12/28/2010

Metabolismul nucleotielor
A. Biosinteza
• Nucleotide structura & rol

• Biosinteza nucleotidelor purinice IMP, AMP, GMP

– Provenienţa atomilor nucleului purinic
– Localizarea enzimelor
– Etapele & reacţiile sintezei IMP
– Inhibitori sintetici = medicamente citostatice & bacteriostatice
– Conversia IMP → AMP & GMP
– Reglarea sintezei ribonucleotidelor monofosforilate
– Conversia nucleotidelor monofosforilate → di- si trifosforilate
– Calea de recuperare a purinelor
– Conversia ribonucleotidelor difosforilate → deoxiribonucleotide difosforilate
– Patologie: Sindromul Lesch-Nyhan

• Biosinteza nucleotidelor pirimidinice

– Provenienţa atomilor nucleului pirimidinic
– Localizarea enzimelor
– Etapele & reacţiile sintezei UMP
– Transformarea UTP → CTP
– Transformarea dUMP → dTMP
– Patologie: Aciduria orotică

Nucleotide – Structura & Rol

• Unităţi de construcţie a acizilor nucleici

• Surse de energie
• Activatori ai precursorilor glicogenului, lipidelor complexe, proteinelor
• Componente ale coenzimelor
• Efectori allosterici

1
 12/28/2010

Provenienţa atomilor nucleului purinic

Ribozo-fosfat

Atomii de azot provin din Asp, Gly, 2Gln

Atomii de carbon provin din CO2, Gly, 2Formil-FH4

! Nucleul purinic se constituie pe ribozo-5’-fosfat

Sinteza IMP – Localizare & Precursori & Etape

• Localizare
Toate enzimele = citoplasmatice
– Precursori
Ribozo-5-fosfat , aspartat (Asp), glicocol (Gly), glutamina (Gln), CO2, N10-
formil-H4F
– Sursa de energie = 5 ATP (6 legături macroergice!)

• Etape
1. Sinteza 5-fosforibozil-1-pirofosfat-ului (PRPP)
2. Sinteza 5-fosforibozilaminei
3. Sinteza inozinmonofosfat-ului (IMP)

2
 12/28/2010

Sinteza IMP – Etapa 1

• Transformarea ribozo-5-fosfat → fosforibozilpirofosfat (PRPP)

PRN = Fosforibonucleotid = AMP, GMP, IMP

Sinteza IMP – Etapa 2

• Transformarea PRPP → Fosforibozilamina

3
 12/28/2010

Sinteza IMP – Etapa 3

Sinteza IMP - Reacţii

4
 12/28/2010

Inhibitori = citostatice & bacteriostatice

• Analogi ai acidului p-aminobenzoic (PABA): sulfonamide
Inhibă competitiv sinteza bacteriană a acidului folic
=> se reduce sinteza purinelor & acizilor nucleici => efectul bacteriostatic
• Analogi ai acidului folic:
- trimetoprim
Inhibă dihidrofolat reductaza => impiedică refacerea H4F
=> Inhibă sinteza purinelor => se reduce sinteza acizilor nucleici
=> efectul bacteriostatic
- metotrexat
Inhibă sinteza purinelor => se reduce sinteza acizilor nucleici
=> se previne multiplicarea celulelor canceroase
=> efectul citostatic
Sunt afectate toate celulele care se divid rapid, inclusiv cele din măduva osoasă,
piele, tractul gastro-intestinal, foliculii părului, sistemul imunitar
=> efecte secundare nedorite: anemie, căderea părului, imunodeficienţă etc.

Conversia IMP → AMP şi GMP

-
Acid micofenolic
Reduce sinteza acizilor nucleici
din limfocitele B & T
Medicament utilizat pentru a
preveni rejecţia grefelor

5
 12/28/2010

Sinteza IMP& AMP& GMP – Reglare

Enzime reglatoare

• PRPP sintetaza
Retroinhibiţie: AMP, GMP (efect maxim când ambele
sunt în concentraţie optimă)

• Glutamin PRPP amidotransferaza

Retroinhibiţie: ATP, ADP, AMP la un centru reglator
GTP, GDP, GMP la alt centru reglator
Activare în avans: PRPP

• Adenilosuccinat sintetaza şi IMP dehidrogenaza

Retroinhibiţie: AMP, respectiv GMP
Activare: GTP, respectiv ATP (ca şi cosubstrate)

Sinteza nucleotidelor di- & trifosforilate

Adenilat kinaza
AMP + ATP 2ADP

Guanilat kinaza
GMP + ATP GDP + ADP

NDK
GDP + ATP GTP + ADP

6
 12/28/2010

Calea de recuperare a purinelor

= Cale de sinteză a IMP, AMP, GMP pornind de la bazel
purinice rezultate prin catabolimul nucleotidelor şi PRPP
Se bazează pe existenţa enzimelor:
• Adenin fosforibozil transferaza (APRT)

Adenina + PRPP  AMP + PPi

• Hipoxantin-Guanin fosforibozil transferaza (HGPRT)

Hipoxantina + PRPP  IMP + PPi

Guanina + PRPP  GMP + PPi
AMP, IMP, GMP nu mai trebuie sintetizate de novo !

