MOARTEA CELULARĂ PROGRAMATĂ

 în organismul unei persoane sănătoase homeostazia celulară este definită ca un echilibru între
procesele distructive şi proliferative celulare.

 Moartea celulară programată (apoptoză) este un proces de distrucţie celulară reglat genetic,
dependent energetic, care înlătură celulele bolnave sau lezate, deoarece au devenit inutile
pentru organism.

 Zilnic, aproximativ 5% din celulele organismului suferă procesul de apoptoză, locul lor fiind luat
de noi celule. In timpul acestui proces celulele mor într-un interval cuprins între 15-120 minute,
fără să lase nici un semn în urma lor (Popescu, 2002; Fesik, 2000).

 Dar, celulele mor şi prin necroză ca urmare a intervenţiei unor agenţi fizici, chimici sau biologici
care distrug membrana plasmatică, afectează anumite organite celulare (cu excepţia nucleului),
determină eliberarea în exterior (peste celulele învecinate) a conţinutului lor celular bogat în
enzime lizozomale şi induc răspunsul inflamator

 Celule apoptotice îşi iniţiază propria distrugere în mod activ, fără însă a afecta celule învecinate
şi Iară să inducă un răspuns inflamator

 Apoptoza (sau absenţa ei) intervine şi în anumite stări patologice grave: apoptoza excesivă este
implicată în imunodeficienţe (de exemplu, SIDA), în maladiile neurologice Alzheimer, Parkinson
şi Huntington (în care neuronii specifici se sinucid prematur şi determină o pierdere ireversibilă
de memorie, mişcări musculare necontrolate şi depresie), în timp ce incapacitatea celulelor de a
intra în apoptoza contribuie la carcinogeneză (Dănăilă şi colaboratorii, 1999).

 Erorile programului apoptotic, atât în sensul scăderii inductorilor apoptotici, cât şi în sensul
elaborării excesive de semnale pentru supravieţuire favorizează tumorigeneza.

Mecanismele moleculare ale apoptozei

 Procesul morţii celulare programate se desfăşoară în mai multe faze. în prima fază are loc

 iniţierea apoptozei, datorită intervenţiei unor stimuli extrem de variaţi, care includ: lezarea
ADN, absenţa factorilor de creştere, toxine şi radiaţii. Prin activarea căii, semnalul este transmis
datorită interacţiunilor proteină - proteină care implică un set bine conservat de module de
semnalizare.

 Urmează faza efectoare a apoptozei în care sunt activate enzimele catabolice şi are loc
permeabilizarea membranei mitocondriale.

 în faza de degradare sau de finalizare a apoptozei sunt degradate proteinele şi este fragmentat
ADN celular
  Cu toate că iniţial apoptoza a fost definită pe baza criteriilor morfologice -condensarea
cromatinei, picnoză nucleară, fragmentarea în corpi apoptotici - în prezent apoptoza este
studiată din punct de vedere biochimic, ca fiind bazată pe un amplu sistem de proteaze,
denumite generic caspaze.

 Caspazele simt activate prin clivare secvenţială de către o altă caspază activată anterior,
mecanism denumit "cascadă caspazică".

Căile de semnalizare

 implicate în apoptoza pot fi clasificate în două categorii:

 căi activate prin semnale apoptotice extrinseci, iniţiate prin ataşarea ligandului la receptorii
celulari de suprafaţă (Fas şi TNF)

 şi căi intrinseci, activate prin semnale emise de senzori în cazul unor leziuni (de exemplu, p53)
sau în cursul dezvoltării

Inductorii apoptotici

 sunt împărţiţi în trei grupuri distincte:

 1.receptori ai morţii

 2. medicamente anti-tumorale genotoxice

 3.şi absenţa factorilor de creştere.

 Receptorii morţii sunt reprezentaţi de TNFR1, Fas, DR-3, DR-4 sau DR-5.

 Factorul de necroză tumorală (TNFa sau TNFJ3) se leagă la receptorul său (TNF-R1) şi induce
trimerizarea acestuia (Blanner şi colaboratorii, 1993).

 Iar ligandul care induce apoptoza, înrudit cu TNF (TRAILf Apoi) utilizează alt receptor al morţii,
DR5.

 Spre deosebire de TNF şi ligandul Fas, care prezintă o înaltă toxicitate, TRAIL declanşează
selectiv apoptoza în celulele tumorale, iar când este administrat la şoarecii cu tumori umane,
determină retragerea tumorilor fără a manifesta o toxicitate aparentă (Hymowitz, 1999)

 Ligandul Fas - unul dintre factorii reprezentativi ai morţii celulare - se leagă la receptorul Fas,
determinând trimerizarea acestuia.

