Manual de Procedimientos

Sensibilidad a los antimicrobianos

en Campylobacter spp.

2008
 AUTORES

Bioq. María Celeste Lucero

Bioq. Marcelo Galas

Dto. Bacteriología
Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas
A.N.L.I.S. “Dr. Carlos G. Malbrán”
Centro Regional de Referencia WHO-Global Salm Surv para
América del Sur.

Manual de Procedimientos. Sensibilidad a los antimicrobianos en Campylobacter spp. 2008 -1-

 ÍNDICE
pág.
INTRODUCCIÓN 3
SECCION I. METODO DE DILUCION EN AGAR
1. Introducción 4
2. Interpretación de los resultados 5
3. Agentes Antimicrobianos. 5
4. Procedimiento 6
4.1. Pesada de los antibióticos 7
4.2. Preparación de la solución de antibiótico de trabajo (SAT) 8
4.3. Preparación de las diluciones del antibiótico 8
4.4. Preparación de las placas de agar para la CIM 9
4.5. Secado de las placas 10
4.6. Preparación de los inóculos 10
4.7. Colocación de los inóculos 11
4.8. Siembra de las placas 11
4.9. Incubación 11
4.10. Lectura e interpretación 12
Figura 1. 13
Figura 2. 14
Figura 3. 15
Planilla 1. 16
Planilla 2 17

SECCION II. METODO DE DIFUCION POR DISCOS

1. Materiales 18
2. Soluciones y medios de cultivo 18
3. Procedimiento 18
3.1. Estandarización del inóculo 18
3.2. Siembra de las placas 19
3.3. Colocación de los discos 19
3.4. Incubación de las placas 19
3.5. Lectura de las placas e interpretación de resultados 20
Planilla 1 22

BIBLIOGRAFIA 23

Manual de Procedimientos. Sensibilidad a los antimicrobianos en Campylobacter spp. 2008 -2-

INTRODUCCION

En el presente manual desarrollaremos los métodos para determinar la sensibilidad a

los antimicrobianos para las especies del género Campylobacter.
El estudio de la sensibilidad a los antimicrobianos puede ser realizado mediante
métodos de difusión o dilución. La elección de uno u otro método depende de varios
factores como preferencia, sencillez y rapidez de las técnicas a utilizar, y de la
disponibilidad de recursos de cada laboratorio.
Hasta el año 2003, no había pruebas estandarizadas para estudiar la sensibilidad a los
antimicrobianos en el género Campylobacter. En ese año el National Committee of
Clinical Laboratory Standards (NCCLS), actualmente Clinical and Laboratory
Standards Institute (CLSI), estableció rangos de control de calidad (CC) para 5
antimicrobianos frente al Campylobacter jejuni ATCC 33560 utilizando el método de
referencia: dilución en agar. En 2006 se estandarizó el método de dilución en caldo,
publicado en los documentos M100-S16 y M45-A, con rangos de CC establecidos para
13 antimicrobianos. En este último documento también figuran puntos de corte de
CIM (concentración inhibitoria mínima) para 4 antimicrobianos y se ha incluido el
método de sensibilidad por difusión como una prueba de tamizaje (“screening”) de
resistencia.
A continuación desarrollaremos las metodologías para realizar la técnica de dilución
en agar (método de referencia) y la difusión por discos (“screening” de resistencia),
concentrándonos en los detalles particulares que implica trabajar con cepas del
género Campylobacter y analizando las variables que pueden afectar cada técnica.