7
 12/28/2010

Sinteza deoxiribonucleotidelor difosforilate

P O P O CH 2 O Baza

OH OH
NDP dATP
SH _
N ADP+ Tioredoxina

Rductaza SH Ribonucleotid
S reductaza
+ Tioredoxina
N ADPH + H
S
P O P O CH 2 O Baza

OH H
dNDP

Patologie - Sindromul Lesch-Nyhan

HGPRT
Hi poxan ti n a IMP  HGPRT  PRPP (substrat în sinteza de novo)
IMP, GMP (inhibitori ai sintezei de novo)
PRPP PPi  Sinteza de novo a nucleotidelor purinice

 Producerea acidului uric  Forma severă de gută

HGPRT  Litiaza renală
Gu an i n a GMP
 Manifestări neurologice caracteristice:
PRPP - retard mental
PPi
- automutilare
- miscări involuntare

Automutilare a buzelor şi degetelor Cristale de urat pe scutece

8
 12/28/2010

Bisinteza nucleotidelor pirimidinice

• Provenienţa atomilor ciclului pirimidinic

Glutamina

Aspartat
CO2

Bisinteza nucleotidelor pirimidinice

• Localizare: citoplsmă & mitocondrie (dihidroorotat DH)

• Etape
1. Sinteza carbamoil fosfat-ului
2. Sinteza acidului orotic
3. Transformarea acidului orotic în UMP

! La început se constituie ciclul piridinic şi apoi acesta reacţionează cu PRPP

9
 12/28/2010

Sinteza UMP- Etape

Sinteza UMP – Reacţii & Reglare

CO2 + Glutamina + ATP
Carbam oil + AT P & P RP P
fosfat _
UT P
sintaza II
O O
- - O
O C O C
+ Asp Trans- + C
H3N CH2 carbam oilaza HNH2 CH2 Didroorotaza HN CH2
O C +
CH O C CH O C CH
- NH - N -
O P H3N
+
COO COO H COO
H2O
C arbam oi l Aspartat C arbam oi l aspartat Aci d dih idro
fosfat (C AP) (C AA) oroti c (DHO A)
+
NAD
DH
+
NADH+ H
O O O
C C C
HN Decarboxilaza HN Transferaza HN
O C O C O C
N N - N -
COO PRPP COO
PPi H
CO2
Rib-5- P Rib-5- P Aci d oroti c
(O A)
UMP O MP

• Enzima reglatoare = carbamoilfosfat sintaza II (citoplasmatică)

10
 12/28/2010

Sinteza UTP & CTP & TMP

NH2

AK NDK CTP sintaza N

UMP UDP UTP
O
N
ATP ADP ATP ADP ATP Gln
Rib-5- P P P
CTP
5-Fluorouracil
_ O
C
Reductaza Fosfataza TMP sintaza N CH3
UMP dUDP dUMP
O
+ N
NADPH + H H2O Pi Metilen H4F
+
NADP H2F
dRib-5- P
H4F
TMP
Reductaza
+ _ NADPH
NADP
Metot rexat

Transformarea dUMP → dTMP

11
 12/28/2010

Patologie – Aciduria orotică

• Deficienţa UMP sintazei

(cu cele 2 domenii: orotat fosforibozil transferaza & OMP decarboxilaza)
=> acumularea şi eliminarea urinară a acidului orotic
=> creştere anormală & anemie megaloblastică

• Dieta bogată în uridină => ameliorarea anemiei şi reducerea excreţiei

acidului orotic

12
Catabolismul acizilor nucleici & nucleotidelor

• Digestia & absorbţia acizilor nucleici exogeni

• Catabolismul acizilor nucleici endogeni
• Catabolismul nucleotidelor purinice
• Provenienţa şi soarta acidului uric
• Patologie: SCID, guta
• Catabolismul nucleotidelor pirimidinice
• Patologie: aciduria orotică

ADN
Digestia & absorbţia acizilor nucleici ARN

Stomac Denaturare
pH acid
Acizi nucleici
denaturati
Intestin Nucleaze
subtire (pancreas)

Oligonucleotide
Intestin Fosfodiesteraze
subtire (pancreas)

Mononucleotide
Intestin Nucleotidaze (mucoasa intestinala)
Urina subtire

Circulatie
Nucleozide
Intestin
subtire Nucleozidaze (mucoasa intestinala)

Pentoze

Purine & pirimidine

Acid uric Intestin Enzimele

gros florei intestinale

Acid uric
Enterocit
(fecale)

1
 Catabolismul acizilor nucleici endogeni

Nucleaze
Acizi nucleari citoplasmatice Nucleotide
H2O

Catabolismul nucleotidelor purinice

• Defosforilare nucleotid: AMP → Adenozina;IMP → Inozina; GMP → Guanozina
• Dezaminare nucleotid: AMP → IMP sau nucleozid: Adenozina → Inozina
• Fosforoliza Inozinei & Guanozinei => Hipoxantina & Guanina + Ribozo-1P
• Transformarea Hipoxantinei & Guaninei → Xantina → Acid uric
AMP deam inaza
AMP IMP
H2O H2O
H2O NH3
5'-Nucleotidaza 5'-Nucleotidaza
Pi Adenozin Pi
deam inaza
Ade n oz in a In oz in a
Pi
H2O NH3 Fosforilaza
O Ribozo 1-fosfat
GMP
N N H2O
5'-Nucleotidaza
N N Pi
Hi poxan tin a
Gu anoz in a
O2 + H2O Pi
Xantin
oxidaza Fosforilaza
H2O2 Ribozo 1-fosfat
O O O
N N Xantin
oxidaza N N Guanaza N N

O N N O O N N H2N N N
H2O
Acid u ri c Xantin a NH3 Gu ani n a
O2 + H2O
H2O2

2
 Catabolismul AMP & GMP

Provenienţa & Soarta acidului uric

Sinteza de
novo
300-600 mg/zi

Purine Nucleotide Nucleotide

exogene purinice tisulare
600 mg/zi

Baze purinice

Urina Acid
600mg/zi uric Intestin
1200mg 200mg/zi

3
 Defectele metabolismului nucleotidelor purinice

Boala Defectul Natura defectului Comentarii

PRPP sintetaza Activitatea Hiperuricemie

PRPP sintetaza Rezistenta la retroinhibitie Hiperuricemie
Guta PRPP sintetaza Afinitatea pt. ribozo 5P Hiperuricemie
PRPP amidotransferaza Rezistenta la retroinhibitie Hiperuricemie
HGPRT Partial defecta Hiperuricemie

