INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA,

UNAM

CROMATOGRAFÍA

Curso de Métodos

Romero García Aida Susana

Semestre 2/2002
 Historia de la Cromatografía.

1848 Way y Thompson: Reconocieron el fenómeno de intercambio iónico en sólidos.

1850 Runge, Schoenbein, y Goeppelsroeder: Estudiaron el análisis por capilaridad en papel.

1876 Lemberg: Ilustró la reversibilidad y estequiometría del intercambio iónico en minerales

como el silicato de alumino.

1892 Reed: Separación en columna en tubos de kaolín usados para la separación de FeCI3 y el
CuSO4.

1906 Tswett: Inventó la cromatografía en columna con el uso de solventes puros para
desarrollar un cromatograma, usó adsorventes suaves para resolver una mezcla de
pigmentos, (ver más detalles abajo).

1930 Karrer, Kuhn, y Strain: Usó adsorventes como hidróxido de calcio activado, aluminio y
magnesio

1935 Holmes y Adams: Sintetizó resinas orgánicas para intercambio iónico.

1938 Reichstein: Introdujo la cromatografía líquida o fluida, así extendió las aplicaciones de la
cromatografía a sustancias sin color.

1938 Izmailov y Schraiber: Describieron el uso de la capa fina de alumina extendida sobre un
vidrio.

1939 Brown: Primero que usó la cromatografía circular en papel.

1941 Martin y Synge: Introdujo la cromatografía por partición en columna.

1944 Consden, Gordon, y Martin: Primeros que describieron la cromatografía de partición en

papel.

1947 Boyd, Tompkins, Spedding, Rieman, y otros: Cromatografía de intercambio iónico

aplicada a varios problemas analíticos.

1948 M. Lederer y Linstead: Cromatografía en papel aplicada a compuestos inorgánicos.

1951 Kirchner: Introdujo la cromatografía de capa fina como es practicada ahora.

1952 James y Martin: Desarrollaron de la cromatografía de gas.

1956 Sober y Peterson: Prepararon las primeras celulosas para intercambio iónico.
1956 Lathe y Ruthvan: Usaron almidón natural y modificado como tamiz para la estimación
del peso molecular.
1959 Porath y Flodin: Introdujeron al dextrán entrecruzado como tamiz molecular

1964 J. C. Moore: Desarrolló la cromatografía de permeación en gel.

En 1906, el botánico ruso Mikhail Tswett (1872-1919) formalizó el uso de la cromatografía en

estudios científicos, aplicándola a la separación de los pigmentos naturales que se encuentran en
las plantas (conocidos como carotenoides y clorofilas). Además le dio ese nombre a la técnica.
Tswett empacó una columna de vidrio vertical (de unos cuantos centímetros de diámetro) con
material adsorbente. Luego, por la columna vertical virtió una solución que contenía la mezcla de
pigmentos provenientes de las hojas molidas de una planta. Pasados unos minutos, el material
empacado en la columna había adquirido una coloración diferente por segmentos. Es decir, había
logrado la separación de los pigmentos naturales de la planta. En cada segmento de color definido
había un pigmento diferente.

CROMATOGRAFÍA

La característica que distingue a la cromatografía de la mayoría de los métodos físicos y químicos