Manual de Procedimientos. Sensibilidad a los antimicrobianos en Campylobacter spp. 2008 -3-

SECCION I
Método de Dilución en agar
1. Introducción
Las técnicas de dilución en agar se pueden utilizar para medir cuantitativamente la
actividad "in vitro" de un antimicrobiano frente a un cultivo bacteriano. Este método
se basa en la preparación de una serie de placas con agar Müeller Hinton suplementado
con un 5% de sangre de carnero desfibrinada (AMHS), a las cuales se les agrega el
antibiótico en distintas concentraciones.
Los inóculos estandarizados de los distintos microorganismos se pueden aplicar rápida
y simultáneamente sobre la superficie del agar utilizando un replicador de Steers (ver
foto). La mayoría de los replicadores existentes transfieren de 25 a 36 inóculos a la
vez por cada placa.
Las pruebas se examinan después de incubar 24 hs a 42ºC o 48hs a 36º-37ºC y se
determina la concentración inhibitoria mínima (CIM) del antimicrobiano frente al
microorganismo ensayado. Esta metodología es laboriosa y contempla muchos pasos
por lo que para obtener valores reproducibles intra e interlaboratorios, cada detalle
técnico debe ser cuidadosamente controlado.
Todos los procedimientos que se explican en este manual están basados en el
documento M7 – A7 del CLSI.

Replicador de Steers

Manual de Procedimientos. Sensibilidad a los antimicrobianos en Campylobacter spp. 2008 -4-

2. Interpretación de los resultados
El valor de CIM obtenido por el método de dilución, orienta al médico tratante sobre
qué concentración de antibiótico necesita alcanzarse en el sitio de infección para
inhibir el desarrollo del microorganismo infectante. La CIM, sin embargo, no
representa un valor absoluto. La CIM real puede estar entre la menor concentración
de antibiótico que inhibe al microorganismo y la siguiente concentración
inmediatamente inferior donde se observa desarrollo del mismo. Si por ejemplo,
fueran probadas diluciones al medio y se determina una CIM de 16 µg/ml, el verdadero
valor podría estar entre 16 y 8 µg/ml. Debe tenerse en cuenta que a pesar de realizar
las pruebas de dilución bajo condiciones cuidadosamente controladas, no siempre se
obtienen los mismos resultados. Generalmente, la reproducibilidad de esta prueba es
de +/- 1 dilución.
Cuando se informa al médico el resultado de la CIM, el valor debe ser acompañado por
su correspondiente interpretación (por ejemplo SENSIBLE, INTERMEDIO o
RESISTENTE). En el caso de Campylobacter el año 2006 se han publicado en el
documento M45-A, los criterios de interpretación para eritromicina, ciprofloxacina,
tetraciclina y doxiciclina basados en puntos de corte epidemiológicos, que distinguen
la población susceptible “wild-type” de aquella que ha adquirido algún mecanismo de
resistencia, ya que no se dispone de estudios clínicos ni de datos farmacocinéticos
/farmacodinámicos.

3. Agentes Antimicrobianos
Los antibióticos estándar o de referencia se pueden obtener directamente del
laboratorio productor o de otras fuentes comerciales. No se recomienda la utilización
de las preparaciones para aplicación parenteral.
Para las pruebas de sensibilidad se debe conocer el lote, la potencia (generalmente
expresada en µg/ml, % ó UI/mg de polvo) y la fecha de vencimiento de los
antimicrobianos de referencia.
El almacenamiento de la droga debe hacerse según las recomendaciones del
laboratorio productor, o a una temperatura igual o menor a -20ºC en un desecador
(preferiblemente con vacío) provisto de algún material desecante como gel de sílice o
cloruro de calcio. Cuando se saca el desecador del freezer se debe esperar que tome
temperatura ambiente antes de abrirlo para evitar que el agua de condensación
humedezca las drogas. Las tetraciclinas deberán almacenarse al abrigo de la luz.

Manual de Procedimientos. Sensibilidad a los antimicrobianos en Campylobacter spp. 2008 -5-