Lesch-Nyhan HGPRT Lipsa enzimei Hiperuricemie

SCID ADA Lipsa enzimei Imunodeficienţă

Litiaza renala APRT Lipsa enzimei Litiază renală
Hipouricemie
Xantinurie Xantin oxidaza Lipsa enzimei
Litiază renală
PRPP  purine
Von Gierke Glucozo 6P-aza Lipsa enzimei
Hiperuricemie

Patologie - Deficienţa adenozin deaminazei  SCID

(“Severe Combined Immunodeficiency Disease”)
AMP deam inaza
AMP IMP
H2O H2O
H2O NH3
5'-Nucleotidaza 5'-Nucleotidaza
Pi Adenozin Pi
deam inaza (ADA)
Ade n oz in a In oz i n a
O
H2O NH3
N N

N N

Riboza

• Gena ADA este exprimată în citosolul tuturor celulelor

• În limfocitele umane ADA are cea mai intensă activitate
 ADA conduce la  adenozinei =>
 dATP = inhibitor al ribonucleotid reductazei
 Sinteza deoxiribonucleotidelor
 Sinteza ADN şi diviziunea celulară
TRATAMENT
• Izolarea copilului într-un mediu steril
• Transplant de maduvă
• Terapie genică

4
 Patologie - GUTA

• Hiperuricemia primară
Determinată de mutaţiile genelor:
 PRPP sintetazei => creşterea producţiei de purine
=> creşterea cantităţii de acid uric
 HGPRT => reducerea reutilizării hipoxantinei şi guaninei
=> cresterea cantităţii de acid uric

• Hiperuricemia secundară
- insuficienţa renală
- chemoterapie
- consum excesiv de alcool (de ce?) şi alimente bogate în purine
- boala von Gierke (de ce?)
- intoleranţa la fructoză (de ce?)

Hiperuricemia primară – Alterarea PRPP sintetazei

Vmax KM
P O CH2 O P O CH2 O
Ki
PRPP sintetaza
OH +2 O P O P
Mg
OH OH ATP AMP OH OH
Riboz o 5-fosfat PRPP

Sinteza excesiva de
nucleotide purinice

P roductie excesiva de
acid uric

Hi pe ru ri ce m i e
= Gu ta prim ara
Cristale aciculare de urat monosodic
Depozitate în ţesuturile moi cristalele iniţiază un process inflamator
Infiltrarea granulocitelor care fagocitează cristalele de urat ROS  alterarea ţesutului eliberarea enzimelor
lizozomale  răspuns inflamator
Producerea lactatului în ţesutul sinovial  scăderea pH-ului depunerea de noi cristale de urat  apariţia tofilor
gutoşi

5
 Guta – Simptome & Tratament

Tof gutos

TRATAMENT
 Inhibiţia xantin oxidazei cu oxipurinol (alloxantina), catabolit al allopurinolului (xantina şi hipoxantina
fiind mai solubile în apă sunt mai uşor de eliminat)
 Intensificarea excreţiei acidului uric (probenecid, sulfinpirazona)

 Antiinflamatoare (aspirina)

 Antichemotactice (colchicina) pentru prevenirea acumulării granulocitelor în zona afectată

Catabolismul nucleotidelor pirimidinice

Ex. Catabolismul timinei

 hidrogenarea dublei legături => dihidrotimina
 desfacerea ciclului dihidropirimidinic
 îndepărtarea grupării amidice
 transaminare => metilmalonil semialdehida

6
Defectele metabolismului nucleotidelor pirimidinice

Boala Enzima defecta Comentarii

Orotat fosforibozil transferaza

Aciduria orotică Tip I & Defect de creştere
OMP decarboxilaza Anemie severă cauzată de eritrocitele
hipocrome
Leucopenie
Aciduria orotică Tip II OMP decarboxilaza

Aciduria orotică  Carbamoil fosfatul mitocondrial

Ornitin transcarbamoilaza
fără componenta  Biosinteza pirimidinelor
(ureogeneza)
hematologică => Encefalopatia hepatică

Aciduria orotica
Cataboliţii alopurinolului & 6-azauridinei
indusă de OMP decarboxilaza
inhibă OMP decarboxilaza
medicamente

7
 10/4/2010

REPLICARE = Sinteza ADN

• Replicare la procariote
- Caracteristici
- Factori necesari
- Etape
• Replicare la eucariote
• Modificări postreplicare
• Inhibiţia replicarii
• Agenţi mutageni. Mecanisme de reparare
• Sinteza de ADN pe matriţă de ARN 1

REPLICARE PROCARIOTE
Caracteristici
• Are loc în timpul diviziunii celulare

• Este semiconservativă
Dintr-o moleculă de ADN “părinte” => 2 molecule “fiice” care conţin un lanţ părinte şi un lanţ
complementar, nou sintetizat.

Asigură stabilitatea genetică a fiecărui

organism şi conservarea informaţiei
genetice de la o generaţie la alta, ȋn
cadrul aceleiaşi specii

1
 10/4/2010

Dovada replicării semiconservative

Experienţa lui Meselson şi Stahl (1957)

Dovada replicării semiconservative

2
 10/4/2010

REPLICARE PROCARIOTE
Caracteristici
• Este bidirecţională
Începe de la origine (“ori C”) prin separarea celor două lanţuri părinte şi formarea a două
furci de replicare.
Cele două furci de replicare se deplasează simultan, în direcţie opusă, până când se
întâlnesc (în punctul “ter” situat pe partea cealaltă a cromozomului, opusă originii)
.

REPLICARE PROCARIOTE
Caracteristici
Prin copierea continuă a lanţului sens (direcţia 3‟-5‟) => “lanţul conducător”,
Prin copierea discontinuă a lanţului antisens (direcţia 5‟-3‟) => “fragmentele Okazaki”
(1000-2000 nucleotide), componente ale “lanţului întârziat”.