de separación, es que se ponen en contacto dos fases mutuamente inmiscibles. La fase
estacionaria y la móvil. Una muestra que se introduce en la fase móvil es transportada a lo largo
de la columna que contiene una fase estacionaria distribuida. Las especies de la muestra
experimentan interacciones repetidas (repartos) entre la fase móvil y la fase estacionaria. Cuando
ambas fases se han escogido en forma apropiada los componentes de la muestra se separan
gradualmente en bandas en la fase móvil. Al final del proceso los componentes separados
emergen en orden creciente de interacción con la fase estacionaria. El componente menos
retardado emerge primero, el retenido más fuertemente eluye al último. El reparto entre las fases
aprovecha las diferencias entre las propiedades físicas y/o químicas de los componentes de la
muestra. Los componentes adyacentes (picos) se separan cuando el pico que sale después es
retardado lo suficiente para impedir la sobreposición con el pico que emergió antes.
Una amplia gama de selección de materiales para las fases móvil y estacionaria, permite separar
moléculas que difieren muy poco en sus propiedades físicas y químicas. En un sentido amplio, la
distribución de un soluto entre dos fases es el resultado del balance de fuerzas entre las moléculas
del soluto y las moléculas de cada fase. Refleja la atracción o repulsión relativas que presentan
las moléculas o iones de las fases competidoras por el soluto y entre sí. Estas fuerzas pueden ser
de naturaleza polar, proviniendo de momentos dipolares permanentes o inducidos, o pueden
deberse a fuerzas de dispersión del tipo London.

Parámetros teóricos que afectan la separación cromatográfica

Comportamiento cromatográfico de los solutos.

El comportamiento cromatográfico de un soluto puede describirse de diversas formas. Considero

ahora importante introducir las definiciones de algunos términos importantes para la
cromatografía en columna (ver figura 1), como son:

Tiempo de retención, tr. El tiempo que un soluto permanece en la columna, se mide desde el
momento de la inyección hasta la elusión del pico máximo. Es característico del soluto para
condiciones de operación constantes. Auxiliar en la identificación de los solutos.

Tiempo muerto, to. El tiempo requerido para eluir un soluto que no se retiene en la fase
estacionaria. Tiempo que un soluto permanece en fase móvil. Representa el espacio vacío de la
columna.

Tiempo de retención ajustado, t’r. Mide el tiempo que el componente permanece en fase
estacionaria.
t’r = tr - to

Ancho a la base, Wb. Es la porción de la línea base intersectada por las tangentes al pico. Para un
pico gaussiano es igual a 4. Tradicionalmente usado en el cálculo de la eficiencia del sistema.
Ancho a la mitad de la altura, W_. Una medida mas reproducible, adecuada para evaluar
manualmente la eficiencia del sistema (platos teóricos).

Número de platos teóricos (N). Cada plato teórico representa un equilibrio teórico de distribución
del soluto entre las fases. El número total de platos teóricos de una columna representa el poder
de separación de la columna. Una buena columna tiene un número alto de platos teóricos. Se
calcula con cualquiera de las ecuaciones:

Comportamiento de retención

El comportamiento de retención refleja la distribución del soluto entre la fase móvil y la

estacionaria. El volumen de fase móvil necesario para transportar la banda de soluto desde el
punto de inyección, a través de la columna, hasta el detector (en el máximo del pico del soluto) se
define como el volumen de retención, Vr. Se puede obtener directamente del cromatograma
multiplicando el tiempo de retención correspondiente, tr, por el gasto o flujo volumétrico, Fc,
expresado como el volumen de fase móvil por unidad de tiempo.
Vr = tr Fc
El gasto o flujo volumétrico, en términos de los parámetros de la columna, depende la sección
transversal de la columna vacía, la porosidad total del relleno (empaque) de la columna y la
velocidad lineal promedio de la fase móvil.

Coeficiente de repartición
Cuando un soluto entra al sistema cromatográfico inmediatamente se reparte o distribuye entre la
fase móvil y la estacionaria. Si la fase móvil se para en cualquier momento el soluto establece un
equilibrio de distribución entre las dos fases. La concentración en cada fase está dada por el
coeficiente termodinámico de partición (o reparto):
K = Cs / Cm
donde Cs y Cm son las concentraciones de soluto en la fase estacionaria y móvil, respectivamente.
Cuando K = 1, el soluto se encuentra igualmente distribuido entre las dos fases. El coeficiente de
reparto determina la velocidad promedio de cada zona de soluto, más específicamente, del centro
de la zona de soluto conforme la fase móvil avanza a lo largo de la columna.

