile cu ser de cercetat nu apare hemoliză, hematiile se
depun formând un “buton” în partea inferioară a tubului (în serul de cercetat există Ac).
Pentru a stabili diagnosticul este obligatoriu ca un rezultat pozitiv să fie confirmat prin reacții
specifice (deoarece cardiolipina este un Ag nespecific!).
10. 3. 2. Reacția de neutralizare (seroneutralizare; RSN)
Ag are o proprietate biologică (ex. toxică) care poate fi blocată/neutralizată prin cuplarea cu
Ac specific. RSN se poate utiliza în:
·         diagnosticul bacteriologic (ex. identificarea Clostridium perfringens prin metoda
plăcilor semineutralizate, toxinotipia în cazul suspicionării TIA cu Clostridium botulinum, pe
animale de laborator);
·         diagnosticul serologic (ex. reacția ASLO, în bolile post-streptococice);
·         prevenirea unor boli infecțioase prin vaccinare;
 ·         evaluarea eficacității vaccinale (titrarea prezenței Ac anti-toxine, testarea prin
intradermoreacție a susceptibilității față de o anumită boală infecțioasă care are la bază drept
mecanism patogenic efectul unei exotoxine, ex. difterie);
·         tratamentul unor boli infecțioase (seroterapie).
10. 3. 2. 1. Reacția ASLO
Se poate utiliza în diagnosticul retrospectiv al unei infecții streptococice sau pentru
confirmarea etiologiei bolilor poststreptococice; determinăm titrul Ac anti streptolizină O
(SLO).
Principiu
SLO are efect hemolitic asupra hematiilor de iepure sau de berbec. Dacă în serul pacientului
există Ac anti-SLO, acțiunea hemolitică a SLO este neutralizată. Prin diluții efectuate în
tuburi, determinăm titrul ASLO (cea mai bună tehnică este cea clasică!).
Tehnica de lucru (Tabelul nr. 1)
Utilizămseruri de cercetat în pereche (recoltate la interval de 7-10 zile), SLO liofilizată,
sânge defibrinat de iepure, soluție salină izotonă, soluție de rivanol 0,3%, eprubete, pipete
gradate foarte curate, baie de apă, centrifugă etc.
Respectăm cu strictețe indicațiile din protocolul de lucru (ex. omogenizăm suspensia de
hematii, diluăm serul 1/10 și repartizăm în tuburi; adăugăm o cantitate constantă de SLO). Nu
putem vizualiza rezultatul reacției în această etapă. Este necesară a doua etapă (agităm
tuburile, adăugăm suspensia de hematii, agităm pentru omogenizare; incubăm 45 minute, la
37°C, centrifugăm; ținem tuburile la frigider, până a doua zi).
Interpretare (Figura nr. 2)
Prin respectarea protocolului, titrul potențial al Ac anti-SLO va fi 12, 50, 100, 125, 166, 250,
333 etc. Titrul reacției ASLO este dat de cea mai mare diluție de ser la care lipsește complet
hemoliza. În țara noastră se acceptă ca normal un titru de 200 (maxim 250) unități ASLO.
Există și alte teste serologice care pot fi utilizate (ex. anti dexoribonucleotidaza B). S-a
demonstrat că dinamica serologiei (creșterea de patru ori a titrului între două determinări
succesive) este mai importantă decât valoarea absolută a titrului, înregistrându-se nivele
crescute (titru de >1900 unități ASLO) în absența simptomatologiei sau a dovezii
microbiologice a unei infecții cu streptococ beta hemolitic de grup A timp de mai mult de 2
ani. De asemenea, există și situații în care, dinamica ASLO este constantă, în absența
simptomatologiei clinice.
10. 3. 2. 2. RSN în profilaxia și tratamentul unor boli infecțioase
Vaccinarea în scopul obținerii unei protecții prin seroneutralizare
Vaccinul DTaP (celular) se face după următoarea schemă: primovaccinarea începe la vârsta
de 2 luni a nou-născutului (se administrează 3 doze la interval de 2 luni, la 2, 4, 6 luni). Pentru
menținerea imunității se practică revaccinarea I la 6 luni de la primo-vaccinare iar
revaccinarea a II-a se practică la 36 de luni de viață a copilului. Următoarea revaccinare are
loc la intrarea în școala primară. Iar mai departe, se recomandă rapeluri cu dT din 10 în 10
ani. (Tabelul nr. 2)
Evaluarea eficacității vaccinurilor
Este recomandată testarea stării de imunitate indusă prin vaccinare. Spre ex. se titrează Ac
anti-toxină (difterică, tetanică etc) în seruri prelevate de la persoanele vaccinate. Protecția
anti-difterică e asigurată de un titru de Ac-anti toxină difterică mai mare de 0,03 UAI/ml.
Terapia sau profilaxia specifică
Se pot administra de imunoglobuline specifice omologe (de la persoane imunizate), de ex.
imunoterapia infecției cu Clostridium tetani când administrăm intramuscular 3-6.000 UAI. Se
pot administra seruri imune heterologe (obținute prin hiperimunizarea cailor) în tratamentul
tetanosului, difteriei, botulismului etc.
Seroterapia poate reprezenta o urgență medicală.
10. 4. Reacții în care componentele sunt marcate
Marcarea componentelor se poate face:

·        izotopic (radio immuno assay, RIA)

·        enzimatic (enyzme linked immuno assay, ELISA)

·        fluorescent (fluorescent immunoassay, FIA)

10. 4. 1. Radioimunoanaliza (RIA) (Figura nr. 3)
Pentru marcarea Ag se poate utiliza 14C etc. Se introduce în reacție o cantitate cunoscută de
Ag marcat, Ag nemarcat (dorim să îl dozăm) și Ac cunoscuți corespunzători Ag. Rezultă o
competiție pentru cuplarea cu Ac între Ag marcat și Ag nemarcat, care se află în proporții
diferite, în funcție de cantitatea Ag de studiat. Se pot folosi tehnici imunologice,
cromatografice sau de fază solidă pentru a separa Ag marcat liber de cel legat în complexele
Ag-Ac. Urmărim protocol de lucru și în final măsurăm radioactivitatea complexului Ag-Ac.
RIA este o tehnică cu foarte mare sensibilitate dar, utilizând radioactivitatea, este înlocuită din
ce în ce mai mult cu tehnica ELISA/EIA.
10. 4. 2. Analiza imunoenzimatică (ELISA/EIA)
Tehnicile ELISA pot fi utilizate atât pentru identificarea Ag cât și pentru identificarea și / sau
titrarea Ac, existând de principiu următoarea succesiune de reacții, în cadrul protocolului:
(Figurile nr. 4 și 5)

·         primul reactiv (fie Ag, fie Ac, depinde de ce urmărim să determinăm) este “fixat” pe un
suport solid (ex. godeurile unei plăci speciale, cumpărate de la producător);

·         adăugăm al doilea reactiv, pe care dorim să îl determinăm (Ac sau Ag);

·         dacă există „potrivire” între cei doi reactivi, are loc formarea complexului Ag-Ac; pentru
eliminarea reactivilor care nu au intrat în complex se spală (automat);

·         se adaugă un reactiv marcat (ex. se poate adăuga un alt anticorp anti-Ac (anti-Fc), cuplat
cu un conjugat enzimatic); are loc o nouă spălare (automat);

·         se adaugă un substrat cromogen pentru enzima marcantă; modificările enzimatice duc la o
modificare de culoare vizibilă cu ochiul liber (însă interpretarea se face automat, la fel ca și
înregistrarea rezultatelor);

·         valorile înregistrate pentru “probă” se compară cu valorile înregistrate pentru martorul
pozitiv și martorul negativ, se aplică o formulă (indicată de către producător; calculul se
realizează tot automat);

·         interpretarea se face conform indicațiilor din protocolul care însoțește trusa ELISA.
Mai frecvent sunt utilizate fosfataza alcalină (substrat cromogen = p-nitro-fenil-fosfat) sau
peroxidaza (substrat cromogen = o-fenilen-diamina în soluție de apă oxigenată).
Specificitatea este bună sau foarte bună iar sensibilitatea este comparabilă cu cea obținută în
cazul RIA. Tehnica este automatizată, iar ansamblul de instrumente foarte flexibil,
permițându-ne practic să efectuăm orice test dorim. (Figura nr. 6, Tabelul nr. 3)
 10. 4. 3. Imunofluorescența (IF/FIA)
Pentru a efectua această tehnică este necesar ca unul dintre reactivi (Ag, Ac sau anticorp anti-
Ac) să fie marcat fluorescent. Imunofluorescența poate fi utilizată atât în diagnosticul
microbiologic direct (pe p.p. recoltat de la bolnav sau pe cultura pură) cât și în diagnosticul
serologic. (Figurile nr. 7 și 8)
Fluorocromii (ex. auramină O, rhodamină B, etc) sunt compuși organici care, după “iradiere”
cu radiații UV absorb radiația de o anumită lungime de undă, intră în stare de excitație; atunci
când revin în “starea normală” pierd energia acumulată emițând radiații luminoase sub forma
de fotoni de o lungime de undă inferioară. Lumina vizibilă emisă depinde de fluorocrom (ex.
culoare galbenă pentru auramină O).
10. 4. 3. 1. IF directă (Figura nr. 7)
Principiu
Folosim Ac marcați fluorescent pentru a ținti un Ag pe care îl bănuim prezent.
Tehnica de lucru
Facem un frotiu pe care îl acoperim cu serul care conține Ac marcați fluorescent, incubăm,
spălăm pentru a îndepărta Ac care nu au intrat în complexul Ag-Ac. NB. Putem adapta
tehnica pentru a ”colora” diferite Ag (ex. pentru a decela și alte tipuri celulare prezente),
materialul genetic (ex. pentru a ”colora” nucleul celulelor eucariote). Așteptăm să se usuce și
examinăm cu microscopul cu fluorescență.
Interpretare
Această tehnică are avantajul de a prezenta o discriminare spațială a Ag investigate. Metoda
este rapidă și aplicabilă pentru frotiuri din p.p. sau din cultură, în anatomia patologică etc.
Pentru fiecare Ag de cercetat trebuie preparat serul care conține Ac specifici, marcați
fluorescent. Putem identifica Legionella pneumophila, Bordetella pertussis, Mycobacterium
tuberculosis, Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum, Cryptococcus neoformans,
Histoplasma capsulatum, Pneumocystis carinii etc.
10. 4. 3. 2. IF indirectă (Figura nr. 8)
Principiu
Ag este cunoscut și urmărim obiectivarea unui Ac. Vom folosi un al doilea anticorp anti-Ac
(țintiți împotriva porțiunii Fc a primului anticorp).
Tehnica de lucru
Facem un frotiu, îl acoperim cu serul de cercetat. După incubație spălăm pentru îndepărtarea
reactivilor care nu au intrat în reacția Ag-Ac. Punem apoi un ser cu Ac anti-Ig de om, marcați
fluorescent și incubăm. Spălăm, așteptăm uscarea frotiului, examinăm la microscopul cu
fluorescență.
Interpretare
Dacă în serul de cercetat există Ac specifici Ag cunoscut, are loc formarea complexului Ag-
Ac iar în etapa următoare, Ac anti-Ig de om se cuplează pe complex și în mod indirect, prin
IF, identificăm Ac. Metoda poate fi utilizată în diagnosticul serologic al legionelozei,
leptospirozei, sifilisului, boreliozei, infecțiilor produse Mycoplasma pneumoniae,
Helicobacter pylori, Toxoplasma gondii, Pneumocystis carinii etc.

11. Testarea imunităţii de tip celular.

11. 1. Cuvinte cheie
·         răspuns imun celular (RIC)
·         intradermoreacție (IDR)
·         purified protein derivate – derivat proteic purificat (PPD)
·         Mantoux
·         imunodeficiență

11. 2. Introducere
Putem folosi testele adresate RIC în cadrul diagnosticului imunobiologic sau în
diagnosticul de laborator pentru anumite boli infecțioase (ex tuberculoza produsă de
Mycobacterium tuberculosis) dar și în investigarea imunităţii de tip celular pentru un subiect
cu suspiciune clinică de imunodeficientă (primară sau secundară).
11. 3. 1. Diagnosticul imunobiologic și imunologic de laborator al infecției cu
Mycobacterium tuberculosis
11. 3. 1. 1. IDR cu PPD
Principiu
Tuberculina reprezintă un amestec de Ag proteice mycobacteriene (întâi se cultivă M.
tuberculosis în mediu lichid, ex. Sauton; după o perioadă bine stabilită de multiplicare, cultura
se filtrează și apoi prin mai multe proceduri de selectare-purificare se obține extractul
proteic).
Dacă o persoană este infectată cu germeni din grupul Mycobacterium tuberculosis, urmează
sensibilizarea şi proliferarea LT. IDR cu PPD stimulează LT şi RIC (inclusiv
hipersensibilitatea de tip IV). Rezultă vasodilataţie, edem şi infiltrat cu LT, bazofile,
monocite, neutrofile etc. Se cunoaşte că reacţia maximă este la circa 48 ore. Aria induraţiei
reflectă HS de tip IV. Eritemul nu este interpretat ca reacţie pozitivă.
Procedura
Ne asigurăm că dispunem de toate materialele necesare: seringi cu gradaţii la 0,1 ml, PPD în
fiole cu 2 UI/doză (echivalentul a 5 UI PPD-S) sau 10 UI/ doză, antiseptic etc.
Tehnica pe care o utilizăm poartă numele de IDR Mantoux (IDR cu PPD). Controlăm fiola
pentru a ne asigura că este în termen, dacă a fost păstrată corespunzător şi o agităm energic
pentru omogenizarea PPD. Se folosește o seringă nouă pentru fiecare pacient; nu se admite
aspirarea de PPD într-o seringă și schimbarea acului pentru fiecare pacient (!). Pregătim
seringa, aspirăm o cantitate suficientă de produs pentru a putea elimina bule de aer şi a fi
siguri că vom injecta intradermic 0,1 ml, fix.
Antiseptizăm de ex. cu alcool medicinal (așteptăm 3 minute) o zonă situată pe faţa anterioară
a antebraţului stâng, în treimea medie. Pătrundem aproape tangent la suprafaţa antebraţului,
cu bizoul în sus, pentru a ne situa în derm (Figura nr. 1). Injectăm strict 0,1 ml. (Film nr. 1)
Dacă am injectat corect, apare o bulă uşor denivelată cu diametru de circa 5 mm (Figura nr.
2).
Interpretare
La persoanele infectate, la locul injectării poate apărea o reacţie (eritem-edem-induraţie)
după circa 6 ore, fiind maximă la 48-72 ore. Totuşi, cel mai frecvent, citirea rezultatului se
face la 72 ore, la lumina naturală.
Recomandăm citirea cel puțin o dată la 24 de ore, astfel că efectuăm o primă citire la cel
târziu 24 ore (pentru a surprinde HS de tip umoral faţă de Ag inoculat, structură proteică), o a
doua citire la 48 ore şi citirea finală la 72 de ore.
Zona unde s-a injectat PPD trebuie palpată pentru a delimita zona de indurație de zona de
eritem. Măsurăm „diametrul maxim” al zonei de infiltraţie (induraţie). Citirea reacţiei este
subiectivă, cu posibile variaţii individuale, totuşi rămâne un element important, care nu
trebuie neglijat. (Figura nr. 3; Film nr. 2)
Pentru investigarea infecţiei cu M. tuberculosis, în ţara noastră se consideră drept negative
reacţiile cu diametru mai mic sau egal cu 9 mm (analiza statistică a distribuţiei valorilor pe
eşantioane reprezentative de subiecţi a arătat că plasarea limitei între valorile de 9-10 mm
separă cel mai bine pe cei neinfectaţi de cei infectaţi). O valoare mai mare de 10 mm
recomandă analize suplimentare şi investigaţii care să elimine riscul tuberculozei-boală, care
necesită tratament. Interpretarea corectă, în context clinic şi epidemiologic revine membrilor
reţelei de pneumo-ftiziologie, conform algoritmului stabilit în Programul Naţional de
Prevenire, Supraveghere şi Control a TB.
11. 3. 1. 2. Testele de eliberare a Interferonului gama (TEIG; IGRA)
În prezent, există variante tehnice (de laborator) considerate de către unii autori mai sensibile
și mai specifice decât IDR cu PPD. Astfel de teste folosite pentru diagnosticul in vitro sunt
testele de eliberare a Interferonului gama (Figura nr. 4). Specificitatea crescută a testului
provine din eliminarea unor reacții fals pozitive la IDR cu PPD, prin faptul că antigenele
conținute de PPD sunt prezente și în structura Bacilului Calmette-Guerin (BCG) și a unor
mycobacterii non-tuberculoase.
Principiu
TEIG investighează răspunsul față de peptide sintetice mai specifice pentru M. tuberculosis
decât PPD (early secretory antigenic target-6 (ESAT-6) and culture filtrate protein 10 (CFP-
10), iar, în ultima iterație a acestor teste, se include și părți antigenice a proteinei TB7.7).
Aceste proteine se găsesc în toate culturile izolate de M. tuberculosis și conduc la o sinteză și
secreție măsurabilă a IFN-γ în majoritatea persoanelor infectate, fiind absente din tulpina de
vaccinare BCG și în majoritatea mycobacteriilor non-tuberculoase. Totuși, trebuie notat faptul
că aceste proteine se găsesc și în M. kansasii, M. szulgai, and M. marinum. Se folosește un
martor pozitiv și un martor negativ, cât și un tub de test.
Procedura
Ne asigurăm că dispunem de toate materialele necesare. Materialul biologic necesar de la
pacient este sânge proaspăt obținut prin puncție venoasă periferică. Aceste teste comerciale
oferă tuburile care sunt „preîncărcate” cu antigenele ce vor stimula populația celulară
mononucleară și vor determina secreția de Interferon-γ. Se identifică traseul al unei vene
superficiale periferice, se antiseptizează zona, de ex. cu alcool medicinal (așteptăm 3 minute)
și efectuăm puncția cu un ac special ce permite atașarea, pe rând a mai multor tuburi vidate și
extragerea unei cantități exacte de sânge.
Tuburile cu sânge se incubează 16-24 de ore. Se folosește o tehnică ELISA (vezi capitolul 10)
pentru citirea cantității de Interferon-γ în martorul negativ și martorul pozitiv, apoi în proba
de investigat.
Interpretare
Întâi se interpretează rezultatele obținute în tuburile folosite ca martor pozitiv și negativ.
Se efectuează pe baza diferenței dintre nivelul de bază (nivelul de Interferon-γ aflat în sângele
pacientului în absența stimulării cu antigene – martorul negativ) și nivelul de IFN-γ produs în
cadrul testului. Se ia în considerare și răspunsul din tubul martor pozitiv.
NB. Majoritatea autorilor sunt de acord cu faptul că în țările endemice pentru tuberculoză,
rezultatele TEIG nu sunt superioare rezultatelor obținute prin IDR cu PPD, însă sunt de multe
ori mai scumpe).
11. 3. 2. Investigarea RIC
Un alt scop este reprezentat de utilizarea IDR cu PPD, împreună cu alte IDR (cu alte Ag,
provenind de la alte microorganisme cu care presupunem că respectiva gazdă a „luat deja
contact”), pentru evaluarea reactivităţii în cadrul RIC.
Imunodeficiențele primare (înnăscute) se întâlnesc în aproximativ 1 din 2.000 de născuți
vii, având un spectru clinic foarte larg. Imunodeficiențele primare au multe similarități cu
imunodeficiențele secundare care pot surveni în cursul vieții, în urma infecțiilor virale, după
administrarea de imunosupresoare pentru a preveni rejetul de grefă, în cursul tratamentului
bolilor autoimune sistemice sau după administrarea de chimioterapie antineoplazică.
 Principiu
Investigarea RIC la oricare pacient include:
·         discuţia cu pacientul şi anamneza (medicaţie primită, momentul debutului suferinţei,
vaccinări efectuate, infecţii în antecedente etc.),
·         examenul clinic,
·         examenul de laborator
·         numărul elementelor figurate, formula leucocitară, frotiul din sângele periferic,
·         VSH, alţi reactanţi de fază acută (proteina C reactivă, IL-6, etc.),
·         studiul subpopulaţiilor limfocitare din punct de vedere numeric şi funcţional prin
citometrie de flux, utilizând anticorpi specifici pentru a marca suprafața celulară,
·         determinarea numărului de celule formatoare de Ac faţă de Ag timo-dependente,
·         studiul funcţiei celulelor fagocitare, evaluarea activităţii citotoxice a celulelor NK şi K,
·         studiul secreţiei de citokine, etc.,
·         teste imunobiologice (IDR), folosind Ag care stimulează RIC; este recomandată o
„baterie” de Ag, patru-cinci din Ag (candidină, coccioidină, histoplasmină, Ag extras din
virusul urlian, fitohemaglutinină, lizat din cultură de Staphylococcus aureus, toxoid tetanic,
toxoid difteric, tricofitină, tuberculină etc).
Procedura
Instilarea Ag intradermic se face asemănător IDR cu PPD. Volumul de instilare va același,
dar trebuie să ținem cont de concentrația Ag utilizate. Este vorba de mai multe instilări, la
nivelul antebrațului, la distanțe diferite.
Interpretare
Pentru investigarea RIC pentru un subiect (am utilizat o „baterie” de Ag), dacă de ex.
rezultatul este „negativ” (nu apare induraţie) pentru niciuna dintre cele 4-5 Ag folosite,
presupunem faptul că subiectul respectiv este anergic în ceea ce priveşte RIC.

