AÇÚCARES SOLÚVEIS TOTAIS (ANTRONA)

FUNDAMENTO
É um método específico para hexoses e consiste na hidrólise pelo ácido sulfúrico
concentrado, que quando aquecido com hexoses sofre uma reação de condensação,
formando um produto de coloração verde e lida no espectrofotômetro a 620 nm.
A antrona (C4H10O) é o produto da redução da antraquinona. Foi primeiramente
reconhecida por Dreywood (1946) como reagente específico para muitos carboidratos
em solução de H2SO4 concentrado produzindo cor azul-esverdeada característica. A cor
é atribuída ao produto da reação HMF (hidroximetilfurfural) ou furfural e antrona.
Carboidratos e seus derivados que não dão esses compostos como derivado final,
apresentam uma grande faixa de diferentes cores.
Essas propriedades têm sido utilizadas na análise diferencial das misturas.
A antrona apresenta os melhores resultados quando aplicada a soluções puras de
hexoses ou seus polímeros, os quais produzem a cor azul-esverdeada característica.
Obs.: Como toda reação de condensação, as condições de aquecimento e resfriamento
devem ser estritamente padronizadas em todos os tubos.
O método da antrona tolera uma concentração de metanol ou etanol (em até 5 %
p/v) mas este deve ser evitado.
MATERIAL E REAGENTES
Antrona (9,10-dihidro-9-oxoanthracena); ácido sulfúrico P.A.; Becker ; bastão
de vidro; funil de filtração; pipetas volumétricas; tubos de ensaio; banho-maria para
água fervente; espectrofotômetro; balança analítica .

CURVA PADRÃO:
∗
TUBOS S. PADRÃO VOLUME ÁGUA (mL) ANTRONA (mL)
(mL)
Branco - - 1,00 2
P1 05 µ g 0,05 0,95 2
P2 10 µ g 0,10 0,90 2
P3 15 µ g 0,15 0,85 2
P4 20 µ g 0,20 0,80 2
P5 25 µ g 0,25 0,75 2
P6 30 µ g 0,30 0,70 2
P7 35 µ g 0,35 0,65 2
 P8 40 µ g 0,40 0,60 2
Amostra - 1,00 2
∗
Após colocar a amostra e a água, os tubos devem ir para um banho de gelo, onde
devem permanecer enquanto se coloca o reagente de antrona. Sempre após colocar a
antrona, deve-se agitar os tubos e voltá-los imediatamente para o banho de gelo. Depois
levar os tubos para banho-maria fervente por 8 minutos. Esfriar em água gelada e ler a
absorbância em espectrofotômetro a 620 nm.

PREPARO DAS SOLUÇÕES

Solução padrão de glicose: Pesar 100 mg de glicose pura e dissolver em balão
volumétrico de 1000 mL com água destilada.
Reagente de Antrona: Passar 200 mg de antrona para balão volumétrico (100
mL) e completar o volume com H2SO4 concentrado (exclusivamente MERCK ).
Obs.: Mantenha ao abrigo da luz e refrigerada (4 ºC). solução estável por 3 semanas.

TÉCNICA:
- 1g de polpa;
- Dissolver em 100 mL de etanol 80 %, dependendo da quantidade de amido contido no
fruto. Caso o fruto não tenha amido, extraia só com água;
- Filtrar;
- Retirar alíquota de 10 mL para 100 mL de água (caso a extração tenha sido feita com
álcool);
- Alíquota para leitura;
- Colocar 2 mL de antrona.
REFERÊNCIA:
YEMN, E.W. & WILLIS, A.J. The estimation of carbohydrate in plant extracts
by anthrone. The Biochemical Journal, London, 57:508-14, 1954.

5) AÇÚCARES REDUTORES (DNS)

PREPARO DO REAGENTE - DNS

 (A)- Pesar 2,5 g de DNS (3,5 - Dinitro - Salicílico) e adicionar 50 mL de NaOH
2N (deve ser realizado num becker de 500 mL)
(B) - Pesar 75 g de tartarato de sódio e potássio (Sal de Rochelle), adicionar 125
mL de água destilada. Agitar sob aquecimento até dissolução total.
Posteriormente adicionar o reagente (A) sobre (B), homogeneizando sob
aquecimento até dissolver completamente e depois de resfriada a mistura, completar o
volume da solução para 250 mL.
Procedimento para obtenção da curva padrão de açúcares redutores (AR) a partir
de uma mistura de sol. de glicose 10 mM (= 0,450 g de glicose dissolvida em água
para 250 mL de solução). Também pode-se usar uma mistura de frutose e glicose desde
que apresente a mesma concentração final.

Obs.: Para quantificar os açúcares redutores de um extrato de tecidos convenientemente

preparado, pode-se usar até 1,5 mL do extrato e adiciona-se o reagente de DNS e
posteriormente segue-se as mesmas recomendações para a obtenção da curva padrão.

CURVA PADRÃO:
Tubo Glicose (10mM) Água A.R. A.R. Reagente*
N° (mL) Destilada (µ Moles) (ug) DNS (mL)
1 0,0 1,5 0,0 0,00 1,0
2 0,2 1,3 2,0 360,32 1,0
3 0,4 1,1 4,0 720,64 1,0
4 0,6 0,9 6,0 1080,96 1,0
*Após adição do reagente de DNS, agita-se os tubos e leva-os para banho fervente em
ebulição por 5 minutos. Deixa-se resfriar ( banho de gelo). Completa-se o volume para
10 mL de água destilada, (ou não, conforme o caso), e fazer a leitura a 540 nm.

TÉCNICA:
- 1g de polpa;
- 50 mL de água (homogeneizar);
- Filtrar;
- Pegar no máximo 1,5 mL do filtrado;
- 1 mL de DNS;
- Agitador de tubos;
- Banho-maria (5 min em água fervente);
- Colocar o material em banho de gelo;
- Colocar 7,5 mL de água destilada (2 x 3,75 mL);
- Leitura a 540 nm.
“Branco” - 1,5 mL de água + 1 mL de DNS. Após o banho maria colocar 7,5
mL de água destilada.

Cálculo prático: Curva X = (Y + 0,00379995)/0,0005775242

Absorbância: Y = 0,399 → X = 697,46
Peso da amostra: 1,0084 g
Diluição: 50 mL

1,0084 --------- 50 mL
X --------- 1,5 mL X = 0,030252 g = 30.252 µ g

30.252 µ g ----------- 697,46

100 ----------- Y Y = 2,30 %

REFERÊNCIA:
MILLER, G.L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of
reducing sugars. Analytical Chemistry, Washington, 31:426-8, 1959.