Resolución
El grado de separación o resolución de dos bandas adyacentes se define como la distancia entre
los picos (o centros) dividida entre el ancho promedio de las bandas. Si la retención y el ancho de
la banda se miden en unidades de tiempo (ver figura 2), la resolución está dada por:
2(tr,2 – tr,1)
Rs =
(Wb,2+Wb,1)

donde los tiempos de retención y los anchos se expresan en las mismas unidades. La resolución
mínima aceptable en mezclas sencillas es 1.0 (ver figura 3), una resolución de 1.5 representa
separación a la línea base.

La resolución alcanzada en un sistema es proporcional al producto de la selectividad, la eficiencia

y la capacidad del sistema, que son los tres más importantes parámetros de control en una
columna cromatográfica, siendo la expresión analítica para Rs la siguiente:
 (a-1) k
Rs = _ ( N )
a (1+k)

selectividad capacidad
eficiencia
La resolución de picos adyacentes puede mejorarse ya sea aumentando la separación de los picos
o disminuyendo los anchos de los picos individuales. Esto involucra la selectividad de la columna
cuando se alejan más los picos y la eficiencia cuando se intenta disminuir el ancho del pico.

Factor de Capacidad
El factor de capacidad o retención k es la cantidad más importante de cromatografía en columna.
Relaciona el equilibrio de distribución de la muestra dentro de la columna con las propiedades
termodinámicas de la columna y con la temperatura. Para un conjunto dado de parámetros de
operación, k es una medida del tiempo transcurrido en la fase estacionaria en relación el tiempo
transcurrido en fase móvil. Se define como el cociente de los moles de un soluto en la fase
estacionaria entre los moles en la fase móvil:
Cs Vs Vs
Factor de capacidad k = = K
CmVm Vm
La razón volumétrica de fases, Vm / Vs, se denota usualmente por b. Así, k’ = K / b. Dicho de
otra forma, la razón de reparto es el tiempo adicional que una banda de soluto requiere para eluir,
en comparación con un soluto no retenido (para el cual k’ = 0), dividido entre el tiempo de
elusión de una banda no retenida:
Vr1 - V0
k’ =
V0

Capacidad
La capacidad en un intercambiador iónico es una medida cuantitativa de su habilidad de tomar
contra-iones intercambiables. La capacidad puede ser expresada como la capacidad iónica total,
capacidad disponible o capacidad dinámica. La capacidad iónica total es el número de
sustituyentes cargados por gramo drenado de intercambiador iónico o por mL de gel hidratado.
La capacidad total puede medirse por titulación con un ácido o base fuerte.
Eficiencia
La eficiencia de la columna está relacionada con el ensanchamiento de la banda que se encuentra
en la columna y puede ser calculada:
2
Vr1 donde W1/2 es el ancho del pico a una altura media
N = 5.54 del pico
W1/2
y se expresa como un número de platos teóricos (N) para la columna bajo condiciones
experimentales específicas. La eficiencia es conocida frecuentemente como el número de platos
teóricos por metro de cama cromatográfica, o expresada como H que es la longitud de la cama
(L) dividida por el número de platos teóricos.
H=L/N
A partir de que el valor observado de N depende de factores experimentales tales como la
velocidad de flujo y la carga de la muestra, es importante que las comparaciones sean hechas bajo
condiciones idénticas. En el caso de la cromatografía de intercambio iónico, la eficiencia se mide
bajo condiciones isocráticas, usando una sustancia que no interacciona con la matriz como por
ejemplo, la acetona. Mejorar la cinética del sistema aumenta la eficiencia de la separación.
Una de las principales causas del ensanchamiento de zona en una cama cromatográfica es la
difusión longitudinal de moléculas de soluto. El efecto se minimiza si las distancias disponibles
para difusión, en ambos la fase móvil y la fase estacionaria, son mínimas. En la práctica esto se
logra usando tamaños de cuentas uniformes y pequeños. La mayor eficiencia se logra con
minicuentas de 3mm de diámetro, no porosas diseñadas para aplicaciones analíticas y
micropreparativas. Después del tamaño de cama, el segundo factor importante es una buena
técnica experimental. Las camas cromatográficas empaquetadas irregularmente y burbujas de aire
en ellas, producirán canales, ensanchamiento de la zona y pérdida de la resolución. Las buenas
separaciones requieren columnas bien empaquetadas.

