Curs 5

Mecanismele prezentării selective a antigenelor de către

moleculele MHC
Limfocitul. Metode de studiu

Mecanismele prezentării selective a antigenelor de către moleculele MHC

Deși ambele categorii de molecule MHC sunt sintetizate și asamblate în reticulul

endoplasmic rugos (RER) ele prezintă diferențiat deteminantul antigenic pentru că se
cuplează cu acesta în subcompartimente celulare diferite.

Moleculele MHC-I

Lanțurile 𝞪 și 𝞫 se sintetizează în RER, dar asamblarea lor și configurarea lor spațială sunt
procese complexe asistate de șaperonine și foldaze care în ansamblu participă la formarea și
ghidarea complexului molecular.
Șaperoninele…
● controlează foldarea (împahetarea) lanțurilor peptidice prin împiedicarea agregării lor
● marchează proteinele cu defecte structurale în structurile primară, secundară, terțiară,
pe care le dirijează spre sistemul ERAD (degradare asociată reticulului endoplasmic)
Foldazele…
● accelerează foldarea proteinelor
● asigură precizia foldării, catalizând reacții de izomerizare

Primul care se elaborează este lanțul 𝞪, la început foarte relaxat, încă nu prezintă domeniile
caracteristice. El va fi adus la conformația spațială adecvată prin cuplarea cu o șaperonină -
calnexina. În acest ansamblu, lanțului 𝞪 îi crește afinitatea pentru lanțul 𝞫, care se sintetizează
între timp și se va asocia lanțului 𝞪. După asocierea 𝞪-𝞫-calnexină, la acest complex se
asociază calreticulina, și o foldază - ERp57 - care se pare că favorizează formarea punților
disulfurice. Cănd se asociază calreticulina, se desprinde calnexina, complexul
𝞪-𝞫-calreticulină-ERp57 va ineracționa cu tapasina, o proteină care facilitează încărcarea
optimă a moleculelor MHC-I cu epitopi. În lumenul reticului endoplasmic, tapasina
recrutează moleculele MHC-I către transportorul TAP (transporter associated with antigen
processing), care transportă epitopii în reticulul endoplasmic. După încărcarea cu epitopi cu
înaltă afinitate, interacțiunea dintre MHC-I și tapasină încetează. TAP aparține familiei
ATP-binding cassette transporter și transportă peptide (provenite din proteine celulare
endogene) din proteozomi în reticulul endplasmic, unde vor fi legate la moleculele MHC-I
născânde.
Structua TAP este formată din două proteine TAP-1 și -2, care au fiecare căte o regiune
hidrofobică, și o regiune ATP-binding. când peptidul leagă TAP, se produce izomerizarea
complexului și astfel modificarea conformațională declanșează hidroliza ATP, și se inițiază
astfel transportul peptidului. Cele două TAP 1 și 2 acționează impreună pe principiul inchis/
deschis, lăsând să treacă câte un epitop format din 8-10 aminoacizi.
Complexul 𝞪-𝞫-calreticulină-ERp57-TAP-tapasina acționează împreună pentru a ține
moleculele MHC-I până când vor fi complet încărcate cu peptide. După încărcare,
complexele MHC-I-epitopi se desprind din interacțiunea cu celelealte proteine (foldaze,
transportori etc) și vor fi translatate mai departe prin aparatul Golgi și apoi pe membrana
celulară externă, în vederea prezentării epitopului către limfocitele T citotoxice sau supresor.

