Documente Academic
Documente Profesional
Documente Cultură
TEZA DE DOCTORAT
„ROLUL UNOR PROTEINAZE ÎN ANGIOGENEZĂ ȘI
PROLIFERAREA TUMORALĂ”
- REZUMAT -
CONDUCĂTOR ŞTIINŢIFIC:
Dr. Lorelei Irina Braşoveanu, CS I
DOCTORAND:
Daniela Glăvan
BUCUREŞTI
- 2019-
1
ROMANIAN ACADEMY
ŞTEFAN S. NICOLAU INSTITUTE OF VIROLOGY
BUCHAREST
PhD Thesys
”THE ROLE OF PROTEINASES IN ANGIOGENESIS
AND TUMOUR PROLIFERATION”
SUMMARY
PhD Advisor:
Dr. Lorelei Irina Braşoveanu, CS I
PhD fellow:
Daniela Glăvan
BUCHAREST
- 2019 -
2
CUPRINS Pag.
Introducere 4
Cercetari personale 9
Materiale şi metode 9
Rezultate şi discuţii 11
Concluzii 28
Bibliografie selectivă 32
3
INTRODUCERE
4
receptorilor estrogenici (ER), progesteronici (PgR) și a receptorilor HER2, precum și
evaluarea marginilor de rezecție.
Carcinogeneza este un proces care are loc în mai multe etape în care se produc
modificări distincte, atât moleculare, cât și celulare și presupune trei etape: inițierea, promoția
și progresia tumorala. Proliferarea este o etapă importantă a dezvoltării și progresiei
cancerului. Aceasta se manifestă prin alterarea expresiei și/sau a activității proteinelor legate
de ciclul celular. Activarea mai multor căi de transducție a semnalului stimulează de
asemenea creșterea celulelor. Etapele inițiale ale dezvoltării tumorale sunt asociate cu un
răspuns fibrinogenic și dezvoltarea unui mediu hipoxic care favorizează supraviețuirea și
proliferarea celulelor stem canceroase. O parte din strategia de supraviețuire a acestor celule
se poate manifsta prin modificări ale metabolismului celular. După apariția tumorilor,
creșterea și metastazarea pot fi susținute printr-o supraproducție de hormoni (în cancerele
hormon dependente), prin promovarea angiogenezei, declanșarea autofagiei (Feitelson M.A.,
2015).
Angiogeneza este un proces complex, multistadial, care include interacțiunea dintre
celulele endoteliale, celulele neoplazice și componenţi ai matricei extracelulare. Baza
moleculară a acestui mecanism poate fi creșterea producției de factori angiogenici sau poate fi
pierderea inhibitorilor de angiogeneză. Trecerea la un fenotip angiogenic este reglată de o
schimbare a echilibrului între reglatorii pozitivi și cei negativi (Yadav L. și colab., 2016). În
condiții normale, balanța înclină spre fenotipul anti-angiogenic. Hipoxia reprezintă pricipalul
stimul al “switch-ului” angiogenic. Angiogeneza este reglată de factori de creștere, citokine
proangiogenice, modulatori ai angiogenezei și inhibitori ai neovascularizației.
Glicozilarea aberantă este adesea considerată o “amprentă a cancerului”, jucand un rol
fundamental în dezvoltarea tumorilor și în progresie. Astfel, glicanii au un rol important în
semnalizarea celulelor canceroase, în disocierea și invazia celulelor tumorale, în interacțiunile
celulă- matrix, precum și în angiogeneză, metastazare și modularea imunității. Rezistența la
tratament, scăparea de sub controlul sistemului imun al gazdei, invazia tumorală și
angiogeneza, metastazarea, sunt strâns legate de sialilarea aberantă a glicoproteinelor și
glicolipidelor
Biomarkerii tumorali fac posibilă detectarea și diagnosticul cancerelor încă din
primele stadii de dezvoltare a tumorii. Aceștia pot fi proteine, imunoglobuline, hormoni,
enzime, cu concentrații mult mai mari decât în mod obișnuit.
Perturbarea membranei bazale este o caracteristică a malignității. Matrix
metaloproteinazele (MMP) sunt o familie de endopeptidaze, enzime care joacă un rol
5
important în invazie și metastazare prin degradarea proteolitică a matrixului extracelular, în
migrare și angiogeneză, prin distrugerea adeziunilor celulă-celulă și celulă-matrix. Nivelurile
MMP crescute se corelează cu invazia, metastazele și prognosticul rezervat în multe tipuri de
cancer, iar modelele animale dau dovadă pentru rolul cauzal al activității MMP în progresia
cancerului. Un alt biomarker studiat pentru rolul său în stimularea creșterii și proliferării
celulelor canceroase, precum și la formarea metastazelor, este o altă proteinază, catepsina D,
factor de prognostic în cancer de sân și endometru.
Stresul oxidativ a fost descris pentru prima dată în anul 1985 și se referă la dezechilibrul
dintre radicalii liberi care formează sistemul pro-oxidant și antioxidanții endogeni, fie din
cauza acțiunii exagerate a oxidanților, fie din cauza reducerii capacității de luptă a sistemului
endogen. Rolul speciilor reactive de oxigen (ROS) în cancer a fost investigat intens în ultimii
ani, deoarece acumularea de specii reactive în celulele canceroase, au un rol important în
inițierea și evoluția acestei boli (Dayem A.A. și colab., 2010). ROS reglează fiecare etapă a
dezvoltării tumorii, inclusiv transformarea, supraviețuirea, proliferarea, invazia, metastazarea
și angiogeneza (Prasad S. și colab, 2016). Stresul oxidativ poate provoca angiogeneza în
cadrul carcinomului mamar, deoarece radicalii de oxigen măresc producția de factori
angiogenici (IL-8 și VEGF), promovează secreția de MMP-1, o colagenază care ajută
creșterea vaselor în micromediul tumoral (Brown N.S. și colab., 2000) și activează MMP-2,
posibil prin reacţia radicalilor de oxigen cu grupările tiol din cadrul MMP-2 (Rajagopalan S.,
1996). Rolurile contradictorii ale ROS și stresului oxidativ în cancerul mamar, fie de inducere
și progresie tumorală, fie de prevenire a tumorigenezei prin alte mecanisme, au determinat
diverse grupuri de cercetare să investigheze potențiali modulatori de stres oxidativ, utili în noi
strategii anticanceroase (Gurer-Oslan H. și colab., 2017). Utilizarea antioxidanților exogeni ar
putea îmbunătăți efectele terapeutice potențând activitatea antitumorală a citostaticelor, cât și
reducând toxicitatea acestora asupra țesuturilor sănătoase (Jaiswell A.K., 1994). In plus,
utilizarea imunoterapiei de tipul anticorpilor monoclonali ce țintesc specific celulele maligne,
micro-vasculatura tumoală existentă (ex. Bevacizumab/ Avastin) împreună cu citostatice și
agenți biologici ar putea îmbunătăți răspunsul la terapie atât în cancerul mamar primar, cât și
în cel metastatic.