12. Diagnosticul de laborator în infecţii

produse de coci patogeni şi condiţionat
patogeni.
12. 1. Cuvinte cheie
·         Testul coagulazei
·         Testul catalazei
·         MRSA
·         Hemoliza
·         Testul bilolizei
·         Sensibilitatea la optochin

·         Sensibilitatea la bacitracină

12. 2. Introducere
Simpla vizualizare prin microscopia optică a unor coci nu este echivalentă cu stabilirea
patogenității acestora, implicarea acestora într-o anume patologie și nicidelimitarea în
microorganisme „bune” sau „rele”. Bacteriile observate pot fi comensale, inofensive sau pot
determina infecții de o severitate variabilă. Atunci când frotiurile sunt colorate Gram,
microorganismele care rețin violetul cristal apar colorate violet: Staphylococcus,
Streptococcus, sau  pot fi colorate roz-roșu (ex. Neisseria spp.). În funcție de dispoziție putem
ridica o anume suspiciune (ex. in diplo în cazul Streptococcus pneumoniae și Neisseria spp.,
în lanţuri Streptococcus spp. sau în grămezi Staphylococcus spp.)
12. 3. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de genul Staphylococcus
12. 3. 1. Clasificare. Genul Staphylococcus cuprinde mai multe specii de microorganisme de
interes medical, cele mai cunoscute fiind reprezentate de: Staphylococcus aureus (prevalenţa
cea mai mare), Staphylococcus epidermidis şi Staphylococcus saprophyticus. Stafilococii sunt
coci Gram-pozitivi aerobi, facultativ anaerobi, imobili, nesporulaţi, catalază-pozitivi.
Stafilococii coagulază-pozitivi sunt încadrati în specia S. aureus.
12. 3. 2. Cale de transmitere. Infecțiile stafilococice se transmit cel mai adesea prin contact
direct piele/piele sau piele/obiect contaminat (pansamente folosite, prosoape, lenjerie intimă).
12. 3. 3. Tabloul clinic variază în funcție de localizarea infecției și de mecanismul
etiopatogenic. Prin multiplicare și invazivitate locală, Staphylococcus aureus determină
infecții supurative (purulente) ale pielii, mucoaselor și ale țesuturilor subiacente, cu apariția
de pustule, furuncule ori abcese (Figura nr. 1). În absența tratamentului, infecția poate
disemina (pot apărea chiar și complicații severe, sepsis și chiar evoluția nefastă, spre deces).
Unele tulpini stafilococice sintetizează exotoxine, provocând toxiinfecții alimentare, necroliza
toxică a epidermului (Figura nr. 2) ori sindromul de șoc toxic. Staphylococcus saprophyticus
poate determina infecții urinare, în special la femeile tinere active sexual.
12. 3. 4. Diagnosticul de laborator
Principii generale. În cazul infecţiilor cu puroi ale tegumentelor şi mucoaselor (ex. abces -
Staphylococcus aureus) diagnosticul de laborator este unul bacteriologic, direct, conform
etapelor studiate vezi capitolul 3.
12. 3. 4. 1. Recoltarea și transportul produsului patologic trebuie să respecte regulile
cunoscute (vezi capitolul 4) (cât mai apropape de la debutul bolii, înainte ca pacientul să
primească medicaţie antibiotică ori chimioterapică etc). În infecţiile stafilococice, produsul
patologic poate fi reprezentat de secreţiile purulente de la nivelul lezinilor cutanate (ex. plăgi
şi arsuri suprainfectate, abcese), de exsudatul nazal sau faringian, de spută, sânge, LCR, urină,
secreţie vaginală ori lichid de vărsătură etc. Vom discuta recoltarea puroiului.
12. 3. 4. 2. Examinarea macroscopică şi microscopică a produsului patologic. Se efectueaza
minim 2 frotiuri: unul colorat Gram şi unul cu albastru de metilen. Prin examinarea la
microscopul optic, notam celulele cu morfologii diferite: celulele epiteliale, celulele
inflamatorii (ex. leucocite PMN) şi cocii Gram-pozitivi, cu diametrul de 0.5-1.5 mm,
dispuşi în grămezi neregulate, în lanţuri scurte, perechi sau izolaţi, localizati intra sau
extraleucocitar (Figura nr. 3).
12. 3. 4. 3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic o facem pentru a obţine
colonii izolate (cultură pură). Stafilococii sunt germeni nepretenţioşi, motiv pentru care
putem folosi medii de cultură simple. Atunci când suspicionăm contaminarea probelor este
recomandată utilizarea un mediu selectiv, precum mediul Chapman, fiind cunoscut faptul că
aceste microorganisme se multiplică pe medii hiperclorurate (Figura nr. 4). Coloniile sunt de
tip S, cu dimensiuni de 1-3 mm, pigmentate diferit în functie de specie (Staphylococcus
aureus-auriu (Figura nr. 5), Staphylococcus epidermidis-alb şi Staphylococcus saprophyticus-
citrin).
12. 3. 4. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic o facem pe baza:
·         Caracterelor morfotinctoriale: coci Gram-pozitivi, 0.5-1.5 mm, dispuşi în grămezi
neregulate, în lanţuri scurte, perechi sau izolaţi (Figura nr. 6)
·         Caracterelor de cultură: colonii de tip S, pigmentate auriu (Figura nr. 5)
·         Caracterelor biochimice: Staphylococcus spp. sunt catalază-pozitivi si fermentează
zaharuri cu producere de acid (ex. S. aureus este manită-pozitiv)
·         Caracterelor antigenice
 ·         Caracterelor de patogenitate: recomandăm ferm efectuarea testului coagulazei (Figura
nr. 7)
·         Sensibilităţii la bacteriofagi (în centrele de referinţă)
·         Altele (în centrele de referinţă, spre exemplu studiul acizilor graşi celulari, teste
biochimice extinse, identificarea toxinelor, identificarea prin biologie moleculară a rezistenţei
la antibiotice etc).
12. 3. 4. 5. Antibiograma este obligatorie şi se realizează de obicei prin metode
difuzimetrice. În ultimul deceniu atenţia întregii comunităţi medicale s-a concentrat asupra
rezistenţei la antibiotice în creştere a Staphylococcus spp., fiind deja celebru microorganismul
insensibil la antibioticele beta-lactamice: stafilococul meticilină-rezistent (MRSA- methicillin
resistant Staphylococcus aureus). Acesta se transmite prin contact direct, iar respectarea
măsurilor generale de igienă contribuie semnificativ la prevenirea apariţiei infecţiilor
stafilococice.
12. 4. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de genul Streptococcus
12. 4. 1. Clasificare. Streptococii sunt coci sferici Gram-pozitivi care formează perechi sau
lanţuri în cursul diviziunii celulare. Dintre speciile cu importanţă medicală amintim:
Streptococcus pyogenes (grup A), Streptococcus agalactiae (grup B) și Streptococcus
pneumoniae (pneumococul). Deși nu a fost stabilită o clasificare standard a Streptococcus
spp., au fost propuse mai multe variante. Astfel, pornind de la compozitia polizaharică a
peretelui bacterian, a rezultat clasificarea Lancefield, ce împarte streptococii în grupele
serologice A-H și K-U. Mai mult, Streptococcus pyogenes, conform factorului de virulență-
proteina M și a antigenului T, a fost subîmpărțit în alte 100, respectiv 20 serotipuri.
Cumulând variate caractere microscopice (prezența capsulei) și biochimice, precum hemoliza,
sensibilitatea la optochin ori la bacitracină vom obține o clasificarea prezentată în Figura nr.
8.
În continuare vom discuta despre diagnosticul de laborator al infecţiilor produse de
Streptococcus pyogenes.
12. 4. 2. Cale de transmitere. Este estimat că un procent cuprins între 5 și 15% din populație
este ”purtătoare” de S. pyogenes la nivel faringian (prima localizare ca frecvență), la nivel
cutanat, anal ori vaginal, fără ca aceste persoane să manifeste semne de boală. Infecția se
transmite de la om la om prin contactul direct al unui tegument traumatizat ori al unei
mucoase cu o secreție contaminată, dar și prin inhalarea unor aerosoli ori prin ingerarea unor
alimente contaminate.
12. 4. 3. Tablou clinic. Streptococii piogeni pot produce afecțiuni foarte variate:
·         Cu afectarea mucoaselor: faringită, angină streptococică (Figura nr. 9)
·         Patologii ale tegumentelor și ale țesuturilor subcutanate: impetigo, erizipel (Figura nr. 10),
celulită, fasceită necrozantă, gangrenă gazeoasă
·         Afecțiuni dezvoltate prin mecanism toxigen: scarlatina, sindromul de șoc toxic

·         Afecțiuni mediate imunitar prin reacții de hipersensibilitate, poststreptococice:

reumatismul articular acut, glomerulonefrita acută.
Alegem pentru discuţie diagnosticul în faringita streptococică.
12. 4. 3. 1 Diagnosticul de laborator este bacteriologic, direct.
12. 4. 3. 1. 1. Recoltarea şi transportul produsului patologic. Vom recolta în condiții de
asepsie exsudatul faringian (secreţia purulentă de la nivelul faringelui), conform regulilor
generale, dar respectând suplimentar următoarele condiții: înainte ca pacientul să se fi spălat
pe dinţi, să fi mâncat, să fi utilizat gargarisme cu diferite soluţii. Dacă aceste condiţii nu au
fost respectate, recoltarea se va face după minim 4 ore. Produsul recoltat trebuie prelucrat cât
mai repede posibil, însă în nici un caz nu trebuie să treacă mai mult de 2-3 ore de la recoltare
până la cultivare (preferabil 1-2 ore, sau mai repede). Dacă această recomandare nu poate fi
respectată, produsul va fi însămânțat pe un mediu de transport.
12. 4. 3. 1. 2. Examinarea microscopică a produsului patologic va ține cont de caracterul
plurimicrobian al acestuia. Se vor colora 2 frotiuri, Gram și albastru de metilen, etapă urmată
de notarea prezenţei următoarelor elemente: celule epiteliale, celule inflamatorii (ex.
leucocite) şi a diferitelor microorganisme printre care și coci Gram-pozitivi aşezaţi separat,
în perechi sau în lanţuri etc.
12. 4. 3. 1. 3. Cultivarea se realizează pe mediul agar-sânge, urmată, după aproximativ 18-48
ore, de interpretarea rezultatului. În cazul unei infecții cu streptococ urmează să vedem
colonii de tip S, de mici dimensiuni, înconjurate de o zonă deb-hemoliză (clară, cu diametrul
mai mare decât diametrul coloniei) (Figura nr. 11).
12. 4. 3. 1. 4. Identificarea se face pe baza următoarelor caractere:
·         morfotinctoriale: coci Gram-pozitivi, dispuşi în lanţuri (Figura nr. 12);
·         de cultură (mediul agar sânge): colonii de tip S, cu diametrul de 0.5-1 mm, înconjurate
deb-hemoliză (Figura nr. 11);
·         biochimice: hemoliză de tip beta, inhibiția multiplicării streptococilor de grup A de
bacitracină (Figura nr. 13), rezistenţa la trimetoprim-sulfametoxazol;
·         antigenice: determinarea polizaharidului specific de grup, determinarea tipurilor M etc.
12. 4. 3. 1. 5. Antibiograma. Streptococii beta-hemolitici de grup Asunt sensibili la
penicilină. Doar dacă pacienţii sunt ”alergici” la medicamentele din clasa beta-lactaminelor se
va efectua antibiograma.
NB: Mai mult de 80% dintre episoadele de faringoamigdalită sunt de etiologie virală și nu
necesită antibioticoterapie.
12. 4. 3. 2. Diagnosticul de laborator serologic
Dacă există suspiciunea ca pacientul să sufere de o boală poststreptococică sau se dorește
confirmarea unei infecţii invazive este recomandată efectuarea diagnosticului serologic prin
reacţia ASLO (vezi şi capitolul 10). Acest test este util și în evaluarea evoluţiei pacientului
sub tratament medicamentos (Figura nr. 14).
Reacţia ASLO identifică titrul anticorpilor anti-streptolizină O, o enzimă hemolitică produsă
de S. pyogenes. Repetarea testării la un interval de 7-10 zile permite interpretarea serologică
în dinamică și observarea evoluției pacientului sub tratament. Pentru zona noastră geografică
se acceptă ca normal un titru de 200 (maxim 250) unităţi ASLO. Este strict necesară
realizarea controlului intern şi extern de calitate. N.B. Metoda cea mai corectă este metoda
clasică de determinare.
12. 5. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Streptococcus pneumoniae
12. 5. 1. Clasificare. Streptococcus pneumoniae se prezintă sub forma unor coci Gram-
pozitivi, alungiţi, dispuşi în diplo, încapsulaţi, nesporulaţi, imobili. Pneumococii sunt aerobi,
facultativ anaerobi, multiplicarea microorganismelor fiind favorizată într-o atmosferă cu 5%
CO2. Pe mediul geloză-sânge determină a-hemoliză.
12. 5. 2. Cale de transmitere. Streptococcus pneumoniae este condiţionat patogen, putând
face parte din flora microbiană normală a tractului respirator superior. Infecția se transmite
prin contactul apropiat cu o persoană purtătoare sau bolnavă, ori prin inhalarea picăturilor
contaminate, eliberate prin tuse ori strănut. Există anumite categorii de persoane predispuse
spre a dezvolta boala: cei cu vârste extreme (copiii foarte mici și adulții cu mai mult de 65 de
ani), persoane cu patologii asociate care determină imunodepresie (diabet zaharat, afecțiuni
cardio-vasculare, HIV/SIDA) ori cu patologii pulmonare (astm, defecte anatomice, mari
fumători).
12. 5. 3. Tablou clinic. Infecția pneumococică este principala cauză a pneumoniilor
comunitare (Figura nr. 15) și reprezintă una dintre cele mai frecvente etiologii ale
 meningitelor la copii și vârstnici. Poate produce și infecţii ale tractului respirator superior, ale
urechii medii și sinusurilor sau, prin diseminare sistemică, endocardită, septicemie.
Vom discuta diagnosticul microbiologic în pneumonia pneumococică.
12. 5. 4. Diagnosticul pneumoniei este clinic, radiologic şi bacteriologic (direct).
12. 5. 4. 1. Recoltarea şi transportul produsului patologic, reprezentat de spută respectă
regulile generale, dar și condiții speciale precum: educarea pacientului în vederea obținerii
expectorației și nu a unei probe salivare, necesitatea efectuării igienei cavității bucale anterior
recoltării.
12. 5. 4. 2. Examinarea microscopică a produsului patologic impune realizarea a două
frotiuri, colorate cu albastru de metilen, respectiv Gram. Se notează prezenţa celulelor de la
nivel alveolar (spre exemplu macrofage), a celulelor inflamatorii (spre exemplu leucocitele
polimorfonucleare) şi a cocilor Gram-pozitivi, alungiți, lanceolați, dispuși în diplo, cu o
capsulă comună (Figura nr. 16).
12. 5. 4. 3. Cultivarea pe medii de cultură. Pneumococii sunt germeni pretențioși, care nu se
dezvoltă pe medii simple. Astfel, însămânțarea se realizează pe mediul geloză-sânge, cu
incubarea într-o atmosferă de 5% CO2 la o temperatură de 35-37°C, condiții care favorizează
multiplicare germenilor. Se vor observa colonii de tip S sau de tip M, cu a-hemoliză (Figura
nr. 17).
12. 5. 4. 4. Identificarea se realizează pe baza caracterelor:
·         morfotinctoriale: coci Gram-pozitivi, alungiţi, lanceolaţi, în diplo, capsulaţi (Figura nr. 16)
·         de cultură: colonii de tip S sau M, înconjurate de o zonă de a-hemoliză
·         biochimice: fermentarea inulinei, autoliza accelerată a sărurilor biliare (testul bilolizei),
sensibilitatea la optochin (etil-hidrocupreină) (Figura nr. 18)
·         antigenice: folosim seruri specifice  polivalente şi monovalente ce țintesc antigenul K, în
reacţia de umflare a capsulei
·         de patogenitate: inocularea la şoarecele alb.
12. 5. 4. 5. Antibiograma este obligatorie şi se realizează de obicei prin metode
difuzimetrice. Pentru verificarea sensibilităţii la penicilină se utilizează microcomprimate cu
oxacilină.
12. 5. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de genul Neisseria
12. 5. 1. Clasificare. Familia Neisseriaceae include mai multe genuri, dar vom discuta în cele
ce urmează numai despre diagnosticul de laborator în infecţiile produse de meningococ
(Neisseria meningitidis) şi gonococ(Neisseria gonorrhoeae). Aceștia sunt coci Gram-negativi,
dispuşi în diplo, reniformi, imobili, înconjuraţi de o structură capsulară comună. În funcţie de
structura capsulei există mai multe serogrupuri.
12. 5. 2. Neisseria meningitidis
12. 5. 2. 1. Cale de transmitere. Infecția meningococică se transmite prin contactul apropiat cu
o persoană purtătoare sau bolnavă (utilizarea în comun a obiectelor de igienă personală, sărut,
tuse). Microorganismul a fost izolat de la nivel nazo-faringian, la persoane sănătoase (purtător
de N. meningitidis).
12. 5. 2. 2. Tablou clinic. N. meningitidis reprezintă una dintre cele mai frecvente etiologii ale
meningitei bacteriene, alături de Haemophilus influenzae și Streptococcus pneumoniae. Dacă
la adulți redoarea cefei, fotosensibilitatea, vărsăturile fără senzație de greață, febra pot sugera
afecțiunea, la copii și la bebeluși suspiciunea de meningită poate fi cu greu intuită, aceștia
prezentând adeseori un tablou clinic atipic (ex. iritabilitate, vomă, reflexe modificate).
Meningita meningococică este o afecțiune cu risc vital, reprezentând o urgență medicală.
12. 5. 2. 3. Diagnosticul în meningita meningococică
Diagnosticul include elemente clinice, într-un context epidemiologic. Pentru stabilirea
etiologiei, diagnosticul este bacteriologic (direct) şi urgent. Este recomandat ca primele
etape să fie efectuate la patul bolnavului.
12. 5. 2. 3. 1. Recoltarea produsului patologic (LCR, puncţie după realizarea examenului
„fundului de ochi”) ar trebui realizată la patul bolnavului, unde repartizăm o cantitate de LCR
pentru examenul citologic şi biochimic, iar restul pentru frotiuri şi culturi (Figura nr. 19).
Dacă transportul este inevitabil, trebuie efectuat fără întârziere şi nu la temperaturi scăzute, ci
aproape de temperatura corpului. Meningococul poate fi izolat şi prin hemocultură, din
exsudatul nazal ori faringian.
12. 5. 2. 3. 2. Examinarea microscopică a produsului patologic permite vizualizarea
celulelor inflamatorii (PMN) şi a cocilor Gram-negativi, dispuşi în diplo, capsulaţi, situaţi
intra sau extraleucocitar (Figura nr. 20).
12. 5. 2. 3. 3. Cultivarea o facem pe medii complexe, în atmosferă de 3-5% CO2, la 37°C.
12. 5. 2. 3. 4. Identificarea rezultă în urma analizei caracterelor:
·         morfotinctoriale (coci Gram-negativi, în diplo, reniformi);
·         de cultură: colonii de tip S sau M, cu o dimensiune de aproximativ 1-2 mm;
·         biochimice: metabolizează diferiţi carbohidraţi (ex. glucoza şi maltoza) şi produc
citocrom-oxidază (testul oxidazei este test cheie în identificare) (Figura nr. 21);
·         antigenice: putem realiza serogruparea (spre exemplu pot aparţine grupului A, B, C, Y sau
W-135) (Figura nr. 22).
12. 5. 2. 3. 5. Antibiograma este recomandată şi se realizează de obicei prin metode
difuzimetrice. Sub un tratament antibiotic adecvat, instituit prompt, majoritatea pacienților cu
meningită meningococică se refac complet (a nu se uita că în anumite patologii este necesară
efectuarea CMI/CMB și eventual și NEI/NEB).
12. 5. 3. Neisseria gonorrhoeae
12. 5. 3. 1. Cale de transmitere. N. gonorrhoeae se transmite prin contact sexual sau de la
mamă la făt în timpul nașterii pe cale naturală. Nu arareori pacienții prezintă multiple infecții
transmise pe cale sexuală, fiind obligatorie investigarea completă. Gonoreea se asociază
frecvent cu infecția cu Chlamydia trachomatis, schemele terapeutice recomandate putând să
”acopere” ambele patologii.
12. 5. 3. 2. Tablou clinic. La bărbaţi apare uretrita gonococică, iar la femei, gonoreea se
localizează endocervical. La nou-născutul care se naşte pe cale naturală din mamă cu gonoree,
poate apărea oftalmia gonococică. Gonococul poate disemina cu apariţia unor leziuni la
distanţă. Important de specificat este faptul că aproximativ 80% din femeile infectate și 10%
din bărbați sunt asimptomatici, reprezentând o cauză de infertilitate.
12. 5. 3. 3. Diagnosticul de laborator în gonoree
Diagnosticul de laborator este numai bacteriologic (direct).
12. 5. 3. 3. 1. Recoltarea şi transportul produsului patologic respectă regulile cunoscute. La
bărbat recoltăm secreţia uretrală, iar la femeie recoltarea trebuie efectuată pe masă
ginecologică de la nivelul colului uterin. Secreţiile au de obicei un aspect purulent. Este de
preferat cultivarea cât mai rapidă, pe medii de cultură complexe (în atmosferă de CO2).
Transportul trebuie realizat foarte rapid în medii de transport (ex. Amies plus cărbune activat).
12. 5. 2. 3. 2. Examinarea microscopică a produsului patologic poate pune diagnosticul.
Notăm prezenţa celulelor epiteliale, a celulelor inflamatorii (ex. leucocite) şi a cocilor
Gram-negativi (în diplo, situaţi intra sau extraleucocitar) (Figura nr. 23).
12. 5. 2. 3. 3. Cultivarea se face pe medii selective (spre exemplu medii cu vancomicină,
colistin, trimetoprim şi nistatin) dacă produsul patologic este contaminat. Recomandăm
cultivarea atât pe medii selective, cât şi pe medii neselective, în atmosferă de 3-10% CO2, la
35-37°C. Coloniile apar în 24-48 de ore. Sunt colonii de tip S, de 0,5-1 mm, sau colonii de tip
M.
12. 5. 2. 3. 4. Identificarea rezultă în urma analizei caracterelor:
·         morfotinctoriale: coci Gram-negativi, în diplo, eventual înconjuraţi de o structură
capsulară comună;
·         de cultură: coloniile sunt de tip S sau M (pot exista până la 5 tipuri de colonii diferite,
ceea ce poate deruta examinatorul neavizat);
·         biochimice: metabolizează diferiţi carbohidraţi (ex. glucoza) şi produc citocrom-oxidază
(testul oxidazei este test cheie în identificare) (Figura nr. 24); testul catalazei este intens
pozitiv;
·         antigenice;
·         Altor caractere (de ex. studiate prin metode ale biologiei moleculare).
12. 5. 2. 3. 5. Antibiograma este recomandată şi se realizează de obicei prin metode
difuzimetrice. Este necesară testarea producerii de b-lactamază. Este necesară testarea prin
tehnica diluției (cel puțin determinarea CMI).

13. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de

enterobacterii.
13. 1. Cuvinte cheie

 Bacili Gram-negativi
 Oxidază-negativi
 Catalază-pozitivi
 Boală diareică acută
 Febra tifoidă
 Dizenterie
 Pesta bubonică

13. 2. Introducere
13. 2. 1. Clasificare
Familia Enterobacteriaceae cuprinde un număr foarte important de genuri şi specii, de
microorganisme importante în medicină. Această familie include atât agenţi patogeni (ex.
Salmonella spp., Shigella spp.) cât și condiţionat patogeni (ex. E. coli) implicaţi în patologia
infecţioasă. Multe bacterii ale acestei familii fac parte din flora intestinului uman sau animal,
altele sunt prezente în apă, pe sol, pe plante etc.
13. 2. 2. Calea de transmitere
13. 2. 2. 1. Genul Escherichia
E. coli face parte din flora intestinală normală. Este implicat (de regulă) în patologie
atunci când îşi modifică habitatul (de ex. ajunge la nivelul tractului urinar). Eliminat în mediul
extern cu materiile fecale, contaminează apa, solul, alimentele etc.
13. 2. 2. 2. Genul Klebsiella
Klebsiella pneumoniae este răspândită în natură; face parte din flora normală a tractului
gastrointestinal, a tractului respirator superior. După terapia prelungită cu antibiotice (mai ales
cu spectrul larg), în mediul spitalicesc se selectează tulpini multirezistente ce pot coloniza
tractul urinar sau respirator la adult şi la copil.
13. 2. 2. 3. Genul Proteus
Germenii din genul Proteus sunt răspandiţi ubicuitar. Se pot găsi pe sol, în ape reziduale,
ape de suprafaţă, în materiale organice în putrefacţie, în alimente şi în produse patologice. Fac
parte din flora intestinală umană.
13. 2. 2. 4 Genul Salmonella
Principalul habitat al salmonelelor este tractul intestinal al oamenilor şi al animalelor.
Pentru S. typhi omul este unicul rezervor. Sursele majore, omul şi animalele vor determina
poluarea solului, a apelor reziduale, a apelor de suprafaţă, în care vor supravieţui de la cateva
zile la câteva luni, daca condiţiile sunt favorabile.
13. 2. 2. 5 Genul Shigella
Bacteriile sunt întâlnite în intestinul şi materiile fecale ale bolnavilor precum şi la
purtătorii aparent sănătoşi. Se pot izola din apă, alimente sau de pe obiecte. Pot fi transmise
prin intermediul muştelor şi a mâinilor murdare,
13. 2. 2. 6 Genul Yersinia
Speciile din genul Yersinia (specia cea mai patogenă) au ca rezervor rozătoarele, păsările,
mamiferele domestice. Se pot transmite prin plăgi muşcate de la o rozătoare la alta sau
ocazional prin intermediul puricilor (puricele de şobolan, puricele de om).
13. 2. 3 Tabloul clinic
13. 2. 3. 1. Tabloul clinic în infecţiile produse de E. coli
Genul Escherichia cuprinde în bună parte germeni comensali. Specia tip este reprezentată
de E. coli. Membrii acestui gen pot determina infecţii intestinale şi extraintestinale. În
condiţiile în care părăseşte habitatul natural, colonizează epiteliul urinar, fiind implicat în
primul rând în infecţii ale tractului urinar. Infecţiile intestinale sau enterocolitele infecţioase
sunt determinate de patotipuri (EAEC, EHEC, EIEC, EPEC, ETEC etc.), fiecare având grupe
serologice şi determinând manifestări clinice distincte.
13. 2. 3. 2. Tabloul clinic în infecţiile produse de genul Klebsiella
Klebsiella pneumoniae poate fi implicată într-o mare varietate de boli precum toxiinfecţii
alimentare de tip infecţios, infecţii ale tractului respirator superior, infecţii urinare etc. Este un
microorganism condiţionat patogen. Pneumoniile cauzate de K. pneumoniae sunt rare dar
foarte grave; cel mai des survin la pacienţii cu boli debilitante ca diabet, afecţiuni pulmonare
cronice, pacienţi alcoolici şi la cei cu un sistem de apărare deficitar.
13. 2. 3. 3. Tabloul clinic în infecţiile produse de Proteus
Proteus poate deveni patogen prin multiplicare şi invazivitate şi poate declanșa infecţii la
diferite nivele ale organismului gazdă. Sunt implicaţi patogenic în afecţiuni ce apar în afara
tractului digestiv, dar există şi toxiinfecţii alimentare de tip infecţios în care aceşti germeni au
reprezentat agenţii cauzali. Infecţiile tractului respirator inferior, pneumoniile, sunt de cele
mai multe ori nosocomiale. Pot suprainfecta plăgile chirurgicale sau pe cele arse, ducând la
apariţia abceselor. Sunt frecvent implicaţi în infecţii la nivelul tractului urinar, capacitatea
Proteus spp. de a descompune ureea joacă un rol foarte important în inducerea litiazei urinare.
13. 2. 3. 4. Tabloul clinic în infecţiile produse de Salmonella
Principalele infectii produse de salmonele se pot împărţi în salmoneloze minore
(enterocolite) şi salmoneloze majore (febra tifoidă). Sunt patogene prin multiplicare şi
invazivitate. Pacienţii imunocompromişi şi cei cu boli hematologice sunt mai susceptibili la
infecţii cu Salmonella decât adulţii sănătoşi.
În caz de enterocolită (gastroenterită, toxiinfecţia alimentară de tip infecţios,
salmoneloză), germenii pătrund pe cale digestivă iar boala apare după ingestia a 105-108
salmonele. Incubaţia durează de la câteva ore până la câteva zile, microorganismul
multiplicându-se în epiteliul intestinal, în regiunea ileocecală, provocând un sindrom
inflamator intestinal cu diaree mucopurulentă şi nesangvinolentă. La debut diareea este
însoţită de greţuri şi vărsături, iar în perioada de stare a bolii simptomele frecvent întâlnite
sunt reprezentate de febră, colici abdominale, mialgii şi cefalee. La nou născut deshidratarea
poate duce la o stare de toxicoză gravă. Persoana infectată poate fi contagioasă timp de circa 3
luni.
Febra tifoidă (febra enterală) poate apărea după ingerarea a 103 S. typhi. Calea de
pătrundere este digestivă, transmiterea fiind realizată de la persoană la persoană. După
ingestie, urmează o perioadă de incubare de aproximativ 1-3 săptămâni, în care
microorganismul traversează mucoasa intestinală, urmată de multiplicarea în submucoasă şi
fagocitarea de catre macrofage. De aici, bacilii trec în circulaţia limfatică, apoi în cea
sangvină determinând etapa bacteriemică a bolii. Simptomele generale se caracterizează prin
febră crescută, stare generală alterată, stare de şoc, însoţită de o simptomatologie digestivă
reprezentată de anorexie, colici abdominale, constipaţie sau diaree. Simptomatologia este
cauzată atât de endotoxina, care activează diferitele cascade inflamatorii şi producerea de
citokine, cât şi consecinţa agresiunii intestinale, hepatice şi asupra vezicii biliare. La sfârşitul
primei săptămâni de boală, salmonele se elimină în materiile fecale, dar excreţia se poate
prelungi mult timp în convalescenţă.
13. 2. 3. 5. Tabloul clinic în infectiile produse de Shigella
Infectiile cu Shigella spp. sunt de regulă limitate la nivelul tractului intestinal, pot produce
și toxiinfecții alimentare de tip infecțios. Shigeloza este o boală diareică acută, cu evoluție
autolimitantă, apare dupa 2-5 zile de la ingestia a 10-1000 de bacterii. Debutul este brusc, cu
febră, diaree apoasă, dureri abdominale intense. În perioada de stare, pacientul are 30-40 de
scaune nefecaloide, cu mucus, puroi și sânge, însoțite de tenesme rectale și stare generală
alterată. În cazul unei infecții produse de Shigella shiga, starea generală se înrăutățește,
pierderile hidro-electrolitice și instalarea unui sindrom de deshidratare acută reprezintă, ca și
în cazul altor diarei, principala problemă. Evoluția poate fi fatală în lipsa tratamentului
corespunzător.
13. 2. 3. 6. Tabloul clinic în infecțiile produse de Yersinia
Genul Yersinia include 11 specii dintre care 3 sunt patogene pentru om: Y. pestis (cauza
ciumei), Y. pseudotuberculosis şi Y. enterocolitica.
Y. pestis este un microorganism patogen al rozătoarelor, oamenii fiind gazde accidentale
infectate prin muşcătura puricilor de şobolan. Microorganismul inoculat la om este fagocitat,
dar se poate multiplica atât intra cât și extracelular. Infecţia rezultată se răspândeşte rapid
către nodulii limfatici regionali. La nivelul nodulilor limfatici determină leziuni caracteristice,
ganglionii devin tumefiaţi, hemoragici, se hipertrofiază, suferă o necroză şi devin fluctuenţi
(aspect caracteristic bubon negru). În cursul invaziei, Y. pestis poate ajunge în torentul
sanguin şi infecţia se poate generaliza. Pesta bubonică poate produce leziuni hemoragice şi
necrotice în toate organele; în lipsa tratamentului, letalitatea este de 50%.
Propagarea infecţiei în cazul pestei pneumonice primare (forma pulmonară) se face rapid,
de la om la om, prin inhalarea particulelor încărcate cu germeni, fără să se mai treacă prin
stadiul de bubon. Se manifestă prin pneumonie hemoragică, septicemie, decesul survine în
mai putin de 24 de ore după instalarea simptomelor clinice, la 90% dintre pacienții netrataţi.
Y. pseudotuberculosis include cel puţin 6 serotipuri, dar cel mai frecvent implicat în
infecţiile umane este serotipul 1. În organismul uman pătrunde pe cale digestivă, originea
contaminării fiind probabil alimentară. Microorganismele penetrează epiteliul porţiunii
terminale a ileonului, ajung în ganglionii limfatici ai regiunii ileo-cecale, unde produc o
adenită reticulară, însoţită de leziuni asemănătoare tuberculozei intestinale. Foarte rar, se
întâlneşte septicemie la pacienţii imunocompromişi (cirotici si diabetici).
Y. enterocolitica cuprinde mai mult de 50 de serotipuri, cele mai multe izolate la oameni
bolnavi. Infecţia orală cu serotipurile patogene pentru om ale speciei Y. enterocolitica se poate
manifesta clinic prin mai multe tipuri de patologie; transmiterea are loc probabil prin
contaminarea apei şi a alimentelor. Enteritele provocate de această specie se manifestă cu
diaree, frecvent acompaniată de subfebrilitate şi dureri abdominale. Poate determina infecţii
cu caracter invaziv localizate pe ileonul terminal cu „prinderea” ganglionilor mezenterici şi
apariţia unui sindrom al fosei iliace drepte, în paralel cu o adenită mezenterică asemănătoare
celei provocate de Y. pseudotuberculosis. La copii, simptomatologia poate conduce la punerea
eronată a diagnosticului de apendicită acută. La adulţi s-a întâlnit în declanşarea unor artrite
reactive sau a unui eritem nodos cu dificultăţi în ceea ce priveşte diagnosticul diferenţial.
13. 3. Diagnosticul de laborator
 Familia Enterobacteriaceae cuprinde un mare număr de genuri şi numeroase specii (peste
2400, dacă sunt luate în considerare și speciile din genul Salmonella). Familia include
germeni care se pot multiplica pe medii simple, aerobi facultativ anaerobi, utilizează glucoza
cu sau fără producere de gaz, oxidază-negativi, catalază-pozitivi. Formează colonii de tip S (R
în cazul culturilor “vechi”) sau M (pentru speciile capsulate), pot fermenta lactoza (ex.
Escherichia coli, Klebsiella spp.) sau sunt lactoză negativi (ex. Salmonella spp., Shigella
spp.). Pentru izolare putem folosi medii selective şi selectivo-diferenţiale. Există medii cu
selectivitate mai redusă (ex. Mac Conkey), medii cu selectivitate medie (ex. ADCL) şi medii
cu selectivitate înaltă (ex. Wilson-Blair). Caracterele biochimice sunt esenţiale pentru
identificare. Studiul caracterelor Ag (prin reacţii Ag-Ac) este de asemenea foarte util
(toate enterobacteriile au AgO, cele mobile au AgH, enterobacteriile capsulate au AgK,
Salmonella typhi prezintă în plus AgVi etc.).
Diagnosticul de laborator este bacteriologic, direct (exceptând febrele enterale în care
există și diagnostic serologic).
13. 3. 1. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Escherichia coli
Diagnosticul de laborator microbiologic în infecţiile cu localizare digestivă
1. Recoltarea şi transportul p.p. respectă regulile cunoscute; recoltăm materii fecale, lichid de
vărsătură etc. După examinarea macroscopică, continuă examenul de laborator. Spre ex., dacă
infecţia ar fi produsă de E. coli enterohemoragic (EHEC), am putea vizualiza cele ce urmează.
Materiile fecale pot avea aspect hemoragic, cu lambouri de mucoasă epitelială.
2. Nu facem frotiu. Examinăm între lamă şi lamelă şi am putea vedea hematiilor şi PMN.
3. Cultivăm pe MacConkey cu D-sorbitol (EHEC nu fermentează sorbitolul, sau îl
fermentează tardiv). Coloniile suspecte, sunt de tip S, 1-, necolorate (coloniile sorbitol-
pozitive au o culoare roz) (Figura nr. 1).
4. Identificarea se face pe baza caracterelor:
·         morfotinctoriale: bacili Gram-negativi;
·         de cultură: colonii de tip S,cu caracterele menţionate mai sus;
·         biochimice (se examinează numai acolo unde sunt condiţii de biosiguranţă, conform unei
Directive Europene): fermentează glucoza (cu producere de gaz), lactoză-pozitivi, nu
fermentează (sau fermentează tardiv) sorbitolul, nu produc H2S, pot produce indol, sunt
urează-pozitivi, mobili (există şi tulpini imobile) etc.;
·         antigenice: prin reacţii de aglutinare sau latex aglutinare (seruri monovalente anti O157 şi
anti H7).
5. Antibiograma este recomandată pentru supravegherea apariţiei fenomenului de rezistenţă la
antibiotice şi chimioterapice; se realizează prin metode difuzimetrice.
Diagnosticul în infecţiile urinare
În principal se recoltează urină. În funcţie de forma clinică se poate recolta şi sânge (ex. în
pielonefrita acută). Pe lângă regulile cunoscute, trebuie subliniat că iniţial se realizează toaleta
locală. Atunci când nu se poate recolta prima urină de dimineaţă, trebuie aşteptat pentru
recoltare 3-4 ore după micţiune. Dacă p.p. nu este prelucrat imediat (în maxim 30 de minute
după recoltare), trebuie menţinut la temperatura frigiderului iar transportul trebuie realizat la
+. Se recoltează urina “din mijlocul jetului”. Există şi alte tehnici de recoltare, neinvazive sau
invazive (puncţie şi aspiraţie suprapubiană, cateterizare uretrală, cu riscurile respective).
După examenul macroscopic (ex. urina poate fi tulbure) pregătim un „sediment urinar”.
Examinăm preparatul între lamă şi lamelă; încercăm să stabilim numărul de bacterii pe câmp
şi respectiv numărul de PMN pe câmp (dacă există leucociturie).
Pentru cultivare putem utiliza mai multe medii diferite. Este de reţinut că facem o urocultură
cantitativă (trebuie să determinăm numărul de bacterii/ml de urină). De ex., dacă însămânţăm
0,1 mililitri de urină diluată (ex. 1/1.000), incubăm şi după apariţia coloniilor calculăm
numărul de bacterii/ml înmulţind nr. de colonii cu 10 şi cu 1.000. Asta înseamnă că, în
condiţiile de mai sus, prezenţa a 7 colonii înseamnă 70.000 bacterii/ml. (Figura nr. 2)
Ce înseamnă urocultură cantitativă? Având în vedere cele de mai sus, dacă numărul de
bacterii/ml este mai mare de 100.000, considerăm urocultura ca fiind pozitivă. Lipsa
coloniilor sau un număr de maxim 10.000 bacterii/ml, semnifică o urocultură negativă. Între
10-100.000 bacterii/ml eventual repetăm analiza.
Dacă urocultura este pozitivă, bacteria izolată se identifică pe baza caracterelor prezentate
anterior şi se tratează conform antibiogramei.
13. 3. 2. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de genul Klebsiella
Sunt enterobacterii imobile, nesporulate. Degradează glucoza este degradată cu producere de
gaz şi fermentează lactoza. Specia tip este Klebsiella pneumoniae (bacili Gram negativi,
capsulaţi). Este un microb condiţionat patogen. Poate produce TIA de tip infecţios, infecţii
ale tractului respirator superior, infecţii urinare etc, inclusiv infecţii nosocomiale.
Pentru diagnostic, luăm drept exemplu situaţia în cazul pneumoniei produse de Klebsiella
pneumoniae. Diagnosticul integral include elemente clinice, paraclinice şi de laborator;
diagnosticul bacteriologic permite stabilirea etiologiei şi tratamentului corespunzător.
1. Recoltarea şi transportul p.p. respectă regulile cunoscute (recoltăm spută). Macroscopic,
poate avea un aspect mucoid, de culoare roşu închis, “în jeleu de coacăze”.
2. Examinăm microscopic p.p. şi notăm prezenţa celulelor (ex. macrofage alveolare),
celulelor inflamatorii (PMN) şi a bacililor Gram negativi, de dimensiuni relativ mari, cu
capsulă (halou, vizibil).
3. Cultivăm pe medii de cultură obişnuite (18-24 ore, 35-37°C) şi examinăm coloniile izolate,
pentru a începe identificarea. Utilizăm medii slab selective (ex. MacConkey). Klebsiella
pneumoniae nu se dezvoltă pe medii înalt selective şi este parţial inhibată pe cele moderat
selective. K. pneumoniae formează colonii lactoză-pozitive, mari, de tip M, cu aspect de
“curgere” pe suprafaţa mediului de cultură (tendinţă de confluare).
4. Identificarea microorganismului se face urmărind caracterele:
·         morfotinctoriale: bacili Gram-negativi, dimensiuni mari, capsulaţi, dispuşi în lanţuri
scurte, perechi sau izolaţi; (Figura nr. 3)
·         de cultură: colonii lactoză pozitive, de tip M, mari (2- la 24 de ore, peste la 48 ore),
bombate, vâscoase, cremoase, în “picătură de miere”, care dau aspectul de “curgere” pe
suprafaţa mediului de cultură, cu tendinţă la confluare (Figura nr. 4);
·         biochimice: glucoză pozitiv (cu producere de gaz), lactoză pozitiv, nu produce H2S,
imobil, urează pozitiv, indol negativ, se dezvoltă folosind citratul ca unică sursă de C. (Figura
nr. 5)
·         antigenice: utilizăm seruri cu Ac cunoscuţi pentru identificarea tulpinilor de Klebsiella,
prin aglutinare, coaglutinare sau latex aglutinare (în laboratoare de referinţă);
·         testarea sensibilităţii la bacteriofagi etc.
5. Antibiograma este obligatorie şi se realizează de obicei prin metode difuzimetrice
(determinarea CMI este indicată).
13. 3. 3. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de genul Proteus
Genul Proteus este format din germeni foarte pleomorfi, foarte mobili, Gram negativi, aerobi
facultativ anaerobi, nu fermentează lactoza, produc urează. Există 2 specii principale, Proteus
mirabilis şi Proteus vulgaris. Sunt germeni condiţionat patogeni.
Pot produce TIA de tip infecţios, infecţii ale tractului urinar (ITU), dar chiar şi alte infecţii
(tegumentare, genitale, infecţii nosocomiale etc). Discutăm diagnosticul de laborator al ITU.
Diagnosticul de laborator microbiologic este bacteriologic, direct.
1. Recoltarea şi transportul p.p. se realizează aşa cum am discutat anterior. Urina poate fi
tulbure, purulentă. Transportul trebuie realizat în maxim 30 minute, iar dacă nu e posibil, p.p.
trebuie transportat “la rece” (+4ºC). (Figura nr. 6)
2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea preparatului proaspăt
între lamă şi lamelă, din sedimentul urinar. Acest tip de examinare este foarte important (uşor
de realizat, ieftin, permite observarea unor elemente utile, care orientează diagnosticul).
Mobilitatea poate fi evaluată. Urmărim numărul de leucocite/câmp. (Film nr. 1)
3. Cultivăm pe medii de cultură simple. Trebuie să demonstrăm prezenţa a peste 100.000
bacterii/ml de urină. Pe mediile simple uzuale, nu se pot obţine colonii izolate; apare
fenomenul de invazie.
4. Identificarea microorganismului se va realiza pe baza mai multor caractere:
·         morfotinctoriale: bacili Gram-negativi, cu polimorfism (bacili, cocobacili, forme
filamentoase de peste 30 µm); (Figura nr. 7)
·         de cultură:
·         Fenomenul de invazie (dacă însămânţăm o tulpină la periferia unei plăci Petri cu mediu
simplu, cultura se “dezvoltă în valuri concentrice”, pe toată suprafaţa mediului) (Figura nr. 8),
·         Pe anumite medii selective (cu săruri biliare), invazia este inhibată şi se obţin colonii
izolate, de tip S, lactoză negative,
·         Fenomenul “liniei de demarcaţie” (dacă pe o placă cu mediu solid cultivăm 2 tulpini
diferite, în 2 puncte opuse, tulpinile se vor dezvolta invadând până în apropierea liniei de
întâlnire, unde se va crea o “linie de demarcaţie” între cele 2 tulpini) (Figura nr. 9);
·         Fenomenul de “căţărare”;
·         Caractere biochimice: sunt microorganisme lactozo negative (alte caractere biochimice se
pot studia pe mediile multi test, TSI, MIU etc.), glucoză pozitive, produc H2S, mobile, urează
pozitive, se pot dezvolta folosind citratul ca unică sursă de carbon; (Figura nr. 10)
·         Caractere antigenice;
5. Antibiograma este obligatorie şi se realizează de obicei prin metode difuzimetrice.
13. 3. 4. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de genul Salmonella.
Genul Salmonella include bacili Gram negativi, mobili cu cili peritrichi, necapsulaţi,
nesporulaţi, nu fermentează lactoza, produc H2S, utilizează citratul ca unică sursă de carbon.
Pot produce salmoneloze minore (ex. TIA) şi salmoneloze majore (ex. febra tifoidă). În cazul
TIA/enterocolitelor, diagnosticul de laborator este bacteriologic, direct. În cazul afecţiunilor
sistemice, diagnosticul poate fi bacteriologic şi serologic.
13. 3. 4. 1. Diagnosticul de laborator în infecţiile cu localizare digestivă
1. Recoltarea şi transportul p.p. (ex. materii fecale) respectă regulile cunoscute.
2. Examinăm microscopic p.p., între lamă şi lamelă (remarcăm prezenţa granulocitelor).
(Figura nr. 11)
3. Cultivăm pe următoarele medii de cultură: un mediu lichid de îmbogăţire (bulion selenit) şi
două medii selectivo-diferenţiale (MacConkey şi ADCL). După 18-24 ore la 35-37ºC, pe
mediile solide pot apărea colonii bacteriene suspecte (lactoză-negative) din care obţinem
cultura pură. Cultura de 18-24 ore din bulion selenit o repicăm pe medii solide. (Figura nr. 12)
4. Identificăm microorganismului pe baza mai multor caractere:
·         morfotinctoriale: sunt bacili Gram-negativi;
·         de cultură: produc colonii de tip S, lactoză-negative (necolorate pe MacConkey;
necolorate, cu centrul negru pe ADCL) (Figura nr. 13);
·         biochimice: fermentează glucoza (cu producere de gaz), sunt lactoză-negativi, produc H2S
şi utilizează citratul ca unică sursă de carbon; (Figura nr. 14)
·         antigenice: utilizăm seruri imune cu Ac anti-O şi ulterior Ac anti-H (reacţii de aglutinare
pe lamă, respectând protocolul de lucru);
·         sensibilitatea la bacteriofagi.
5. Antibiograma este recomandată în cazul pacienţilor foarte în vârstă, sau în cazul copiilor
foarte mici, prematuri, cu alte boli adăugate şi pentru supravegherea apariţiei fenomenului de
rezistenţă la antibiotice şi chimioterapice.
13. 3. 4. 2. Diagnosticul de laborator în febrele enterale (ex. febra tifoidă)
Diagnosticul cert este reprezentat de izolarea şi identificarea S. typhi din p.p.
Diagnosticul bacteriologic, direct respectă etapele prezentate anterior.
În prima săptămână de boală, p.p. e reprezentat de sânge; ulterior putem recolta materii
fecale, urină, lichid biliar, măduvă hematogenă etc. Dacă p.p. este reprezentat de materii
fecale, respectăm ceea ce am prezentat mai sus (există şi particularităţi). Coloniile de S. typhi
pot să nu prezinte centrul de culoare neagră pe ADCL. S. typhi nu produce gaz din glucoză iar
H2S este în cantitate mică. Nu foloseşte citratul ca unică sursă de carbon. Pentru identificarea
AgO este necesară o inactivare prealabilă (termică). Prezenţa AgVi poate crea probleme în
identificarea AgO. Lizotipia poate fi foarte utilă. Testarea sensibilităţii la antibiotice şi
chimioterapice este indicată în toate infecţiile produse de S. typhi.
Diagnosticul serologic: se realizează respectând principiile generale. Serodiagnosticul
”Widal” (folosind culturi vii) nu se mai practică astăzi. Tehnica actuală poartă numele de
analiză serică cantitativă (aglutinare în tuburi). Utilizăm serii de tuburi (câte o serie pentru
fiecare Ag cunoscut folosit). Utilizăm 6 serii de tuburi pentru a evidenţia Ac anti-O (TO - S.
typhi, AO - S. paratyphi A, BO - S. paratyphi B), şi anti-H (d - S. typhi, a - S. paratyphi A, b -
S. paratyphi B). Pregătim diluţiile, incubăm pentru Ac anti-O timp de 18-20 ore la 52ºC şi 10
minute la temperatura camerei iar pentru Ac anti-H timp de 2 ore la 52º C şi 10 minute la
temperatura camerei. Apoi citim reacţia. Un titru de 1/250 în cazul Ac anti-O şi respectiv
1/2.500 în cazul Ac anti-H este sugestiv. Creşterea de 4 ori a titrului, la 2 determinări
succesive confirmă diagnosticul.
În cazul convalescenţilor şi purtătorilor este recomandată reacţia de aglutinare în tuburi pentru
identificarea prezenţei şi titrului Ac anti-Vi (titru mai mare de 1/40).
13. 3. 5. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de genul Shigella
În genul Shigella există 4 subgrupe: A. Shigella dysenteriae (13 serotipuri), B. S. flexneri (6
serotipuri), C. S. boydii (18 serotipuri) şi D. S. sonnei (1 serotip cu 2 faze, R şi S). Sunt bacili
gram negativi, imobili, nesporulaţi, necapsulaţi, aerobi facultativ anaerobi, glucoză pozitivi
(fără producere de gaz), oxidază negativi, lactoză negativi. Subgrupele se pot diferenţia, de
ex. pe baza fermentării manitei (subgrupul A este manită negativ).
Produc infecţii la nivelul tractului intestinal. Dizenteria poate apărea după ingestia a numai
10-100 bacterii. Shigella spp. poate produce şi toxiinfecţii alimentare de tip infecţios.
Diagnosticul de laborator este bacteriologic (direct) şi trebuie pus rapid.
1.    Recoltarea şi transportul p.p. (materii fecale) respectă regulile cunoscute. Macroscopic,
m.f. pot fi în cantitate mică (mucus, puroi, sânge). Transportul trebuie să fie realizat rapid
(recomand însămânţarea la patul bolnavului; altfel, trebuie să folosim mediul de transport, ex.
Cary-Blair). Recoltarea se poate face şi cu ajutorul sondei Nelaton, din colonul sigmoid.
2.    Examinarea microscopică a p.p. este foarte importantă. Poate oferi un răspuns concret,
rapid, util. Examinăm preparatul între lamă şi lamelă, iniţial cu obiectivul 40´. Dacă
evidenţiem numeroase PMN, mecanismul producerii bolii este de tip invaziv, iar dacă
remarcăm un procent de peste 75% PMN, alături de hematii, acest aspect este sugestiv pentru
dizenteria bacteriană. (Figura nr. 15)
3. Cultivăm pe medii slab şi moderat selective. Dacă apar colonii lactoză negative, repicăm pe
medii multitest (TSI, MIU, MILF).
4. Identificarea microorganismului se realizează pe baza mai multor caractere:
·         Caractere morfotinctoriale: sunt bacili Gram-negativi;
·         Caractere de cultură: produc colonii de tip S, lactoză negative, 1- (Figura nr. 16);
·         Caractere biochimice: sunt glucoză pozitivi, fără producere de gaz, lactoză negativi, nu
produc H2S, imobili, urează negativi, indol negativi; (Figura nr. 17)
·         Caractere antigenice: utilizăm seruri imune polivalente anti-subgrup sau seruri imune
specifice de tip (reacţii de aglutinare pe lamă, conform schemelor de lucru);
 ·         Testarea sensibilităţii la bacteriofagi (lizotipia) poate fi utilizată în scop epidemiologic.
5. Antibiograma este recomandată. Se realizează prin metoda difuzimetrică standardizată atât
în special în scopul supravegherii apariţiei unor tulpini rezistente cât şi pentru stabilirea
tratamentului antimicrobian corespunzător.
13. 3. 6. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de genul Yersinia
Genul Yersinia include mai multe specii. Infecţii umane pot produce Yersinia pestis (ciumă),
Y. pseudotuberculosis şi Y. enterocolitica. Sunt bacili sau cocobacili Gram negativi, coloraţi
bipolar. Prezintă pleomorfism. Cresc pe medii simple.
Yersiniozele cu poartă de intrare digestivă pot avea drept agenţi etiologici Y. enterocolitica
sau Y. pseudotuberculosis. Diagnosticul de laborator în yersiniozele cu poartă de intrare
digestivă este bacteriologic, direct. Pentru manifestări extra-digestive se poate face şi
diagnostic serologic.
Diagnosticul bacteriologic
1.    Recoltarea şi transportul p.p. (materii fecale), se face conform regulilor prezentate
anterior. Se poate folosi mediul de transport Cary-Blair.
2.    Examinarea microscopică a p.p. include realizarea unui preparat între lamă şi lamelă. Vom
evidenţia prezenţa celulelor inflamatorii.
3. Cultivăm pe medii selective clasice (MacConkey, ADCL) sau mediul CIN (cefsulodină,
irgasan, novobiocină). Incubăm şi la temperatura camerei (20-30ºC).
4. Identificăm pe baza caracterelor:
·         morfotinctoriale: cocobacili sau bacili Gram-negativi, pleomorfi (Figura nr. 18);
·         de cultură: produc colonii de tip S, 1-1,5 mm (2-3 mm după 48 ore);
·         biochimice: fermentează glucoza fără producere de gaz, nu fermentează lactoza, nu
produc H2S, sunt imobile la 37ºC şi mobile la 22º C, nu produc indol, produc urează;
·         antigenice: utilizăm seruri specifice anti-Yersinia (reacţii de aglutinare pe lamă).
            5. Se recomandă realizarea antibiogramei, prin metoda difuzimetrică standardizată.
Diagnosticul serologic
Diagnosticul serologic poate fi util în determinarea etiologiei artritelor reactive, eritemului
nodos sau în cazul altor manifestări extra-intestinale. Anticorpii apar la circa 4-7 zile de la
debutul bolii, ating valoarea maximă după circa 14 zile şi persistă câteva luni. Se pot practica
diferite tehnici, de ex. reacţia de aglutinare în tuburi.
Un titru mai mare de 1/160 poate avea semnificaţie. Se recomandă testarea în dinamică.
Trebuie să fie luată în considerare posibilitatea apariţia unor reacţii încrucişate, datorită
existenţei unor Ag asemănătoare la microorganisme din genurile Brucella sau Salmonella.