Moleculele MHC-II

În RER se sintetizează ambele lanțuri 𝞪 și 𝞫, împreună cu încă un lanț - invariant chain - Ii,
formând împreună un complex trimeric, incapabil sa lege peptide/epitopi, Trimerul - 𝞪-𝞫-Ii -
este transportat în aparatul Golgi și semnalele intracitoplasmatice inițiate de Ii conduc
complexul pe o cale endolizozomală, unde lanțul Ii va fi supus proteolizei și degradat gradual
de catepsine la un mic fragment rămas asociat moleculei MHC-II - the class II-associated Ii
chain peptide - CLIP. În compartimentul specializat lizozom-like, interactiunea complexului
𝞪-𝞫-CLIP cu un alt dimer, anume HLA-DM, face posibilă indepărtarea CLIP și legarea
peptidului epitop la molecula MHC-II rămasă. HLA-DM are mare afinitate pentru CLIP și
astfel catalizează schimbul CLIP cu peptidele antigenice din endolizozom rezultate din
prelucrarea antigenului nativ exogen după ce a fost endocitat/fagocitat de APC.
Prezentarea selectivă a antigenelor de către moleculele MHC-I și -II, ambele sintetizate în
RER se realizează prin faptul că ​Ag endogen tranzitează RER, fiind transportat din
proteozomi in RER și cuplat aici la moleculele MHC-I, iar ​Ag exogen tranzitează endozomii,​
unde se leagă la moleculele MHC-II, care până în acest moment au fost blocate de Ii și apoi
de CLIP.

Limfocitul

Metode de identificare, separare și de studiu pentru limfocite

Cercetarea în imunologia celulară se poate face pe suspensii de celule cu un grad înalt de

puritate, ceea ce face necesară punerea la punct a unor metode de separare a populațiilor
celulare și de purificare a lor. Aceste metode se bazează pe particularitățile biologice ale
acestor celule, cum ar fi…
● existența unor markeri membranari specifici, aceștia fiind de regulă receptori care pot
interacționa cu anumiți liganzi. Pe baza acestei proprietăți s-au pus la punct tehnicile
de rozetare și imunofenotiparea sau citometria în flux (flow-cytometry).
● îndeplinirea de către celule a unor funcții biologice, cum ar fi funcția de fagocitoză.
Fagocitoza realizată de granulocite și monocite poate fi evaluată în sânge sau culturi
celulare folosind citometria în flux sau imunofluorescența. Alte metode folosesc
câmpul magnetic, pentru că macrofagele pot fagocita in vitro particule cum ar fi fierul
coilodal, acesta ajungând în lizozomi. Celulele puse în câmp magnetic se pot separa
de cele care nu au fagocitat fierulcoloidal.
● aderarea la anumite suprafețe. In vitro, în anumite condiții, macrofagele, unele
populații de limfocite T și limfocitele B pot adera la coloana de fibre de nylon, sticlă
sau plastic, pentru că aceste celule pot exprima molecule de adeziune dacă li se oferă
condiții optime.
● exprimarea pe membrane a anumitor receptori care pot recunoaște și liga anumiți
liganzi, ceea ce face posibilă separarea celulelor cu ajutorul cromatografiei de
afinitate. Prin ligarea liganzilor respectivi, celulele își cresc greutatea și își schimbă
potențialul electric de suprafață.
● mărimea diferită și viteza de sedimentare diferită pentru diversele tipuri de celule.
Separarea celulelor se realizează prin traversarea diferențiată a unui gradient de
densitate fie liber (cum se pot separa limfocitele și monocitele prin sedimentare liberă
în mediu de dextran, de exemplu), fie prin centrifugare (cum se pot separa
mononucleatele și granulocitele prin centrifugare în gradient de densitate). Produse
care au diferite gradiente de densitate - Ficol-Odiston, dextran, sucroza, percoll - pot
fi preparate în funcție de numărul de celule care urmează a fi separate.
Separarea limfocitelor și monocitelor din sângelele periferic prin centrifugare în
gradient de densitate Ficol-Odiston

Tehnica de separare se bazează pe centrifugarea unei probe de sânge împreună cu gradientul

de densitate, timp în care separarea celulelor în funcție de mărime și greutate se face
concomitent cu traversarea diferențiată prin gradientul de densitate.