Selectividad
La selectividad (a) se define la habilidad del sistema para separar los picos, por ejemplo la
distancia entre dos picos. El factor de selectividad puede ser calculado del cromatograma usando
la expresión: k2 Vr2 - V0 V r2
a= = =
k1 Vr1 - V0 V r1
Una buena selectividad es un factor muy importante, mejorar la selectividad implica alterar la
termodinámica del sistema cromatográfico.
Rs está relacionada de forma lineal con la selectividad pero relacionada de forma cuadrática con
la eficiencia. Esto significa que un incremento de cuatro veces en la eficiencia es necesario para
duplicar la resolución en condiciones isocráticas.
La selectividad en la cromatografía de intercambio iónico depende no solo de la naturaleza y
número de grupos iónicos en la matriz, también depende del pH y fuerza iónica.

Tipos de cromatografía
La cromatografía puede clasificarse de acuerdo al tipo de equilibrio involucrado, mismo que es
gobernado por el tipo de fase estacionaria utilizada. Así la cromatografía puede ser de (1)
adsorción, (2) partición, (3) intercambio iónico, (4) exclusión, y (5) afinidad (ver figura 4).

1. Cromatografía de adsorción
La fase estacionaria es un sólido en el que los componentes de la muestra son adsorbidos. La fase
móvil puede ser un líquido (cromatografía líquido-sólido) o un gas (cromatografía gas-sólido);
los componentes se distribuyen entre dos fases a través de la combinación de los procesos de
adsorción y desorción. La cromatografía de capa fina (TLC) es un ejemplo especial de
cromatografía por adsorción en la cual la fase estacionaria es un plano, en la forma de un soporte
sólido en un plato inerte.