3.1. Elección de las concentraciones a ensayar
Para la elección de las concentraciones a ensayar para un determinado antibiótico, se
deberían tener en consideración los puntos de corte para cada antimicrobiano en
particular. Se recomienda elegir el rango de concentraciones de manera tal que incluya
el rango de CIM de la cepa patrón de control de calidad que se desea utilizar. El
número final de concentraciones deberá ser elegido por quien realiza la prueba
teniendo en cuenta las siguientes consideraciones:
- CIM usual de la combinación germen/droga (CIM50 y CIM90 previamente
reportadas en la literatura o basadas en la experiencia previa),
- Punto de corte de sensibilidad y resistencia; y
- Rango aceptable de la cepa de CC (Campylobacter jejuni ATCC 33560) ensayada en
paralelo con las cepas incógnitas (Tabla 3B del documento M100-S16– CLSI).
Para la realización del método de dilución en agar para Campylobacter spp. se sugiere
probar eritromicina y ciprofloxacina, que son los antimicrobianos de primera línea para
el tratamiento de las diarreas por este género y doxiciclina que también puede usarse
como droga de segunda línea. Los rangos de concentraciones de antibióticos a utilizar,
así como el solvente y el diluyente de elección en cada caso se indican en la Tabla 1.

Tabla 1. Rangos de concentraciones, solventes y diluyentes indicados para los

antibióticos seleccionados.

Rango de Concentración de la
Antibiótico diluciones solución de antibiótico Solvente
(µg/ml) de trabajo (SAT) (µg/ml) Diluyente
Ciprofloxacina
0.03 - 512 10240 Agua* Agua
(CIP)
Eritromicina
0.06 - 256 5120 Metanol Agua
(ERI)
Doxiciclina
0.015 - 256 5120 Metanol Agua
(DOXI)

* Agregar la mitad del volumen de agua. Luego gota a gota agregar NaOH 0.1M hasta disolver y completar el
volumen calculado con agua.

4. PROCEDIMIENTO
Materiales:
• Estándar de turbidez equivalente al 0.5 de la escala de Mc Farland
• Tubos de vidrio 13x100mm

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 • Ansas para inocular tipo loop (1-10 µl)
• Mechero tipo Bunsen
• Placas de Petri (9 cm de diámetro)
• Pipetas de 0.1 ml (podrán utilizarse pipetas automáticas)
• Pipetas de 1, 5 y 10 ml
• Micropipetas hasta 1000 µl
• Baño termostatizado (50-55ºC)
• Replicador tipo Steers

Soluciones y medios de cultivo

• Solución fisiológica estéril
• Agua destilada estéril
• Agar Müeller Hinton (AMH)
• Sangre de carnero desfibrinada

Día 1 Comentarios teóricos

4.1. Pesada de los antibióticos

4.1.1. Cálculo de la cantidad de droga a pesar
La cantidad de antibiótico a pesar depende de
varios valores: La pesada de los antibióticos a ensayar
• la concentración de la solución de antibiótico de debe hacerse un una balanza analítica bien
calibrada, con una precisión igual o mayor
trabajo (SAT), que se encuentra en la tercer
al décimo de miligramo, y se debe evitar
columna de la tabla 1, pesar cantidades muy pequeñas de droga
• el volumen de la SAT (aproximadamente 10 ml) debido al alto error que acarrean.
• y la potencia del antibiótico que figura en el
inserto de cada droga.
Para averiguar la cantidad de antibiótico a pesar se
puede hacer el siguiente cálculo:

Pesada de ATB (mg) = Volumen de SAT (ml) x concentración de SAT (µg/ml)

Potencia del ATB (µg/mg)

4.1.2. Cálculo de la cantidad de droga activa.

Para saber cual es exactamente la cantidad de
droga activa hay que utilizar el dato de potencia.
(EJEMPLO: que un antibiótico tenga una potencia En general los antimicrobianos se obtienen
de 930 µg/mg, implica que por cada miligramo de como sales. Esto significa que no todo el
polvo pesado sólo 930 µg tendrán actividad peso de la droga en polvo será activo.
antimicrobiana)

Manual de Procedimientos. Sensibilidad a los antimicrobianos en Campylobacter spp. 2008 -7-

 Completar los datos:

Peso del antibiótico total: __________

Potencia: _________

Cálculo:

1mg droga pesada ---------------________ µg de droga activa (dato de potencia)

____ mg droga pesada -------------- X= _____ µg de droga activa

4.2. Preparación de la solución de

antibiótico de trabajo (SAT)
Para preparar la SAT se debe tener en cuenta el
peso de droga activa (calculado en el punto 4.1.2.) y
la concentración más alta del rango deseado (ver
columna 2 de la tabla 1).
Esto es por que la solución del antibiótico
Se debe tener en cuenta que para el método de
se diluirá 1/20 al ser incorporada al agar
dilución en agar la SAT debe ser 20 veces más (1ml de la solución de antibiótico + 19 ml de
concentrada que la deseada en la placa más AMHS)
concentrada.