Testul rozetării

...este utilizat pentru separarea populațiilor de limfocite T și B. Separarea este posibilă astfel
pentru că limfocitele T prezintă pe suprafață un marker specific (CD2) care interacționează
cu un ligand exprimat pe eritrocitele de oaie. Eritrocitele se vor fixa în jurul limfocitului T,
realizând in vitro agregate cu aspect de rozete - rozete E.
Ligandul lui CD2 de pe membrana eritrocitelor de oaie este similar cu ligandul exprimat pe
membranele APC - CD58 sau LFA3. Acestea sunt molecule de adeziune care permit
apropierea celulelor între ele, în timpul cooperării celulare.
Limfocitele B nu exprimă CD2 și nu rozeteză.

Utilizarea tehnicii de rozetare cu unele modificări permite identificarea în cadrul populației

de limfocite T a unor subpopulații cu afinități diferite de legare a hematiilor de oaie și, astfel,
se pot identifica limfocite T helper și T supresor. Pentru acest scop se modifică modul de
incubare și concentrația limfocitelor de oaie.

Tip de rozetă Specificații tehnice Limfocit formator Valori medii ale

de rozetă și procentelor* de
markerul specific celule formatoare
de rozete în sângele
periferic la
donatori sănătoși

rozete E totale ● suspensie de limfocite T

limfocite
● eritocite de oaie
150/l
● incubare 24 de
ore la 4​o​ C

rozete E de mare ● suspensie de limfocit T helper 43%

afinitate (E​M​) limfocite CD2 de mare
● eritrocite de oaie afinitate pentru
50/l eritrocitele de oaie
● incubare 1 oră la
+29​o​ C

rozete E45 ● suspensie de limfocit T supresor 9%

limfocite CD2 termostabil
● eritrocite de oaie
150/l
● incubare 1 oră la
+45​o​ C

Tehnica rozetării poate fi, de asemenea, folosită și cu eritrocite de bou, modificând legarea
eritrocitului la limfocit, și anume, indirect, prin intermediul anticorpilor, la care se mai poate
adăuga complementul. Se obțin rozete EA (eritrocite-anticorpi). Astfel se pot separa
limfocitele B. Limfocitele B exprimă receptori pentru fragmentul Fc al IgG, receptori pentru
complement. Eritrocitele de bou sunt preferate în acest demers pentru că nu reacționează cu
CD2 și permit încărcarea cu Ac antieritrocitari în doze mari. Prin această metodă pot fi
studiate limfocitele din sângele periferic în diagnosticul și monitorizarea tratamentului unor
boli autoimune și neoplazice.

Tip de rozetă Specificații tehnice Limfocit Valori medii ale

formator procentelor* de
de rozetă celule formatoare
și de rozete în sângele
markerul periferic la donatori
specific sănătoși

rozete EA ● suspensie de limfocite limfocit B 26%

(eritrocite de bou, ● eritrocite care au fixat Fc𝜸R
anticorpi) specific pe suprafață IgG
antieritrocit
● incubare 24 de ore la 4​o​ C

rozete EAC ● suspensie de limfocite limfocit B 23%

(eritrocite de bou, ● eritrocite care au fixat recptor C3b
anticorpi, specific pe suprafață IgM
complement) antieritrocit+ ser de
șoarece (CBA sau AKR)
diluat ca sursă de
complement deficitar în
C5
● centrifugare 6-8 min la
300g
● incubare 24 de ore la 4​o​ C

rozete ES ● suspensie de limfocite limfocit B 17%

(eritrocite de bou, ● eritrocite care au fixat Ig de
proteina A specific proteina A suprafață
stafilococică) stafilococică (aceasta se
leagă la limfocitele care
au pe suprafață IgG
legate prin Fab sau Fc)

*%celule formatoare de rozete = (raportul dintre numărul de celule rozetate și total, adică
suma celor rozetate și nerozetate )x100