Medicina translațională, personalizată, completată de noile descoperiri din domeniul
medicinei de precizie, reprezintă o punte de legatură între cercetarea fundamentală și cea
clinică, permițând pe de o parte ca descoperirile cercetătorilor din laborator să fie transferate
în clinică și folosite în diferite trialuri clinice, iar pe de altă parte, datele clinice obținute în
6
diferite studii clinice să poată fi folosite pentru abordări complexe ale unor teme de cercetare,
unor studii in vitro în laboratoarele de cercetare.
SCOPUL, OBIECTIVELE SI ORIGINALIZATEA TEZEI
Scopul tezei de doctorat a constat în evaluarea expresiei unor biomarkeri solubili asociați
proceselor de proliferare celulară, angiogeneză și stres oxidativ în cancerul mamar, care să
poată fi utilizați în clinica oncologica pentru îmbunătățirea procedurilor de diagnostic,
prognostic, evidențierea riscului de metastazare, precum și monitorizarea tratamentului. In
plus, s-a urmarit in vitro efectul modularii de catre agenți chimioterapeutici și/sau biocompuși
a expresiei biomarkerilor luați în studiu.
7
STRUCTURA TEZEI
8
PARTEA EXPERIMENTALĂ
METODOLOGIE
9
Tehnici de laborator utilizate pentru evaluarea expresiei biomarkerilor în seruri sau
supernatante de culturi celulare
- Evaluarea catepsinei D în seruri sau supernatante de cultură s-a făcut după metoda
colorimetrică adaptată dupa metoda lui Capony F. și colab. (1987). În urma hidrolizei
hemoglobinei, în prezența catepsinei D, se eliberează în mediul de reacție produși de hidroliză
solubili în acid tricloracetic, al căror conținut de catepsină D poate fi determinat
spectrofotometric, la = 280 nm.
- Dozarea acidului sialic a fost adaptată după metoda lui după Kattermann&Kriegel
(1981) și se bazează pe oxidarea cu acid periodic, rezultă formarea acidului β-formilpiruvic,
acesta reacționează cu două molecule de acid tiobarbituric și rezultă un cromofor roz, cu
maximul de absorbanță la = 549 nm .
- Determinarea concentrației produșilor de peroxidare lipidică s-a făcut după o metodă
adaptată după Janero D.R. (1990) și se bazează pe reacția MDA cu acidul tiobarbituric, în
urma căreia rezultă un aduct colorat în roșu care prezintă un maxim de absorbție la =535 nm.
- Determinarea concentrației tiolilor albuminici s-a făcut după o metodă adaptată după
Albini A. (1990). Grupările tiol (-SH) se pot cuantifica în urma reacţiei acestora cu acidul
5,5`-ditio-bis (2-nitrobenzoic) - reactivul Ellman.
- Determinarea antioxidanților totali s-a făcut după o metodă adaptată după Benzie
&Strain ( 1996).
Analiza statistică a datelor s-a realizat utilizând programul GraphPad sau Student t test.
Analiza corelațiilor s-a facut prin regresie liniară (indici de corelatie r2, statistic semnificativi
pentru p<0.05).
10
REZULTATE ȘI DISCUȚII
11
Figura 1. Concentrația catepsinei D în serurile pacientelor cu cancer mamar
13
peroxidare lipidică prin măsurarea produsului final malondialdehida (MDA) a relevat o serie
de rezultate individuale grupate în funcție de gradul de difererențiere.
Nivelurilor PX au crescut usor, odată cu creșterea gradului de diferențiere tumorală.
Astfel, media nivelurilor de PX în serurile testate a fost de 5,75 M/100 mL în grupul
pacientelor G1, 5,95 M/100 mL pentru G2 și 6,05 M/100 mL pentru G3, comparativ cu
media valorilor din serurile donatoarelor sanatoase, de 2,11 M/100 mL (Figura 3). Per
ansamblu, media PX în întreg lotul de paciente cu cancer mamar a fost de 5,96 M/100 mL.
Valorile crescute se asociază cu dimensiunea tumorală, dar și cu gradul de diferențiere,
sugerând că tumora este un factor de stres oxidativ.
Generarea stresului oxidativ în cursul procesului de creștere și dezvoltare tumorală
este evidențiată în special prin stimularea peroxidarii lipidice, proces în urma căruia sunt
generate numeroase aldehide cu caracter electrofil, compuși stabili care pot difuza în
interiorul celulei exercitând mai multe efecte citotoxice. Peroxizii lipidici sunt molecule care
se formează prin atacul radicalilor liberi, cum ar fi ROS sau a speciilor reactive de azot
(RNS), asupra reziduurilor de acizi grași polinesaturați (PUFA) sau asupra fosfolipidelor
membranare.
Aceste rezultate sugerează instalarea unui stres oxidativ asociat prezenței tumorale și
incapacitatea sistemelor antioxidante endogene să neutralizeze și să capteze moleculele active
și reactive de oxigen produse de tumoră. Produșii de peroxidare lipidică ar putea fi
responsabili de blocarea ciclului celular și/ sau a mecanismelor apoptotice ducând la scăderea
eficacității terapeutice și instalarea rezistenței la tratament. Excesul de produși de peroxidare
lipidică poate inhiba progresia ciclului celular prin blocarea kinazelor dependente de cicline
menținând celulele tumorale în faza G0, prelungirea fazei G1 și întârzierea intrării în faza S,
reducându-se rata de proliferare a celulelor tumorale. Deși stresul oxidativ intens ar putea fi
eficient în inducerea citotoxicității tumorale, stresul oxidativ moderat indus ar putea avea
efecte contrare contribuind la dezvoltarea mecanismelor de rezistență si scăzând eficacitatea
terapeutică. Mai mult, numeroase studii in vivo și in vitro susțin că celulele și țesuturile
tumorale suferă un stres oxidativ intens, cronic, subletal, comparativ cu celulele normale,
chiar și în lipsa unor stimulări exogene prealabile, fiind absolut necesară pentru viabilitatea și
creșterea tumorală. Stresul oxidativ intens intratumoral poate juca un rol important în procesul
de invazie tumorală și metastazare.
