Dozarea spectrofotometrică în domeniul vizibil (VIS) a colorantului Verde

de Malachit dintr-o probă de analizat

Scopul cercetării constă în determinarea cantitativă a colorantului Verde de

Malachit dintr-o probă de analizat..
Obiectivele lucrării :
- stabilirea și aplicarea unei metode spectrofotometrice de dozare în domeniul Vizibil
(VIS) a colorantului Verde de Malachit;

Cl-
C

CH3
H3C N
+
N
CH3
H3C

Fig. 1 Structura chimică a colorantului Verde de Malachit

denumirea IUPAC: 4-[(4-dimetilaminofenil)-fenil-metil]-N,N-dimetil-anilină), sau :

4-{[4-(Dimetilamino)fenil](fenil)metiliden}-N,N-dimetilciclohexa-2,5-dien-1-imină clorură
M = 364,917 g/mol, formula moleculară: C23H25ClN2. Este foarte uşor solubil în apă
distilată şi în alcool etilic sau metilic absolut. Solubil în acetonă. Insolubil în solvenți organici
nepolari. Din punct de vedere chimic, este un colorant triarilmetanic (trifenilmetanic) .
Este utilizat ca indicator de pH și este cunoscut și sub denumirile de verde de
anilină, verde bază 4, verde diamant B sau verde victoria B, La concentrații mai mari este
foarte toxic și conduce la contaminarea peștelui din crescătoriile piscicole , acvarii, atunci
când colorantul este utilizat ca antifungic, dezinfectant. Este un antifungic și antiparazitar
foarte eficient pentru flora dar în special pentru fauna acvatică (pești) la concentraţii mici și
foarte mici. Verdele Malachit este utilizat des în medicina veterinară ca antiseptic de uz
extern în soluţii apoase diluate 0,5-1%, în tratamentul rănilor infectate în stadiu incipient,
zgârâieturilor. juliturilor, escarelor.

1
 Principiul metodei. Verdele Malachit (Clorura de tetrametil-di-p-amino-trifenil-
carbinol) prezintă o absorbție maximă în domeniul Vizibil (VIS) la lungimea de undă ʎ max .=
617 nm și poate fi dozat spectrofotometric din ape (în cazul poluării), fluide biologice (spută,
ser, salivă, sâmge, urină – în cazul intoxicațiilor), precum și din unele produse farmaceutice
veterinare.
Reactivi necesari şi aparatură
- pulbere standard pură de Verde Malachit;
- soluţie stoc de Verde Malachit, 0,01 % (100 µg/mL) preparată din pulberea
standard pură;
- soluţie standard de lucru de Verde Malachit, 18 µg/mL obţinută prin diluţie cu H 2O
distilată din soluţia stoc;
- soluţii etalon de Verde Malachit (0,18 µg/mL – 2,70 µg/mL);
- probă de dozat ce conţine Verde Malachit;
- apă distilată;
- eprubete gradate de 10 mL.

Etapa 1. Calibrarea (etalonarea ) spectrofotometrului la lungimea de undă λ max. = 617

nm, față de Verdele de Malachit , cu ajutorul soluțiilor etalon de Verde de Malachit (0,18
– 2,70 μg/mL), preparate din pulbere standard pură de Verde Malachit;

Din soluția stoc de Verde Malachit 100 µg/mL (0,01%) se prepară, printr-o diluție cu
H2O distilată, o soluție standard de lucru de lucru Verde Malachit, 18 μg/mL (se măsoară
exact cu pipeta 9 mL de soluţie stoc 100 μg/mL, care se aduc cantitativ cu apă distilată într-
un balon cotat de volum V bc = 50 mL). Din soluția de lucru de Verde Malachit 18 μg/mL
astfel preparată, se obțin șapte soluții etalon de Verde Malachit -, conform tabelului 1. Se
măsoară pe rând absorbanțele soluțiilor etalon obținute în urma reacției de culoare de mai sus,
cu concentrații cuprinse între 0,18 – 2,70 μg/mL în funcție de H 2O distilată ca martor, la
lungimiea de undă λmax. = 617 nm. (tabel 1). Volumul final de soluție în cele 7 eprubete cu
soluții etalon a fost Vf = 10 mL.