2. Cromatografía de partición
La fase estacionaria de la cromatografía de partición es un líquido soportado en un sólido inerte.
Otra vez, la fase móvil puede ser un líquido (cromatografía de partición líquido-líquido) o un gas
(cromatografía de partición gas-líquido, GLC). La cromatografía en papel es un tipo de
cromatografía de partición en la cual la fase estacionaria es una capa de agua adsorbida en una
hoja de papel.
Estas son clasificaciones arbitrarias de la técnicas cromatográficas, y algunos tipos de
cromatografía se les considera juntas como una técnica separada, como la cromatografía de gases
para la cromatografía gas-sólido y gas-líquido. En cualquier caso, los equilibrios sucesivos son
los que determinan cuanto tiempo el analito permanecerá unido o se moverá con el eluyente
(fase móvil).
La cromatografía de gases es la técnica a elegir para la separación de compuestos orgánicos e
inorgánicos térmicamente estables y volátiles. La disponibilidad de detectores versátiles y
específicos, y la posibilidad de acoplar el cromatógrafo de gases a un espectro de masas o a un
espectrofotómetro de infrarrojo, amplían aún más la utilidad de la cromatografía de gases.
Un cromatógrafo de gases consiste en varios módulos básicos ensamblados para: 1) proporcionar
un gasto o flujo constante del gas transportador (fase móvil), 2) permitir la introducción de
vapores de la muestra en la corriente de gas que fluye, 3) contener la longitud apropiada de fase
estacionaria, 4) mantener la columna a la temperatura apropiada (o la secuencia del programa de
temperatura), 5) detectar los componentes de la muestra conforme eluyen de la columna, y 6)
proveer una señal legible proporcional en magnitud a la cantidad de cada componente.
Sólo aprox. 20% de los compuestos conocidos permiten ser analizados por cromatografía de
gases, ya sea por que son insuficientemente volátiles y no pasan a través de la columna, o porque
son térmicamente inestables y se descomponen en las condiciones de separación.
La cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC, de high-performance liquid
chromatography) no está limitada por la volatilidad o la estabilidad térmica de la muestra. La
HPLC es capaz de separar macromoléculas y especies iónicas, productos naturales lábiles,
materiales poliméricos y una gran variedad de otros grupos polifuncionales de alto peso
molecular. Con una fase móvil líquida interactiva, otro parámetro se encuentra disponible para la
selectividad, en adición a una fase estacionaria activa. La separación cromatográfica en HPLC es
el resultado de las interacciones específicas entre las moléculas de la muestra con ambas fases,
móvil y estacionaria. Tales interacciones esencialmente no existen en la fase móvil para la
cromatografía de gases. La HPLC ofrece una mayor variedad de fases estacionarias, lo que
permite una mayor gama de estas interacciones selectivas y más posibilidades para la separación.
El recobro de la muestra es fácil en la HPLC. Las fracciones separadas se recolectan en forma
sencilla, colocando un recipiente abierto al final de la columna. El recobro es usualmente
cuantivativo (exceptuando la adsorción irreversible en la columna) y los componentes separados
son fácilmente asilados del disolvente de la fase móvil. Adicionalmente al tipo usual de
compuestos orgánicos, la cromatografía líquida en columna puede manejar separaciones de
compuestos iónicos, productos lábiles de origen natural, materiales poliméricos y compuestos
polifuncionales de alto peso molecular.
En el modo normal de operaciones de partición líquido-líquido, una fase estacionaria polar (p. ej.
agua, metanol) se usa con una fase estacionaria no polar (p. ej. hexano). Esto favorece la
retención de compuestos polares y la elusión de compuestos no polares y se le conoce como
cromatografía fase normal. Si se utiliza una fase estacionaria no polar con una fase móvil polar,
entonces los solutos no polares serán retenidos y los solutos polares eluidos. Esto se conoce como
cromatografía por fase reversa.
El mecanismo de separación en cromatografía de fase reversa depende de interacciones
hidrofóbicas entre las moléculas de soluto en la fase móvil y el ligando hidrofóbico inmovilizado
en la fase estacionaria. La naturaleza actual de las interacciones de unión hidrofóbica asume que
la interacción de unión es el resultado de un efecto entrópico favorable. Las condiciones iniciales
de unión de la fase móvil usadas en la cromatografía de fase reversa son acuosas lo cual indica un
grado alto de estructuras de agua organizadas alrededor de las moléculas de soluto y el ligando
inmovilizado. A medida que el soluto que une al ligando hidrofóbico inmovilizado disminuye el
área hidrofóbica expuesta hacia el disolvente. Así, el grado de organización de la estructura de
agua disminuye con un favorable aumento de entropía en el sistema.