14
b) Determinarea concentraţiei tiolilor albuminici (dupa Albini A., 1990).
Pentru a defini în continuare termenii de stres oxidativ s-a urmărit și modul în care
speciile reactive de oxigen acționează asupra proteinelor, știindu-se că ținta primară o
reprezintă lipidele, iar speciile radicalice extrem de reactive aflate încă în circulație și produse
în exces atacă și dublele legături din structura proteinelor. Tiolii (SH) obținuți în urma acestui
atac pot reprezenta extensia degradării oxidative proteice și astfel, indirect, să fie o măsură a
stresului oxidativ.
Spre deosebire de PX, nivelurilor SH au scăzut în serurile pacientelor cu cancer
mamar comparativ cu lotul martor, atingând valoarea medie de 366,92 mM, scăderea fiind
corelată invers cu creșterea gradului de diferentiere tumorală. Astfel, media nivelurilor SH în
serurile testate a fost de 398,8 mM în grupul pacientelor G1, 372,63 mM pentru G2 și 327,92
mM pentru G3, comparativ cu media valorilor din serurile donatoarelor sănatoase, de 415,27
mM. Acțiunea metaboliților activi ai oxigenului la nivelul proteinelor structurale sau
enzimatice determină denaturarea acestora. Un factor hotărâtor în această reacție de oxidare a
grupărilor –SH proteice de către SRO, este cel steric. Expunerea grupărilor tiolice din proteine
este esențială. Așa se explică creșterea sensibilității la oxidare a proteinelor denaturate
(aceasta proprietate este utilizată ca o metodă eficientă de identificare a conținutului în grupări
tiolice, precum și pentru identificarea structurii secundare și terțiare a proteinelor).
Prin degradarea oxidativă se inhibă activitatea enzimatică, ca urmare a modificării
centrului catalitic activ (datorită oxidarii grupărilor tiolice sau hemului, dar și prin degradari
oxidative ale ciclurilor aromatice din structura unor aminoacizi).
15
general cu starea clinică a pacientelor, cu modul de alimentație, stil de viață și putem afirma
că parametrii investigați pot completa tabloul markerilor utili în monitorizarea eficienței
tratamentului și a evoluției bolii.
Nivelurile AO sunt crescute în serurile pacientelor cu cancer mamar comparativ cu
lotul martor. Testele efectuate au evidențiat o valoare medie a AO de 1368,2 mM, crescută
comparativ cu media valorilor din serurile donatoarelor sanatoase, de 1260 mM. Aceasta
creștere se înregistrează în grupurile pacientelor cu gradul 1 sau 2 de diferențiere. Astfel,
media nivelurilor AO în serurile testate a fost de 1546,6 mM pentru G1 și 1426,48 mM pentru
G2. Media valorilor de AO determinate în serurile pacientelor în G3 a fost de 1001 mM
(Figura 3). Trebuie însă avut în vedere faptul că acest grup a cuprins un numar mic de cazuri.
În foarte multe afecțiuni umane, stresul oxidativ este doar o consecință, nu o cauză a
procesului patologic al bolii. În celula neoplazică, instalarea dezechilibrului dintre producția
de specii reactive de oxigen și eliminarea radicalilor liberi conduce la o stare de stres oxidativ
și la distrugerea unor componente esențiale ale celulei Mai multe studii atestă faptul că
stresul oxidativ rezultat din acest dezechilibru, are un rol cauzator dar este și o consecință a
carcinogenezei, interferând cu toate fazele acestui proces, cum ar fi inițierea, promovarea,
progresia, invazia și metastazarea.
16
De asemenea, unele studii indică prezenţa metastazelor hepatice şi pulmonare, în faza finală a
bolii.
Varianta ascitică a tumorii Walker 256 a fost obţinută de Warren şi Gates (1936),
Planinşek (1965), Agostino şi Cliffton (1959), Comişel (1976), fiind întreţinută şi la ora
actuală, prin pasaje intraperitoneale seriate la şobolani Wistar.
In vederea efectuării experimentelor in vivo pe șololanii purtători de tumoră Walker, s-
au format 2 loturi de șobolani.
Câte 10 șobolani au fost sacrificaţi la 7, 14, 21, 28 şi 35 de zile de la grefă, momente
în care s-a evaluat tumora primară şi s-au recoltat probe biologice: ţesut tumoral, în vederea
obținerii frotiurilor și probe de sânge, în vederea obţinerii serului utilizat în dozările
ulterioare.
Tumora locală a fost măsurată cu ajutorul unui șubler, măsurînd cele două diametre şi
s-a calculat volumul tumoral după formula:
V=1/2LxW²
L=diametrul longitudinal al tumorii (mm)
W=diametrul transversal al tumorii (mm)
35 zile
28 zile
50 21 zile
45 14 zile
40
volum tumoral mm3
7 zile
35
30
25
20
15
10
0 zile
5
0
1 la inoculare
nr zile de
17
cascada proteolitică din timpul invaziei. Catepsina D a avut o valoare crescătoare în cursul
evoluției carcinosarcomului Walker 256., ceea ce este în concordanță cu datele din literatură,
care sugerează că această enzimă joacă un rol direct sau reglator în metastazarea tumorală.
18
inductoare de specii active de oxigen. Aceasta se datorează faptului că lipidele au o distribuție
mare în organism și în membrana celulară, primul atac al radicalilor liberi de oxigen fiind la
acest nivel. In ceea ce privește nivelul tiolilor albuminici (SH) se înregistrează o mărire a
valorilor determinate cu o rată mai mică decât cea a degradarii oxidative a proteinelor,
sugerând și în același timp confirmând datele noastre prin care afirmăm că ținta primară a
atacului oxidativ o reprezintă lipidele și abia apoi, odată cu intensificarea reacțiilor în lanț ,
când se produc în exces radicali liberi, sunt atacate și moleculele proteice.