2
 Tabel 1
Prepararea soluţiilor etalon de Verde Malachit şi măsurarea absorbanţelor în funcţie
de concentraţii – trasarea dreptei de calibrare a spectrofometrului

Nr. mL soluţie de mL H2O Concentraţiile C (µg/mL) Absorbanţele

det. lucru, 18 µg/mL distilată ale soluţiilor etalon A (ʎmax. = 617
nm)
1. 0,1 9,9 0,18 µg/mL 0.029
2. 0,2 9,8 0,36 µg/mL 0.070
3. 0,3 9,7 0,54 µg/mL 0.093
4. 0,4 9,6 0,72 µg/mL 0.128
5. 1,0 9,0 1,80 µg/mL 0.307
6. 1,2 8,8 2,16 µg/mL 0.371
7. 1,5 8,5 2,70 µg/mL 0.574
-
Cu valorile absorbanţelor redate în tabelul 1 s-a trasat dreapta de calibrare a
spectrofotometrului la lungimea de undă λ = 617 nm în raport cu colorantul Verde Malachit ,
ce a fost redată în figura 1. Important: Valoarea absorbanței probei trebuie să fie cuprinsă
întotdeauna între absorbanțele soluțiilor etalon, pentru ca proba să poată fi dozată
spectrofotometric în UV-VIS.

Fig. 1 Dreapta de calibrare obținută pentru soluțiile etalon de Verde Malachit

( Erori cam mari !)

Trasarea dreptei de calibrare în Microsoft Excel – pentru cine nu știe încă (într-un
document Excel se trec, pe prima coloană în ordine crescătoare, de sus în jos, valorile
concentrațiilor C (μg/mL) iar pe-a doua coloană – valorile absorbanțelor A(λ) . Se selctează

3
apoi, ambele coloane cu toate valorile trecute și se dă comanda Insert → Scatter. Apare
graficul format doar din puncte. Se dă click dreapta pe puncta (se selectează toate punctele)
apare un meniu cu Add Trendline. Se dă click stânga pe această comandă , apare un alt
meniu mare în partea dreaptă cu Format Trendline. Se bifează în acest meniu, în partea de
jos, ultimele 2 căsute (“Display Equation on chart “ și “Display R-squared value on
chart”) . Prin acest fapt, se afișează ecuația dreptei de regresie și valoarea coeficientului
de regresie R2. Se obține astfel Fig.1. Astfel se procedează în toate determinările
spectrofotometrice ale unor analiți din probe , în domeniul UV-VIS.

Calculul concentrațiilor C (μg/mL) ale celor 7 soluții etalon de Verde Malachit

( scrise cu bold → tabelul 1):
Din relația Ci. Vi = Cf . Vf , unde Ci = concentrația inițială a soluției din care am preparat
soluțiile etalon = 18 µg/mL = soluția standard de lucru de Verde Malachit -. Cf = x =
concentrația finală din fiecare eprubetă cu soluție etalon, ce trebuie calculată., Vi =
volumul inițial de soluție standard 18 µg/mL ce trebuie măsurat pentru a prepara fiecare din
cele 7 eprubete etalon (coloana 2 din tabelul 1), iar Vf = volumul final de soluție după
adăugarea tuturor reactivilor și a H2O distillate în fiecare eprubetă cu soluție etalon, Vf = 10
mL.

Eprubeta 1. 18 . 0.1 = Cf 1 . 10 de unde Cf 1= (18 . 0,1) / 10 = 0,18 µg/mL .

Deci Cf 1 = 0,18 µg/mL
Eprubeta 2. 18 . 0.2 = Cf 2 . 10 de unde Cf 2= (18 . 0,2) / 10 = 0,36 µg/mL .
Deci Cf 2 = 0,36 µg/mL
Eprubeta 3. 18 . 0.3 = Cf 3 . 10 de unde Cf 3 = (18 . 0,3) / 10 = 0.54 µg/mL .
Deci Cf 3 = 0.54 µg/mL
Eprubeta 4. 18 . 0.4 = Cf 4 . 10 de unde Cf 4 = (18 . 0.4) / 10 = 0,72 µg/mL .
Deci Cf 4 = 0.72 µg/mL
Eprubeta 5. 18 . 1.0 = Cf 5 . 10 de unde Cf 5 = (18 . 1,0) / 10 = 1,80 µg/mL .
Deci Cf 5 = 1,80 µg/mL
Eprubeta 6. 18 . 1.2 = Cf 6 . 10 de unde Cf 6 = (18 . 1,2) / 10 = 2,16 µg/mL .
Deci Cf 6 = 2,16 µg/mL
Eprubeta 7. 18 . 1.5 = Cf 7 . 10 de unde Cf 7 = (18 . 1,5) / 10 = 2,70 µg/mL .
Deci Cf 7 = 2,70 µg/mL