3
 10/4/2010

REPLICARE PROCARIOTE
Caracteristici
• Direcţia replicării este 5’→3’

REPLICARE PROCARIOTE
Factorii necesari
• Matriţă (“template”) = fiecare lanţ al ADN părinte, citit în direcţia 3‟-5‟. Necesară pentru
ghidarea legării nucleotidului complementar în vederea formării noului lanţ de ADN;
• Deoxiribonucleotide trifosforilate: dATP, dGTP, dCTP, dTTP (substrate ale ADN
polimerazelor);
• Ribonucleotide trifosforilate: ATP, GTP, CTP, UTP (substrate ale ARN polimerazei);
• Enzime:
- ADN polimeraze ADN-dependente: I, II si III
- ARN polimeraza (primaza): cu activitate 5‟-3‟ polimerazică care sintetizează “primeri”
(oligoribonucleotide), folosind ca matriţă monolanţul de ADN;
- Helicaze: enzime care despiralează ADN părinte (ex. Dna B, proteina rep);
- Topoizomeraze: enzime care elimină suprahelicarea produsă prin despiralare, fie prin
tăierea unui singur lanţ (tipul I), fie prin tăierea ambelor lanţuri (tipul II, ex. giraza);
- ADN ligaza: uneşte capătul 3‟ al unui fragment Okazaki cu fosfatul din capătul 5‟ al altui
fragment Okazaki (folosind ca sursă de energie ATP);
• Proteine:
- dna A: recunoaşte originea replicării şi iniţiază despiralarea ADN;
- SSB (“Single-strand binding protein”): împiedică reasocierea lanţurilor şi acţiunea
enzimelor de clivare a monolanţurilor;
- n, n’, n’’, i, dna C: formează primozomul.
8

4
 10/4/2010

ADN polimeraze ADN-dependente

Tip de Activitate Activitate Rol

polimerază polimerazică exonucleazică
Îndepărtează primerii
POl I 5‟-3‟ 3‟-5‟ şi 5‟-3‟ Repară ADN
Repară ADN
POL II 5‟-3‟ 3‟-5‟
Alungeşte primerii de
POL III 5‟-3‟ 3‟-5‟ ARN folosind dATP,
dGTP, dCTP, dTTP

• Activitatea exonucleazică 3‟-5‟ asigură fidelitatea replicării, este responsabilă

de “proof reading”, respectiv de corectarea greşelilor de citire;

• Activitatea exonucleazică 5‟-3‟ sau activitatea de excizie-reparare este

esenţială pentru îndepărtarea primerilor şi pentru repararea ADN alterat .
9

Activităţile ADN polimerazei III

Functia polimerazica Functia corectoare

Nucleotidul trifosforilat este selectionat si fixat
(prin legaturi de H) de baza complementara din lantul
ADN matrita, apoi este legat (prin legatura 3’-5’ fosfoester)
la capatul 3’ al lantului in curs de sinteza.
polimeraza
Daca ADN polimeraza imperecheaza gresit un
nucleotid, foloseste activitatea 3’-5’ exonucleazica
pentru excizarea lui.

Enzima Enzima
avanseaza revine

Activitate 5’→3’ Activitate 3’→ 5’

polimerazica exonucleazica

ADN
matrita Lant nou sintetizat
Activitatea 3’-5’ exonucleazică permite ADN polimerazei III să corecteze (“proofread”)
lanţul nou sintetizat

10

5
 10/4/2010

Primaza = ARN pol. ADN dependentă

Are activitate 5‟-3‟ polimerazică => sintetizează “primeri” (oligoribonucleotide),
folosind ca matriţă monolanţul de ADN;

11

Rolurile helicazei & topoizomerazei

Helicaza (ex. Dna B, proteina rep) despiralează ADN părinte;

Topoizomeraza elimină suprahelicarea produsă prin despiralare, fie prin tăierea

unui singur lanţ (tipul I), fie prin tăierea ambelor lanţuri (tipul II);

12

6
 10/4/2010

Acţiunea ligazei
ADN ligaza: uneşte capătul 3‟ al unui fragment Okazaki cu fosfatul din capătul 5‟
al altui fragment Okazaki (folosind ca sursă de energie ATP);

13

REPLICARE - Etape

• Iniţiere
• Elongare
• Terminare

14

7
 10/4/2010

REPLICARE – Etapa de iniţiere

Etapa de iniţiere = Etapa de formare a replizomului
• Recunoaşterea “secvenţelor consens” (AT)n din regiunea “ori” de către
dnaA, urmată de împachetarea (tasarea) regiunii şi despiralarea duplexului în
regiunea învecinată, respectiv formarea celor două “furci de replicare”;
• Inserţia complexului dnaB-dnaC;
• Deplasarea furcii de replicare prin acţiunea dnaB şi expulzarea dnaA;
• Stabilizarea porţiunii despiralate prin fixarea proteinei SSB;
• Constituirea primozomului prin ataşarea proteinelor n, n‟, n‟‟, i şi a primazei;
• Sinteza ARN primer (amorsă);
• Constituirea replizomului prin ataşarea polimerazei III şi a helicazei (proteina
rep) la primozom.

15

REPLICARE - Etapa de elongare

Etapa de elongare = etapa de alungire a amorsei (ARN primer)
• Legarea succesivă a deoxiribonucleotidelor de către ADN Pol III
(catalizează atacul nucleofil al OH din capătul 3‟al primerului asupra
grupării α-fosfat al NTP complementar nucleotidului din lanţul matriţă).
ADN Pol III are acţiune 5‟-3‟polimerazică =>numai lanţul sens (3‟-5‟) poate fi
copiat continuu => lantul conducator (“leading strand”).
Copierea lanţului antisens (5‟-3‟) presupune formarea mai multor bucle (pentru
schimbarea sensului) şi sinteza mai multor amorse de ARN prin alungirea
cărora rezultă fragmentele Okazaki (1000-2000 nucleotide).
• Constituirea lanţului întârziat (“lagging strand”) prin acţiunea Pol I (care
înlocuieşte primerii cu deoxiribonucleotide) şi a ligazei (care uneşte
fragmentele Okazaki);
• Înaintarea furcilor de replicare produce în amonte o suprahelicare pozitivă
care necesită intervenţia topoizomerazelor
16