Ca reacție la creșterea stresului oxidativ de la nivel celular, tumora produce în exces
aceste proteine cu sulf (glutation, cisteină, thioredoxină, etc.) ca și măsură de protecție,
endogenă. Drept urmare, creșterea oxidării proteice la nivel tumoral nu este întotdeauna
recepționată de către organism ca un factor de stres oxidativ și nu se activează concomitent
sistemele naturale de protecție antioxidantă.
Scopul lucrării în această etapă a cercetării a fost să identificăm rolului speciilor
reactive de oxigen în cascada de semnalizare a procesului de angiogeneză. Pentru început, a
fost realizat un model experimental in vivo care a constat în inducerea carcinomului Walker
256 la șobolanii Wistar urmărindu-se parametrii biochimici de stres oxidativ în dinamica
creșterii tumorale.
Determinarea concentrației produșilor SRO
Prima etapă a fost reprezentată de urmărirea creșterii şi dezvoltării tumorale, care
implică în primul rând determinările metrologice macroscopice ale animalelor de laborator
prezentate anterior.
Rata de succes a transferului tumoral a fost bună, existând însă și câteva cazuri de
rejecții în limita marjei de rejecții spontane. Creșterea tumorală înregistrată a fost de până la
60% față de valoarea de la 7 zile post-implant.
La fel ca și în cazul activării catepsinei D, ca și a acidului sialic, mediile valorilor
peroxizilor lipidici cresc de la 5,42 mM/100 mL (înainte de inoculare) la 6,18 mM/100 mL la
7 zile post-implant și 8,75 mM/100 mL la 14 zile dupa inoculare. Rezultatele obținute indică o
creștere a reacțiilor de oxidare manifestată asupra lipidelor, prin creșterea valorilor
malondialdehidei de peste 2 ori. Creșterea este în dinamică, proporțională cu dezvoltarea
tumorii și sugerează încă o dată faptul că tumora este inductoare de specii active de oxigen.
Aceasta se datorează faptului că lipidele au o distribuție mare în organism și în membrana
celulară, primul atac al radicalilor liberi de oxigen fiind la acest nivel.
Intensificarea stresului oxidativ se observă și prin creșterea nivelurilor tiolilor în
sânge. Aceștia care sunt secretați de către tumoră și nivelurile lor sunt direct corelați cu
19
creșterea volumului tumoral și a numărului de zile de la implant. Astfel, la o săptamână după
inoculare, SH crește de la 311 uM la 335 uM, la 14 zile atingând valoarea de 375 uM.
Tumora are un comportament aparte, prin eludarea mecanismelor de control al
creșterii, ea reușește să elaboreze o serie de mecanisme adaptative la factorii de stres.
Odată formate, speciile reactive de oxigen sunt rapid descompuse de către sistemele
antioxidante. Ca si in cazul PX și SH, creșterea AO cea mai accentuată are loc în prima
săptamână de la inoculare, de la 0,66 mM la 0,99 mM. Sistemele naturale de captare au fost
activate ca urmare a instalarii unui stres oxidativ. Ele nu sunt la intensitatea necesară
neutralizarii tuturor reactivilor nou creați. Drept urmare, balanța este în continuare înclinată în
favoarea părții oxidante, în defavoarea antioxidanților.
In concluzie, în această etapă am avut drept scop demonstrarea, validarea ipotezei
conform căreia tumora induce un stres oxidativ crescut, alterează procesele de metabolizare
aerobă consecutiv angiogenezei. Tumora este un factor de stres oxidativ și se supune unei
relații duale de tip cauză-efect. Nu putem afirma dacă stresul oxidativ creat este o cauză sau o
consecință a prezenței tumorii maligne.
20
funcțiile celulare (adeziune, proliferare, apoptoză, transmitere de semnale). Metoda prezintă
avantaje majore faţă de tehnicile convenţionale deoarece nu necesită marcarea celulelor; este
asigurată cinetica în timp real, se poate controla calitatea celulelor vii, oferă un conţinut
informatic crescut. În plus, tehnica are o sensibilitate şi reproductibilitate mare și permite
monitorizarea întregii populaţii celulare. În urma derulării testelor, am obtinut informaţii
despre statusul biologic al celulelor cum ar fi proliferarea/ moartea celulară, blocarea într-o
fază a ciclului celular, modificări morfologice, apoptoza, transmitere de semnale,
citotoxicitate mediată celular sau de către compuși chimici, extracte naturale, compuși
biologic activi. Curbele de creștere în timp real au demonstrat modularea proliferării celulare
de către concentrații scalare de agenți chimioteraputici sau biocompuși. Astfel,
experimentele RTCA s-au realizat pentru celule tratate cu concentrații cuprinse între 1 uM-
100 uM epirubucina (EPI), 10-1000 uM endoxan (EDX) sau 12,5-200uM biocompuși
(quercetina/OCT, resveratrol/RSV sau curcumina/CRM). Datele obținute au permis stabilirea
concentrațiilor și timpilor de lucru.
1.2. Testarea citotoxicității agenților chimioterapeutici și biocompușilor prin metode
colorimetrice (MTS) s-a realizat prin tratarea celulelor cu aceleasi concentrații, ca și în cazul
RTCA, pentru 72h. Datele obținute concordă cu datele obținute prin RTCA. În scopul
evaluarii capacității citotoxice a unor agenţi chimioterapeutici şi a unor biocompuși în liniile
celulare standardizate luate în studiu (LLC-WRC 256 și MCF-7) s-a folosit metoda
colorimetrica MTS. Datele obținute au permis stabiliarea concentrațiilor de lucru pentru
tratarea liniilor celulare, în scopul modularii expresiei și funcțiilor unor biomarkeri. În acest
scop s-a utilizat kit-ul “CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay”
(Promega, SUA).