4
Etapa 2. Prepararea, în paralel, a probei de dozat ce conțin Verde Malachit - și citirea
absorbanței acestei probe AP
S-au cântărit la balanța analitică circa a = 0,0052 g pubere Verde Malachit probă care au fost
aduse cantitativ cu apă distilată la balon cotat de volum V2 = 50 mL cu apă distilată sub
agitare până la dizolvare completă. Apoi s-a completat cu H2O distilată exact până la semn.
Din soluția probă astfel preparată s-a măsurat un volum v = 0,7 mL soluție care au fost aduși
cantitativ într-o eprubetă gradată de volum v2 = 10 mL. S-a adăugat apoi H2O distilată exact
până la 10 mL sub agitare. (9,3 mL H2O). S-a măsurat absorbanța probei la lungimea de undă
ʎ . = 617 nm față de H2O distilată. S-au realizat câte trei determinări și s-a calculat o
max

absorbanță medie a probei AP.

Tabel 2. Valorile măsurate ale absorbanței AP și concentrației probei de Verde
Malachit
Probe Concentrația CP Absorbanța Z % Verde Malachit
(μg/mL) Ap (λmax. = 617 nm) (g % de Verde Malachite pur)
1. 1,024 AP = 0,188 (0,7 mL) Z = 14,066 %

Ap = 0,188 din v = 0,7 mL soluție probă

Etapa 3. Dozarea propriu-zisă a colorantului Verde Malachit din proba de analizat,
calculul concentrației procentuale de Verde Malachit pur din cele a = 0.0052 g probă.
a. Calculul concentrației CP (μg/mL) de Verde Malachit din ecuația dreptei de
etalonare
Ecuațua dreptei de calibrare a fost de forma y = ax + b, unde y = A P = absorbanța
probei, iar x = CP = concentrația probei în µg/mL. S-a obținut AP = a.CP + b, de unde CP =
(AP – b) /a = concentrația probei exprimată în µg/mL. În ecuația dreptei de regresie (fig. 1) :
y = 0,198 x – 0,0147, se înlocuiește y = AP și x = CP și se obține: AP = 0,198..CP – 0,0147.
Dar : AP = 0,188. Din ecuația dreptei de calibrare, CP = (AP + 0,0147) / 0,198 = (0,188 +
0,0147 )/ 0,198, deci CP = 1,024 μg/mL
b. Calculul cantității X(μg) de Verde Malachit pur din v 2 = 10 mL soluție probă (din
eprubeta gradată).
CP µg.....................................1 mL
X µg.......................................v2 mL probă (10 mL), de unde X = CP. v2 = cantitatea
în µg de Verde Malachit pur din v2 = 10 mL (din eprubeta gradată).
Pentru probă, X = 1,024 . 10 = 10,24 µg Verde Malachit pur