Cálculo del solvente necesario para obtener la concentración deseada:

________ µg ---------------- 1 ml
(Concentración deseada)
________ µg ---------------- X=________ml (vol. de solvente para disolver la droga pesada)
(droga activa calculada punto 4.1.2)

Agregar el volumen calculado del solvente apropiado con pipeta de 5 ml.

** Asegúrese de tomar todos los recaudos necesarios para el manejo de solventes
distintos del agua según indicaciones del fabricante **

4.3. Preparación de las diluciones del

antibiótico
La SAT será en todos los casos la primera dilución
del rango (la más concentrada). El objetivo en este
paso es obtener diluciones al medio sucesivas de la
SAT.

Para ello, tomar una gradilla con tubos de

13x100mm dejar el primer tubo vacío y agregar 3ml

Manual de Procedimientos. Sensibilidad a los antimicrobianos en Campylobacter spp. 2008 -8-

de agua destilada al resto de los tubos. Colocar 3
ml de la SAT (con pipeta de 5 ml) en el primer y Un esquema alternativo de dilución del
segundo tubo. Homogeneizar bien el segundo tubo antibiótico se puede obtener en la Tabla 5
del documento M100-S16 del CLSI.
y tomar 3 ml de solución y transferirlos al tercer tubo
de la serie, homogenizar y pasar 3 ml al cuarto.
Repetir este procedimiento hasta el último tubo (ver
fig.1).

Con el fin de controlar la preparación de las soluciones de antibiótico y las condiciones de

la CIM se utilizará la cepa de referencia Campylobacter jejuni ATCC 33560 cuyos rangos
de halos para los antibióticos de trabajo figuran en la Tabla 3B del documento M100-S16
del CLSI.

4.4. Preparación de las placas para la CIM

(ver fig.1)
Tomar los tubos con 18 ml de AMH fundido y
enfriado a 50-55º C (mantenerlos en el baño
termostatizado hasta su utilización). Agregar a cada El agregado de sangre sustenta mejor el
tubo 1ml de sangre de carnero desfibrinada para crecimiento del Campylobacter spp. y hace
obtener una concentración final de 5% y más clara la lectura de la CIM.
homogeneizar bien.
De a una a la vez y empezando por la más diluida,
tomar las diluciones preparadas en el punto 4.3 y
con pipeta de 1 ml o micropipeta, transferir 1ml de La placa de Petri debe alcanzar una
cada solución a un tubo con AMHS (dilución 1/20). profundidad de 3-4 mm con la mezcla agar-
Homogeneizar correctamente cada tubo y volcar antibiótico.
todo el contenido en la placa de Petri que
corresponda. Si se formaran burbujas en la placa,
pasar ligeramente la llama del mechero por la
superficie de la misma para eliminarlas.

Importante: rotular previamente cada placa con

el valor de la concentración final resultante.

Preparar además dos placas con 20 ml de AMHS

sin antibiótico por cada antibiótico, como control de
crecimiento al comienzo y al final de cada serie de
placas.
Este control (placa sin antibiótico) permitirá
conocer la viabilidad de los
microorganismos a los cuales se les
evaluará la sensibilidad.