14. Diagnosticul de laborator în infecţii produse de

microorganisme din genurile Vibrio și Pseudomonas.
14. 1. Cuvinte cheie
·         Bacilul piocianic
·         Vibrion holeric
·         Ecthyma gangrenosum
·         Scaune riziforme
·         Oxidază pozitivi
·         Pigmentogeneză
14. 2. Introducere
14. 2. 1. Clasificare
Bacilii Gram negativi studiați în acest capitol sunt incluși în genurile Pseudomonas și Vibrio.
Cea mai importantă specie a genului Pseudomonas este Pseudomonas aeruginosa (bacilul
piocianic, “bacilul puroiului albastru”) una din principalele bacterii oportuniste. Genul Vibrio
face parte din familia Vibrionaceae și cuprinde mai multe specii cu patogenitate variabilă
pentru om.
14. 2. 2. Cale de transmitere
14. 2. 2. 1. Genul Vibrio
Vibrio cholerae se găsește în intestinul și în materiile fecale ale omului bolnav de holeră.
Supraviețuiește timp îndelungat în apele poluate și pe obiectele contaminate. În mediul
extern, prezența vibrionului holeric este explicată prin contaminarea fecală, existând și
posibilitatea unui ciclul de viață extraintestinal. Vibrionii sunt introdusi în organism pe cale
digestivă fie prin alimente, fie pe calea mâinilor murdare.
14. 2. 2. 2. Genul Pseudomonas
Pseudomonas aeruginosa este un bacil comensal al tubului digestiv, foarte răspândit în natură
(agent de putrefacție a materiei organice animale și vegetale). Este o bacterie căreia îi place
apa. A fost izolat din apa de râu, de piscină, termală etc. Este o bacterie rezistentă în mediul
extern, supraviețuind mai multe luni de zile și chiar multiplicându-se în apă la temperatura
mediului ambiant. Contaminează obiectele din grupurile sanitare, produsele alimentare,
chiuvetele. Este din ce în ce mai frecvent izolat din mediul de spital, de pe diferite suprafețe și
dispozitive medicale. Elaborează o piocină (bacteriocina) cu efect inhibitor asupra unor
tulpini din aceiasi specie.

14. 2. 3. Tablou clinic

14. 2. 3. 1. Tabloul clinic în infecțiile produse de Vibrio cholerae
Holera este o toxiinfecție alimentară (TIA) acută, caracteristică omului. Nu este o infecție
invazivă, vibrionii nu difuzează în sânge, ci rămân cantonați la nivelul intestinului. Aderă la
epiteliul celular (adezine/pili), se atașeză de microvilii de la nivelul epiteliului ciliat, apoi
colonizează și invadează mucoasa. La acest nivel se multiplică și eliberează variate substanțe
active biologic, incluzând enzime extracelulare, enterotoxine, citotoxine, hemolizine (este
vorba în special de enterotoxina holerică). După o perioadă de incubație de 1-4 zile, boala
debutează brutal cu grețuri, vărsături, diaree abundentă (10-30 litri/zi) însoțite de crampe
abdominale. Scaunele sunt apoase, riziforme (“apă de orez”), conțin mucus, celule epiteliale
și numeroși vibrioni. Pierderile masive de apă și electroliți prin scaune diareice și prin
vărsături conduc la deshidratarea organismului, acidoză, hemoconcentratie marcată, colaps
circulator și decesul bolnavului. Rata mortalității în lipsa tratamentului adecvat este de
aproximativ 25-50%.
14. 2. 3. 2. Tabloul clinic în infecțiile produse de Pseudomonas aeruginosa
Tulpinile de Pseudomonas aeruginosa sunt patogene prin virulență și toxinogeneză. Este
putin virulent pentru organismul sănătos, dar devine agresiv pentru cei imunodeprimați.
Dintre factorii de virulență ai bacilului piocianic se pot aminti prezența pililor (asigură
adeziunea de substratul specific), producerea unor proteaze (cu efecte histotoxice), a unor
lipaze, sinteza de hemolizine, exotoxine (exotoxina A, de natură proteică, sintetizată în
cantități variabile în funcție de tulpină mult mai toxică decât endotoxina) și a
lipopolizaharidului din peretele bacterian cu rol de endotoxină. Pseudomonas aeruginosa
poate produce infecții foarte variate, de la infecții tegumentare superficiale până la septicemii
fulminante. În urma contaminării cu diferite soluții apoase sau după înot în piscină, la
persoanele cu reactivitate normală, infecțiile sunt de obicei localizate (foliculite, otite, infecții
oculare etc.). Ar putea semnala prezența piocianicului, culoarea albastră verzuie a
pansamentelor, ca urmare a proprietății de pigmentogeneză prin producerea de piocianină
(albastru) și pioverdină (galben verzui fluorescent). Poate cauza o varietate de infecții ale
pielii, atât localizate cât și difuze, poate avea o evoluție gravă, cu apariția de vezicule, care se
sparg, apărând o bază necrotică și poate progresa în profunzime (ecthyma gangrenosum)
(Figura nr. 1). Pseudomonas a fost de asemenea implicat în foliculită și forme greu de
gestionat de acnee vulgară. Poate determina apariția bacteriemiei în principal la pacienții
imunodeprimați. Condiții predispozante includ afecțiuni maligne hematologice,
imunodeficiența în SIDA, neutropenie, diabet zaharat și arsuri severe. Infecțiile respiratorii
cauzate apar aproape exclusiv la persoanele cu un tract respirator inferior și un mecanism de
apărare sistemic compromise. Colonizarea tractului respirator inferior la pacienții cu fibroză
chistică (mucoviscidoză) este dificil de eradicat fiind produsă de un fenotip particular al
speciei de Pseudomonas aeruginosa. În lipsa tratamentului adecvat (dificil datorită rezistenței
la antibiotice), evoluția procesului infecțios poate fi gravă (80% din septicemiile cu piocianic
au evoluție letală).
14. 3. Diagnosticul de laborator în infecţii produse de microorganisme din genurile
Vibrio și Pseudomonas
14. 3. 1. Diagnosticul de laborator în holeră (Vibrio cholerae)
Genul Vibrio include mai multe specii. Cea mai bine cunoscută specie este Vibrio cholerae
(vibrionul holeric), mobil, aerob facultativ anaerob, oxidază pozitiv, rezistent la pH alcalin şi
săruri biliare. Produce toxina holerică şi respectiv holera.
Diagnosticul este bacteriologic, direct. Trebuie realizat cât mai urgent.
14. 3. 1. 1. Recoltarea şi transportul p.p. respectă regulile prezentate anterior (vezi capitolul
4). Recoltăm materii fecale sau/şi lichid de vărsătură. Materiile fecale sunt apoase, riziforme
(ca “apa de orez”), au culoare verzuie, miros fetid, conţin mucus. Cel mai bine însămânţăm
rapid. Dacă nu putem ajunge la laborator 1-3 ore folosim mediul de transport Cary-Blair. Apa
peptonată alcalină (pH 9-9,5) poate fi utilizată ca mediu de transport dar şi ca mediu de
îmbogăţire.
14. 3. 1. 2. Examinăm microscopic p.p., în preparatul între lamă şi lamelă (nu frotiuri) (Figura
nr. 2). Utilizăm obiectivul 40. Nu se evidenţiază PMN. Există vibrioni care prezintă mişcări
active.
14. 3. 1. 3. Cultivăm (direct sau după transport) în apă peptonată alcalină (APA). După 6-8
ore la 35-37º, trecem pe un mediu selectiv, cu săruri biliare (TCBS şi/sau BSA), prelevând de
la suprafaţa mediului lichid (unde ar putea să apară un „văl”). Dacă examinăm microscopic
(între lamă şi lamelă) conţinutul „vălului” am putea grăbi diagnosticul.
14. 3. 1. 4. Identificarea microorganismului se va realiza pe baza caracterelor
·         morfotinctoriale: bacili Gram-negativi; (Figura nr. 3)
·         de cultură: produc colonii de tip S(galbene, mari, 2-4 mm, pe TCBS) sau colonii de tip S
(rotunde, strălucitoare, transparente ca picăturile de rouă, pe BSA);
·         biochimice: V. cholerae este oxidază pozitiv; alte teste biochimice se pot efectua în
laboratorul de referinţă;
·         antigenice: utilizăm ser anti-holeric O:1 (reacţii de aglutinare pe lamă); în centrul de
referinţă se confirmă reacţia pozitivă şi se identifică serotipul (Ogawa, Inaba sau Hikojima);
dacă rezultatele sunt negative se foloseşte şi serul anti-holeric O:139;
·         testarea sensibilităţii la bacteriofagi se poate utiliza în studii epidemiologice sau în scop
de cercetare (în laboratorul de referinţă).
14. 3. 1. 5. Antibiograma se realizează prin metoda difuzimetrică standardizată, pentru
supravegherea apariţiei unor tulpini rezistente la medicamentele antimicrobiene (vezi
capitolul 8).
14. 3. 2. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de genul Pseudomonas
 Genul Pseudomonas include mai multe specii, specia tip fiind reprezentată de Pseudomonas
aeruginosa (bacilul piocianic/“bacilul puroiului albastru”). Sunt bacili Gram-negativi,
aerobi,oxidază pozitivi, nesporulaţi, mobili (unul sau mai mulţi cili polari).
Discutăm diagnosticul de laborator în infecţiile tegumentelor. Este un diagnostic
bacteriologic, direct, etapele fiind similare celor discutate anterior.
14. 3. 2. 1. Recoltarea şi transportul p.p. (puroi) respectă recomandările cunoscute.
Macroscopic, p.p. poate avea un aspect sugestiv (culoare albastră/galben-verzui fluorescentă).
14. 3. 2. 2. Examinăm microscopică după realizarea a cel puţin 2 frotiuri (colorate cu A.M. şi
Gram). Notăm prezenţa celulelor, prezenţa celulelor inflamatorii (ex. PMN) şi a bacililor
gram-negativi, 1-5/0,5-1µm, dispuşi în lanţuri scurte, perechi sau izolaţi. (Figura nr. 4)
14. 3. 2. 3. Cultivăm pe medii de cultură obişnuite, timp de 18-24 ore. Bacilul piocianic se
poate multiplica la temperaturi care variază între 5-42ºC, însă dezvoltarea optimă este la 30-
37ºC. Recomandăm utilizarea unor medii de cultură selective (p.p. contaminat). Formează
coloniide tip S care se pigmentează, însoţindu-se de pigmentarea mediului (ex. albastru sau
galben-verde fluorescent) (Figura nr. 5). Cultura poate avea un miros ca al florilor de tei.
14. 3. 2. 4. Identificăm microorganismului pe baza caracterelor
·         morfotinctoriale: sunt bacili Gram-negativi, dispuşi în lanţuri scurte, perechi, izolaţi,
relativ polimorfi. În culturi mai vechi pot apărea diferite forme (filamentoase, cocoide).
Mobilitatea se poate examina pe preparatul proaspăt, între lamă şi lamelă. (Figura nr. 6) (Film
nr. 1)
·         de cultură: produc colonii de tip S pigmentate (se remarcă şi pigmentarea mediului,
albastru sau galben-verde fluorescent). Cultura poate avea un miros aromat, ca al florilor de
tei. Pe mediile cu sânge produc hemoliză. (Figura nr. 7)
·         biochimice: produce diferiţi pigmenţi (de ex. piocianina/albastră şi pioverdina sau
fluoresceina/galben-verzui fluorescentă); degradează oxidativ glucoza, nu fermentează
lactoza; este oxidază pozitiv. (Figura nr. 8)
14. 3. 2. 5. Antibiograma este obligatorie şi se realizează de obicei prin metode difuzimetrice.
Este bine ca testarea difuzimetrică să se însoțească de determinarea CMI.