8
 10/4/2010

Copierea lanţului antisens (5’-3’) presupune formarea de

bucle pentru schimbarea sensului

Directia de deplasare
a furcii de replicare

Primozom ARN
primer

ADN ADN
polimeraza polimeraza

Lant Lant
conducator intarziat

17

REPLICARE - Etapa de elongare

Lanţul ȋntârziat este Lanţul conducător este

sintetizat ȋn direcţia sintetizat ȋn direcţia 5’-3’
5’-3’ dinspre furca de către furca de replicare şi
replicare şi necesită necesită un singur primer
mai mulţi primeri

18

9
 10/4/2010

REPLICARE - Etapa de terminare

Etapa de terminare = etapa ȋn care proteina “ter-binding” se

leagă de secvenţele de terminare “ter” situate pe partea
opusă a cromozomului
=> este oprită acţiunea helicazei (Dna B).

INHIBITIA REPLICARII la procariote

Norfloxacina
= inhibitor al ADN girazei (topoizomeraza II) bacteriene
= medicament utilizat pentru tratarea infecţiilor bateriene 19

Recapitulare

Începe la furca de replicare prin

• separarea lanţurilor (facilitată de helicază, SSB, ADN topoizomeraze)
• legarea ADN polimerazei
ADN polimeraza sintetizeaza noile lanţuri ȋn direcţia 5’→3’ folosind
• primeri sintetizaţi de primază
• lanţurile parentale de ADN ca matriţe
Rezultă 2 lanţuri complementare fiice (replicarea este semiconservativă):
• lanţul conducător prin alungirea unui singur primer, ȋn direcţia 5‟→3‟ , către furca de replicare
• lanţul ȋntârziat prin alungirea mai multor primeri, ȋn direcţia 5‟→3‟ , dinspre furca de replicare

20

10
 10/4/2010

REPLICARE - Eucariote
• Are loc numai în faza S a diviziunii celulare

La eucariotele superioare se divid activ un număr

restrâns de celule (ex. celule din piele, cripte
duodenale, foliculi piloşi).
Precursorii eritrocitelor (eritroblaste) se divid de un
număr limitat de ori, apoi îsi pierd nucleul (se
transformă în eritrocite) şi părăsesc ciclul celular.
Majoritatea celulelor sunt reţinute, după mitoză, în
faza G0 de nondiviziune (“resting phase”).
Reintrarea în ciclul celular poate fi determinată de
condiţii de stress şi este controlată de kinazele ciclin-
dependente (CDK).
Aceasta explică regenerarea rapidă (câteva
săptămâni) a ficatului distrus în proporţie de 90%.

21

REPLICARE - Eucariote
• Eucariotele au mai multe polimeraze
Activitate
Tip Rol
exonucleazică

α - Sinteza primerilor şi a “fragmentelor Okazaki”

(200 nucleotide)
Repararea ADN

β - Repararea ADN

γ 3’-5’ Replicarea ADN mitocondrial

δ 3’-5’ Sinteza “lanţului conducător”

ε 3’-5’ Repararea ADN

22

11
 10/4/2010

REPLICARE - Eucariote
• Decurge de 10 ori mai încet (100 de pb/sec) datorită
gradului înalt de condensare;
• Accesul la ADN a proteinelor şi enzimelor necesare
replicării este facilitat prin desfacerea cromatinei (etapa
limitantă de viteză), proces iniţiat de metilarea în poziţia
5 a citozinelor (sub acţiunea ADN-metil transferazei).
• Există mai multe origini (aproximativ 100 pentru fiecare
cromozom);
• Mai multe (20-80) origini situate într-o anumită zonă a
cromozomului formează o unitate de replicare (replicon);
repliconii se activează treptat pe parcursul fazei S a
ciclului celular;

23

REPLICARE - Eucariote

Mai multe origini

Bidirecţională

24

12
 10/4/2010

REPLICARE - Eucariote

Telomeraza
facilitează
replicarea
telomerelor
(capetele
cromozomilor)

25

Modificări postreplicare = Modificări epigenetice

Metilarea “insulelor CpG”

• Se transmite de la o generaţie la alta
• Este specifică fiecărui ţesut
• Este realizată de metilaze SAM-dependente
• Vizează doar citozinele din secvenţe 5'-CpG-3„ (≈ 30000 insule CpG ≈ 1-2 kb )

Demetilarea insulelor CpG determină expresia genelor asociate

Organism 5'-metil citozina (mC)

Animale 2-7%

Plante >25%

↓ 5'- mC => ↑expresia genei

↑ 5'- mC => ↓ expresia genei
26

13
 10/4/2010

REPLICARE - Inhibiţie
Elongarea ADN poate fi blocată prin incorporarea
analogilor de nucleotide proveniţi din analogi de
nucleozide (fosforilaţi de enzimele de “salvare” )
care conţin:
2’deoxiriboză modificată:
- lipsa OH din pozitia 3‟
ex. Dideoxiinozina = didanozina = ddI

- ȋnlocuirea OH din poziţia 3‟ cu azido

ex. Azidotimidina = zidovudina = AZT= antiviral
2’deoxiriboza ȋnlocuită cu arabinoza (epimer)
ex. citozin arabinozid = citarabina = araC = citostatic
adenin arabinozid = vidarabina = araA =antiviral

Analogii de nucleozide ȋncetinesc multiplicarea

ADN-ului celulelor care se divid rapid (canceroase)
şi a virusurilor!
27

Alterarea ADN- Efectul fumatului

28

14
 10/4/2010

Alterarea ADN- Efectul UV

29

REPARARE ADN - Etape

Xeroderma pigmentosum = cancer de piele

cauzat de acumalarea mutatiilor datorita
absentei excinucleazei UV-specifice 30

15
 10/4/2010

Sinteza de ADN pe matriţă de ARN

31

Rolul revers transcriptazei ȋn

infecţia cu retrovirus

32

16
 10/3/2010

TRANSCRIERE

• Definiţie
• Localizare (timp, spaţiu)
• Factori necesari
• ARN polimeraza – caracteristici
• Unitate transcripţională
• Etape
• Procesare transcript primar
• Inhibitori
• Control & Reglare. Operonul Lactoza
• Transcriere la eucariote

TRANSCRIERE - Definiţie
Transcriere = sinteza de ARN (începând cu capătul 5’) folosind ca matriţă lanţul
3’-5’ al ADN care corespunde unei gene (nu se transcrie tot ADN-ul !).