Manual de Procedimientos. Sensibilidad a los antimicrobianos en Campylobacter spp. 2008 -9-

4.5. Secado de las placas
Antes de inocular los microorganismos, colocar las
placas, abiertas e invertidas, en una estufa de 35º C
por 40 min. o en un equipo de flujo laminar por 15 a
20 min para eliminar el exceso de humedad que
pudieran contener.
4.6. Preparación de los inóculos
La inoculación de las placas se realizará utilizando
un replicador de Steers con capacidad para 33
cepas.
4.6.1. Ajuste del inoculo al patrón de 0.5 Mc
Farland
A partir de un cultivo fresco en placa tomar 3 o 4
colonias del microorganismo a estudiar y
resuspenderlas en un tubo con 3 ml de solución
fisiológica. Ajustar la turbidez de la suspensión por
comparación visual, hasta turbidez equivalente al
tubo 0,5 de la escala de Mc. Farland. Para ello, mire
los tubos contra un fondo blanco con una línea
negra como contraste.
Importante: agitar muy bien el estándar de
turbidez antes de proceder a la comparación
4.6.2. Dilución 1/10 de la suspensión
bacteriana (0.5 Mc Farland) (ver fig. 2 )
Con pipeta de 0.1 o 0.2 ml, transferir 0.1 ml de cada
inóculo ajustado en el punto 4.6.1. a un tubo con 0.9
ml de solución fisiológica. De esta manera se
realiza una dilución 1/10 del inóculo ajustado.
Una vez ajustado, el inóculo debe utilizarse dentro
de los 15 minutos.
Manual de Procedimientos. Sensibilidad a los antimicrobianos en Campylobacter spp. 2008
Es importante que no queden rastros de
humedad sobre la superficie del agar, debido a
que las cepas de Campylobacter spp. tienden a
difundir sobre la placa húmeda. El secado
incorrecto de las mismas puede provocar que
los spots de crecimiento de cepas vecinas se
mezclen dificultando la interpretación de la
prueba.
Evite la sobre desecación de las placas
Para la inoculación de las placas para la dilución
en agar se puede utilizar un replicador tipo
Steers (que deposita simultáneamente múltiples
inóculos) o también puede realizarse con pipeta
o ansa calibrada. La siembra de los inóculos se
realiza por “spot” en la superficie del agar
(aproximadamente 2 µl de suspensión). Cada
4
“spot” debe contener una cantidad neta de 10
bacterias.
Las suspensiones bacterianas preparadas
contendrán aproximadamente 1 x 108
UFC/ml.
Evitar extremos en la densidad del inóculo.
Se obtendrá así una suspensión de ~1 x
107 UFC/ml que será el inóculo de trabajo.
- 10 -
4.7. Colocación de los inóculos (ver fig. 2 )
La colocación de los inóculos obtenidos en el punto
4.6.2. se realizará con pipeta automática,
depositando con mucho cuidado 400 µl de cada uno
de ellos en el pocillo correspondiente de la
policubeta.
IMPORTANTE: asegurarse de no salpicar y
contaminar los pocillos contiguos al que se está
cargando.
Registrar correctamente el nombre de la cepa y la
posición de la policubeta en que se la depositó en el
esquema de la fugura 3.
4.8. Siembra de las placas
La siembra de las placas de antibiótico comienza
con la placa control que sólo contienen MHS y
luego continuar con la serie de placas con
antibiótico comenzando con aquella que posea la
menor concentración.
IMPORTANTE: Se debe hacer una marca en
cada placa de agar antes de comenzar con la
siembra para identificar la ubicación de los
inóculos en la misma
IMPORTANTE: mirar periódicamente que todos
los clavos estén depositando la microgota de
inóculo.
IMPORTANTE: no invertir ni inclinar las placas
hasta que la microgota de inóculo se haya
absorbido.
Manual de Procedimientos. Sensibilidad a los antimicrobianos en Campylobacter spp. 2008
Recuerde agitar muy bien el inóculo de
trabajo antes de proceder a colocarlo en el
pocillo de la policubeta
Verifique que todas las placas estén secas
antes de la siembra.
Sembrando desde la placa con menor
concentración de antibiótico se reduce la
posibilidad de efecto “carry over”. De todas
maneras se debe inocular una segunda placa
control de viabilidad al finalizar la serie
(corresponde a la placa sin antibiótico del
equipo siguiente), para confirmar que no hubo
contaminación ó un significativo efecto "carry
over" de antibiótico durante el procedimiento
que disminuya la viabilidad de los aislamientos.
Cada clavo del replicador de Steers deposita
aproximadamente 1-2 µl, como el inóculo
utilizado tiene 1 x 107 UFC/ml , por cada “spot”
4
quedarán aproximadamente 1-2 x 10 bacterias
que es el inóculo recomendado.
Las placas inoculadas se deben mantener a
temperatura ambiente hasta que el agar
absorba el líquido que acompaña al inóculo pero
no más de 15 minutos
La temperatura óptima de crecimiento de los
Campylobacter termófilos es de 42ºC, pero
también desarrollan aunque más lentamente a
37ºC. Ciertas especies de Campylobacter (C.
jejuni sps. doyleli, C. fetus y C. lari) sólo
desarrollan a 37ºC. por lo tanto la elección de la
temperatura de incubación debe hacerse según
la especie.
Los Campylobacter spp. son microorganismos
microaerófílos por lo que necesitan una
atmósfera con bajo contenido de O2 y al menos
10% de CO2 (5% O2, 10%CO2 , 85%N2).
- 11 -
 Día 2 Comentarios teóricos