21
Figura 6. Citotoxicitatea agenților chimioterapeutici
Tratamentele de 72 de ore cu citostatice și Avastin au determinat creșterea procentelor
de liză celulară, și implicit scăderea viabilității celulare. Astfel, tratamentele cu epirubicină
(EPI) au indus o scădere a numărului de celule viabile de la 98,46% pentru concentrația de 1
uM până la 66,22% pentru tratamentele cu 100 uM. Eficiența endoxanului s-a dovedit a fi mai
redusă la concentrații mici, doar concentrația de 100 uM putând induce o liză celulară sub
15%. Avastinul a demostrat o acțiune citotoxicică mai redusă, 25 ug/mL determinând o
viabiliate de 98%, iar 100 uM inducând moartea a 25,17% dintre celule.
22
VEGF în angiogeneză. (Stathopoulos J., 2010). Studii realizate de Oh J.H. și colab.
demonstrează că Quercetina poate avea potențial terapeutic pentru tratamentul cancerului
mamar rezistent la Tamoxifen prin inhibarea Pin1 (Oh J.H. și colab., 2010).
Studiul nostru a arătat că Quercetina administrată înaintea citostaticelor are ca efect
scăderea concentrației de VEGF, deci scăderea angiogenezei. Rezultatele sunt în concordanță
cu cele obținute de Oh J.H. și colab.,
Curcumina, un polifenol natural din turmeric, care prezintă proprietăți puternice
antioxidante, antiinflamatorii și antiseptic, inhibă angiogeneza mediată de VEGF în celulele
endoteliale intestinale uman prin inhibarea COX-2 și MAPK. În plus, s-a constatat că
Curcumina inhibă producția de VEGF de la diferite celule tumorale. (Lin H. și colab., 2015).
Liu Z. și colab. au constatat că efectul inhibitor al Resveratrolului asupra proliferării
celulare crește odată cu creșterea concentrației de Resveratrol. De asemenea, efectul inhibitor
a crescut cu timpul. Resveratrolul a avut un efect inhibitor asupra exprimării VEGF și a
inhibat semnificativ proliferarea celulelor tumorale. Resveratrolul poate exercita un efect
antitumoral prin inhibarea expresiei VEGF în celulele tumorale (Liu Z., Li Y., Yang R.,
2014). În studiul nostru, la concentrația de lucru, Resveratrolul nu a avut o influență marcantă
asupra VEGF, poate probabil trebuia mărită concentrația acestuia.
Curcumina, un polifenol natural din turmeric, care prezintă proprietăți puternice
antioxidante, antiinflamatorii și antiseptice, a fost folosită de secole pentru tratarea
inflamației, a tumorilor și a altor boli. Dovezile acumulate sugerează că curcumina își
manifestă activitatea anti-tumorală prin modularea diferitelor ținte, fie prin interacțiune
directă, fie prin modularea expresiei genelor. S-a demonstrat că posedă activitate
antiangiogenică directă in vitro și in vivo.
Matrix metaloproteinaza- 2 (MMP-2) este o enzimă cu funcții importante în invazia
cancerului mamar și în metastaze, dar nu este clar încă, dacă nivelurile de MMP-2 circulante,
pot prezice riscul de cancer mamar. (Aroner S.A. și colab., 2015). Alți cercetători au
concluzionat că MMP-2 și MMP-9 sunt supraexprimate în cancerul mamar și sunt strâns
legate de metastazarea ganglionilor limfatici și stadializarea tumorii. Astfel, aceste proteinaze
pot fi utilizate ca indicatori de referință pentru ghidarea tratamentului cancerului mamar și
estimarea prognosticului. (Li H. și colab., 2017). În studiul nostru, am constatat că tratamentul
cu Quercetină timp de 24 h a scăzut nivelul de MMP-2 , dar apoi , la 72 h nu a mai avut nici
un efect inhibitor asupra MMP-2. Resveratrolul a avut efect inhibitor asupra MMP-2 la 24 h
de tratament, ca si QCT. Nivelul proteinei MMP-2 a fost examinat în celulele martor,
netratate și celulele tratate cu Quercetină. După tratamentul cu Quercetină de 36 de ore,
23
celulele tratate cu Quercetină (40 µmol) au exprimat un nivel mult mai scăzut al proteinelor
MMP-2 decât celulele martor (0 µmol). Pe baza acestor rezultate, Quercetina a inhibat
nivelurile de proteine p-Akt1, MMP-2 și MMP-9 în linia celulară HCCLM3. (Jun L. și colab.,
2018).
Tang F. și colaboratorii în studiile lor, nu au observat efecte inhibitorii ale
Resveratrolului asupra exprimării MMP-2, migrației și invaziei celulelor canceroase mamare
(Tang F. și colab., 2008).
TIMP-1 este un biomarker care indică un prognostic nesatisfăcător la pacientele cu
cancer mamar triplu negative și țintirea TIMP-1 poate oferi o intervenție terapeutică atractivă
în special pentru aceste paciente. (Cheng G. și colab, 2016).
In ceea ce privește SRO, în urma rezultatelor obținute prin tratarea celulelor cultivate în
mediul specific cu citostatice dedicate tratamentului în cancerul de sân, se observă, așa cum
anticipasem, o creștere a peroxidarii lipidice induse de epirubicină funcție de timp, obținându-
se o relație doză-efect. Endoxanul nu induce oxidare specifică, dar combinația celor doi
compuși crește citotoxicitatea față de celulele normale netratate. Prezența Quercetinei, a
Resveratrolului și a Curcuminei, determină scăderea oxidării lipidelor tot într-un mod
dependent de timp. Cel mai important răspuns este legat de momentul administrării
antioxidanților. Introducerea în mediul de cultură al antioxidanților înaintea citostaticelor,
determină scăderea producerii de metaboliți activi ai oxigenului, ceea ce din punct de vedere
terapeutic, nu reprezintă un beneficiu real citostatic.
Administrarea antioxidanților în cultură după citostatice, nu influențează semnificativ
distrugerea lipidelor prin peroxidare, dar cu siguranță aceste rezultate sunt de real folos în
modelul in vivo și eventual la pacienți, antioxidanții administrați după chimioterapie, pot
diminua efectele secundare asociate.
