Tehnologii ADN

recombinant

Conf. S.Capcelea
◼ Principii generale
◼ Rol aplicativ
 Izolarea ADN genomic pentru analiza unei gene umane
 Izolarea ARNm specific unei gene umane

 Obţinerea fragmentelor de restricţie

 Obţinerea ADNc
 Obţinerea ADNrec

 Separarea fragmentelor de ADN dintr-un amestec de fragmente

 Aprecierea lungimii fragmentului de interes

 Clonarea unei gene umane in vivo

 Clonarea unei gene umane in vitro

 Denaturarea ADN in vivo

 Denaturarea ADN in vitro
 ADN
ADN recombinant – recombinant
moleculă de ADN obţinută
din segmente de origine
diferită, capabilă să se
replice
Etapele obţinerii ADN 1. Izolarea plasmidului/vectorului de clonare
recombinant Izolarea ADN uman
2. Inserarea genei umane in vectorul de
clonare
a. clivarea ADN cu ER
b. unirea complementara a capetelor adezive
a FR
c. Ligarea >>>> ADNrec

3. Introducerea ADNrec in celula bacteriana -

gazda de clonare
a. Are aparatul de replicare necesar clonarii
geneide interes
b. Are aparatul de transcriptie si translatie
necesar sintezei proteineide interes

4. Clonarea celulei transformate

a. Clonarea geneide interes
b. Expresia geneide interes

5. Selecţia celulelor transformate

•tratare cu antibiotice
•marcheri radioactivi sau fluorescenţi
 Componentele necesare pentru
tehnologia AND rec = clonarea ADN in vivo:

-ADN de clonat (de cercetat): FR, ADNc

-Vector de clonare
- Enzime de restricţie = restrictaze
- Gazdă de clonare compatibilă cu vectorul
- Sistem de selecţie a clonelor analizate
- Set de reagenţi pentru manipularea ADN
 Dimensiunile inserţiilor clonate în diferiţi vectori
Vectorul Dimensiunile fragmentului Gazda de
inserat clonare
Plasmide < 10 kb ADN Bacterii,
Drojdii
Bacteriofagi < 25 kb ADN Bacterii
Cosmide 30-45 kb ADN Bacterii

BAC (Cromozom artificial < 300 kb ADN Bacterii

al bacteriilor)
YAC (Cromozom artificial 0,2-2.0 Mb ADN Drojdii
al drojdiilor)

Vectorul:
- are capacitate să insereze şi să transfere ADN străin
- se replică autonom în celula gazdă (conţine ori)
- conţine gene de rezistenţă la antibiotice (capacitate de a fi selectate)
 Scopul tehnologiei ADN rec

▪Clonarea genei/secvenţei de interes cu scop de:

▪multiplicare;
▪izolare şi formare a bibliotecilor de ADNrec;
▪analiză moleculară.

▪Expresia genică cu scop de:

▪analiză a funcţiei genei clonate;
▪obţinerea produsului proteic.
 Izolarea acizilor nucleici
Izolarea ADN
• Colectarea celulelor nucleate din orice ţesut

• Izolarea nucleilor (opţional) în soluţii hipotonice

• Lezarea membranelor (acţiunea detergenţilor)

• Deproteinizarea AND (acţiunea proteazelor)

• Precipitarea ADN
Izolarea ARNm
•Colectarea materialului din ţesutul de interes

•Lezarea celulelor în prezenţa detergenţilor şi a inhibitorilor

de ARN-aze

•Deproteinizarea

•Precipitarea selectivă a ARN

•Precipitarea ARN de cercetat.

 Elemente necesare pentru manipularea
ACIZILOR NUCLEICI
- Cum se izolează ADN sau ARN dintr-o celulă?
- Cum se obţin fragmente de ADN de cercetat?
- FR (ER, SR, RFLPs, hărţi de restricţie)
- ADNc (ADN complimentar unei mol. ARNm);
- Cum se separă fragmentele de AN şi cum se apreciază
lungimea → comparare a ADN la diferite persoane
(electrozoreza AN)?;
- Cum se vizualizează ADN, având dimensiuni
submicroscopice?
- Care sunt principiile clonării ADN in vivo (vectori de
clonare, gazde de clonare) şi clonării ADN in vitro?;
- Denaturarea ADN in vitro
- Hibridizarea mol. ADN (AND/ADN; AND/ARN)
Obţinerea FR – fragmentelor de restricţie prin acţiunea
specifică a ER (enzimelor de restricţie)
Situsuri recunoscute de enzime de restricţie
RFLPs – polimorfismul lungimii FR
la două persoane X şi Z
ER – edonuclează situs specifică, de origine bacteriană,
care recunoaşte un SR şi clivează ADN bicatenar