4.10. Lectura e interpretación

Para determinar el punto final, las placas deben
recibir la luz directa. La CIM se registrará como el
valor de la menor dilución que inhibe
completamente el desarrollo bacteriano
No se debe considerar el desarrollo de una simple
colonia o una tenue película causada por el
depósito del inóculo.
Si persisten dos o más colonias en
concentraciones superiores al aparente
punto final, o si se encuentra desarrollo a
altas concentraciones y no a bajas, se debe
controlar la pureza del cultivo y
probablemente deba repetirse la prueba.

Debe leerse en primer lugar el desarrollo de cada

cepa en la placa control. Si alguna cepa presenta
un crecimiento muy leve o no se observa
crecimiento, el resultado de esa cepa no debe ser
considerado.

Luego, leer los valores de CIM de C. jejuni ATCC

33560 para eritromicina, ciprofloxacina y doxiciclina. Para poder validar los resultados de CIM
con cada uno de los antibióticos el valor de
Interpretar los resultados con la Tabla 3B del la cepa de CC debe estar dentro del rango
documento M100-S16 del CLSI, y registrarlos en la de concentraciones establecido por la CLSI
Tabla 2. (Tabla 3B del documento M100-S16), de lo
contrario los resultados obtenidos para ese
Una vez validadas las curvas de cada antibiótico no pueden ser aceptados.
antimicrobiano leer los resultados de CIM de las
cepas incógnita e interpretarlos con la Tabla 4 del
documento M45-A del CLSI. Los organismos se
informarán sensibles, intermedios o resistentes
frente al antimicrobiano ensayado. Volcar los
resultados en la Tabla 3.

Manual de Procedimientos. Sensibilidad a los antimicrobianos en Campylobacter spp. 2008 - 12 -

 Figura 1
Dilución en Agar
1. Preparación de la dilución
3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml 3 ml

3 ml
____ml
de H20

3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml* 3 ml*

SAT ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____
____
____ µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml
CIP activa µg/ml
µg/ml
___mg

1 ml
Agregado de 1ml de
sangre de canero
desfibrinada

Tubos con
18ml de Baño a
50°C
MH

20 ml Volumen
Final

Manual de Procedimientos. Sensibilidad a los antimicrobianos en Campylobacter spp. 2008

____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____ ____
µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml

- 13 -
 Figura 2
Dilución en Agar
Preparación y colocación del inóculo

0.1 ml

Cultivo Fresco 0.5 de 0.9 ml

de la Bacteria
McFarland de SF 400 µl

Policubetas de inóculos
del Replicador de Steers

Manual de Procedimientos. Sensibilidad a los antimicrobianos en Campylobacter spp. 2008 - 14 -

 Figura 3. ESQUEMA DE DISTRIBUCIÓN DE LOS
INÓCULOS

Replicador

Manual de Procedimientos. Sensibilidad a los antimicrobianos en Campylobacter spp. 2008 - 15 -

 PLANILLAS PARA REGISTRO DE RESULTADOS
Planilla 2. Resultados de la cepa control de calidad.
Fecha: __/__/____ Temperatura de incubación: ___________