Rezultatele obținute în același model experimental și care vizează degradarea
oxidativă a proteinelor sunt asemănătoare ca în cazul lipidelor. În dinamica tratamentului
citostatic are loc o degradare oxidativă a proteinelor crescând nivelul tiolilor serici funcție de
timp, adică creșterea concentrației determină efectele scontate citotoxice. Se înregistrează
aceeași relație doză-efect, dată de combinația Epirubicină-Endoxan. Quercetina, Resveratrolul
și Curcumina, au efecte antioxidante doar în concentrație mare, administrate înaintea
citostaticelor.
Măsurarea nivelului antioxidanților totali prin tehnicile mai sus menționate
demonstrează abilitatea Quercetinei, Resveratrolului și Curcuminei să diminueze nivelele
crescute în urma tratamentului cu citostatice. .De altfel această diminuare are loc, așa cum
24
reiese din datele obținute doar când sunt administrate înaintea compușilor chimici cu acțiune
citotoxică.
25
demostrat o acțiune citotoxicică mai redusă, 25 ug/ml determinând o viabiliate de 91,04%, iar
tratamentul cu 100uM determinând scăderea viabilitătii până la 66,53%% dintre celule.
3. Testarea citotoxicității agenților chimioterapeutici și biocompușilor prin analiza
celulară în timp real ( RTCA)
Ca și în cazul LLC-WRC-256, Curbele de proliferare vs. citotoxicitate obținute în
urma tratarii celulelor cu aceleași concentrații de citostatice sau compuși bioactivi au permis
selecționarea concentrațiilor, timpilor de tratament. Rezultatele obținute au fost confirmate de
cele efectuate folosind testul MTS.
26
intensității degradării oxidative a lipidelor. Momentul introducerii în cultură a compușilor
flavonoidici influențează diminuarea stresului oxidativ.
Nu sunt încă elucidate pe deplin mecanismele prin care Quercetina își exercită
activitățile anti-proliferative. Posibilele explicații sunt legate de proprietățile sale antioxidante
și capacitații sale de a inhiba diferite substraturi enzimatice, de a neutraliza agenții anti-
cancerigeni și de a interfera cu căile de semnalizare atât la nivelul transducției semnalului cât
și la nivelul receptorilor celulari. Studii anterioare au demonstrat că acest flavonoid în
concentrații mici este antioxidant, dar poate deveni pro-oxidant atunci când este administrat
în exces. Aceasta constatare este valabilă pentru toți compușii cu structură polifenolică și este
deosebit de important a se avea în vedere momentul în care reacțiile de oxido-reducere în
echilibru, se schimbă.
27
CONCLUZII
1. În scopul realizării unor teste de evaluare a expresiei unor biomarkeri cu rol in diagnosticul,
prognosticul si monitorizarea tratamentului la paciente cu cancer mamar cu risc crescut de
recidivă și/sau metastazare, s-a implementat un studiu pe un lot de 70 de paciente cu cancer
mamar, de la care s-au prelevat fragmente de ţesut tumoral si sânge, în vederea determinărilor
enzimatice şi de stres oxidativ.
2. Pentru realizarea modelului experimental in vivo s-au folosit 60 șobolani Wistar albino,
normali, sănătoşi, cu o greutate medie de 200 g, în vârstă de 8 săptămâni proveniți din
Biobaza Institutului Oncologic ”Prof. Dr. Alex. Trestioreanu” București (I.O.B).
3. S-au implementat doua modelele experimentale in vitro: linia celulară murină de carcinom
LLC-Walker 256 si linia celulara umană de adenocarcinom mamar MCF-7 (ECACC).
4. Pe modelele in vitro implementate s-a efectuat modularea eliberării unor biomarkeri ai
proliferării celulare, angiogenezei și stresului oxidativ de către tratamente singulare de
citostatice și biocompuși, precum și combinații ale acestora.
5. În scopul evaluării capacității citotoxice a unor agenţi chimioterapeutici şi a unor
biocompuși, în liniile celulare standardizate luate în studiu (LLC-WRC 256 și MCF-7) s-a
realizat analiza celulara în timp real (RTCA) cu ajutorul tehnologiei xCELLigence,
detectându-se momentul și concentrațiile optime de aplicare a tratamentului.
6. Din punct de vedere histopatologic, toate pacientele incluse în studiu au fost diagnosticate
cu carcinom invaziv ductal (carcinom glanduliform și trabecular), cu invazia țesutului gras
peritumoral. În ceea ce privește gradul de diferențiere, 6 paciente au avut tumori cu gradul
G1, 54 paciente cu gradul G2 și 10 paciente cu gradul G3. Nici o pacientă luată în studiu nu
prezenta semne clinice sau radiografice de metastaze la distanță.
7. Creșterea nivelurilor catepsinei D s-a corelat cu creșterea gradului de diferențiere tumorală,
media valorilor catepsinei D în serurile pacientelor fiind de 28,31 nM. Astfel, media
nivelurilor de catepsină D în serurile testate a fost de 25 nM în grupul pacientelor G1, 28,13
nM pentru G2 și 31 nM pentru G3, comparativ cu media valorilor din serurile donatoarelor
sănatoase, de 6,65 nM. Concentrația a variat ușor și funcție de vârsta pacientelor, în grupul de
peste 50 de ani fiind de 51,32 nM, față de 46,42 nM în grupul pacientelor până în 50 de ani.
8. Testarea catepsinei D în serurile pacientelor cu cancer mamar s-a realizat în dinamică,
înainte de intervenția chirurgicală și la 6 luni după intervenție. In ambele grupuri de vârstă s-a
constatat reducerea nivelurilor de catepsină D dupa intervenție, de la 46,42 nM la 28,9 nM
28
pentru pacientele până in 50 de ani, și de la 51,32 nM la 27,14 nM pentru pacientele peste 50
de ani.
9. Evaluarea acidului sialic (AS), marker al glicozilării aberante în cancerul mamar, a
evidențiat o creștere a concentrației în serurile pacientelor incluse în studiu, față de lotul
sănătos. Creșterea nivelurilor AS s-a corelat cu cresterea gradului de diferențiere tumorală.
Astfel, media nivelurilor de AS în serurile pacientelor incluse în studiu a fost de 2,72 mM,
distribuite astfel: o medie de 2,49 mM în grupul pacientelor aflate în faza G1, 2,71 mM pentru
G2 și 2,82 mM pentru G3, comparativ cu media valorilor AS din serurile donatoarelor
sănătoase, de 1,92 mM.