Imunofenotiparea sau citometria în flux

Citometria în flux este o metodă de măsurare a proprietăților celulare pe măsură ce celulele se

deplasează într-un singur fir (flux) într-o coloană de lichid și întrerup o rază de lumină laser.
Pentru că a devenit o metodă standard pentru evaluarea celulelor hematopoetice și pentru
identificarea populațiilor și subpopulațiilor de limfocite, mai este cunoscută sub numele de
imunofenotipare​.
Prin imunofenotipare se pot identifica și separa seturi și subseturi de limfocite din sângele
periferic și se pot pune în evidență chiar și limfocite activate. Citometria în flux permite
determinarea simultană a unor parametri caracteristici unei singure celulele aflată într-un
curent de lichid - mărime, granularitate, fluorescență. Tehnica folosește ​anticorpi
monoclonali (​AcMo​) și ​fluorocromi.​ Antigenele marker de pe suprafața sau din interiorul
celulei aflate în suspensie leagă AcMo fluorocromați. Astfel, celulele acoperite cu astfel de
anticorpi fluorocromați vor putea fi identificate și separate folosind citometria în flux.
Metoda a fost pusă la punct mai ales datorită necesității de a determina numărul absolut de
limfocite T- CD4+ util în stadializarea și în monitorizarea tratamentului la pacienții infectați
cu HIV. Apoi, aceeași metodă a fost găsită utilă în evaluarea bolilor limfoproliferative, a
sindroamelor de imunodeficiență, și în alte boli cu mecanisme imune.
AcMo se obțin prin fuziunea unei celule producătoare de Ac - limfocitul B activat de la
șoarece - cu o celulă care are capacitatea de a se multiplica nedefinit - celula mielomatoasă -
și rezultă o celulă hibridă - Hybridoma cell - capabilă să producă cantități nelimitate de
anticorpi monoclonali. Aceștia au înaltă specificitate și afinitate pentru un determinant
antigenic. Acuratețea imunofenotipării depinde atât de calitățile acestor anticorpi monoclonali
cât și de proprietățile fluorocromilor.

Citometrul în flux posedă o cameră de curgere în care celulele trec una câte una prin fața
unui laser. Detectarea fluorescenței se obține cu ajutorul unei unde laser cu argon (488 nm) ca
sursă de excitație. Sistemul optic (complex conținând filtre și oglinzi) captează emisia de
fluorescență produsă de fluorocromii excitați de unda laser. Sistemul electronic de detecție
analizează semnalele rezultate, obținându-se date despre complexitatea structurală a clulei și
semnalează prezența unor antigene corespunzătoare anticorpilor monoclonali marcați. Cei
mai utilizați fluorocromi sunt izocianatul de fluoresceină (ITCF) care dă lumină galben-verde
și este detectat cu detectorul de fluorescență 1-FL1și Phycoeritrina (PE) care dă lumină roșu
portocaliu și este detectat cu FL2. Prin marcarea unei suspensii de celule cu cei doi
fluorocromi se pot obține populații distincte de celule. Rezultatele sunt înregistrate sub forma
unor grafice dot-plot, în care fiecare punct din imagine reprezintă o celulă care a trecut prin
fața undei laser și rezultatele mai pot fi reprezentate de computer sub formă de histograme.
Exemplificăm prin prezentarea imunofenotipării limfocitelor din sângele uman cu AcMo
fluorocromați proveniți din truse standardizate - Simultest IMK Becton Dickinson.

A - populații de limfocite analizate pe baza mărimii și granularității celulare

B - Controlul negativității probelor. este obligatorie introducerea unei probe de control,
conținând IgG2a marcată cu ITCF și IgG1 maracată cu PE, Fluorocromii nu se leagă de Ag
membranare, ci sunt fixați nespecific prin intermediul receptorilor pentru Fc.
C - limfocite T (CD3+) și limfocite B (CD19+). CD19 se exprimă pe membranele LB, în
toate stadiile de maturare, fiind Ag specific de suprafață.
D - celule care exprimă markeri antigenici specifici de suprafață - Th (CD4+), Tc (CD8+).
E - Limfocite T activate = celule CD3+ care exprimă markerul HLA-DR.
F - Limfocite T (CD3+) și NK (CD16+/CD56+).
Graficele arată întensitatea emisiilor fluorescente ale fluorocromilor ITCF și PE cuplați cu
AcMo respectivi. Automat se calculează valorile procentuale ale seturilor și subseturilor
celulare, rezultatele fiind redate numeric și grafic în comparație cu valorile normale asociate
vârstei.