Viteza = 20-50 nucleotide /sec; Frecvenţa erorilor = 10-4 (1 bază din 104 baze)

1
 10/3/2010

TRANSCRIERE - Scop
Scopul transcrierii = Sinteza moleculelor de ARN necesare traducerii:
- ARNm = matriţă
- ARNt = transportori ai aminoacizilor
- ARNr = componente ale ribozomilor

La procariote, spre deosebire de eucariote, sinteza proteinelor începe înainte

de a se finaliza sinteza ARNm!

TRANSCRIERE
Când are loc?
- unele gene (constitutive) sunt transcrise constant
- unele gene (inductibile/represabile) sunt transcrise “la nevoie”

Factori necesari ( la procariote)

- Matriţa = lanţul 3’-5’ al ADN-ului ce corespunde unei gene
- Ribonucleotide trifosforilate: ATP, GTP, CTP, UTP
- Enzime: ARN polimeraza ADN-dependentă, giraza
- Proteine: factorul ρ (ro)

2
 10/3/2010

ARN polimeraza - Structura

Holoenzima = factor σ + miez (α2’)

Factor de iniţiere sigma (σ)

-recunoaste promotorul şi astfel asigură
poziţionarea corectă a ARN polimerazei
pe ADN în vederea iniţierii transcrierii
Holoenzima

Miez = (α2’)
α -necesară pentru reconstituirea miezului
-leagă factorii transcripţionali
-conţine centrul activ polimerazic
-conferă susceptibilitatea la inhibitori
(ex. rifampicina)
’- conţine sarcini pozitive care facilitează
α2  ’σ α2  ’ + σ fixarea enzimei pe ADN (cu sarcini -)
5

Promotor (promoter) - Definiţie

= Regiunea recunoscută de subunitatea de tip σ (sigma) a ARN polimerazei,
situată înaintea secvenţei codificante (poziţia -1→-70)

3
 10/3/2010

Tipuri de factori sigma din E.coli

Tip Promotor recunoscut Secvenţa consens promotor
Regiunea -35 Regiunea -10
σ70 Majoritatea genelor TTGACAT TATAAT
σ32 Gene induse de şocul termic TCTCNCCCTTGAA CCCCATNTA

σ28 Gene pentru motilitate şi CTAAA CCGATAT

chemotaxie
σ38 Gene pentru faza staţionară şi ? ?
răspuns la stres Regiunea -24 Regiunea -12
σ54 Gene pentru metabolismul CTGGNA TTGCA
azotului şi alte funcţii

D.N. Amosti, M.J. Chamberlain, 1989, Pro.Nat’lAcad Sci USA 86: 830
R. Hengge-Aronsis, 1996, Mol. Microbiol. 21:887
7

Unitate transcripţională - Definiţie

Unitatea transcripţională = fragmentul de ADN care se extinde de la
promotor  terminator

GENA

Promotor Terminator

+1
Transcriere

ARN
Produsul transcrierii = transcript primar

4
 10/3/2010

TRANSCRIERE - Etape

• INIŢIERE

• ELONGARE
• TERMINARE

Etapa de INIŢIERE
• Fixarea ARN polimerazei pe regiunea promotor
=> “complex promotor deschis” şi
formarea primei legături fosfodiester

-40 Promotor +20

ARN pol

Secvenţe nespecifice
-40 +20
ARN pol

Complex promotor închis

-9 +2
ARN pol

10
Complex promotor deschis

5
 10/3/2010

Etapa de ELONGARE
= Sinteza ARN în direcţia 5’-3’, cu eliberarea factorului σ

11

Etapa de ELONGARE (continuare)

Pe măsură ce ARN polimeraza înaintează pe matriţa de ADN şi catalizează formarea
de noi legături fosfodiester se formează un helix hibrid ADN-ARN scurt;
Concomitent are loc:
• un proces de rerăsucire (“rewinding”) a dublului helix de ADN, în urma polimerazei
• un proces de desrăsucire (“unwinding”) a dublului helix de ADN, în faţa polimerazei

12

6
 10/3/2010

Etapa de TERMINARE
Eliberarea ARN sintetizat şi a ARN polimerazei
• Independentă de factorul ρ
semnalizată de formarea “structurii în agrafă” (rezultat al transcrierii palindromului
din “terminator”) care încetineşte deplasarea ARN Polimerazei.

După structura în
agrafă, transcriptul
conţine o secvenţă
UUUUU
care facilitează
eliberarea ARN din
hibridul ADN-ARN

13

Etapa de TERMINARE (continuare)

• Dependentă de factorul ρ (ro)
care se leagă de secvenţe bogate în C de lângă capătul 3’ al ARN nou sintetizat şi
migrează în spatele ARN polimerazei, în direcţia 5’-3’, până când ajunge în regiunea
terminator

14

7
 10/3/2010

Procesare transcript primar

Transcript primar = copia liniară a unităţii transcripţionale (fragmentul de ADN
cuprins între secvenţele de iniţiere şi terminare).
La procariote (spre deosebire de eucariote), ARNm este identic cu transcriptul
primar, care posedă la extremităţi 2 secvenţe suplimentare (leader & trailer)
care nu se vor exprima în proteină.