10. Nivelurilor PX au crescut ușor, odată cu creșterea gradului de diferențiere tumorală.
Astfel, media nivelurilor de PX în serurile testate a fost de 5,75 M/100 mL în grupul
pacientelor G1, 5,95 M/100 mL pentru G2 și 6,05 M/100 mL pentru G3, comparativ cu
media valorilor din serurile donatoarelor sănătoase, de 2,11 M/100 mL. Per ansamblu, media
PX în întreg lotul de paciente cu cancer mamar a fost de 5,96 M/100 mL. Valorile crescute
se asociază cu dimensiunea tumorală, dar și cu gradul de diferențiere, sugerând că tumora este
un factor de stres oxidativ.
11. Aceste rezultate sugerează instalarea unui stres oxidativ asociat prezenței tumorale și
incapacitatea sistemelor antioxidante endogene să neutralizeze și să capteze moleculele active
și reactive de oxigen produse de tumoră. Produșii de peroxidare lipidică ar putea fi
responsabili de blocarea ciclului celular și/ sau a mecanismelor apoptotice ducând la scăderea
eficacității terapeutice și instalarea rezistenței la tratament.
12. Nivelurile AO sunt crescute în serurile pacientelor cu cancer mamar comparativ cu lotul
martor. Testele efectuate au evidențiat o valoare medie a AO de 1368,2 mM, crescută
comparativ cu media valorilor din serurile donatoarelor sănătoase, de 1260 mM. Aceasta
creștere se înregistrează în grupurile pacientelor cu gradul 1 sau 2 de diferențiere. Astfel,
media nivelurilor AO în serurile testate a fost de 1546,6 mM pentru G1 și 1426,48 mM pentru
G2. Media valorilor de AO determinate în serurile pacientelor în G3 a fost de 1001 mM.
13. În foarte multe afecțiuni umane, stresul oxidativ este doar o consecință, nu o cauză a
procesului patologic al bolii. În celula neoplazică, instalarea dezechilibrului dintre producția
de specii reactive de oxigen și eliminarea radicalilor liberi conduce la o stare de stres oxidativ
și la distrugerea unor componente esențiale ale celulei Mai multe studii atestă faptul că
stresul oxidativ rezultat din acest dezechilibru, are un rol cauzator dar este și o consecință a
29
carcinogenezei, interferând cu toate fazele acestui proces, cum ar fi inițierea, promovarea,
progresia, invazia și metastazarea.
14. Odată cu creșterea tumorii are loc o creștere a concentrației catepsinei D comparativ cu
lotul martor de șobolani neinoculați. Astfel, la o săptamână de la inoculare nivelurile
catepsinei D, ating valoarea medie de 13,37nM, comparativ cu 11,26 nM la lotul martor.
După încă o săptamână, concentrația Catepsinei D aproape se dubleza 25,62 nM, urmând ca
apoi creșterea să nu mai fie atât de accentuată, astfel încat la 5 săptamâni să atingă valoarea de
28,32 nM.
15. Același profil de creștere în corelație cu volumul tumorii îl are și acidul sialic. S-a
constatat că nivelul acidului sialic seric, crește odată cu evoluția tumorii, atingând valori
aproape duble, la 35 zile de la inoculare (3,21 mM), față de momentul inoculării (1,81mM).
La 2 săptamâni de la inoculare nivelurile de acid sialic sunt de 2,62 mM, iar după alte 2
săptamâni nivelul acidului sialic atingă valoarea de 3,15 nM, ceea ce sugerează că sunt
prezente metastaze.
16. Tumorile induc un stres oxidativ crescut, alterează procesele de metabolizare aerobă
consecutiv angiogenezei. Tumora este un factor de stres oxidativ și se supune unei relații
duale de tip cauză-efect. Nu putem afirma dacă stresul oxidativ creat este o cauză sau o
consecință a prezenței tumorii maligne.
17. Odată formate, speciile reactive de oxigen sunt rapid descompuse de către sistemele
antioxidante. Ca și în cazul PX și SH, creșterea AO cea mai accentuată are loc în prima
săptamână de la inoculare, de la 0,66 mM la 0,99 mM. Sistemele naturale de captare au fost
activate ca urmare a instalarii unui stres oxidativ. Ele nu sunt la intensitatea necesară
neutralizarii tuturor reactivilor nou creați. Drept urmare, balanța este în continuare înclinată în
favoarea părții oxidante, în defavoarea antioxidanților.
18. Curbele de creștere în timp real (RTCA) au demonstrat modularea proliferării celulare de
către concentrații scalare de agenți chimioterapeutici sau biocompuși. Experimentele RTCA s-
au realizat pentru celule tratate cu concentrații cuprinse între 1 uM-100 uM epirubucină (EPI),
10-1000 uM endoxan (EDX) sau 12,5-200uM biocompuși (quercetina/OCT, resveratrol/RSV
sau curcumina/CRM). Datele obținute au permis stabilirea concentrațiilor și timpilor de lucru.
19. Tratamentele de 72 de ore cu citostatice și Avastin au determinat creșterea procentelor de
liza celulară, și implicit scăderea viabilității celulare. Astfel, tratamentele cu epirubucină
(EPI) au indus o scădere a numărului de celule viabile de la 98,46% pentru concentrația de 1
uM până la 66,22% pentru tratamentele cu 100 uM. Eficiența endoxanului s-a dovedit a fi mai
redusă la concentrații mici, doar concentrația de 100 uM putând induce o liză celulară sub
30
15%. Avastinul a demostrat o acțiune citotoxică mai redusă, 25 ug/mL determinând o
viabiliate de 98%, iar 100 uM inducând moartea a 25,17% dintre celule.
20. Tratamentul combinat cu EPI si EDX determină o activare mai puternică a catepsinei D,
comparativ cu efectul tratamentului singular cu 10 uM EPI, în ambele modele in vitro
implementate. Adaugarea unui biocompus, cum este RSV, a determinat o creștere a nivelului
de catepsină D eliberată în supernatantele de cultură.