 Domeniul morţii trimerizat captează în regiunea sa citoplasmatică pro-caspaza 8, prin

intermediul unui adaptor (FADD - domeniul morţii asociat cu Fas/ MORT 1).

 In urma acestui mecanism, pro-caspaza 8 este autoactivată şi devine o enzimă matură.

 Apoi, caspaza 8 activează caspaza 3 pe două căi.

 Pe una dintre aceste căi, caspaza 8 procesează direct pro-caspaza 3 din aval şi astfel caspaza 3
activată clivează diferite proteine, printre care ICAD (inhibitorul DN-azei activată de caspaze).

 Apoi, CAD (DN-aza activată de caspaze) este eliberată din ICAD şi degradează ADN-ul
cromozomial.

 Pe cealaltă cale, caspaza 8 clivează Bid, un membru pro-apoptotic al familiei Bcl-2, care
determină eliberarea citocromului c din mitocondrie în citosol.

 Bcl-2 sau Bcl-xL - doi membrii anti-apoptotici ai familiei Bcl-2 - inhibă eliberarea citocromului c
(Kluck şi colaboratorii, 1997).

 în continuare, citocromul c activează caspaza 9 împreună cu Apaf-1 (factorul apoptotic de

activare a proteazei), iar caspaza 9 activează retrograd caspaza 3 (Fig. 3).

 Medicamente genotoxice anti-tumorale, cum sunt etoposidul sau radiaţiile y determină leziuni
ale ADN-ului cromozomial, care sunt semnalizate mitocondriei prin intermediul p53, conducând
la eliberarea citocromului c şi la activarea consecutivă a caspazei 9 pe calea descrisă mai sus
(vezi Fig. 3).

 Apoptoza indusă de absenţa factorilor de creştere a fost cel mai bine studiată pe liniile celulare
mieloide dependente de IL-3.

 în prezenţa IL-3, semnalele de la receptorul IL-3 determină fosforilarea Bad, un membru pro-
apoptotic al familiei Bcl-2.

 Bad fosforilat este cooptat într-un complex împreună cu adaptorul proteic 14-3-3 (vezi Fig. 3).

 In absenţa IL-3, Bad nefosforilat este eliberat din complex şi translocat către mitocondrie, unde
determină eliberarea citocromului c şi activarea caspazei 9.

 Protooncogenă Akt codifică o serin/ treonin kinază exprimată ubicuitar, al cărui domeniu
catalitic este omolog cu acela al kinazelor din familia PKA sau PKC.

 Kinaza Akt/ PKB constituie în aval un substrat pentru protein kinaza PI3, având activitate anti-
apoptotică.

 Au fost identificate patru molecule proteice care participă la semnalizarea morţii celulare
programate:

 domeniul morţii (DD),

 domeniul efector al morţii (DED)

 şi domeniile N-terminale ale DFF45, DFF40.

 Domeniul morţii se află în regiunea intracelulară a receptorilor morţii, în timp ce efectorul morţii
şi domeniile de recrutare caspazice sunt localizate la nivelul proteinelor adaptor, cum sunt FADD
şi procaspazele (Fesik, 2000).