+1 Gena ADN

5’ 3’
Secvenţa care va fi tradusă
Secvenţa Secvenţa
conducătoare remorcă
“leader” “trailer”

Transcript primar ARNm

15

Procesare transcript primar

Atât la procariote cât şi la eucariote transcriptul primar al ARNr şi ARNt suferă
modificări post-transcripţionale catalizate de ribonucleaze (excizia unor fragmente).
ARNt suferă modificari suplimentare (=> nucleotidele minore) care conferă identitate
fiecărui tip de ARNt.

Trancript primar (45S) din care se formează toate tipurile de ARN cu excepţia ARNm

16

8
 10/3/2010

Inhibitori ai transcrierii
• Inhibitori care se inseră între 2 perechi GC ale ADN => blochează elongarea
Ex. actinomicina D (dactinomicina)
• Inhibitori care inhibă giraza => împiedică înaintarea ARN polimerazei
Ex. acidul nalidixic, norfloxacina
• Inhibitori care se leagă de ARN polimerază, inhibând elongarea
Ex. rifampicina (rifampin)
• Analogi ai ribonucleotidelor (inhibă elongarea)
Ex. 3’-deoxiadenozina (cordicepina)

17

CONTROLUL TRANSCRIERII

Controlul transcrierii se realizează, la nivelul etapei

de iniţiere, modificând afinitatea ARN polimerazei
pentru promotor prin:

• schimbarea tipului de subunitate sigma

• modificarea miezului polimerazei (ex. ataşarea ppGpp)

• intermediul proteinelor activator (ex. CAP) sau represor

18

9
 10/3/2010

REGLAREA TRANSCRIERII
La bacterii genele structurale care codifică enzime implicate în aceaşi
cale metabolică sunt adiacente şi împreună cu unicul promotor formează
un operon.
=> Prin transcrierea genelor structurale se formează un singur
ARNm policistronic. Transcrierea genelor structurale este
reglată de gena reglatoare care codifică proteina represor.

19

REGLAREA TRANSCRIERII
(continuare)

Prin exprimarea genei reglatoare => represorul inactiv.

Ca urmare a legării corepresorului => un complex activ care se leagă de operator
(secvenţă specifică din promotor), şi blochează accesul ARN polimerazei la promotor.
20

10
 10/3/2010

OPERONUL LACTOZA (Lac)

21

Reglarea operonului Lac

Allolactoza
(izomer al lactozei)

În prezenţa glucozei => adenilat ciclaza inactivă => nivel scăzut AMPc => nu se formează
complexul CAP-AMPc necesar pentru accesul şi legarea ARN polimerazei la promotor.
În prezenţa lactozei, se formează allolactoza (cantitate mică) care se leagă specific de represor
şi, prin modificări conformaţionale, determină desprinderea represorului de pe operator, fapt care
nu este suficient pentru iniţierea transcrierii genelor structurale! 22

11
 10/3/2010

Reglarea operonului Lac

În absenta glucozei adenilat ciclaza este activă => nivel ridicat AMPc (“hunger signal”) => se
formează complexul CAP-AMPc apt să se lege de locusul specific din promotor => este facilitat
accesul ARN polimerazei la promotor.
În prezenţa lactozei operatorul este liber şi ARN polimeraza poate transcrie genele structurale
permiţând bacteriei să utilizeze lactoza ca sursă de energie
C. Dacă este prezentă doar glucoza => ↓ AMPc => complexul CAP-AMPc este absent
=> ARN polimeraza nu se leagă de promotor şi genele nu sunt sunt transcrise, indiferent
23
dacă operatorul este ocupat de represor!

Reglarea operonului lactoza - Recapitulare

24

12
 10/3/2010

Transcrierea la eucariote
• Mai complexă decât la procariote
• Există polimeraze diferite pentru sinteza fiecărui tip de ARN:
- Polimeraza I pentru ARNr 45S (în nucleoli)
- Polimeraza II pentru ARNm (în nucleoplasmă)
- Polimeraza III pentru ARNt şi ARNr 5S (în nucleoplasmă)
- Polimeraza mitocondrială pentru ARN-urile mitocondriale (matrice)
• Fiecare din cele 4 tipuri de polimeraze utilizează promotori diferiţi
• ARN polimeraza II utilizează o diversitate de promotori care conţin secvenţe “consens”:
- caseta TATA (poziţia -32) reprezentând semnalul “unde” începe transcrierea
- casetele CAAT şi GC (în amonte faţă de +1) reprezentând semnalul “când” începe transcrierea
• Pe lângă secvenţele consens (recunoscute de factorii de iniţiere) există
- secvenţe situate la distanţă de promotori (în amonte sau în aval de punctul de start)
care măresc (“enhancer”) sau reduc (“silencer”) viteza de iniţiere a transcrierii ca
urmare a interacţiunii cu factorii de transcriere
- “elemente de răspuns” la hormoni liposolubili

Elemente Enhancer & Caseta Caseta Gena

de răspuns silencer CAAT TATA structurală

Expresie reglabilă Expresie bazală

25

Inhibitori ai transcrierii la eucariote

ARN polimerazele animale (mai ales polimeraza II) sunt inhibate de amanitină,
produsă de ciuperca otrăvitoare Amanita phalloides

26

13
 10/3/2010

Sinteza ARN pe matriţă de ARN

• Unele virusuri au ca material cromozomial ARN care se replică în celula
gazdă sub acţiunea ARN polimerazei ARN dependente (replicaza)
sintetizată în organismul gazdă.
• După infecţie se sintetizează, pe matriţa de ARN (+), o replică
complementară (-) rezultând un duplex ARN.
• Catena ARN (-) va servi ca matriţă pentru sinteza a numeroase catene
complementare (+).
• ARN-ul viral va funcţiona ca ARNm pentru sinteza proteinelor virale

+ +- -----

ARN viral Duplex ARN Molecule fiice

omoloage ARN viral

27

14
 TRADUCERE

• Definiţie
• Cod genetic
• Factori necesari
• Etape
• Inhibitori
• Reglare
• Modificări post-traducere