C. jejuni
Antibiótico
ATCC 33560

Rango (µg/ml)
CIM µg/ml
CLSI/NCCLS

0.12 - 1 (36-37ºC)
CIP
0.06 – 0.5 (42ºC)

1 – 4 (36-37ºC)
ERI
1 – 4 (42ºC)

0.5 – 2 (36-37ºC)
DOXI
0.25 – 2 (42ºC)

Manual de Procedimientos. Sensibilidad a los antimicrobianos en Campylobacter spp. 2008 - 16 -

 Planilla 3. Resultados de las cepas en estudio.
Fecha: __/__/____ Temperatura de incubación: _________

Nro de CIP ERI DOX

Cepa CIM CIM CIM CIM
S,I,R S,I,R
µg/ml µg/ml µg/ml µg/ml

Manual de Procedimientos. Sensibilidad a los antimicrobianos en Campylobacter spp. 2008 - 17 -

 SECCION II
Método de Difusión por discos
1. Materiales
• Estándar de turbidez equivalente al 0.5 de la escala de Mc Farland
• Ansas para inocular tipo loop (1-10 µl)
• Pinzas
• Mechero tipo Bunsen
• Discos de antibióticos
• Regla o calibre
• Jarra de anaerobiosis
• Generadores de microaerofilia

2. Soluciones y medios de cultivo

• Solución fisiológica estéril
• Placas de 9 cm de diámetro con agar Müeller Hinton con 5 % de sangre de
carnero desfibrinada (AMHS) con una profundidad del agar de 4 mm.

3. PROCEDIMIENTO

Día 1 Comentarios teóricos

3.1 Estandarización del inóculo

A partir de un cultivo fresco en placa tomar 3 o 4
colonias del microorganismo a estudiar y
resuspenderlas en un tubo con 3 ml de solución
fisiológica.
Ajustar la suspensión por comparación visual hasta
llegar a la misma turbidez del estándar de 0.5 de la
escala de Mc. Farland. Para ello, mire ambos tubos
contra un fondo blanco con una línea negra como
contraste.
Importante: agitar muy bien el estándar de
turbidez antes de proceder a la comparación
Una turbidez equivalente al 0.5 de Mc Farland
representa aproximadamente 108 UFC/ml para
bacterias de rápido crecimiento.
La estandarización de inóculo es esencial ya que
el tamaño de la zona de inhibición depende de la
densidad del inóculo y para la interpretación de
la misma se requiere un inóculo confluente.
Nunca utilice inóculos no estandarizados para el
hisopado de las placas. Evitar extremos en la
densidad del inóculo.

Manual de Procedimientos. Sensibilidad a los antimicrobianos en Campylobacter spp. 2008 - 18 -

3.2 Siembra de las placas
Dentro de los 15 minutos después de ajustado el
inóculo siembre las placas de AMHS con un hisopo
estéril.
Importante: las placas deben secarse bien antes
de usar.
Presione el hisopo contra las paredes del tubo a fin
de escurrir el exceso de inóculo.
Siembre la superficie seca de las placas de AMHS
por hisopado en tres direcciones para asegurar una
completa distribución del inóculo.
Espere de 3 a 5 minutos (pero no más de 15 min)
antes de aplicar los discos para que el exceso de
humedad superficial sea absorbido.
3.3 Colocación de los discos
Colocar los discos sobre la superficie del agar con
pinza estéril aplicando una ligera presión.
La colocación de los discos se realizará según
figura 1
3.4 Incubación de las placas
Incubar las placas invertidas dentro de los 15
minutos posteriores a que los discos fueron
aplicados, a 42oC por 24 horas o a 36-37oC por 48
hs. en ambiente microaerofílico (10 % CO2, 5% O2 y
85% N2).
Manual de Procedimientos. Sensibilidad a los antimicrobianos en Campylobacter spp. 2008
Las placas de AMHS para realizar la difusión por
discos deben tener un espesor de 4±0.5 mm. El
agregado de 5% de sangre de carnero
desfibrinada sustenta mejor el crecimiento del
Campylobacter spp. y hace más clara la lectura
de los halos de inhibición.
El agua de condensación sobre la superficie del
agar provoca la difusión del Campylobacter spp
y produce halos irregulares.
Resultados reproducibles y confiables requieren
una inoculación homogénea de las placas.
Debido a que algunas drogas difunden casi
instantáneamente, un disco no debe ser
removido una vez que tomó contacto con la
superficie del agar. Si el disco es movido, la
carga de antibiótico del mismo será menor que la
que estandarizada, por lo que se observará una
tendencia a la falsa resistencia.
Debido a que los diámetros de los halos
esperados con algunos antimicrobianos
frente a las cepas de Campylobacter spp.
miden entre 30 y 50 cm., no deben colocarse
más de 3 discos por placa de 90 mm.
La temperatura óptima de crecimiento de los
o
Campylobacter termófilos es de 42 C, pero
también desarrollan aunque más lentamente a
37oC. Ciertas especies de Campylobacter (C.
jejuni sps. doyleli, C. fetus y C. lari) sólo
o
desarrollan a 37 C. por lo tanto la elección de la
temperatura de incubación debe hacerse según
la especie.
- 19 -
 Figura 1
Esquema sugerido para la colocación de los discos