Aplicații clinice ale imunofenotipării

Metoda are numeroase aplicații în hematologie, oncologie, boli autoimune, în programele de

transplant, în obstetrică.
* Imunofenotiparea este de mare ajutor în ​diagnosticul și monitorizarea terapiei
hemopatiilor maligne, oferind informații pentru stabilirea criteriilor de clasificare. De
exemplu, astfel pot fi clasificate leucemiile acute în leucemii limfoide B, limfoide T, mieloide
și nediferențiate.
Pe lângă criteriile morfologice și citochimice, acuratețea diagnosticului crește la 99% când se
adaugă informații obținute prin imunofenotipare. Antigenele CD19 și CD20 sunt asociate cu
leucemiile limfoide B. CD2, CD5 și CD7 sunt asociate leucemiilor limfoide T. Iar CD13 și
CD33 indică natura mieloidă a unei leucemii numai dacă nu sunt exprimați markeri ai unui
alt tip de leucemie. Punerea unui diagnostic corect într-o leucemie acută permite stabilirea
schemelor terapeutice adecvate. De asemenea, datele obținute din imunofenotipare ajută la
stabilirea prognosticului.
* În neoplazii, metoda se alică mai ales pentru ​aprecierea statusului imunodepresiv care se
asociază bolii de bază. În acest context, este de interes evaluarea celulelor CD3+, CD4+,
CD8+, CD16+/CD56+. De asemenea, pot fi reperați markeri cu o oarecare specificitate
pentru diferite tipuri de neoplazie.
Aprecierea gradului de imunodepresie este utilă și în alte boli care asociază acest fenomen,
cum este infecția cu HIV, în care, scăderea specifică a numărului de limfocite CD4+ și
creșterea celor CD8+ cu scăderea marcată a raportului CD4/CD8 se asociază cu SIDA.
* În bolile autoimune, imunofenotiparea limfocitară ajută la ​evaluarea stadiului și gradului
de agresiune a procesului autoimun ​și devine un instrument important în monitorizarea
clinică a acestor boli și a terapiei imunosupresive aplicate acestor cazuri. Determinarea unor
antigene prezintă interes clinic pentru ​a evalua predispoziția genetică la anumite boli
autoimune.​ De exemplu, antigenul HLA-B27 se asociază cu incidența crescută a spondilitei
anchilopoetice, artritei reumatoide, uveitei și sindromului Reiter. Pe când anumite antigene
HLA-DQ, HLA-DR și HLA-B se asociază cu risc înalt de apariție a diabetului zaharat tip 1.
* Imunofenotiparea rămâne metoda de elecție pentru ​stabilirea compatibilității în domeniul
chirurgiei de heterotransplantare în programul de transplant de celule stem hematopoetice și
în monitorizarea statusului imun post-transplant​. Raportul CD4/CD8 poate fi util în
monitorizarea transplantului de măduvă osoasă ca indicator al instalării reacției
grefă-contra-gazdă.
* Sarcina fiziologică reprezintă o excepție de la legile imunității, fiind tolerată de către
sistemul imun al mamei. Au fost descrise caractere particulare ale celulelor sistemului imun
în această stare fiziologică. Celulelor Ts(CD8+/CD11b+) le-a fost recunoscut un rol
hiperstenic (hiperfuncțional), iar celulelor NK(CD16+/CD56+) le-a fost descris un rol
inhibitor. Cercetarea acestor seturi de limfocite în timpul sarcinii, prin imunofenotipare, poate
contribui la ​supravegherea eficientă a sarcinii normale sau patologice.​ Disgravidiile tardive,
hipertensiunea arterială, eclampsia, pot surveni ca urmare a unei toleranțe imune compromise
în evoluția sarcinii.