3. Cromatografía de intercambio iónico

La separación en la cromatografía de intercambio iónico depende la adsorción reversible de
moléculas de soluto cargadas, a una resina con grupos iónicos de carga opuesta. El mecanismo de
separación se basa en un equilibrio de intercambio iónico. Muchos de los experimento de
intercambio iónico se llevan a cabo en cinco etapas.
La primera etapa es un equilibrio en el cual el intercambiador iónico se encuentra en las
condiciones apropiadas de pH y fuerza iónica, lo que permitirá la unión de las moléculas de
soluto. En este estado inicial, los grupos que se intercambiarán están asociados con sus
respectivos contra-iones (usualmente aniones o cationes simples, como cloruro o sodio).
En una segunda etapa se encuentra la aplicación de la muestra y su adsorción, en la cual las
moléculas del soluto llevan a cabo el apropiado desplazamiento de carga de los contra-iones y se
unen reversiblemente al gel. Las substancias que no se unen son eluídas de la cama del
intercambiador usando el buffer inicial.
En la tercera etapa, se lleva a cabo la desorción de la muestra cambiando las condiciones de
elusión, al desfavorecer la formación del enlace iónico de las moléculas de la muestra y la cama
del intercambiador. Esto normalmente se logra aumentando la fuerza iónica del buffer de elusión
o cambiando su pH.
En las cuarta y quinta etapas corresponden a la remoción de sustancia no eluídas bajo las
condiciones experimentales previas y regresar al equilibrio de las condiciones iniciales para la
siguiente purificación.
La separación de diferentes sustancias se lleva a cabo porque éstas tienen diferentes grados
interacción con el intercambiador iónico debido a diferencias en sus cargas, densidades de carga
y distribuciones de carga en su superficie. Estas interacciones pueden ser controladas variando
condiciones como la fuerza iónica y el pH. Las diferencias en propiedades de carga de
compuestos biológicos son a menudo considerables, y tomando en cuenta que la cromatografía de
intercambio iónico es capaz de separar especies con propiedades poco diferentes.
Se pueden llevar a cabo separaciones por intercambio iónico en una columna, mediante un
procedimiento en lote o por adsorción en cama extendida.

La matriz. Un intercambiador iónico consiste de una matriz sólida insoluble a la cual se unen de
forma covalente grupos cargados. Los grupos cargados se asocian a contra-iones móviles. Estos
contra-iones pueden intercambiarse reversiblemente a otros iones de la misma carga sin alterar la
matriz.
La matriz puede tener carga positiva o negativa y los contra-iones también. Los intercambiadores
cargados positivamente tienen contra-iones cargados negativamente (aniones) disponibles para
ser intercambiados por lo que son llamados intercambiadores aniónicos. Intercambiadores
cargados negativamente tienen contra-iones cargados positivamente (cationes) y se les conoce
como intercambiadores catiónicos.
La matriz puede estar hecha de compuestos inorgánicos, resinas sintéticas o polisacáridos. Las
características de la matriz determinan sus propiedades cromatográficas tales como su eficiencia,
capacidad y recuperación, así como su estabilidad química, fuerza mecánica y fluidez. La
naturaleza de la matriz afectará su comportamiento hacia sustancias biológicas y el
mantenimiento de la actividad biológica

Grupos cargados. La presencia de grupos cargados es una propiedad fundamental de un

intercambiador iónico, y el tipo de grupo determina el tipo y fuerza del intercambiador iónico; su
número total y disponibilidad determina la capacidad. Hay una variedad de grupos que pueden
escogerse para usarse en intercambiadores iónicos; algunos de estos se muestran a continuación.

Intercambiadores aniónicos Grupo funcional

Dietilaminoetil (DEAE) -O-CH2-CH2-N+H(CH2CH3)2
Aminoetil cuaternario (AEC) -O-CH2-CH2-N+H(CH2CH5)2-CH2-CHOH-CH3
Amonio cuaternario (C) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-N+H(CH3)3

Intercambiadores catiónicos Grupo funcional

Carboximetil (CM) -O-CH2-COO-
Sulfopropil (SP) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CH2-CH2SO3-
Metil sulfonato (S) -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2SO3-

Se usan los grupos sulfónico y amino cuaternario para formar intercambiadores iónicos fuertes,
los otros grupos formar intercambiadores iónicos débiles. Los términos fuerte y débiles se
refieren a la extensión de variación de ionización con pH y no a la fuerza del enlace.
Los intercambiadores iónicos fuertes están completamente ionizados en un amplio rango de pH
mientras que con los intercambiadores iónicos débiles, el grado de disociación y la capacidad de
intercambio varia más marcadamente con el pH.