SR – secvenţă palindromică de ADN, recunoscută şi

clivată de enzimele de restricţie

FR – fragment ADN bicatenar obţinut prin clivare cu

ajutorul restrictazelor

RFLPs – Polimorfismul Lungimii Fragmentelor de

Restricţie, ce identifică diferenţele individuale ale
moleculelor de ADN

Hărţi de restricţie – schema dispunerei relative a

situsurilor de restricţie într-o moleculă de ADN
5kb
6kb
10kb
2,5kb
 Electroforeza
1. Principii:
– migrarea moleculelor cu sarcină electrică în
cîmp electric
- viteza de migrare este determinată de GM
- se realizează în gel de agaroză sau
poliacrilamidă
2. Scop
- Separarea mol ADN sau ARN sau proteine
dintr-un amestec de molecule
- Determinarea lungimii relative sau GM
- Compararea mol de la diferite persoane
3. Aplicaţii practice
- se utilizează în diferite tehnici de testare a
genelor pentru interpretarea rezultatelor
 Clonarea in vivo, într-o cel
bactreriană, a unei gene
umane
Probleme:
◼ Genele umane sunt mari;
◼ Conţin secvenţe
reglatoare diferite de cele
a bacteriilor;
◼ Conţin introni ce nu pot fi
înlăturaţi de celula
bacteriană.

Soluţie:
Obţinerea unui ADNc pe baza
ARNm caracteristic genei
ţintă
 Etapele obţinerii ADNc (ADN
complementar)

•Izolarea ARNm+ poli(A)

•Hibridarea poli(A) cu oligo(dT)

•Sinteza ADNc cu ajutorul

reverstranscriptazei

•Hidroliza ARN

•Sinteza ADN bicatenar cu

ajutorul ADN-polimerazei
 Vizualizarea ADN

Colorarea specifică Hibridizarea cu sonde marcate

Fuxnă bazică Fluorescente Radioactive

(in situ) (reci) (calde)

Bromură de
etidiu
(În geluri)
Este necesar de ştiut

Sunt necesare structura secvenţei

cantităţi mari de ADN ADN de cercetat

 Clonarea ADN
= multiplicarea unei mol ADN prin
replicare repetată
In vivo In vitro
◼ Tehnologia ADN rec ◼ Tehnica PCR
◼ Utilizarea celulei –
gazdă de clonare ◼ Este relizată în
◼ Replicarea într-un eprubetă
vector de clonare cu ◼ Replicarea unei
utilizarea aparatului secvenţe de interes
de replicare a celulei
gazdă cu ajutorul unui
◼ Cu posibilitatea aparat de replicare
obţinerii produsului artificial
proteic
 Clonarea in vitro – PCR
(reacţia ciclică de polimerizare a
noilor copii de ADN)
1ADN →2 ADN → 4 ADN → 8 ADN → 16 ADN → 32 ADN → etc
 Componentele necesare pentru
clonarea in vitro (PCR):
- ADN de cercetat
- Primeri specifici secvenţei de clonat –
complimentari secvenţelor flancante
- Taq-polimeraza – ADN-polimerază termostabilă
- dNTP
- Instalaţie de modificare ciclică a temperaturii:
- tº de denaturare ADN
- tº de renaturare (ADN+primer)
- tº de polimerizare (elongarea catenelor
noi de ADN)
 Extragerea ADN Pregătirea componentelor Amplificarea ADN-ţintă
pentru PCR

Colorarea şi Electroforeza vizualizarea Autoradiografia şi

produşilor PCR interpretarea rezultatelor
produşilor PCR
 Hibridarea acizilor nucleici

•Hibridare - unirea complementară a

fragmentelor (moleculelor) de acizi nucleici:
•ADN de cercetat +
•Sonda oligonucleotidică marcată radioactiv
sau fluorescent

!!!! Sonda oligonucleotidică

• Secventa de AND monocatenara
• Complementara genei / secventei de interes
• marcată radioactiv sau fluorescent pentru vizualizarea hibrizilo
ADN de cercetat-Sonda
 Utilizarea tehnicilor de analiză a acizilor
nucleici în medicină
Analiza ADN:
▪depistarea mutaţiilor genice patologice
→ diagnostic precis al bolilor genetice prenatal
→ diagnostic precis al bolilor genetice postnatal precoce
▪identificarea polimorfismului individual
→ depistarea predispoziţiei la anumite boli
→ dactiloscopie genomică (analiza filiaţiei)
▪depistarea ADN străin (bacterian, viral)
→ diagnosticul bolilor infecţioase
→ stabilirea gradului de infectare
Analiza ARNm:
▪analiza expresiei genice ţesut-specifică
▪evaluarea gradului de expresie a genei normale / patologice