5
 c. Calculul cantității Y(μg) de Verde Malachit pur din V 2 = 50 mL soluție (balon
cotat).
Dar X µg....................................v mL soluție probă (v = 0,7 mL)
Y µg.................................V2 mL soluție (b.c.), deci Y = V2. X / v = cantitatea în
µg de Verde Malachit pur din V2 = 50 mL soluție (balon cotat). Se transformă apoi
valoarea lui Y din µg în g.
Pentru probă, Y = (10,24 .50) / 0,7 = 731,43 µg Verde Malachit pur = 0,00073143
g Verde Malachit.
d. Calculul concentrației procentuale Z% de Verde Malachit pur din a = 0,0052 g
probă solidă luată în studiu .
Y .10-6 g pur.............................................a g probă (0,0052 g)
Z %.....................................................100 g probă de analizat, de unde:
Z = (100. Y.10-6) /a = concentrația procentuală (%) de Verde Malachit pur din a = 0,0052 g
pulbere solidă de probă, g % (g % Verde Malachit pur din a g probă de analizat).
Pentru probă, Z = (0,00073143 . 100) / 0,0052 = 14,066 g % Verde Malachit pur
din a = 0,0052 g probă de analizat.
Etapa 4. Calculul unor parametri statistici ai dreptei de regresie (de calibrare).-
liniaritatea metodei
Liniaritatea unui proces de analiză constă în capacitatea de a conduce, în interiorul unui
interval dat, la rezultate direct proporţionale cu concentraţia substanţei analizate, dintr-un
anumit eşantion. Întensitatea semnalului analitic (absorbanţa măsurată) este variază direct
proporţional cu concentraţia, pentru un anumit domeniu. Valoarea acceptată pentru
coeficientul de corelaţie este :r ˃ 0,999, coeficientul de regresie liniară r2 ≥ 0,999.
S-au determinat parametrii statistici ai dreptei de regresie cu ajutorul softului Microsoft
Office Excel 2016., redaţi în tabelul 3.
Limita de detecţie (LD) reprezintă cea mai mică cantitate de analit dintr-o probă ce poate fi
detectată într-un eşantion față de un martor, în condiţii experimentale stabilite. Se exprimă în
aceleaşi unităţi ca şi concentraţia analitului şi se calculează folosind următoarea formulă: LD
= 3 x SE/ Panta (1)
Limita de cuantificare (LC) este dată de cea mai mică concentrație de analit dintr-o probă,
ce poate fi determinată cantitativ (cuantificată) cu o precizie și acuratețe acceptabilă, în
aceleași condiții experimentale date. Valoarea ei s--a exprimat în aceleaşi unităţi ca şi
concentraţia analitului şi s-a calculat astfel: LQ = 10 x SE / Panta (2), unde SE a reprezentat
eroarea standard a dreptei de regresie.
6
Din meniul situat în pareta de sus a paginii în Excel se face click stânga pe DATA → DATA
ANALYSIS. (Dacă nu aveți în meniu DATA ANALYSIS se descarcă : Excel Option – Add
In) Apare o mică fereastră cu o înșiruire de funcții . Se caută funcția REGRESSION, se
selectează și apare alt meniu (Regression). Imput Y range (se selectează toată coloana lcu
valorile numerice ale ui Y – absorbanțele), apoi Imput X range se selectează toată coloana
cu valorile lui X – concentrațiile . Se dă OK și apar încă o foaie Excel cu mai multe tabele.
Se ia primul tabel din foaie:

Tabel 3 . Valorile unor parametri statistici ai regresiei liniare

Parametrii statistici ai regresiei liniare (Regression Statistics)
Coeficientul de corelaţie R 0.9870797
2
Coeficientul de regresie lineară R 0.9743264
Coeficientul de regresie R2 adjustat 0.9691917
Eroarea standard (SE) a dreptei de regresie 0.0350397
Observaţii (valori ale absorbanţelor măsurate) 7

Ecuaţia dreptei de regresie a fost: y = 0.198 x – 0,0147 , sau Ap (λ) = 0,198. Cp –

0.0147 (μg/mL) . Intersecţia cu ordonata a fost 0.0147 (-), iar panta dreptei a fost 0,198.
Coeficientul de regresie R2 = 0,9743264, iar coeficientul de corelaţie R nu s-au situat în
limitele normale de valori , S-au situat mult sub valoarea minimă admisă (0.999) . (tabelul
3), S-a constatat variaţia neproporţională a absorbanţelor măsurate ale soluţiilor etalon cu
concentraţiile acestora (liniaritate foarte slabă a metodei). . Eroarea standard (SE) a dreptei
de regresie a avut valoarea 0,0350397 (valoare prea mare !) (tabel 3)
Limita de detecţie. LD = 3 . 0,0350397 / 0,198 = 0,531 μg/mL, Limita de cuantificare.
LQ = 10 . 0,0350397 / 0,198 = 1,770 μg/mL. (valori cam mari !)

Concluzii
Metoda aplicată pentru dozarea spectrofotometrică în vizibil (VIS) a colorantului Verde de
Malachit – dintr-o probă nu a fost liniară pe întreg domeniul de concentraţii ales 0.18 –
2,70 μg/mL; (din fig. 1 se observă că ultimele trei puncte sunt foarte depărtate de dreaptă )
coeficientul de regresie liniară : R2 = 0,9743264, iar cel de corelaţie R = 0.9870797, nu s-au
încadrat în intervalul normal de valori (R2 ≥ 0,999; R > 0,999). . Eroarea standard a dreptei
de regresie a fost SE = 0,0350397 (valoare mult prea mare ! ) Limita de detecţie, LD =
0,531 μg/mL și limita de cuantificare, LQ = 1,770 μg/mL nu s-au încadrat în limitele

7
normale de valori. Concentrația procentuală de Verde Malachit din a = 0,0052 g probă luate
în lucru a fost Z = 14,066 % Verde Malachit pur = o valoare mult prea mică față de
valoarea reală (80% - 85%) !!