TRADUCERE - Definiţie

Traducere = sinteza unui lanţ polipeptidic, la nivel ribozomal,

folosind ca matriţă ARNm citit în direcţia 5’-3’

3’

5’

1
 TRADUCERE - Factori necesari
(la procariote)

Factori necesari
– Matriţă: ARNm policistronic (citit în direcţia 5’→3’)
– 20 Aminoacizi standard
– ARNt specific fiecărui Aa (>20)
– 20 Aminoacil-ARNt sintetaze
– Subunităţi ribozomale: 30S, 50S
– Factori de iniţiere:IF1, IF2, IF3
– Factori de elongare: EF-Ts, EF-Tu, EF-G (translocaza)
– Factori de terminare (eliberare): RF1, RF2, RF3 (RRF)
– Sursă de energie: GTP + Mg2+
– Enzime: Met-ARNt formilaza, peptidil transferaza (localizată pe 50S)
– Donor grupare formil: acidul N10-formil tetrahidrofolic (N10-CHO-H4F)

TRADUCERE – Caracteristici procariote

Traducerea însoţeşte transcrierea O moleculă de ARNm este tradusă simultan
de mai mulţi ribozomi situaţi la o distanţă de ≈
100 nucleotide (polizom) => mai multe lanţuri
polipeptidice

Viteza: 20-40 amino acizi/sec

Este consumatoare de energie:
•1GTP pentru iniţiere,
•2GTP pentru fiecare leg. peptidică 4

2
 CODUL GENETIC - Caracteristici
• Permite
“traducerea unui text scris într-o limbă care utilizează 4 cuvinte”: bazele
A, G, C, U într-o limbă care utilizează 20 cuvinte”: cei 20 Aa standard

• Rezultă prin combinarea celor 4 baze grupate câte 3 => 64 codoni

• Este universal, degenerat dar nu şi ambiguu!

5
Khorana & Nirenberg

“Citirea” codonilor
Codonii se citesc începând cu codonul de iniţiere AUG,
fără semne de punctuaţie, până la unul dintre codonii STOP
(nonsens): UAA, UAG, UGA

3
 Etapa de INIŢIERE

Etapa de initiere presupune:

• Sinteza aminoacil-ARNt
• Formarea complexului de iniţiere 30S
• Formarea complexului 70S

Etapa de INIŢIERE

Sinteza aminoacil-ARNt

La procariote Met-ARNtfmet este convertit în

formil-Met-ARNtfmet sub acţiunea transformilazei
(donor formil-H4F)!

4
 Etapa de INIŢIERE
Formarea complexului de iniţiere 30S si apoi a complexului 70S
• Pe locusul Peptidil (P) se găseşte formil-metionil-ARNt (fMet-ARNt)
• Locusul Aminoacil (A) este liber

Complexul 70S

Complexul de initiere 30S 9

Etapa de ELONGARE

• Inserţia Aminoacil-ARNt următor (AA2-ARNt) pe locusul

Aminoacil (A)
• Formarea legăturii peptidice

10

5
 Etapa de ELONGARE
• Inserţia Aminoacil-ARNt următor (AA2-ARNt) pe locusul Aminoacil (A)
Hidroliza GTP asociat factorului de elongare Tu consfinţeşte legarea corectă a AA2-ARNt

Tu-GDP → Tu-GTP
prin intervenţia factorului Ts
11

Etapa de ELONGARE

• Formarea
legaturii
peptidice
Sub acţiunea peptidil
transferazei (din
subunitatea 50S) se
transferă fMet pe
gruparea NH2 a
aminoacil-ARNt2

Translocaza (EF-G)
determină glisarea
(cu un codon) a
ribozomului spre
capătul 3’ a ARNm
Simultan ARNt-ul
descărcat părăseşte
locusul P 12

6
 Etapa de ELONGARE

13

Etapa de TERMINARE
• Recunoaşterea codonului STOP
(UAG) de către unul dintre factorii de
eliberare (RF)

• Hidroliza legăturii ester catalizată de

peptidil transferaza “transformată” de RF
în hidrolază

• Eliberarea ARNt descărcat urmată de

disocierea ribozomului 14

7
 Diferenţe procariote-eucariote

Fixarea ARNm la subunitatea
ribozomală mică
Primul amino acid
Eucariote
Capătul 5’ (CAP) al ARNm
leagă factorii eIF şi subunitatea
40S care conţine Met-ARNtmet;
ARNm este scanat pentru
găsirea codonului START
Metionina
Procariote
Secvenţa Shine-Dalgarno situată în
amonte de codonul AUG se leagă
prin legături de H de o secvenţă
complementară din ARNr 16S
Formil-Metionina

Factorii de iniţiere >12 eIF 3 IF

Ribozomi 80S (40S + 60S) 70S (30S + 50S)

15

Traducere - Inhibitori
Puromicina blochează elongarea substituindu-se unui aminoacil-ARNt

Analog structural al extremităţii 3’ a tirozil-ARNt

Efectele altor medicamente:

• tetraciclina împiedică inserţia aminoacil-ARNt pe locusul A
• cloramfenicolul inhibă peptidil transferaza
• eritromicina inhibă translocarea

16

8
 Modificări post traducere
• Îndepărtarea grupării formil a fMet terminale (procariote)
• Îndepărtarea Met sau a unor fragmente peptidice
• Acetilare
• ADP-ribozilare
• Carboxilare
• Acilare cu acizi graşi
• Glicozilare
• Hidroxilare
• Metilare
• Fosforilare
17
• S-farnezilare (ex. oncoproteine)

Sinteza proteinelor membranare & secretate

Începe cu sinteza peptidei semnal
Peptida semnal este recunoscută de SRP (“signal recognition particle”)=> este sistată
temporar sinteza proteinei
SRP este legat de receptorul specific de pe membrana reticulului endoplasmic
Peptida semnal pătrunde în lumenul reticulului prin porul învecinat receptorului şi este
clivată de “semnal peptidază”
Continuă sinteza proteinei

18