Apoptoza şi mitochondria
 în căile de semnalizare ale morţii celulare
programate, pe lângă receptorii morţii este implicată şi
mitocondria.
 Calea apoptotică extrinsecă presupune participarea
mitocondriei numai în anumite tipuri de celule (în care
pro-caspaza 8 are un nivel scăzut), proteinele
mitocondriale eliberate fiind necesare pentru propagarea
semnalului apoptotic.
 în alte tipuri de celule însă, caspaza 8 este capabilă să
activeze direct programul morţii.
 în organismele la care mitocondria joacă un rol crucial
în apoptoză, implicarea sa constă în depozitarea factorilor
apoptotici.
 In afara citocromului c, componentele mitocondriale
implicate în apoptoză includ adenilat kinaza-2 (AK2),
factorul inductor al, apoptozei (AIF),
 SMAC/ Diablo şi anumite pro-caspaze
 O serie de substanţe participă la permeabilizarea
membranelor mitocondriale, printre acestea numărându-
se molecule mici
 (calciul, oxidul nitric, speciile reactive ale oxigenului),
 lipide (ceramidele şi palmitatul)
 şi proteine (cele mai importante făcând parte din
familia Bcl-2)
 Calciul este unul dintre activatorii fundamentali ai
PTPC.
 însă atingerea unui nivel al Ca2+ mitocondrial suficient
pentru deschiderea PTPC presupune creşterea însemnată
şi/ sau prelungită a Ca citosolic, fenomen întâlnit în
anumite stări patologice, cum sunt ischemia miocardică
sau degenerescenta ereditară a retinei.
 în plus, nivelul citosolic al Ca2+ pare să nu fie singurul
factor determinant al efectelor Ca2+
 Calciul contribuie, în mod indirect, la eliberarea
citocromului c din mitocondrie prin activarea unei protein
fosfataze - calcineurina - care defosforilează Bad, un
membru pro-apoptotic al familiei Bcl-2, permiţând
translocarea Bad către mitocondrie.
 Se cunoaşte faptul că Bcl-2 modulează homeostazia
calciului în mitocondrie şi reticulul endoplasmic, şi poate
regla fluxul de calciu în interiorul mitocondriei, ca răspuns
la stimuli apoptotici
 în anumite tipuri de celule, expunerea la acizi graşi
(de exemplu, la palmitat şi stearat) poate induce apoptoza.
S-a observat că nivelul palmitatului şi stearatului în sângele
de reperfuzie influenţează puternic regenerarea celulelor
cardiace după ischemia miocardică.
 în afară de rolul acizilor graşi ca precursori sintetici ai
sfingolipidelor
 Oxidul nitric (NO), atât cel endogen, cât şi cel exogen,
induce apotoza în megacariocite, printr-un mecanism care
implică interacţiunea cu superoxidul.
 Inhibitorii sintazei NO previn sepsisul indus de
apoptoză în celulele măduvei osoase, în timp ce donorii
NO induc apoptoza în celulele leucemice umane HL-60
printr-un mecanism dependent de citocromul c şi caspaze.
 Speciile reactive ale oxigenului (ROS), generate ca
răspuns la stimuli apoptotici, produc depolarizarea
mitocondriilor izolate, consecutiv deschiderii PTPC
(Sharpless şi DePinho, 2002).
 Interesantă pare ideea conform căreia deschiderea
PTPC mediată de ROS a fost utilizată mai întâi de către
eucariotele timpurii pentru îndepărtarea mitocondriilor
care produceau ROS în exces ("mitoptoză").
Familia proteinelor Bcl-2
 Proto-oncogena Bcl-2 a fost identificată pentru
prima dată, pe baza poziţiei sale, la nivelul punctului de
rupere al translocaţiei cromozomiale t (14; 18) în anumite
limfoame cu celule B.
 Conexiunea dintre Bcl-2 şi apoptoză a fost intuită
odată cu descoperirea la C. elegans a produsului genei
Ced-9, capabil să regleze în sens negativ dezvoltarea
proceselor apoptotice în orgnism şi care s-a dovedit a fi
un omolog al Bcl-2.
 Rolul membrilor familiei Bcl-2 în permeabilizarea
membranei mitocondriale a fost demonstrat de
implicarea anumitor membrii ai familiei (Bid, Bax, Bak) în
eliberarea citocromului c din mitocondriile purificate.
 Deşi observaţiile sugerează că membrii familiei Bcl-2
pot regla apoptoza prin controlul permeabilizării
membranelor mitocondriale, acest mecanism nu este
valabil în cazul C. elegans, unde mitocondria nu este
implicată în semnalizarea morţii celulare.
 Moleculele anti-apoptotice Bcl-2 conţin 4 subtipuri
de domenii omoloage BH (Fig. 7), în timp ce membrii pro-
apoptotici tind să piardă domeniul N-terminal BH4, iar în
multe cazuri chiar şi domeniile BH1 şi BH2, fiind denumite
de aceea proteine ce conţin numai BH3 (Schendel şi
colaboratorii, 1999).
 Domeniul BH4 se găseşte aproape exclusiv la
membrii anti-apoptotici şi se pare că mediază
interacţiunea cu calcineurina.
 în plus, îndepărtarea domeniului BH4 prin clivaj
proteolitic transformă Bcl-2 din anti- în pro-apoptotic.
 Recent s-a descoperit că domeniul BH4 al Bcl-2 este
implicat în controlul funcţionării canalului anionic
dependent de voltaj (VDAC) din compoziţia PTPC
mitocondrial (Revillard şi colaboratorii, 1998).
 Analiza structurală a unora dintre membrii familiei
Bcl-2 a sugerat că domeniul BH3 poate fi "mascat" în
interiorul moleculei, fiind indisponibil pentru formarea
de legături cu alte molecule, ceea ce a permis clasificarea
membrilor familiei Bcl-2 în două categorii: cu "BH3
mascat" şi cu "BH3 expus" (prin expunerea părţii
hidrofobe a domeniului BH3).
 în funcţie de acest criteriu, moleculele cu BH3 expus
pot fi considerate active, în timp ce moleculele cu BH3
mascat sunt fie anti-apoptotice, fie molecule pro-
apoptotice conformaţional inactive, aşteptând activarea
printr-o serie de modificări incluzând fosforilarea şi
clivajul proteolitic