4. Cromatografía de exclusión por tamaño

En la cromatografía de exclusión puede separarse moléculas solvatadas de acuerdo a su tamaño y
habilidad a penetrar en una estructura tamiz (la fase estacionaria).
La separación en cromatografía de partición y en cromatografía de intercambio iónico se logra de
diferentes interacciones de solutos con la fase móvil y la fase estacionaria. En contraste, las
separación en cromatografía de exclusión por tamaño se lleva a cabo por diferencias en tamaño
molecular y la habilidad de diferentes moléculas para penetrar los poros de la fase estacionaria a
diferentes tamaños o magnitudes.
La cromatografía de exclusión por tamaño se usa extensivamente para las separaciones
preparativas de macromoléculas de origen biológico, así como para la purificación de polímeros
orgánicos sintéticos.

5. Cromatografía de afinidad
Este tipo de cromatografía utiliza interacciones altamente específicas entre un tipo de moléculas
de soluto y una segunda molécula unida covalentemente (inmovilizada) a la fase estacionaria. Por
ejemplo, la molécula inmovilizada podría ser un anticuerpo específico para un proteína particular.
Cuando una mezcla cruda que contiene miles de proteínas se pasa a través de una columna, sólo
una proteína reacciona con el anticuerpo que está unido a la columna. Después de lavar todos los
otros solutos de la columna, la proteína deseada es desplazada del anticuerpo cambiando el pH ,
la fuerza iónica o la polaridad.
Las interacciones entre las moléculas del ligando y blanco pueden ser el resultado de
interacciones hidrofóbicas o interacciones electrostáticas, fuerzas de van der Waals y/o puentes
de hidrógeno.
La purificación por afinidad requiere un ligando bioespecífico que puede ser unido
covalentemente a una matriz cromatográfica. El ligando acoplado debe retener su afinidad
específica de enlace hacia las moléculas blanco, y después de lavar el material no unido, la unión
entre la molécula blanco y el ligando debe ser reversible y permitir que las moléculas blanco sean
removidas en forma activa. Cualquier componente puede ser usado como un ligando para
purificar a su compañero respectivo. Algunas interacciones biológicas típicas usadas
frecuentemente en cromatografía de afinidad son:
¸ Enzima sustrato análogo, inhibidor, cofactor.
¸ Anticuerpo antígeno, virus, célula.
¸ Lecitina polisacárido, glicoproteína, receptor de superficie celular, célula.
¸ Ác. nucleico secuencia base complementaria, histonas, polimerasa de
ácidos nucleicos, proteína de unión al DNA.
¸ Hormona, vitamina receptor, proteína acarreadora.
¸ Glutatión glutatión-S-transferasa o proteínas de fusión GST
¸ Iones metálicos proteínas de fusión poli (his), proteínas nativas con histidina,
residuos de cisteína y/o triptofano en sus superficies.
La matriz. Es un soporte inerte al cual un ligando puede ser directa o indirectamente acoplado.
Algunas características importantes para ésta son:
¸ adsorción no específica extremadamente baja es esencial ya que el éxito de la
cromatografía de afinidad depende de interacciones específicas,
¸ los grupos hidroxilo en los residuos de azúcar pueden servir para unirse a un ligando,
¸ proporcionando una plataforma ideal del desarrollo del medio de afinidad,
¸ la estructura de poro abierta asegura una capacidad de unión alta, aún para biomoléculas
grandes porque el interior de la matriz estaría disponible para el ataque de ligandos,
¸ propiedades de fluido buenas para la rápida separación,
¸ estabilidad bajo un rango de condiciones experimentales tales como pH alto y bajo,
detergentes y agentes disociadores.
El ligando. Es la molécula que se une reversiblemente a moléculas específicas o grupo de
moléculas, capacita la purificación por cromatografía de afinidad.
La selección del ligando para cromatografía de afinidad está influenciado por dos factores:
El ligando debe presentar una afinidad de unión específica y reversible para la sustancia blanco y
debe tener grupos químicamente modificables que permitan ser unidos a la matriz sin destruir su
capacidad de unión.
Brazo espaciador. El sitio de unión de una proteína blanco a menudo se localizan dentro de la
molécula y un medio de afinidad preparado con pequeños ligandos acoplados directamente a la
columna puede exhibir una capacidad de unión baja debido a interferencias estéricas, por
ejemplo, el ligando no podría accesar al sitio de unión de la molécula blanco. En estas
circunstancias un brazo espaciador se pone entre la matriz y el ligando para facilitar la unión
específica. El brazo espaciador puede ser diseñado para máximar la unión específica.