15. Diagnosticul de laborator în infecţii produse de bacili

Gram pozitivi.
15. 1. Cuvinte cheie
·         Germen anaerob
·         Exototină
·         Falsă membrană
·         Pustulă malignă
·         Risus sardonicus
·         Toxiinfecție alimentară de tip toxic
15. 2. Introducere
15. 2. 1. Clasificare
Bacilii Gram pozitivi studiați se pot clasifica în bacili nesporulați (ex. Corynebacterium
diphteriae, Listeria spp.) și respectiv  bacili Gram pozitivi sporulați (ex. Bacillus anthracis,
Clostridium spp.). Există și alți bacili Gram-pozitivi.
15. 2. 2. Cale de transmitere
15. 2. 2. 1 Bacili Gram-pozitivi nesporulați
Specia tip a genului Corynebacterium este C. diphteriae, agentul etiologic al diferiei. Genul
cuprinde și alte specii, care în anumite condiții, pot genera infecții umane. Corynebacterium
diphteriae poate fi identificat în leziuni dermice (la nivel tegumentar), precum și în tractul
respirator superior. Transmiterea bacteriei se realizează pe cale respiratorie sau prin contact
direct, cu zonele contaminate.
Listeria monocytogenes este un microorganism patogen, capabil să se multiplice în
macrofage, celule epiteliale, fibroblaste. Sunt bacterii răspândite în natură (la nivelul solului,
plantelor). Pot fi izolate din alimente (ex. brânzeturi) și identificate în lapte și produse lactate,
carne crudă sau insuficient prelucrată. Se transmite omului prin consumul de alimente
contaminate. Listerioza este o zoo-antroponoză. Infecția la om evoluează de multe ori
inaparent și deseori apare în mod accidental.
15. 2. 2. 2 Bacili Gram-pozitivi sporulați
Bacillus anthracis este un germen ubicuitar, sporii îi conferă rezistență. Este agentul etiologic
al unei zoo-antroponoze care afectează ierbivorele. Se găsește în țesuturile și umorile
animalelor bolnave. Este eliminat prin dejecții și contaminează mediul extern. Germenul
sporulează pe sol și supraviețuiește zeci de ani.
Clostridium tetani, germen anaerob, specie patogenă prin toxinele neurotrope elaborate,
produce tetanosul. Sporii pătrund în organism prin intermediul unor plăgi “tetanigene”
(asigură condiții de anaerobioză necesare multiplicării germenului).
Clostridium botulinium nu se multiplică în organism ci în alimente unde produce o exotoxină.
Infecția (botulismul) apare prin ingestia de alimente care conțin toxina botulinică preformată.
Există și unele excepții.
Clostridiile gangrenei gazoase cresc pe medii simple, în condiții de strictă anaerobioză. Sunt
ubicuitare, prezente în mod normal în tractul digestiv al omului sau al animalelor ca forme
vegetative. Eliminate pe sol prin dejecte, sporulează. Sursa principală pentru contaminare este
reprezentată de sol.

15. 2. 3. Tablou clinic

15. 2. 3. 1 Tabloul clinic în difterie
Frecvent infecția este localizată la poarta de intrare (în general la nivelul amigdalelor)
determinând o angină. La nivelul tractului respirator (laringe, faringe, nas) se produce o
laringită cu obstrucția căilor respiratorii. Nu are capacitate invazivă, se multiplică la poarta de
intrare; determină un proces inflamator cu necroză și exsudat. Toxina elaborată local induce și
apariția unei structuri compusă din fibrină, leucocite, eritrocite, celule epiteliale respiratorii
distruse și bacterii, denumită “falsa membrană” (Figura nr. 1), foarte aderentă de țesutul
subiacent; smulgerea ei determină sângerare. Din cauza prezenței acestor membrane la nivelul
căilor respiratorii, există pericol de asfixie. La distanță, toxina circulă prin sânge și se fixează
pe miocard, suprarenale, sistem nervos sau la nivel renal. Cu cât diagnosticul este mai tardiv,
cu atât rata mortalitații prin difterie crește.
15. 2. 3. 2 Tabloul clinic în infecțiile produse de Listeria spp.
Listerioza este o zoo-antroponoză. Infecția umană apare accidental și evoluează inaparent, în
foarte multe cazuri. În mod normal, sistemul imunitar elimină infecția. Dacă sistemul imun
este deficitar sau compromis, manifestările sistemice ale infecției se pot dezvolta. La nou-
născut contaminarea se produce transplacentar. După naștere, în primele ore, poate exista
septicemie cu multiple localizări secundare și afectare neuro-meningeană. La gravidă, infecția
este frecvent inaparentă cu manifestări nespecifice, de tip ”gripal”, febră, simptomatologie în
sfera urinară, digestivă. La adult, listerioza se poate manifesta ca meningoencefalită. Calea
gastrointestinală este considerată cea mai importantă cale de pătrundere asociată consumului
de alimente contaminate (ex. brânză din lapte nepasteurizat).
15. 2. 3. 3 Tabloul clinic în infecțiile produse de Bacillul anthracis
Simptomatologia depinde de localizarea infecției și poate exista o perioadă de 1 zi sau mai
mult de 2 luni până la apariția manifestărilor. La om în funcție de localizarea manifestărilor
clinice putem vorbi despre:
a. Antraxul cutanat,cunoscută sub numele de “pustulă malignă”, apare după contactul direct
cu solul contaminat cu spori (cel mai frecvent). La locul pătrunderii sporilor (ex.
leziune/traumatism), dupa o perioada de 4-5 zile, apare o papulă, care ulterior se transformă în
veziculă. Dupa ce vezicula se sparge, la baza ei se observă o crustă de culoare neagră,
inconjurată de o zonă de edem (Figura nr. 2). Netratată, infecția poate disemina, ducând la
generalizarea procesului infecțios (septicemie).
b. Antraxul pulmonar, apare ca urmare a inhalării sporilor; aceștia se cantonează la nivelul
alveolelor pulmonare, se transformă în bacili care eliberează exotoxina. Inițial simptomele
sunt ușoare și nespecifice, similare unei afecțiuni respiratorii virale. Ulterior, după 1-3 zile,
apar semne de insuficiență respiratorie acută (febră, dispnee, hipoxie, hipotensiune).
Pneumopatia acută are adesea o evoluție gravă.
c. Antraxul gastrointestinal apare prin ingerarea cărnii provenită de la un animal infectat.
Manifestările clinice includ febră, greață, vărsaturi, dureri abdominale, diaree sanguinolentă,
deshidratare. Este rară la om, dar insoțită de o mortalitate mare.
15. 2. 3. 4 Tabloul clinic în infecțiile produse de genul Clostridium
Tetanosul este produs de Clostridium tetani patogen prin multiplicare la poarta de intrare
și toxinogeneză. Elaborează o exotoxină neurotropă ce ajunge în sistemul nervos pe calea
nervilor periferici și secundar pe cale sanguină sau limfatică. Acționează la nivelul centrilor
motori blocând eliberarea mediatorilor de glicină și  acid gamma amino butiric (care au rol
inhibitor). Apare paralizia spastică (spasme severe, dureroase, ale musculaturii striate, inițial
în zona contaminată). Contractura musculaturii feței are un aspect caracteristic “risus
sardonicus” (fruntea încrețită, pleoapele închise pe jumătate, colțurile gurii trase în jos) și a
mușchilor masticatori manifestată prin trismus (gura nu se mai deschide) (Figura nr. 3). Pe
fondul contracturii tonice, orice stimul extern determină apariția de crize de contracturi
musculare paroxistice foarte dureroase. Starea de conștiență este păstrată. Moartea se produce
prin asfixie ca urmare a spasmului mușchilor respiratori.
Botulismul apare prin ingestia de alimente care conțin toxina (toxiinfecție alimentară de tip
toxic / toxină preformată în aliment). Toxina botulinică este substanța biologică cea mai
toxică cunoscută. Doza letală pentru om este de circa 1-2 µg. După ingestie, se resoarbe la
nivel intestinal și ajunge în circulație. Acționează la nivelul joncțiunii neuromusculare
blocând eliberarea de acetilcolină. Apare paralizia flască, cu o evoluție descendentă. Începe la
extremitatea cefalică, afectând mușchii globilor oculari, cu diplopie, hipersecreție lacrimală și
ajunge pană la paralizia musculaturii respiratorii. Decesul survine prin asfixie. În primele 6
luni de viață poate apărea botulismul infantil, ca o consecință a formării toxinei botulinice
prin germinarea la nivel intestinal a sporilor ingerați (ex prin consum de miere). La persoanele
care folosesc droguri injectate intravenos sau prezintă leziuni contaminate cu pământ, poate
apărea botulismul plăgilor.
Gangrena gazoasă este produsă de două sau mai multe dintre următoarele specii: C.
perfringens, C. novyi, C. septicum, C. histolyticum, C. sporogenes etc. Poarta de intrare pentru
spor este tegumentul contaminat (leziuni/traume). Anaerobioza determină germinarea
sporilor, formele vegetative se multiplică, fermentează zaharuri și se formează gaz. Leziunea
este însoțită de un edem dur, crepitant (datorită prezenței de gaz) și necroza țesuturilor.
Diseminarea infecției este favorizată de distensia tisulară cu obstrucția mecanică a structurilor
vasculare în conjuncție cu sinteza de toxine. Evoluția în 20-80 % din cazuri este fatală.
15. 3. Diagnosticul de laborator în infecţii produse de bacili Gram pozitivi
15.3.1. Diagnosticul de laborator în difterie
 Genul Corynebacterium include mai multe specii. Grupul Corynebacterium diphtheriae
cuprinde speciile C. diphtheriae, C. pseudotuberculosis şi C. ulcerans. Tulpinile lizogene
(infectate cu bacteriofagi tox+) sintetizează toxina difterică; aceasta are efecte importante la
nivel cardiac (miocardită), nervos (demielinizare), renal (necroză tubulară), suprarenalian,
muscular şi hepatic.
Diagnosticul de laborator în difterie este bacteriologic (direct) şi trebuie realizat urgent;
fixarea toxinei pe celule țintă este ireversibilă, astfel încât decizia trebuie luată foarte rapid
(acesta este și motivul pentru care cel mai bine este ca vaccinarea să se realizeze
corespunzător și să existe prevenirea infecției).
Se porneşte de la un diagnostic de suspiciune (clinic) şi se realizează diagnosticul de
laborator. Examinarea frotiurilor din p.p. în contextul clinic poate conduce la recomandarea
de instituire a tratamentului (administrare de Ac antitoxină), imediat, fără a aștepta finalizarea
diagnosticului bacteriologic.
            1. Recoltarea şi transportul p.p. respectă recomandările obişnuite (vezi cap. 4), dar
există și anumite lucruri de atenție. Trebuie să recoltăm secreţii de la nivelul faringelui şi
secreţii nazale. Dacă există o „falsă membrană” se recomandă detaşarea cu grijă a acesteia şi
recoltarea secreţiei. Se vor utiliza cel puțin 4 tampoane, 3 pentru recoltarea secreţiilor
faringiene şi al 4-lea pentru recoltarea secreţiilor nazale. Un tampon va fi utilizat pentru
realizarea frotiurilor, al doilea se va utiliza pentru cultivare pe diferite medii de cultură solide,
selective şi neselective (ex. geloză sânge, Loeffler şi medii cu telurit de potasiu). Al treilea şi
al patrulea tampon sunt introduse într-un mediu de îmbogăţire (OST, ou-ser-telurit). (Figura
nr. 4)
2. Examenul microscopic este foarte important. Atunci când contextul clinic este sugestiv, în
baza acestui examen se poate începe tratamentul (leucocite, bacili Gram-pozitivi, cu capetele
mai umflate, aşezaţi în V, L) (Figura nr. 5).
3. Cultivarea a avut loc și continuăm diagnosticul, chiar dacă tratamentul a fost început.
Trebuie să obţinem colonii izolate, respectiv o cultură pură, să le identificăm şi să punem în
evidenţă capacitatea toxigenă. Coloniile caracteristice apar la 24-28 h pe mediul cu telurit de
potasiu (colonii de tip R pentru biotipul gravis).
4. Identificarea microorganismului se realizează pe baza mai multor caractere:
·         Caractere morfotinctoriale:bacili Gram-pozitivi, polimorfi, cu capete umflate, aşezaţi în
V, L sau sub formă de „litere chinezeşti”;
·         Caractere de cultură: produc colonii de tip Ssau R, în funcţie de biotip (R pentru gravis);
pe mediul Loeffler (electiv) coloniile apar în 18 ore (albe, lucioase, bombate, semicremoase);
·         Caractere biochimice: diferenţierea biotipurilor se realizează prin testul catalazei (pozitiv),
ureazei (negativ), reducerea nitraţilor şi fermentarea unor zaharuri;
·         Caractere antigenice: utilizăm ser cu Ac anti-toxină difterică pentru identificarea
producerii toxinei (testul ELEK); (Figura nr. 6)
·         Caractere de patogenitate: testarea producerii de toxină pe celule Vero sau prin alte
metode (ex. PCR pentru subunităţi ale genei tox+ etc.).
5. Antibiograma se poate realiza prin metoda difuzimetrică standardizată (vezi cap. 8), în
special în scopul supravegherii apariţiei unor tulpini rezistente la medicamentele
antimicrobiene sau în scop de cercetare. De regulă, tulpinile de C. diphtheriae sunt sensibile
la penicilină sau eritromicină.
15. 3. 2. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Listeria spp.
Genul cuprinde mai multe specii dintre care cea mai importantă specie este Listeria
monocytogenes (poate produce infecţii variate animale și umane). Sunt bacili fini, Gram
pozitivi (Figura nr. 7), aerobi facultativ anaerobi, mobili la 25ºC; se dezvoltă mai bine la 20-
30ºC sau chiar la temperatura frigiderului („îmbogăţire la rece”).
Diagnosticul de laborator în infecţiile cu L. monocytogenes este bacteriologic, direct.
1. Recoltarea şi transportul p.p. (sânge, lichid amniotic, placentă, ţesut fetal etc.) se face
conform regulilor discutate anterior (vezi capitolul 4).
2. Examinarea microscopică a p.p. permite evidenţierea unor bacili sau cocobacili Gram
pozitivi, dispuşi izolat, în perechi sau în lanţuri scurte, intra sau extracelular.
3. Cultivarea se face pe medii complexe. L. monocytogenes se poate multiplică la temperaturi
ce variază între 2-45°C (cel mai bine la 20-30°C). Sunt necesare medii selective atunci când
p.p. este potenţial contaminat.
4. Identificăm microorganismul pe baza caracterelor:
·         morfotinctoriale: bacili fini Gram-pozitivi, dispuşi separat sau grupaţi în palisade, în
perechi sau “în formă de litere” (asemănător corynebacteriilor);
·         de cultură: formează colonii de tip S, cu aspect de picături de rouă; pe agar-sânge,
coloniile sunt înconjurate de b-hemoliză; (Figura nr. 8)
·         biochimice: produce b-hemoliză; fermentează diferiţi carbohidraţi;
·         antigenice: folosim seruri cu Ac cunoscuţi pentru identificarea tulpinilor de Listeria
monocytogenes; serotiparea este utilă în scop epidemiologic.
5. Antibiograma poate fi necesară şi se realizează de obicei prin metode difuzimetrice. În
cazul infecţiilor grave se vor determina CMI şi CMB (vezi cap. 8).
15. 3. 3. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Bacillus anthracis
Din genul Bacillus mai frecvent implicate în patologia umană sunt B. anthracis, B. cereus şi
B. subtilis. B. anthracis se prezintă sub formă de bacili Gram pozitivi, de dimensiuni mari,
imobili, sporulaţi, cu sau fără capsulă, aerobi facultativ anaerobi.
15. 3. 3. 1. Diagnosticul de antrax porneşte de la datele clinice şi epidemiologice.
Diagnosticul de laborator este bacteriologic, direct şi trebuie realizat cât mai rapid.
1. Produsul patologic recoltat şi transportat este reprezentat cel mai frecvent de secreţii de la
nivelul leziunilor cutanate (în funcţie de forma clinică - cutanată/viscerală).  Dacă transportul
va dura peste o oră, asigurăm temperatura de transport (2-8ºC). Trebuie luate măsuri de
biosecuritate !
2. Examinăm microscopic frotiurile din p.p. (colorăm 2 frotiuri şi unul îl reţinem, ca rezervă)
şi putem remarca structuri de ţesut, PMN (relativ rare) şi bacili Gram pozitivi, cu capetele
„tăiate drept”, de dimensiuni mari (1,5mm/10mm), capsulaţi, dispuşi izolat, în perechi sau
lanţuri scurte, incluşi într-o capsulă comună. (Figura nr. 9)
3. Cultivăm pe geloză nutritivă sau geloză sânge, în condiţii de aerobioză, la de 37ºC (se poate
multiplica şi la 15-42ºC). Pot fi necesare medii selective.
4. Identificăm microorganismului pe baza mai multor caractere:
·         Caractere morfotinctoriale: bacili Gram-pozitivicu dimensiuni mari, dispuşi în lanţuri;
poate începe procesul de sporogeneză (spor oval, situat central, mai mic decât bacilul);
·         Caractere de cultură: produc colonii de tip R, mari, de 2-5 mm (marginile neregulate, cu
prelungiri laterale au dus la asemănarea cu „capul de meduză” sau „coama de leu”); (Figura
nr. 10)
·         Caractere biochimice: Bacillus anthracis este catalază pozitiv, produce lecitinază şi este
sensibil la penicilină;
·         Caractere de patogenitate: testarea patogenităţii la şoarecele alb.
5. Antibiograma nu este necesară. Bacillus anthracis este sensibil la penicilină, eritromicină,
tetraciclină, cloramfenicol, ciprofloxacină etc (atenție în atac bioterorist).
15. 3. 3. 2. Diagnosticul imunobiologic (IDR cu antraxină)
Este importantă punerea diagnosticului de antrax la animale (în special ierbivore).
15. 3. 4. Diagnosticul de laborator în infecţii produse de genul Clostridium
Genul Clostridium include mai multe specii care se găsesc în intestinul animalelor; se elimină
în mediul extern şi sporulează. Sunt bacili Gram pozitivi, de dimensiuni mari, aşezaţi în
perechi sau lanţuri, mobili cu cili peritrichi (C. perfringens este capsulat). (Figurile nr. 11 și
12)
Diagnosticul de laborator al infecţiilor cu germeni anaerobi este destul de dificil, este
costisitor şi sunt necesare atât dotări speciale cât şi un personal medical experimentat. Ca o
particularizare a acestui diagnostic, în legătură cu infecţiile clostridiente, prezentăm
succesiunea etapelor.
1. Prima etapă este esenţială. Dacă nu sunt menţinute condiţiile de anaerobioză, nu avem
cum să realizăm diagnosticul de laborator.
2. Produsul patologic poate să aibă un miros putrid. Constatăm prezenţa unor fragmente de
ţesut necrotic, a unor secreţii de culoare închisă, existenţa de sânge şi puroi în plagă etc.
Examenul microscopic are rol orientativ (cu toate acestea, este un examen care poate fi
realizat în orice laborator; multe dintre laboratoare nu pot face decât acest examen). C. tetani
are 0,5-2mm/2-18mm (dacă sporulează, sporul este rotund, localizat terminal), C. botulinum
are 0,5-1,5mm/3-20mm (dacă sporulează, sporul este oval, localizat central sau subterminal)
în timp ce C. perfringens are 0,5-1,5mm/1,5-19mm (dacă sporulează, sporul este oval,
localizat subterminal). Examenul microscopic poate servi la alegerea terapiei antimicrobiene.
3. Pentru cultivarea p.p. pregătim minim 3 medii de cultură (bulion VF, geloză-sânge plus
neomicină incubat în anaerobioză şi geloză-sânge incubat în aerobioză). Incubarea în condiţii
de anaerobioză durează 24-48 de ore la 35-37ºC. Pentru că am incubat în aerobioză şi
anaerobioză, putem evalua în funcţie de apariţia coloniilor dacă sunt germeni aerobi sau
anaerobi.
4. Identificarea se realizează pe baza caracterelor:
·         morfotinctoriale:baciliGram-pozitivi;am putea observa fenomenul de sporogeneză;
·         de cultură: speciile mobile (majoritatea) formează colonii de tip S, cu margini ondulate şi
tendinţă de invadare a mediului; dacă a avut loc inocularea şi în profunzimea mediului,
coloniile au aspect pufos; Clostridium perfringens (imobil) formează colonii de dimensiuni
mari, de tip S, rotunde, cu margini regulate, convexe (pot avea şi aspect R);
·         biochimice: testăm producerea de lecitinază; (Figura nr. 13) pentru tulpinile lecitinază-
pozitive se pot verifica mobilitatea, fermentarea lactozei, producerea de lipază, urează,
hidroliza gelatinei, digestia cărnii etc.; clostridiile sunt sensibilie la vancomicină şi rezistente
la colistin;
·         antigenice:
·         demonstrarea prezenţei tetanospasminei prin seroneutralizare la şoareci,
·         testarea prezenţei anti-toxinei tetanice (titrul protectiv ³0,01UAI/ml),
·         demonstrarea prezenţei toxinei botulinice în alimente, materii fecale, ser sau în medii de
cultură [prelevăm cultură din bulion VF, centrifugăm şi supernatantul îl împărţim în 2 tuburi;
un tub îl încălzim la 100ºC; răcim; inoculăm intraperitoneal la două loturi de şoareci; dacă
şoarecii injectaţi cu p.p. inactivat termic mor, nu este vorba de toxina botulinică (pentru că
toxina botulinică este termosensibilă); prezenţa toxinei botulinice poate fi confirmată prin
seroneutralizare (protejăm un şoarece cu anti-toxină de tip A şi un alt şoarece cu anti-toxină
de tip B, apoi îi injectăm cu p.p.; dacă animalul seroprotejat cu anti-toxina de tip A
supravieţuieşte iar celălalt animal moare cu semne caracteristice pentru botulism, în mediul de
cultură a existat C. botulinum de tip A).
5. Antibiograma nu se recomandă, în infecţiile cu bacili Gram-pozitivi sporulaţi (lucrurile
diferă în cazul germenilor anaerobi Gram-negativi). Clostridiile sunt sensibile la penicilină,
cefalosporine, vancomicină, tetracicline, metronidazol etc, însă tratamentul este mai complex.
 16. Diagnosticul de laborator în infecţii produse de
Mycobacterium tuberculosis.
16. 1. Cuvinte cheie
•     BAAR
•     Ziehl Neelsen
•     Löwenstein Jensen
•     Ritm lent de multiplicare
•     TB activă/ TB latentă
•     IDR cu PPD
16. 2. Introducere
16. 2. 1. Clasificare
Genul MYCOBACTERIUM include peste 140 de specii şi subspecii diferite. Cei mai
cunoscuți reprezentanţi sunt M. tuberculosis şi M. leprae. În afara acestor specii definite
înainte de 1900 există numeroase specii de mycobacterii netuberculoase (considerate iniţial
drept saprofite). De fapt sunt microorganisme condiţionat patogene; în condiția în care apar
deficienţe ale sistemului imun pot fi implicate în patologia umană.
16. 2. 2. Calea de transmitere
Principala sursă de infecţie este reprezentată de pacienţii cu tuberculoză (TB) pulmonară.
Nucleii de picătură expectoraţi sunt particule de 1-3 µm, care poartă bacili acid-alcool
rezistenţi (BAAR). Fiind de dimensiuni foarte mici pot traversa barierele de apărare ale
organismului şi pot ajunge la nivel alveolar. Intraalveolar bacilii sunt fagocitaţi de macrofage
şi celule dendritice, dar unii dintre ei supravieţuiesc şi se multiplică la acest nivel. Înaintea
dezvoltării imunităţii specifice, mycobacteriile pot disemina la nivelul ganglionilor limfatici şi
pot ajunge în majoritatea organelor. De obicei nu are loc o multiplicare necontrolată la niveul
ficatului, splinei sau măduvei hematogene. Cei mai mulţi dintre indivizi dezvoltă un răspuns
imun celular eficient care împiedică multiplicarea suplimentară a bacililor şi leziunile se
vindecă. Deşi o treime din populaţie este infectată cu M. tuberculosis (TB latentă) doar 10%
dezvoltă boala. În 5% din cazuri TB activă apare în primul an de la infecţie şi în 5% la un
moment dat în cursul vieţii. Un rol important îl deţine imunitatea gazdei. Pacienţii cu TB
latentă nu reprezintă o sursă de infecţie.
16. 2. 3. Tablou clinic
Cea mai frecventă formă de TB este cea pulmonară, dar majoritatea organelor pot fi afectate.
Manifestările clinice sunt nespecifice, depind de gazdă, de microorganism şi interacţiunea
dintre acestea. Debutul bolii adeseori este insidios. Se caracterizează prin tuse, dispnee,
subfebră, scădere ponderală şi transpiraţii nocturne. Cel mai frevent tusea este productivă,
uneori poate fi însoţită de hemoptizie. Pacienţii cu TB latentă sunt asimptomatici.
16. 3. Diagnosticul de laborator
16. 3. 1. Principii generale
Discutăm aspectele legate de diagnosticul de laborator (microbiologic) în infecţiile produse de
M. tuberculosis, varianta hominis. Tuberculoza (TB) poate avea diferite localizări. Cea mai
frecventă formă este TB pulmonară. Epidemiologic, pacienţii cu TB pulmonară (elimină prin
spută BAAR) reprezintă principala sursă de infecţie. Diagnosticul, tratamentul corect şi
complet al acestor pacienţi este esenţial.
Diagnosticul poate fi sugerat clinic, paraclinic (ex. radiologic), de alte elemente de laborator,
dar trebuie confirmat prin izolarea şi identificarea M. tuberculosis. O primă etapă în
diagnostic este examinarea frotiului din p.p. (cel mai adesea spută) folosind coloraţia Ziehl
Neelsen. Trebuie avut în vedere că M. tuberculosis este un microorganism, care se dezvoltă
lent pe medii complexe. Actual prin utilizarea metodelor de cultură rapide şi a tehnicilor
moleculare diagnosticul este realizat într-un timp mult mai scurt.
16. 3. 2. Diagnosticul bacteriologic
Diagnosticul de laborator este bacteriologic, direct. Datele obţinute în cadrul diagnosticului
imunobiologic şi serologic pot completa informaţiile şi pot fi utile.
16. 3. 2. 1. Recoltarea şi transportul produsului patologic
Recoltarea şi transportul p.p. se realizează respectând o serie de reguli, discutate anterior cu
mare atenţie şi respectând toate normele privind protecţia personalului medical (vezi
capitolul 4). Principalul p.p. este sputa; se pot recolta şi lichid de spălătură bronşică, LCR,
urină, lichide recoltate prin puncţie articulară, probe obţinute prin biopsie, puroi etc. Sputa
trebuie decontaminată (de ex. prin tratare cu NaOH 4%) şi neutralizată (cu acid) în vederea
realizării etapelor 2 şi 3. Este important ca pacientul să fie instruit de personalul medical
pentru ca p.p. să fie recoltat într-un mod corespunzător.
16. 3. 2. 2. Examinarea microscopică
Examinarea microscopică a p.p. include minim 3 frotiuri (colorate A.M., Gram şi Ziehl
Neelsen). Examinăm şi notăm prezenţa celulelor de la nivelul tractului respirator inferior (ex.
macrofage alveolare), prezenţa celulelor inflamatorii (PMN) şi prezenţa BAAR. În coloraţia
Ziehl Neelsen mycobacteriile tuberculoase apar ca bacili subţiri, drepţi, de 0,4/3µm, roşii pe
fond albastru (celelalte structuri au culoare albastră) (Figura nr. 1). O altă modalitate de
examinare a frotiului este utilizând coloraţia fluorescentă (IF). În acest caz se observă bacilii
de culoare galben fluorescent pe un fond galben pal (dacă se foloseşte permanganat de
potasiu) (Figura nr. 2).
Rezultatele examenului microscopic (IF/Z-N) trebuie să fie cuantificate prin numărul de
BAAR în raport cu numărul de câmpuri examinate (10-30 câmpuri în cazul IF, 100-300 în
cazul Z-N). De ex. înregistrarea a 1-9 BAAR/10 câmpuri (în IF) sau 1-9 BAAR/100 de
câmpuri (Z-N) ne permite să notăm în buletinul de analiză 1+ (maxim sunt 4+, la peste 9
BAAR/1 câmp/Z-N). Acest mod de notare permite să comparăm rezultatele între laboratoare
diferite sau rezultatele unui bolnav în cursul tratamentului. Examenul microscopic negativ nu
exclude diagnosticul de TB.
16. 3. 2. 3. Cultivarea
Cultivarea se poate face pe diferite medii de cultură (lichide, semisolide şi solide, pe bază de
ou, de ex. mediul Löwenstein-Jensen sau agar, tip Middlebrook ). La compoziţia mediului L-
J se adaugă verde malachit (inhibă multiplicarea unor microorganisme). Pentru izolare este
necesară o atmosferă de 8-10% CO2. Incubarea se face la 35-. Este foarte important să
examinăm mediile în fiecare zi (în prima săptămână după inoculare), ulterior săptămânal până
la împlinirea a 6-12 săptămâni (M. tuberculosis are o rată de diviziune de 12-27 ore). Există şi
metode de cultură „rapide”. Cu ajutorul unor astfel de sisteme se poate detecta creşterea M.
tuberculosis mult mai rapid decât pe mediile tradiţionale (în 4-25 zile).
16. 3. 2. 4. Identificarea
Identificarea microorganismului se realizează pe baza caracterelor:
·         morfotinctoriale: BAAR (Figura nr. 3);
·         de cultură: M. tuberculosis şi M. bovis-BCG formează colonii de tip R, rugoase,
grunjoase, nepigmentate (Figura nr. 4);
·         biochimice: testul producerii de niacină, testul reducerii nitraţilor şi testul catalazei la şi
după încălzire la ;
·         antigenice (se pot examina în centre de referinţă);
·         de patogenitate: M. tuberculosis este patogen pentru cobai;
·         alte teste:
o   teste care au la bază analiza caracterelor fenotipice moleculare, de ex. studiul cromatografic
al acizilor graşi din peretele celular, sau genotipice (PCR, sonde nucleotidice);
o   tehnicile de amplificare a acizilor nucleici au ca principiu amplificarea unor regiuni
specifice; se poate folosi atât cultura cât şi produsul patologic;
 o   detectarea antigenelor mycobacteriene în urină. Se poate detecta în urină
lipoarabinomananul (LAM) prin tehnica ELISA. Metoda s-a dovedit a fi utilă mai ales la
pacienţii coinfectaţi HIV-TB;
o   teste ce utilizează anumiţi mycobacteriofagi.
16. 3. 2. 5. Testarea sensibilității la antibiotice și chimioterapice
Testarea sensibilității la medicamentele anti-TB este necesară; se realizează conform
recomandărilor Programului Naţional de Prevenire, Supraveghere și Control a TB. Se pot
utiliza metoda proporţiilor, metoda rapoartelor de rezistenţă etc. S-au dezvoltat tehnici
moleculare prin care sunt identificate mutațiile specifice responsabile de apariția rezistenței
(ex. Genotype MTBDRplus, Xpert MTB/RIF, etc). Alte tehnici au ca principiu metode
colorimetrice, folosirea mycobacteriofagilor.
16. 3. 3. Diagnosticul imunobiologic
Diagnosticul imunobiologic presupune evaluarea răspunsului imun de tip celular. Se
utilizează IDR cu PPD. În anumite situaţii se poate utiliza IGRA (IFN γ Release Assay) (vezi
capitolul 11). Nici IDR cu PPD, nici IGRA nu deosebesc TB latentă de TB activă.
16. 3. 4. Diagnosticul serologic
Diagnosticul serologic are la bază detectarea răspunsul imun de tip umoral exprimat prin
prezenţa de Ac anti-mycobacterieni ce pot fi evidenţiaţi prin tehnica ELISA. Testele nu sunt
standardizate şi nu au intrat în practica de rutină. De reţinut: în diagnosticul TB nici un
element nu este lipsit de importanţă într-un context clinic, paraclinic şi epidemiologic.

17. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de

microorganisme din genul Treponema.

17. 1. Cuvinte cheie

·           Spirochetă
·           Infecție transmisă pe cale sexuală
·           Șancru dur
·           Microscopie pe fond întunecat
·           Teste treponemice și nontreponemice
·           Bordet-Wasserman
·           VDRL
·           TPHA

17. 2. Introducere
17. 2. 1. Clasificare
Bacteriile spiralate studiate fac parte din ordinul Spirochaetales, subîmpărțit în familia
Spirochaetaceae (genurile Treponema și Borrelia) și familia Leptospiraceae (genul
Leptospira). Specia Treponema pallidum, cu alte patru subspecii care pot produce infecții la
om, este clasificată în cadrul genului Treponema.
17. 2. 2. Cale de transmitere
Infecția cu Treponema pallidum subspecia pallidum determină afecțiunea denumită sifilis
(lues); este transmisă în aproximativ 90% din cazuri pe cale sexuală. Din acest motiv, atunci
când consultăm un pacient suferind de sifilis, este esențial să efectuăm o anamneză detaliată
cu privire la contactele sexuale neprotejate, în vederea depistării partenerilor potențial
infectați. Nu arareori, la aceste persoane sunt decelate simultan multiple infecții transmise pe
cale sexual (ITS), un caz aparte fiind acela al asocierii infecției HIV, care prin imunosupresie
poate determina o evoluție nefavorabilă a luesului.
Sifilisul dobândit poate evolua în mai multe stadii clinico-biologice: primar, secundar, latent
și terțiar, cu afectarea mucoaselor, a țesutului cutanat, iar în formele mai severe cu afectarea
organelor interne, a sistemului osteoarticular, nervos, cardiac.
Atunci când o femeie însărcinată suferă de lues, bacteria poate să depășească bariera
placentară determinând avort spontan sau sifilis congenital, cu posibilitatea unor malformații
fetale invalidante.
17. 2. 3. Tablou clinic
După aproximativ 3 săptămâni de la contactul sexual infectant (uneori fiind posibilă totuși o
perioadă de latență prelungită, de până la 10 săptămâni), la locul inoculării se formează
şancrul dur, o ulcerație cu centrul și marginile de consistență fermă, ce exsudează un lichid
clar, foarte bogat în treponeme (Figura nr. 1). Această leziune este însoțită de adenopatie
regională. N.B.: orice ulcerație a mucoaselor bucală, faringiană, genitală sau anorectală obligă
la testarea serologică pentru sifilis.
După alte 6 săptămâni apar leziunile secundare sub forma unei erupții maculopapulare
roșiatice, localizate la orice nivel (Figura nr. 2), dar şi condiloame mai frecvent în regiunea
anogenitală (Figura nr. 3). În stadiile primar și secundar leziunile sunt foarte contagioase,
fiind bogate în spirochete.
În sifilisul terțiar (nu foarte des întâlnit în practica actuală datorită tratamentului curativ larg
răspândit cu penicilină - terapie de elecție), pacientul poate să dezvolte complicații
neurologice, cardio-vasculare, osteo-articulare etc.
N.B.: sifilisul este considerat “marele imitator”, tabloul clinic putând fi adeseori atipic, similar
diferitor afecțiuni dermatologice.

17. 3. Diagnosticul de laborator

17. 3. 1. Principii generale
Diagnosticul infecției cu T. pallidum pornește de la elemente clinice și epidemiologice.
Confirmarea prin metode de laborator este obligatorie (cu atât mai mult cu cât manifestările
cutanate sau mucoase pot fi înșelătoare).
Diagnosticul de certitudine se stabilește prin vizualizarea spirochetelor în secrețiile prelevate,
prin microscopia în câmp întunecat sau prin imunofluorescență directă. Totuși, aceste tehnici
sunt laborioase și necesită un examinator experimentat, motive pentru care nu sunt utilizate de
rutină în practica medicală. De ce nu folosim microscopia clasică? Datorită dimensiunii
reduse a bacteriilor, care nu permite vizualizarea acestora. Treponema pallidum nu poate fi
cultivată pe medii artificiale, diagnosticul bacteriologic cuprinzând doar 2 etape: recoltarea și
transportul produsului patologic și examinarea microscopică.
Diagnosticul serologic al probelor sanguine este cel mai frecvent utilizat pentru a confirma
suspiciunea clinică, existând două tipuri de teste disponibile: nontreponemice (VDRL, RPR
etc.) și treponemice (TPHA, FTA-abs etc.).
17. 3. 2. Diagnosticul bacteriologic
Acesta poate fi realizat atât în sifilisul primar, cât şi în sifilisul secundar.
17. 3. 2. 1. Recoltarea si transportul produsului patologic
Recoltarea și transportul probelor prelevate trebuie să respecte regulile cunoscute (vezi
capitolul 3), dar există şi aspecte particulare infecției sifilitice. Cel mai adesea produsul
patologic este reprezentat de exsudatul clar de la nivelul leziunilor primare, dar poate fi
prelevat și de la nivelul leziunilor secundare ori din ganglionii limfatici regionali. După
îndepărtarea crustelor superficiale, care nu conțin microorganisme viabile, se recoltează cu
grijă, fără să provocăm sângerare locală. Preparatele nu trebuie să conţină hematii, leucocite,
fragmente de țesut sau bule de aer. Ulterior, preparatele microscopice între lamă şi lamelă
sunt examinate rapid, în maxim 20 de minute de la recoltare.
17. 3. 2. 2. Examinarea microscopică
17. 3. 2. 2. 1. Examenul microscopic pe fond întunecat
Pentru fiecare leziune se pregătesc cel puțin două preparate lamă/lamelă. Preparatele nu
trebuie să se usuce. În acest scop, pentru menținerea într-o atmosferă umedă, le vom pune
într-o cutie Petri în care punem și puțină vată îmbibată cu apă distilată. Preparatele nu pot fi
examinate în vederea detectării treponemelor cu ajutorul microscopului optic, cu imersie.
Vom utiliza microscopul pe fond întunecat, vom examina insistent, cel puțin 10 minute în
cazul unui rezultat aparent negativ (Figura nr. 4).
Experiența examinatorului își spune cuvântul, fiindu-i dificil unui medic neantrenat să
diferențieze pe baza caracterelor microscopice treponemele patogene de acelea nonpatogene.
Pledează în favoarea diagnosticului de infecție cu Treponema pallidum subspecia pallidum
vizualizarea unor microorganisme foarte subţiri şi lungi, spiralate, luminoase pe fondul negru
al câmpului, mobile, dar cu o deplasare lentă, ce seamănă cu o mişcare de înşurubare (Film nr.
1). Rezultatul pozitiv poate pune diagnosticul de sifilis primar (Figura nr. 5) și poate decide
tratamentul.
17. 3. 2. 2. 2. Imunofluorescența directă
Am discutat deja despre dificultatea diferențierii treponemelor patogene de acelea saprofite,
iar imunofluorescența directă vine în ajutorul diagnosticianului permițând marcarea cu
anticorpi fluorescenți monoclonali (o singură subspecieTreponema  țintită) sau policlonali a
microrganismelor de cercetat (reactie antigen-anticorp) (Figura nr. 6). Reactivul este obținut
de la pacienți cu sifilis sau de la animale de laborator infectate, serul acestora fiind tratat cu o
tulpină Reiter, nepatogenă, în scopul creșterii specificității, urmată de marcarea anticorpilor
cu izotiocianat de fluoresceină.
17. 3. 2. 3. Alte elemente utile în diagnosticul bacteriologic
În laboratoarele de referință sunt utilizate și alte metode diagnostice, spre exemplu testul
infectivității la iepure (RIT). Produsul prelevat este inoculat animalului de experiență
intratesticular sau cutanat, etapă urmată de observarea modificărilor clinico-biologice.
Aceasta este cea mai sensibilă metodă existentă pentru detectarea Treponema pallidum.
La pacientele însărcinate este posibilă prelevarea lichidului amniotic, în vederea diagnosticării
prin tehnici de biologie moleculară, precum Polymerase Chain Reaction (infecția sifilitică
depășind bariera materno-fetală).
17. 3. 3. Diagnosticul serologic
Testarea serologică este considerată metoda standard de detectare a infecției sifilitice, în toate
stadiile evolutive. Cel mai adesea serul pacientului este produsul testat, dar în situații aparte și
alte probe pot fi utilizate; spre exemplu într-o suspiciune de neurosifilis lichidul cefalo-
rahidian (LCR) poate fi supus examinării. Există două tipuri de teste disponibile, clasificate în
funcție de specificitatea antigenului utilizat: nespecifice sau nontreponemice și specifice sau
treponemice. Diagnosticul pozitiv se stabilește prin îmbinarea acestora, putând utiliza, spre
exemplu VDRL sau RPR din prima categorie, urmată de confirmarea prin TPHA sau FTA-
abs din a doua categorie. Pentru monitorizarea evoluției sub tratament sunt repetate periodic
testele nontreponemice (Figura nr. 7; algoritm de diagnostic).
17. 3. 3. 1. Reacţii serologice care utilizează antigene nontreponemice
Infecția cu Treponema pallidum conduce la apariția în serul pacientului, după aproximativ 2
săptămâni de la debut, a unor anticorpi protectori, denumiți istoric “reagine”. Aceștia
reacționează cu antigenul (cardiolipina), un difosfatidil-glicerol prezent în structura celulelor
cardiace umane și animale, dar și în aceea a membranei mitocondriale bacteriene. Această
reacție antigen-anticorp stă la baza testelor nontreponemice sau nespecifice: reacția de fixare
a complementului Bordet-Wasserman (RBW, cu cea mai mare vechime, din 1906) și reacțiile
de floculare Veneral Disease Research Laboratories (VDRL, cel mai frecvent utilizat) și
Rapid Plasma Reagin (RPR).
17. 3. 3. 1. 1. Reacţia de fixare a complementului Bordet Wasserman
Această metodă este discutată în detaliu în ”Diagnosticul de laborator în microbiologie”.
17. 3. 3. 1. 2. Reacţia de precipitare VDRL
Principiu. VDRL este o reacție antigen-anticorp nespecifică, observându-se flocularea la
punerea în contact a serului pacientului cu antigenul cardiolipină.
Procedura. În scopul efectuării microreacţiei VDRL sunt necesare următoarele materiale:
plăcile cu godeuri, antigenul de tip VDRL (preparat comercial), serul de cercetat (clarificat
prin centrifugare și inactivat timp de 30 minute la 56ºC) și probele martor (seruri cu
reactivitate cunoscută, martor pentru antigen).
În continuare, vom introduce în fiecare godeu 0,05 ml ser (în godeul pentru martor
antigenic punem soluţie salină fiziologică) și câte o picătură de suspensie antigenică (1/60
ml). După acoperirea plăcii, o vom plasa pe un agitator timp de 4 minute, la 180 turații pe
minut (Film nr. 2).
Interpretarea o vom face imediat, așezând placa pe un fond întunecat și observând, cu
ajutorul unei lupe, fiecare godeu, începând cu martorii și continuând cu serurile de testat.
Interpretare. Este posibil să obținem un rezultat negativ atunci când lichidul nu prezintă
flocoane, un rezultat slab pozitiv dacă observăm flocoane fine într-un lichid uşor tulbure sau
un rezultat intens pozitiv atunci când vizualizăm flocoane de dimensiuni mari într-un lichid
clar (Figura nr. 8).
Testul VDRL se pozitivează la aproximativ săptămâni de la apariția șancrului și la 4-8
săptămâni de la contactul sexual infectant.
Așa cum am învățat, diagnosticul serologic este realizat în etape, fiind necesară repetarea
testării. Din acest motiv, un rezultat negativ nu elimină diagnosticul de sifilis, fiind
recomandată, în special cazul unui pacient suspect, repetarea testării după 1 săptămână, 1 lună
şi la 3 luni.
Prin cumularea informațiilor epidemiologice, clinice și paraclinice, completate de un
rezultat VDRL pozitiv se stabilește suspiciunea de sifilis, a cărui confirmare se face
obligatoriu prin efectuarea unui test treponemic/specific. Nu trebuie să omitem posibilitatea
apariției unui rezultat fals pozitiv în următoarele situații: a.pacienți cu diferite patologii
infecțioase asociate (pneumonii de etiologie virală, rujeolă, hepatite virale acute,
mononucleoză infecţioasă sau alte infecţii virale, malarie), b.pacienți cu afecțiuni imunitare
asociate (boli ale țesutului de colagen), c.administrarea unor produse biologice de uz uman ce
pot declanșa reacții imunitare (ex. vaccinare recentă). Fiziologic, la persoanele în vârstă sau
pe parcursul sarcinii pot sa apară rezultate fals pozitive.
17. 3. 3. 2. Reacţii serologice care utilizează antigene treponemice
Antigenele treponemice sunt extrase din tulpinile Reiter sau Nichols de Treponema pallidum,
cu o mare specificitate. Teste treponemice sunt următoarele: reacția de hemaglutinare TPHA,
testul imobilizării treponemelor și testul de imunofluorescență indirectă FTA-Abs.
17. 3. 3. 2. 1. Reacția de hemaglutinare TPHA (T. pallidum Hemagglutination Test)
În această reactive antigenele specifice, extrase din tulpina Nichols, sunt adsorbite pe
membrana unor hematii fixate. În cazul în care în serul de cercetat sunt prezenţi anticorpi anti-
Treponema pallidum, hematiile sensibilizate aglutinează în reţele caracteristice formate din
complexe imune.
17. 3. 3. 2. 2. Testul imobilizării treponemelor (TPI) nu mai este utilizat în prezent, dar
pentru o lungă perioadă de timp a fost considerat tehnica standard de diagnostic. Serul de
cercetat era diluat și amestecat cu treponeme vii, mobile (obținute din testicul de iepure) și
complement. La microscopul pe fond întunecat era observată mobilitatea bacteriilor. Dacă
pacientul suferea de sifilis, anticorpii din serul acestuia reacționau cu treponemele din probă,
imobilizându-le.
17. 3. 3. 2. 3. Testul de imunofluorescenţă indirectă FTA Abs (Fluorescent Treponemal
Antibody)
Principiu.Serul pacientului este pus în contact cu antigene treponemice, formându-se
complexe antigen-anticorp. La adăugarea în proba de cercetat a anticorpilor anti-
imunoglobuline umane marcați fluorescent, complexele pot fi vizualizate prin microscopia cu
fluorescență.
Procedura. Serul care va fi utilizat în reacție este obținut prin prelucrarea serului pacientului
(într-o diluție de 1/5 este pus în contact cu un extract antigenic nespecific- comun
treponemelor patogene și comensale- din tulpină Reiter, în scopul îndepărtarii anticorpilor
care nu sunt specifici pentru T. pallidum). Ulterior, serul obținut este pus în contact cu
antigenele specifice ale tulpinii Nichols de T. pallidum. În acest moment, în cazul în care
pacienții suferă de sifilis, se formează complexe antigen-anticorp. La adăugarea în proba de
cercetat a Ac anti-imunoglobuline umane marcați fluorescent, complexele pot fi vizualizate
prin microscopia cu fluorescență. În cazul în care serul de cercetat este pozitiv, treponemele
apar galben-verzui (Figura nr. 9).
17. 3. 3. 2. 4. Tehnica ELISA (ex. detectarea anticorpilor de tip Ig M anti-T. pallidum)
este utilă pentru diagnosticul sifilisului congenital.
Interpretarea rezultatelor se face în context clinic, epidemiologic şi de laborator. Dacă, spre
exemplu, atât VDRL, cât şi TPHA dau un rezultat negativ, infecţia este de obicei exclusă.
Însă, în cazul în care pacientul se află la debutul bolii, iar anticorpii nu sunt nedectabili
(suspiciunea clinică sau epidemiologică persistă), repetăm testele după 3 săptămâni. Nu
intrăm în amănunte privind strategia diagnostică şi terapeutică, dar este foarte important de
știut că algoritmul este elaborat de către comisiile de specialitate ale ministerului sănătății și
trebuie respectate ca atare.