CIP

ERI
TET

CIP: ciprofloxacina; TET: tetraciclina; ERI: eritromicina.

Día 2 Comentarios teóricos

3.5 Lectura de las placas e interpretación de

resultados
Las pruebas de sensibilidad deben ser
Examine y verifique la pureza del inóculo. realizadas de cultivos puros. Si se produjera
contaminación durante la realización del ensayo,
generalmente esta puede ser fácilmente
detectada examinando la placa del
antibiograma.

La presencia de colonias aisladas indica un

Examine y verifique que el crecimiento sea inóculo bacteriano de densidad inferior al
confluente. estandarizado. Se deberá repetir la prueba. Lo
mismo si el inóculo bacteriano fuera más denso
Si las placas fueron satisfactoriamente hisopadas y que el recomendado.
el inóculo fue el correcto, las zonas de inhibición
serán uniformemente circulares
Colonias mayores creciendo dentro de la zona
Mida los diámetros de las zonas de inhibición. El de inhibición deberán ser subcultivadas,
reidentificadas y reensayadas.
punto final deberá tener en cuenta el área que no
muestre desarrollo obvio a ojo desnudo, no
incluyendo velo de crecimiento o colonias muy
pequeñas que puedan ser detectadas solo con
mucha dificultad en el borde de la zona.

Manual de Procedimientos. Sensibilidad a los antimicrobianos en Campylobacter spp. 2008 - 20 -


Los discos que no presenten halos de inhibición
pueden ser interpretados como resitentes.
Utilice la Planilla 1 para el registro de los resultados
Manual de Procedimientos. Sensibilidad a los antimicrobianos en Campylobacter spp. 2008
El documento M45-A del CLSI no incluye puntos
de corte para Campylobacter spp. para el
método de difusión por discos; pero propone
esta técnica como un screening de resistencia.
Los antimicrobianos que no presentan zona
de inhibición frente a un determinado
aislamiento se correlacionan completamente
con CIMs que indican la presencia de un
mecanismo de resistencia. Pero la
interpretación de zonas de inhibición
distintas de 6mm se considera problemática
por gran variabilidad en las lecturas de las
zonas de inhibición debido a crecimiento
difuso o tipo pátina en los bordes de los
halos.
- 21 -
 Planilla 1. Resultados de las cepas en estudio.
Fecha: __/__/____ Temperatura de incubación: _________

Nro de CIP ERI DOX

Cepa Halo Halo Halo
Interpr. Interpr. Interpr.
mm mm mm

Manual de Procedimientos. Sensibilidad a los antimicrobianos en Campylobacter spp. 2008 - 22 -

 BIBLIOGRAFIA

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S13. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Wayne, PA

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Manual de Procedimientos. Sensibilidad a los antimicrobianos en Campylobacter spp. 2008 - 23 -