APLICACIONES
La cromatografía de adsorción es particularmente adecuada para el análisis de moléculas no
ionizantes, insolubles en agua y relativamente simples, que frecuentemente son isómeros o
compuestos muy relacionados. El intervalo de compuestos que pueden separarse se extiende
desde los hidrocarburos muy polares hasta compuestos polifuncionales fuertemente polares. Esta
cromatografía se ve poco influida por las diferencias en peso molecular y más por los grupos
funcionales específicos. En consecuencia, la separación por adsorción de compuestos que difieren
solamente en el grado o tipo de sustitución alguilo, como en los miembros de las series
homólogas, es pobre. Esta cromatografía se utiliza en la separación de la vitamina D3 y sus
metabolitos las vitaminas A, D y E (y compuestos muy relacionados a estas vitaminas), muchas
drogas de abuso (LSD, por ejemplo), antidepresivos tricíclicos, bloqueadores beta y los PTH-
amino ácidos. Los aceites naturales y los extractos de esencias se analizan fácilmente y los
pigmentos menos polares de las plantas, tales como los carotenoides y las porfirinas, se han
separado con éxito durante muchas décadas. Los ésteres también son factibles de ser separados,
siendo los glicéridos y los ftalatos típicos de esta clase de compuestos. También han sido
separadas en clumnas de sílice las aflatoxinas y otras micotoxinas.
En química clínica cada vez se realiza con más frecuencia el análisis cuantitativo de las drogas de
abuso por medio de la cromatografía de fase reversa. Los productos farmacéuticos que se
analizan en forma rutinaria incluyen a los barbitúricos, drogas antiepilépticas, analgésicos y
sedantes. Aplicaciones adicionales de los métodos de fase reversa son los conservadores
alimentarios, herbicidas y azúcares. En el campo farmacéutico ha venido en aumento el uso de
esta técnica a costa de la cromatografía de adsorción. Un amplio espectro de biomoléculas,
lipofílicas o iónicas, pequeñas o grandes, pueden ser separadas debido a que el contenido de agua
en la fase móvil puede variar desde el 100% hasta porcentajes muy bajos o ninguno en absoluto.
Los compuestos lipofílicos, tal como los triglicéridos, que tienen una solubilidad muy pobre en
los disolventes acuosos de la fase inversa, con frecuencia pueden separarse con una fase inversa
no acuosa utilizando una columna empacada de octadecilo y disolventes orgánicos polares como
el acetonitrilo o el tetrahidrofurano.
En la actualidad, la cromatografía ha alcanzado tal nivel de fineza y especialización que cada uno
de sus tipos constituyen herramientas imprescindibles en las áreas de la ciencia y la tecnología,
en la industria química, farmacéutica, cosmética, en estudios ambientales, en la clínica, en
alimentos, etc.

Bibliografía
Willard, HH., Instrumental Methods of Analysis, Wadsworth, Inc., U.S.A., 1988.
Handbooks of Amersham Pharmacia Biotech: Ion Exchange Chromatography, Affinity
Chromatography, Hydrophobic Interaction Chromatography, Reversed Phase Chromatography,
Sweden, 2002.
http://gc.discussing.info/gs/b_theory/index.html
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