18. Diagnosticul de laborator în infecţii produse de

microorganisme din genurile Chlamydia și Mycoplasma.
18. 1. Cuvinte cheie

 Corpusculi elementari și corpusculi reticulați

 Trahom
 Conjunctivită
 Pneumonie interstițială
 Limfogranulomatoză
 Traheobronșită

18. 2. Introducere
18. 2. 1. Clasificare
Bacilii Gram negativi studiați în acest capitol sunt incluși în genurile Chlamydia și
Mycoplasma. Speciile cu cea mai mare importanță a genului Chlamydia sunt Chlamydia
trachomatic, C. psittaci și C. pneumoniae; acestea cauzează infecții variate – fiind implicate
în infecții cu transmitere sexuală și pneumonii atipice, dar și alte forme de patologie. Unii
autori clasifică C. psittaci şi C. pneumoniae în genul Chlamydophila.
În genul Mycoplasma întâlnim speciile M. pneumoniae, M. genitalium și M. hominis. Aceste
microorganisme cauzează, la rândul lor, infecții variate – fiind implicate în infecții cu
transmitere sexuală (uretrite non-gonococice), pneumonii atipice, dar și pielonefrită, febră
post-partum sau infecții sistemice (în special la pacienții imunodeprimați).
18. 2. 2. Fiziologie și cale de transmitere
18. 2. 2. 1. Genul Chlamydia
Microorganismele din genul Chlamydophila prezintă un ciclu de dezvoltare particular. Aceste
microorganisme sunt „parazite”, folosind ATP din celulelei eucariote infectate. Astfel,
replicarea lor are lor doar intracelular. În mediul extracelular, aceste bacterii există sub forme
numite corpusculi elementari (CE), asemănătoare cu sporii bacterieni, inactive metabolic,
dar cu infecțiozitate păstrată. CE sunt endocitați de celulele eucariote și se reorganizează sub
formele metabolic-active, non-infecțioase, capabile de replicare, numite corpusculi reticulați
(CR).
C. pneumoniae și C. psittaci se transmit aerogen, fiind o cauză de pneumonie bacteriană
interstițilă (numită și „atipică”). C. trachomatis este responsabilă de boli oftalmologice și boli
cu transmitere sexuală. Acestea sunt transmise prin contact direct, prin fluide biologice sau
prin vectori.
Pe baza proteinelor din structura sa, microorganismul se poate împărți în multiple
serogrupuri.
18. 2. 2. 2. Genul Mycoplasma
Microorganismele din genul Mycoplasma sunt cele mai mici organisme care pot să
supraviețuiască de sine stătătoare în natură, fără nevoia de a parazita o celulă gazdă. Spre
deosebire de celelalte microorganisme, acestea nu au perete celular și prezintă steroli în
membrană. Sunt microorganisme pleomorfe ce prezintă forme cocoidale sau bacilare
(dimensiuni de la 0.1 – 0.2 µm la 1 – 2 µm). Timpul de generație a acestor microorganisme
este de 6 ore, așa încât culturile se dezvoltă greu, necesitând tehnici speciale de examinare și
o compoziție specială a mediilor de cultură.
Calea de transmitere a M. pneumoniae este aerogenă, în cursul episoadelor de tuse. M.
genitalium și M. hominis, sunt transmise prin contact direct.

18. 2. 3. Tablou clinic

18. 2. 3. 1. Tabloul clinic în infecțiile produse de Chlamydia spp.
Trahomul este o infecție difuză, cronică, a conjunctivei. Apare o importantă fibroză a
conjunctivei, însoțită de eversiunea pleoapei, care contribuie la leziunile oculare. Rezultatul
este diminuarea acuității vizuale, uneori până la orbire (Figura nr. 1).
Conjunctivita neonatală apare atunci când nou-născutul este contaminat în cursul nașterii
naturale. După o perioadă de incubare de 5-12 zile, apare inflamarea pleoapelor și secreția
purulentă (Figura nr. 2). Tratamentul trebuie să fie sistemic, întrucât poate să apară și auto-
inocularea cu evoluție spre pneumonie interstițială.
Lymphogranuloma Venereum este o boală cu transmitere sexuală (ITS) ce prezintă la debut o
leziune primară la locul de inoculare – aceasta este o papulă sau o leziune ulceroasă,
nedureroasă și care se vindecă repede. Inflamația progresează, în a doua fază, implicând
lanțul ganglionar inghinal, cu apariția adenopatiilor dureroase, fluctuante, ce pot fistuliza.
Infecțiile urogenitale sunt de multe ori greu de diagnosticat datorită faptului că infecțiile sunt
asimptomatice la aproximativ 80% din persoanele de sex feminin. Acestea reprezintă un
rezervor natural pentru infecție. Aceste infecții pot duce la sterilitate dacă nu sunt detectate și
diagnosticate corespunzător. Infecțiile la bărbați sunt cel mai adesea simptomatice, dar 25%
din infecții rămân asimptomatice.
18. 2. 3. 2. Tabloul clinic în infecțiile produse de Mycoplasma pneumoniae
            Traheobronșita este forma clinică cea mai frecvent întâlnită. Aceasta se caracterizează
prin tuse neproductivă, febră, cefalee și subfebră. De multe ori, simptomatologia asociază și
faringită.
Pneumonia atipică reprezintă o altă formă de prezentare. Spre deosebire de pneumoniile cu S.
pneumoniae, simptomatologia este mai subtilă. Examenul radiologic contrastează cu
simptomatologia, arătând infiltrate bronhopneumonice diseminate (Figura nr. 3).
18. 3. Diagnosticul de laborator în infecţii produse de microorganisme din genurile
Chlamydia și Mycoplasma
Ne vom referi în continuare la diagnosticul infecţiilor produse de C. trachomatis și M.
pneumoniae.
18. 3. 1. Diagnosticul bacteriologic în trahom (Chlamydia trachomatis)
18. 3. 1. 1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând
regulile cunoscute (vezi capitolul 4), în special recoltarea cât mai rapid după debutul bolii şi
înainte de iniţierea antibioterapiei şi respectând măsurile de precauţie. Produsul patologic
poate fi reprezentat de raclat conjunctival sau de la nivelul altor mucoase (ex. cervivală),
urină, spermă, secreţie purulentă uretrală, secreţii nazale, secreţii faringiene, spută, aspirat
ganglionar, puroi din fistulă etc. În cazul în care secreţia uretrală nu este evidentă, putem
utiliza un tampon subţire pe care îl introducem cu blândeţe 3-5 cm în uretră, rotindu-l uşor.
Indiferent de p.p. recoltat, tampoanele trebuie să fie din Dacron. Produsul trebuie să fie
prelucrat imediat. Dacă acest lucru nu este posibil, transportul se va face în medii speciale de
transport sau la cel puţin -20º C (preferabil -70ºC).
18. 3. 1. 2. Examinarea microscopică a produsului patologic include realizarea unor frotiuri pe
care le „colorăm” prin imunoflorescență. Aceasta pune în evidenţă incluziile
intracitoplasmatice sau corpusculii elementari (Figura nr. 4). Frotiul este uscat, fixat chimic
(cu acetonă, la -20ºC) şi „colorat” imunofluorescent (metoda directă sau indirectă). Urmărim
prezenţa celulelor inflamatorii (PMN) şi a celulelor caracteristice ţesutului de la nivelul căruia
am realizat recoltarea. Incluziile apar ca o masă bine definită, cu fluorescenţă de ex. galben-
verzui, în interiorul celulelor epiteliale. Frotiul va fi examinat cel puţin 3 minute în cazul în
care pare să fie negativ. Celelalte frotiuri vor putea fi colorate prin metoda Gimenez
(corpusculii elementari apar aglomeraţi şi de culoare roşie pe fondul verde al frotiului) sau cu
lugol (incluziile de C. trachomatis conţin glicogen și apar ca o masă de culoare brună). Unii
autori menţionează că examenul citologic, cu punerea în evidenţă a unor limfocite
„transparente” şi a unui număr crescut de histiocite este sugestiv pentru infecţia cu C.
trachomatis. Prin tehnici de tip ELISA se pot pune în evidenţă antigene în p.p. Există şi
tehnici ale biologiei moleculare care pot fi aplicate direct pe p.p. (sonde nucleotidice, PCR
etc).
18. 3. 1. 3. Pentru cultivarea produsului patologic am putea utiliza oul de găină embrionat
(inoculare la nivelul sacului vitelin) dar de regulă se folosesc culturile de celule. Pentru
Chlamydia trachomatis se pot utiliza liniile celulare BGMK, HeLa 229. Înainte de inocularea
pe culturile de celule, p.p. este centrifugat (3000´g, timp de 60 minute). Se pot utiliza culturile
de celule în sistemul clasic sau micrometoda de cultivare pe culturi de celule în godeuri.
Incubarea durează 48-72 de ore. Tehnica incubării este destul de complexă (incubări repetate,
în condiţii diferite) şi trebuie să respecte strict protocolul de lucru.
18. 3. 1. 4. Identificarea se va realiza diferenţiat. În cazul în care s-a utilizat micrometoda,
godeurile se examinează microscopic după colorare cu lugol sau prin imunofluorescenţă. În
cazul cultivării prin metoda clasică, realizăm frotiuri pe care le fixăm chimic (de ex. cu
metanol). Un frotiu va fi colorat cu lugol (incluziile de C. trachomatis conţin glicogen) iar
altul cu Ac monoclonali marcaţi fluorescent. Se pot aplica şi tehnici de biologie moleculară.
 18. 3. 1. 5. Nu există tehnici standardizate de stabilire a sensibilităţii la antibiotice şi
chimioterapice a tulpinilor de Chlamydia spp. În tratament se pot folosi eritromicina (sau alte
macrolide), tetraciclinele sau fluorochinolonele.
18. 3. 2. Diagnosticul serologic în trahom (Chlamydia trachomatis)
Diagnosticul serologic implică utilizarea reacţiei de fixare a complementului, reacţiei de
microimunofluorescenţă şi a tehnicilor de tip ELISA. Se consideră că un titru 1/64 este
sugestiv în timp ce o creştere de 4 ori a titrului în dinamică permite diagnosticul pozitiv.
Identificarea prezenţei Ac de tip IgM la nou născuţi permite diagnosticul de pneumonie cu C.
trachomatis. Tehnicile imunologice sunt frecvent utilizate în scop epidemiologic (studii de
seroprevalenţă).
18. 3. 3. Diagnosticul imunobiologic în infecțiile cu C. trachomatis
Utilizarea intradermoreacţiei (IDR Frei) a intrat în istoria medicinii.
18. 3. 4. Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Mycoplasma pneumoniae
18. 3. 4. 1. Recoltarea şi transportul produsului patologic trebuie să se realizeze respectând
regulile cunoscute (vezi capitolul nr. 6), în special recoltarea cât mai rapid după debutul bolii
şi înainte de iniţierea antibioterapiei. Produsul patologic poate fi reprezentat de exsudat
faringian, secreţii nazale, spută, secreţii genitale, urină etc. În continuare vom discuta numai
diagnosticul de laborator în infecţiile respiratorii. Transportul trebuie realizat la rece (la +4ºC)
cât mai rapid posibil, fără a depăşi un maxim de 3-4 ore de la recoltare. O alternativă este
reprezentată de utilizare mediilor speciale de transport care pot asigura conservarea p.p.
pentru cel mult 24 de ore. Utilizarea azotului lichid (-70ºC) permite conservarea probelor timp
de mai multe zile dar nu este încă accesibilă (cu foarte puţine excepţii) sistemului sanitar
românesc.
18. 3. 4. 2. Examinarea microscopică a produsului patologic nu permite obţinerea unor
rezultate utile, M. pneumoniae ca şi celelalte specii ale ordinului are dimensiuni foarte reduse.
Unii autori recomandă realizarea de frotiuri colorate imunofluorescent. Pornind de la p.p. s-ar
putea realiza amplificarea genetică (PCR) cu o sensibilitate foarte bună. Prin tehnici de tip
ELISA pot fi puse în evidenţă Ag de M. pneumoniae în spută.
18. 3. 4. 3. Cultivarea pe medii de cultură a produsului patologic se poate realiza utilizând
tehnici şi medii speciale. Unul dintre mediile de cultură cunoscut este mediul îmbogăţit, pe
bază de infuzie de cord bovin numit generic PPLO. Acest mediu include atât substanţe
nutritive, surse de energie, indicator de pH cât şi substanţe care îi asigură selectivitatea. Cei
mai mulţi autori recomandă însămânţarea p.p. atât pe un mediu de cultură solid cât şi pe un
mediu de cultură lichid (ex. bulion PPLO). Vom realiza o incubare la 37ºC în atmosferă de
5% CO2 şi urmărim culturile pe mediul lichid pentru a sesiza cât mai rapid (dar nu mai
devreme de 48-72 ore de incubare) modificările de culoare care trădează virajul pH-ului.
Mediul devine acid prin fermentarea glucozei în cel mult 3-4 săptămâni. Este recomandat să
realizăm repicări pe medii solide şi lichide cât mai curând după ce am observat virajul pH-ului
(Figura nr. 5).
18. 3. 4. 4. Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza mai
multor caractere:
·           morfotinctoriale nu sunt utile în identificarea M. pneumoniae
·           de cultură:
·        Se pot examina la stereomicroscop (cu mărire de minim 25x). În scopul identificării trebuie să
„citim” placa cu mediu agarizat de cel puţin 2 ori pe săptămână. Pot apărea colonii de
dimensiuni foarte mici (cu diametru de la 10 până la 200 µm), cu aspect muriform. (Figura nr.
6) Sunt descrise şi colonii cu aspect de „ou-ochi”, cu centrul dens, opac, înconjurat de o zonă
periferică mai clară pe care unii autori le consideră drept tipice pentru Mycoplasma (astfel de
colonii ar mai putea fi produse de bacterii în formă L şi necesită realizarea diagnosticului
diferenţial).
 ·         Se poate realiza şi cultivarea pe oul de găină embrionat (inoculare intravitelină) sau în culturi
de celule.
·           biochimice: Fermentează glucoza, nu metabolizează arginina, nu hidrolizează ureea dar
reduce (în aerobioză) tetrazoliul. Acesta este un compus incolor, iar în cazul în care este redus
la formazan, culoarea devine roşie. Testul se poate realiza direct pe placa pe care presupunem
prezenţa coloniilor de M. pneumoniae.
·           Alte caractere care ar putea fi utilizate în identificare sunt:
·        Fenomenul adsorbţiei hematiilor de cobai
·        Colorarea imunofluorescentă a coloniilor cu seruri specifice marcate cu fluorocromi
·        Inhibarea dezvoltării coloniilor în jurul unor discuri impregnate cu anticorpi specifici
·           Tehnici de biologie moleculară (sonde nucleotidice, PCR) etc.
18. 3. 4. 5. Nu există o standardizare a tehnicilor pentru determinarea sensibilităţii la
antibiotice şi chimioterapice. Tratamentul pneumoniei cu M. pneumoniae se poate face cu
eritromicină sau alte macrolide sau cu tetracicline. Durata tratamentului este de circa 3
săptămâni.
18. 3. 5. Diagnosticul serologic al infecțiilor cu M. pneumoniae
În cursul infecţiei se produc Ac din diferite clase, unii fiind utili pentru neutralizarea M.
pneumoniae în timp ce alţii acţionează ca auto-Ac (determinabili prin reacția Coombs). Dintre
aceştia, aglutininele „la rece” (crioglobuline) sunt Ac de tip IgM oligoclonali care
reacţionează cu un Ag de la suprafaţa hematiilor pacienţilor infectaţi cu M. pneumoniae. Cu
toate că există şi alte maladii în care apar aglutinine la rece, iar pe de altă parte aceştia nu se
pot identifica la toţi pacienţii infectaţi cu M. pneumoniae, demonstrarea aglutininelor la rece
continuă să fie utilă în diagnosticul serologic. Utilizăm serul pacientului pe care îl amestecăm
cu eritrocite provenite de la pacienţi de grup O, incubăm la 0ºC câteva minute şi urmărim
apariţia aglutinării. Dacă apare aglutinarea repetăm testul realizând diluţii de ser pentru a
determina titrul. Un titru 1/32 este sugestiv pentru infecţia cu M. pneumoniae.
Se poate utiliza şi RFC, dar pentru că Ac fixatori de complement apar tardiv (3-4 săptămâni)
este utilă în studii epidemiologice. Tehnica de tip ELISA poate determina Ac de tip IgM (anti
adezina P1) şi este utilă în infecţia acută.