21. Măsurarea nivelului antioxidanților totali prin tehnicile mai sus menționate demonstrează
abilitatea Quercetinei, Resveratrolului și Curcuminei de a diminua nivelurile crescute ale SRO
în urma tratamentului cu citostatice. De altfel această diminuare are loc, așa cum reiese din
datele obținute doar când sunt administrate înaintea compușilor chimici cu acțiune citotoxică.
22. Medicina translațională, personalizată, completată de noile descoperiri din domeniul
medicinei de precizie, reprezintă o punte de legatură între cercetarea fundamentală și cea
clinică, permițând pe de o parte ca descoperirile cercetătorilor din laborator să fie transferate
în clinică și folosite în diferite trialuri clinice, iar pe de altă parte, datele clinice obținute în
diferite studii clinice să poată fi folosite pentru abordări complexe ale unor teme de cercetare,
unor studii in vitro în laboratoarele de cercetare.
31
BIBLIOGRAFIE
1. Albini, A. (1990) Standardization of protein free SH groups in blood plasma. Boll Soc.
Ital. Sperim., 18, 1829- 98.
2. Aroner, S.A., Rosmer, B.A., Tamini, R.M., Tworoger, S.S., Baur, N., Jaos, T.O.,
Hankinson, S.E. (2015) Plasma matrix metalloproteinases levels and breast cancer risk.
Cancer Epidemiol,39(3), 321- 327
3. Benzie, I.F., Strain, J.J. (1996) The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as a
measure of “antioxidant power”: the FRAP assay. Anal Biochem, 15, 239(1), 706.
4. Bray, F., Ferlay,J., Soerjomataram, J., Siegel, R.L., Torre, L.A., Jemal, A. (2018).
Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality
worldwide for 36 cancers in 185 contries. CA Cancer J.Clin., 68 (6), 384 – 424
5. Brown, N.S, Bicknell, R. (2001). Hypoxia and oxidative stress in breast cancer:
Oxidative stress: its effects on the growth, metastatic potential and response to therapy
of breast cancer. Breast Cancer Res, 3(5), 323 – 327.
6. Capony, F., Morisset, M., Barrett, A.J., Capony, J.P., Vignon, F.,Chambon, M., Louisot,
P., Rochefort, H. (1987) Phosphorylation, glycosylation and proteolytic activity of the
52-kD estrogen induced protein secreted by MCF-7 cells. J.Cell. Biol., 104, 253-262
7. Cheng, G., Zielonka, J., Ouari, O., Lopez, M., McAllister, D., Boyle, K., Barios, C.S.,
Weber, J.J., Johnson, B.D., Hardy, M, Dwinwell, M.B., Kalyamaram, B. (2016)
Mitochondria- Enhanced Antiproliferative and Radiosensitizing Effects in Pancreatic
Cancer cell. Cancer Res, 76(13), 3904-15
8. Feitelson, M.A, Arzumanyan, A., Kulathinal, R.J., Blain, S.W., Holcombe,
R.F., Mahajna, J., Marino, M., Martinez-Chantar, M.L., Nawroth, R., Sanchez-Garcia,
I., Sharma, D., Saxena, N.K., Singh, N., Vlachostergios, P.J., Guo, S., Honoki, K., Fujii,
H., Georgakilas, A.G., Bilsland, A., Amedei, A., Niccolai, E., Amin, A., Ashraf,
S.S., Boosani, C.S., Guha, G. ,Ciriolo, M.R., Aquilano, K., Chen, S., Mohammed,
S.I., Azmi, A.S., Bhakta, D., Halicka, D., Keith, W.N., Nowsheen, S. (2015) Sustained
proliferation in cancer: Mechanisms and novel therapeutic targets. Semin Cancer Biol,
35 Suppl:S25-S54. doi: 10.1016 Gan, S.D., Patel, K.R. (2013). Enzyme Immunoassay
and Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, 133 (9), 1–3
32
9. Garcia, M., Plated, N., Liandet, E., Laurent, V., Derocq, D., Brouillet, J.P., Rochefort,
H. (1996) Biological and clinical significance of cathepsin D in breast cancer
metastasis. Stem Cells, 14(6), 642-50
10. Georgescu, D., Comisel, V., Enachescu, F. (2000) Oncobiologie. Ars Docendi,
Bucuresti
11. Gibellini, L., Pinti, M., Nasi, M., Montagna, J.P., De Biasi, S., Roat, E., Bertoncelli, L.,
Cooper, E.L., Cossarizza, A. (2011) Quercetin and cancer chemoprevention. Evid Based
Complement Alternat Med, doi:10.1093
12. Jaiswell, A.K. (1994) Antioxidant response element. Biochem. Pharmacol, 48,439-444
13. Janero, D.R. (1990) Malondialdehyde and thiobarbituric acid-reactivity as diagnostic
indices of lipid peroxidation and peroxidative tissue injury. Free Radic Biol Med; 9,
515-540
14. Kattermann, V.R., Kriegel, R. (1981) Mikromethode zur Besimmung von N-Acetyl-
Neuraminsaure in Glycoproteinen. J.Clin. Chem.Clin. Biochem. 19 , 31-34
15. Li, H., Qui, Z., Feng, L., Wang, C. (2017) The relationship between MMP-2 and MMP-
9 expression levels with breast cancer incidence and prognostic.Oncol Lett, 14(5), 5865-
5870
16. Maio, M., Altomonte M., Calabro L., Fonsatti E. (2001) Bioimmunotherapeutic targets
on angiogenetic blood vessels in solid malignancies. Front Biosci., 6:776-784
17. Rajagopalan, S., Meng, X.P., Ramasamy, S., Harrison, D.G., Galis, Z.S. (1996)
Reactive oxygen species produced by macrophage-derived from cells regulate the
activity of vascular matrix metalloproteinases in vitro. J. Clin. Invest., 98:2572-2579
18. Tang, H., Yuen, K.L., Tang, H.M., Fung, M.C. (2009) Reversibility of apoptosis in
cancer. Br.J. Cancer, 100(1), 118- 122
19. Yadav L., Puri N., Rastogi V., Satpute P., Sharma V. (2015) Tumour Angiogenesis and
Angiogenic Inhibitors: A Review. Journal of Clinical and Diagnostic Research. (6):01-
05.
20. Zhang, Z., Wuhrer, M., Holst, S. (2018) Serum sialylation changes in cancer. Glycoconj
J., 35(2), 139-160
33