19. Diagnosticul de laborator în infecţii cu Candida

albicans. (Gabriela-Loredana Popa, Violeta-Corina
Cristea)
19. 1. Cuvinte cheie
·         Levuri
·         Pseudomicelii
·         Candidoză
·         Mediu Sabouraud
·         Antifungigramă
19. 2. Introducere
Fungii sunt microorganisme eucariote, larg răspândite în natură. Au fost descrise peste
250.000 de specii dar dintre acestea doar circa 200 pot fi implicate în patologia umană.  În
micologia medicală fungii sunt clasificați în: levuri, fungi dimorfi și fungi filamentoși.
Levurile sunt reprezentate de elemente unicelulare rotund ovalare care se înmulțesc prin
înmugurire, fungii filamentoși cresc sub formă de hife iar fungii dimorfi pot prezenta
ambele aspecte, putând trece din forma de levură în cea filamentoasă în funcție de condițiile
de mediu (levuri in vivo, hife in vitro).
Genul Candida cuprinde peste 150 de specii, cele mai frecvent întâlnite în patologia umană
fiind reprezentate în ordinea frecvenței de: C. albicans, C. tropicalis, C. glabrata, C.
parapsilosis, C. krusei. C. albicans face parte din flora saprofită a cavității bucale, tubului
digestiv și tractului genital feminin. Sunt microorganisme condiționat patogene și determină
infecții doar la pacienții ce prezintă factori de risc atât intrinseci (ex. vârste extreme,
endocrinopatii, hemopatii maligne, SIDA) cât și extrinseci (ex. leziuni la nivel tegumentar,
tratament abuziv cu antibiotice şi chimioterapice, terapie imunosupresivă, diferite manevre
medico-chirurgicale). În funcție de localizare, infecțiile fungice pot fi superficiale atunci când
afectează pielea, fanerele și mucoasele (bucale şi peribucale, genitale) și infecții invazive sau
sistemice caracterizate prin invazia țesuturilor profunde, a organelor sau diseminare sangvină
(fungemie sau candidemie). Infecția sistemică frecvent are ca punct de plecare colonizarea cu
Candida, aceasta reprezentând un factor de risc important în dezvoltarea sepsisului.
19. 3. Diagnosticul de laborator poate fi micologic (direct) sau imunologic (indirect).
19. 3. 1. Diagnosticul micologic
Fiecare laborator clinic trebuie să aibă personal instruit și posibilități materiale pentru
realizarea examenului micologic, sau măcar o parte din acesta (recoltare, examinare
microscopică, evidenţierea levurilor - structurilor miceliene - structurilor pseudo-miceliene,
testul filamentării, zimograma, auxanograma și antifungigrama).
19. 3. 1. 1. Recoltarea şi transportul p.p. se fac respectând aceleaşi reguli, discutate în cazul
infecţiilor bacteriene.
Spre ex. într-o candidoză superficială tegumentară, antiseptizăm, după care recoltăm p.p. prin
ștergerea zonei afectate cu un tampon steril care este imersat ulterior într-un recipient cu
mediu de transport. În același mod mai recoltăm un tampon din care vom efectua examinarea
microscopică. În cazul infecțiilor de la nivelul unghiilor (onicomicoze), raclăm şi colectăm
fragmentele de unghie într-un recipient sterilcu capac etanș. Timpul de transport nu trebuie să
depăşească 48 de ore (iar p.p. nu trebuie să se usuce). Pentru prevenirea multiplicării
bacteriene în cazul acestor produse patologice se adaugă antibiotice în mediul folosit pentru
însămânțare (frecvent se folosește mediul Sabouraud cu cloramfenicol și gentamicină).
În cazul suspiciunii de fungemie se recoltează hemoculturi de preferat în recipiente special
destinate acestui scop (BACTEC Mycosis-IC/F Culture Vials) și transportate către laborator
imediat sau la 37°C (Figura nr. 1). Este suficientă o singură hemocultură pozitivă pentru a
pune diagnosticul de fungemie iar tratamentul antifungic se începe imediat.
19. 3. 1. 2. Examinarea microscopică a p.p. are câteva particularităţi
·         Dacă examinăm un p.p. sub formă de scuame sau fragmente unghiale, facem întâi un
preparat între lamă şi lamelă, folosind o soluţie 10-30% KOH-glicerol care are rol de
dilacerare a stratului cornos. Dacă utilizăm şi calcofluor alb (fluorocrom), levurile se
vădovoide, cu dimensiuni relativ mari, iar pseudomiceliile şi miceliile se văd galben-verzui
sau alb-albăstrui. (Figura nr. 2) Aceste aspecte ne fac să suspicionăm prezenţa Candida spp.
(cultivarea este însă strict necesară).
·         Dacă examinăm un p. p. recoltat de la nivelul mucoaselor, pregătim şi preparate între
lamă-lamelă şi frotiuri (colorate A.M. şi Gram). În cazul preparatelor proaspete folosim şi
calcofluor alb. Dacă vedem levuri şi pseudomicelii, suspicionăm prezenţa Candida spp.
(Figura nr. 3)
19. 3. 1. 3. Cultivarea p. p. o facem pe mediul Sabouraud (putem adăuga, pentru selectivitate,
cloramfenicol, gentamicină, cicloheximidă). Un p. p. necontaminat îl cultivăm pe Sabouraud
neselectiv. Un p. p. contaminat îl cultivăm şi pe Sabouraud neselectiv dar şi selectiv. Potrivim
termostatul la 28-30ºC, pentru incubare şi aşteptăm 24-96 ore.
19. 3. 1. 4. Identificarea o facem prin examinarea caracterelor
·         morfotinctoriale: Examinăm preparate proaspete colorate cu lactofenol şi frotiuri fixate şi
colorate, remarcând prezenţa levurilor (rotunde, ovoide sau puţin mai alungite, Gram
pozitive); dovedim şi puritatea coloniei. (Figura nr. 4) În particular, dacă repicăm din colonie
pe un mediu cu agar şi făină de porumb (slab nutritiv) şi apoi facem un preparat între lamă şi
lamelă, vom vedea apariţia de chlamidospori (la extremitatea pseudomiceliilor). (Figura nr.
5)
·         de cultură: Produc în 24-96 ore colonii de tip S (rotunde, bombate, netede, albe, care
seamănă cu coloniile bacteriene dar sunt mai mari). (Figura nr. 6)
·         biochimice: Facem spre ex. auxanograma (levurile au un echipament enzimatic şi pot să
utilizeze un anumit carbohidrat ca unică sursă de carbon; C. albicans asimilează glucoză,
maltoză, trehaloză, galactoză etc.). (Figura nr. 7)Testarea fermentării unor carbohidraţi poartă
numele de zimogramă. (Figura nr. 8)
·         antigenice: Putem folosi diferite tehnici (aglutinare pe lamă, latex-aglutinare, ELISA).
·         alte teste care ar putea fi utile în identificare
·         Testul filamentării - verificăm capacitatea blastoconidiilor de a produce, în anumite
condiţii, tubi germinativi [repicăm tulpina pe medii care conţin ser de iepure; din 60 în 60 de
minute pregătim preparate între lamă şi lamelă şi examinăm microscopic pentru a detecta
prezenţa tubilor germinativi; C. albicans produce în maxim 4 ore pseudofilamente/tubi
germinativi relativ (scurte, fără stricturi, cu un calibru similar)]; (Figura nr. 9)
·         Detectarea unor metaboliţi prin tehnici cromatografice;
·         Identificarea se mai poate obține prin utilizarea unor kit-uri comerciale precum Candifast,
Auxacolor, API 20C, API 32C etc.
19. 3. 1. 5. Antifungigrama a fost pusă la punct (standardizată) relativ recent.
Există sisteme comerciale care efectuează antifungigrama pe o diluție a unor antifungice
(Candifast) sau pe două diluții (Fungitest). Standardele EUCAST și CLSI recomandă metoda
diluţiilor în bulion sau E-test. (Figura nr. 10)
19. 3. 2. Diagnosticul imunologic
Diagnosticul imunologic poate fi serologic şi imunobiologic.
19. 3. 2. 1. Diagnosticul serologic
Există studii care arată că identificarea şi titrarea Ac anti-C. albicans poate fi utilă în
diagnosticul candidozelor profunde. Iniţial au fost utilizate tehnici de aglutinare pentru
detectarea prezenţei Ac anti-manan. Ulterior au fost puse la punct tehnici pentru detectarea
prezenţei Ac faţă de Ag localizate în citoplasma C. albicans. Detectarea de antigen C.
albicans în ser este înalt sugestivă pentru o candidoză sistemică sau generalizată.
19. 3. 2. 2. Diagnosticul imunobiologic
Intradermoreacţia cu candidină este pozitivă la majoritatea persoanelor adulte, fiind astfel
utilă în aprecierea existenţei RIC. Se mai poate utiliza testul transformării blastice a
limfocitelor în prezenţa unor Ag de C. albicans.

20. Elemente de microbiologie orală- Biofilmul dentar și

implicațiile în patologie. (Gabriela-Loredana Popa,
Mara-Mădălina Mihai)
20. 1. Cuvinte cheie

·                     Microbiocenoză

·                     Microbiom

·                     Microfloră
·                     Biofilm

·                     Placă dentară

20. 2. Introducere. Microbiocenoza orală și biofilmul bacterian dentar
Contrar concepției tradiționale, conform căreia o afecțiune este determinată de infecția acută
sau cronică în care este implicată o singură specie bacteriană, în patologiile cavității bucale
dezechilibrul și implicit boala apar atunci când specii patogene sau condiționat patogene,
prezente în microflora orală într-o proporție limitată, se dezvoltă exagerat, în detrimentul
celorlalte microorganisme.
Atunci când discutăm despre microorganismele de la nivelul cavității orale, ar trebui să luăm
mereu în considerare următoarele noțiuni: aceea a microbiocenozei orale, care cuprinde toate
speciile bacteriene existente, atât microorganismele în formă liberă, din secrețiile salivare, cât
și pe acelea atașate suprafețelor epiteliale ori dentare, și noțiunea biofilmului bacterian, care
este reprezentat de microorganismele aderente smalțului dentar.
20. 2. 1. Microbiocenoza orală
Microbiocenoza cavităţii bucale, este formată dintr-un ansamblu de specii bacteriene care nu
au efecte patogene asupra gazdei colonizate. Este estimat un număr cuprins între 700 și 1.000
de specii care formează microbiomul, multe dintre acestea neputând fi cultivate și izolate prin
tehnicile clasice, ci identificate doar prin metode ale biologiei moleculare. Studiul ARN
ribozomal 16s a putut, astfel, să identifice un grup, numit generic TM7, identificat de curând
la nivelul plăcii dentare subgingivale.
O echipă de cercetători de la Institutul Forsyth, Cambridge, SUA, au creat o platformă online
unde este prezentat comunității științifice internaționale Microbiomul Oral Uman (Human
Oral Microbiome Database http://www.homd.org/). Microbiocenoza are un important rol de
apărare, atât prin menținerea homeostaziei și a unui pH fiziologic, cât și prin relațiile inter-
bacteriene comensal-patogen (spre exemplu prin competiţia pentru hrană, oxigen, receptori de
legare). Cea mai mare cantitate de bacterii se pare că se află în spaţiile inter-dentare, în
apropierea şanţului gingival, sublingual etc. Pe suprafaţa dinţilor, a mucoasei jugale sau la
nivel lingual se găsesc în special bacterii aerobe în timp ce în spaţiul gingival putem identifica
bacterii facultativ sau strict anaerobe.
20. 2. 2. Biofilmul bacterian dentar
20. 2. 2. 1. Definiție
Biofilmul bacterian este reprezentat de o comunitate complexă de microorganisme ce se
dezvoltă într-o structură mucopolizaharidică protectoare față de acțiunea antibioticelor sau a
moleculelor sistemului imunitar (Figura nr. 1).
Studierea biofilmului bacterian al cavității orale își are originea în secolul al XVII-lea, când
biologul olandez Antoine Leeuwenhoek, părintele microbiologiei, descria pentru prima dată
„vietăți” în fragmentele dentare observate microscopic (Figura nr. 2). Dezvoltarea tehnicilor
moderne de cultivare în laborator a microorganismelor anaerobe, precum și utilizarea recentă
a tehnicilor de diagnostic molecular, au permis identificarea a peste 700 de specii ce
colonizează cavitatea orală.
La nivel dentar, atât supra cât și subgingival, microorganismele se organizează într-un biofilm
aderent, cunoscut și sub denumirea de placă dentară. Semnalizarea intercelulară, facilitată atât
prin secreția unor molecule difuzibile în mediu, cât și prin contactul direct bacterian,
influențează poziționarea bacteriilor în cadrul biofilmului și activitatea metabolică a acestora.
Atunci când nu este îndepărtat regulat, biofilmul aderă permanent la suprafața dentară, unde
se maturează și determină apariția cariilor dentare, a gingivitei, a paradontopatiei. Mai mult,
efectele pot fi sistemice, unele studii sugerând implicarea biofilmului dentar în afecțiuni
cardio-vasculare, ateroscleroză, diabet zaharat, afecțiuni respiratorii, complicații obstetricale
și nașterea prematură.
20. 2. 2. 2. Dezvoltarea spațiotemporală a biofilmului oral
Asemănător altor structuri multicelulare, precum țesuturile organice, evoluția biofilmului
dentar trebuie analizată atât din punct de vedere spațial, cât și temporal. Procesul variază în
funcție de localizare, fiind importante diferențele structurale de la nivel supragingival vs
subgingival, cât și efectele patogenice carii dentare vs paradontopatii.
Au fost descrise următoarele etape succesive ale dezvoltării biofilmului: aderarea/ atașarea
reversibilă a microorganismelor, aderarea/atașarea ireversibilă, maturizarea și dispersia
(Figura nr. 3).
Atașarea reversibilă. După aproximativ o jumătate de oră de la precedenta spălare a dinţilor,
o peliculă de substanţe mucoide se depune pe suprafaţa smalţului dentar. Viteza de formare a
acestei structuri este influențată și de compoziția alimentelor ingerate ulterior. Cu cât
cantitatea de glucide este mai mare, cu atat pelicula se dezvoltă mai rapid: prin fermentarea
carbohidraților, pH-ul virează spre aciditate, iar la valori mai mici de 4-5 are loc precipitarea
structurilor mucoide. Consumul exagerat de dulciuri face ca resursele naturale de neutralizare,
existente în salivă, să fie depăşite.
În continuare, evoluţia este influenţată substanţial de igiena personală. Dacă aceasta este
deficitară, faza de ataşare şi colonizare bacteriană determină structurarea plăcii bacteriene. Un
„film” reprezentat de o materie albă, subţire, alcătuită din resturi alimentare, bacterii,
leucocite polimorfonucleare, celule epiteliale orale descuamate se acumulează la suprafața
dintelui. Acesta este uşor de îndepărtat, spre ex. prin utilizarea unui jet mai puternic de apă.
Microorganismele care colonizează suprafețele dentare aderă la acestea prin intermediul unor
receptori, formând un prim „strat”.
Atașarea ireversibilă. În continuare, bacteriile libere din cavitatea bucală, precum
Streptococcus sanguis, Streptococcus mutans, precum şi Actinomyces spp., se pot atașa
primului strat, îngroşându-l. Există şi ale metode de aderare. Se poate forma o rețea în care
unele bacterii sunt deja fixate, iar altele sunt suspendate, relativ ferm. Ulterior se ataşează şi
alte bacterii (stafilococi, spirochete), fungi (levuri, filamente) etc.
NB: Matricea plăcii dentare în curs de formare are în compoziţie atât substanţe ale gazdei, cât
şi produşi bacterieni.
Maturizarea. Dacă igiena este în continuare deficitară, iar aceste structuri nu sunt
îndepărtate, prin accentuarea colonizării (multiplicare și atașare), placa bacteriană se dezvoltă
mai mult. Bacteriile se „cuplează” unele de altele, alcătuind o matrice. La aproximativ 48 ore
de la formarea biofilmului îndepărtarea devine dificilă, iar după 7-9 zile aceasta este foarte
dificilă. La nivel plăcii bacteriene pot fi identificate specii de streptococi (ex. S. sanguis, S.
gordoni, S. oralis), actinomicete, precum şi elementele menţionate anterior. În cazul în care
apare gingivită, se pot identifica Fusobacterium nucleatum, Prevotella intermedia,
Selenomonas sputigena, Campylobacter sputorum, Haemophilus parainfluenzae. În
periodontita cronică (pierdere de ţesut conjunctiv lax periodontal şi de suport a dintelui în
alveolă) identificăm spirochete, germeni Gram pozitivi filamentoşi, bacterii Gram negative
mobile, specii anaerobe (P. gingivalis, P. intermedia, Tannerella forsythia etc.). Apar
fenomene inflamatorii.
Microorganismele patogene sunt arareori eliminate de către moleculele sistemului imunitar.
Inflamația locală, determină un flux crescut al lichidului sulcular gingival, un transudat bogat
în nutrienți bacterieni care întreține cercul vicios.
O placă bacteriană abundentă are întotdeauna o implicare patologică. Placa supragingivală
este implicată în producerea cariilor dentare în timp ce placa subgingivală este implicată în
producerea paradontopatiilor.
Dispersia. Microorganismele care compun biofilmul se pot detașa de acesta, fie individual,
fie în agregate pluricelulare. Acest eveniment poate fi urmat de invazia țesuturilor adiacente
ori de o diseminare sangvină, cu apariția complicațiilor sistemice (cel mai frecvent
endocardite). Procedurile stomatologice pot provoca bacteriemie tranzitorie, motiv pentru care
pacienților cu afectare valvulară cardiacă documentată le este recomandată profilaxia
antibiotică.
Un alt mecanism prin care microorganismele ar putea determina apariția afecțiunilor
sistemice ar fi acela al stimulării răspunsului inflamator local ori sistemic și posibil,
declanșarea unor reacții auto-imunitare.
A fost sugerată implicarea biofilmului oral în ateroscleroză și în nașterea prematură, fiind
necesare studii suplimentare pentru a confirma aceste suspiciuni.
20. 3. Caria dentară

Caria dentară reprezintă o leziune la nivel dentar. Factorul determinant al cariilor dentare
este reprezentat de bacterii și influențat esențialmente de placa dentară. Printr-un dezechilibru
metabolic în cadrul biofilmului supragingival sunt produse în exces substanțe acide, iar pH-ul
scade, promovând demineralizarea dentară. Apare initial „pata de smalţ” (pierde luciul
caracteristic), apoi zona respectivă se îngălbeneşte și se dezvoltă o eroziune superficială (în
smalţ) (Figura nr. 4). Aceasta înaintează, putând afecta într-un final pulpa dentară. Cariile se
pot însoţi de complicaţii (gangrena pulpei dentare, abcese etc).
În apariția cariilor dentare, vechimea biofilmului este esențială. Doar comunitățile microbiene
mai vechi de 48 de ore sunt suficient de mature pentru a reduce pH-ul sub valoarea limită de
5,5 la care apare demineralizarea dentară. Odată cu revenirea pH-ului la normal, țesutul
dentar se remineralizează. Atunci când există un dezechilibru între aceste două procese se
dezvoltă cariile dentare. Prezența biofilmului nu este echivalentă cu apariția patologiei,
observându-se faptul că suprafețele acoperite de placă dentară își păstrează integritatea
perioade îndelungate de timp, dar reprezintă totuși o condiție necesară pentru inițierea
procesului patogen. Există multipli factori biologici precum fluxul salivar, capacitatea de
neutralizare a lichidelor orale (salivă, lichid gingival), dietă bogată în carbohidrați, fluorizarea
dentară, compoziția microbiană a biofilmului și a microbiocenozei orale, care influențează
metabolismul mineral dentar, fiind imposibilă anihilarea tuturora prin metode fezabile.
A fost demonstrat faptul că Streptococcus mutans este înalt cariogen, fiind considerat o
îndelungată perioadă de timp drept agentul etiologic primordial al cariilor dentare. În anul
2003 Marsh și colaboratorii au formulat o nouă teorie: cariile rezultă printr-o modificare a
ecologiei locale, cu alterarea condițiilor de mediu și a microflorei comensale, leziunile nefiind
determinate de un singur agent patogen. Reducerea pH-ului promovează inițial multiplicarea
bacteriilor acidogene, Streptococcus spp. non-mutans și Actinomyces spp., iar ulterior, prin
persistența in timp a condițiilor nefavorabile, multiplicarea speciilor acidurice Streptococcus
mutans și a Lactobacillus spp. care determină demineralizarea dentară. Toate acestea reduc
posibilitatea ca opțiuni terapeutice precum vaccinarea sau terapia țintita antibiotică să fie
realmente eficiente. Utile ar fi mai degrabă îndepărtarea mecanică a biofilmului printr-o
igiena riguroasă a cavității orale și prevenirea acidifierii mediului prin stimularea dezvoltării
bacteriilor non mutans, printr-o alimentație săracă în glucide etc.
Recent s-a demonstrat faptul că procesul de apariție a cariilor dentare este reversibil în stadiile
inițiale, al leziunilor necavitare, dacă se creează condiții favorabile prin îndepărtarea
biofilmului dentar și prin fluorizarea topică.
20. 4. Paradontopatia
20. 4. 1. Introducere
Dacă în trecut se considera că paradontopatia are la bază traume sau malformaţii, acum
principalul factor etiologic este reprezentat de flora microbiană orala (mai ales germenii
anaerobi, Gram negativi). Există şi o teorie imunologică. Aceasta susţine faptul că
mecanismul imun duce la degenerare, retracţie gingivală și la expulzia dentară din alveolă
(boli ale ţesutului colagen).
20. 4. 2. Etiopatogeneză
Există multipli factori care stau la baza etiopatogeniei paradontopatiilor precum: factori
genetici, de mediu, cât și factori locali precum compoziția biofilmului bacterian și răspunsul
inflamator al gazdei (Figura nr. 5).
Acumularea plăcii dentare determină apariția unei reacții inflamatorii la interfața gingivală,
care, la persoanele predispuse, se extinde în profunzime. Datorită plăcii bacteriene
subgingivale apare afectarea țesutului adiacent, rezultând o gingivită cronică. În timp,
procesele inflamatorii locale deteriorează structurile prin care dintele este menținut în alveola
dentară. Bacteriile determină liza ligamentelor de susținere, iar prin cumulul acestor
mecanisme pot rezulta chiar și distrugeri ale țesuturilor osoase. În stadiile finale, prin
resorbția osoasă alveolară, dinții devin mobili și se poate ajunge la edentație.
Există mai multe tipuri de paradontopatii. Prima, din punctul de vedere al frecvenței de
apariție, este forma difuză cronică în etiologia căreia sunt implicați germenii P. gingivalis,
T. forsythia, T. denticola, Eubacterium nodatum și care progresează în zeci de ani, devenind
evidentă clinic la vârste înaintate. Forma difuză agresivă apare la vârste tinere, cu debut la
pubertate și este asociată cu A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, T. forsythia,
Camplylobacter rectus. Există și o formă localizată agresivă, cu afectarea incisivilor și a
primilor molari, dar în acest caz pacienții nu prezintă placă dentară semnificativă și nici
inflamație gingivală. Este suspicionată implicarea A. actinomycetemcomitans și P. gingivalis
în etiologia acestui tip de paradontopatie. Mai special cu privire la aceste două specii
bacteriene, este faptul că pot invada și supraviețui la nivelul epiteliului gingival, unde, prin
mecanisme citotoxice și pro-apoptotice, determină liza leucocitară.
Dar cum anume se declanșează boala? Microorganismele sintetizează enzime proteolitice,
precum gingipainele, care degradează fie structurile paradonțiului, fie chiar moleculele
sistemului de apărare (componente ale sistemului complement, citokine, anticorp).
20. 4. 3. Terapia paradontală
Important de reținut ar fi faptul că biofilmul subgingival prezintă o susceptibilitate redusă la
antibiotice și la mecanismele de apărare ale sistemului imunitar. După curățarea spațiului
subgingival, microorganismele libere din cavitatea bucală recolonizează această regiune. Din
acest motiv terapia sistemică antibiotică nu este recomandată de rutină, fiind utilă la pacienții
cu forme agresive și eventual, la persoanele cu patologii asociate, precum diabetul ori stările
imunosupresive.
Sunt de preferat îndepărtarea mecanică periodică a plăcii dentare la medicul stomatolog,
completată de respectarea măsurilor de igiena orală.
20. 5. Tehnici de diagnostic
Diagnosticul microbiologic al acestor afecțiuni este relativ dificil, deoarece bacteriile
implicate sunt pretențioase, având o serie de necesităţi fiziologice şi biochimice deosebite.
NB. Majoritatea speciilor localizate la acest nivel pot fi identificate numai prin metode ale
biologiei moleculare sau alte tehnici moderne și costisitoare.
Ca şi principiu general al diagnosticului bacteriologic, pentru transportarea produsului
patologic recoltat sunt utilizate 2 medii, unul în aerobioză si unul în anaerobioză. Datorită
tendinţei de co-agregare a bacteriilor, anterior însămânţării pe medii de cultură, tuburile cu
produs patologic trebuie să fie agitate energic. Având în vedere numărul foarte mare de specii
diferite care ar putea fi cultivate, o altă recomandare generală ar fi de a dilua produsul
patologic. Condiţiile de incubare trebuie să fie atât în aerobioză, cât şi în anaerobioză. Geloza-
sânge asigură condiţii de creştere pentru majoritatea speciilor pe care am putea să le studiem
prin metode ale bacteriologiei clasice. Utilizarea mediilor selective (ex. cu bacitracină pentru
S. mutans) sau adăugarea unor anumite suplimente nutritive (ex. acid N-acetil muramic pentru
Tannerella forsythia) permit izolarea speciilor bacteriene identificabile.