Biochimie-Facultatea de Inginerie medicală 2019-2020

Lucrarea nr. 4
Izolarea si identificarea cazeinei si lactozei din lapte
Background
Laptele este o suspensie apoasa coloidala formată din mai multe componente ce include glucide,
lipide, proteine şi fosfaţi. Conţinutul in fiecare din aceste componente depinde de sursa laptelui (de vaca, de
oaie, de capră, etc.) precum şi de modul de procesare la care a fost supus fiecare sortiment.

Cazeina este cea mai importanta proteina din lapte. Acesta funcţionează ca proteina de stocare, care
îndeplineste cerinţele nutriţionale. Cazeina poate fi izolată din lapte prin acidifiere pentru a o aduce la punctul
izoelectric. La punctul izoelectric, numărul de sarcini pozitive pe o proteina este egal cu numărul de sarcini
negative. Proteinele sunt mai puţin solubile în apă la punctul izoelectric, deoarece tind să formeze agregate
datorită interacţiunilor electrostatice. Capătul pozitiv al moleculei de proteină atrage capătul negativ al altei
molecule de proteine, iar agregatele formate precipită din soluţie.

Pe de altă parte, dacă o molecula de proteina are o sarcină net pozitivă (la un pH scăzut - condiţii
acide) sau o sarcina net negativă (la un pH ridicat -condiţii bazice), solubilitatea în apă crește.
Lactoza este glucida care se gaseşte in lapte şi este, din punct de vedere structural, compusă dintr-o
moleculă de α-D-glucoză şi una de β-D-galactoză, unite prin legătură 1,4-β-glicozidică.

În prima parte a acestui experiment, veti izola cazeina din lapte care are un pH de aproximativ 6.6.
Cazeina va fi separata ca un precipitat insolubil prin acidularea laptelui la punctul izoelectric (pH 4.6).
Grăsimea care precipită împreună cu cazeina poate fi eliminată prin dizolvarea în alcool. Dupa separarea
caseinei si îndepartarea grasimilor veti separa si celelalte proteine solubile (lactoalbumina si lactoglobulina)
prin denaturare si precipitare, in final in solutie ramanand numai lactoza.
În a doua parte a acestui experiment, veti realiza identificarea cazeinei si lactozei prin efectuarea unor
teste chimice cunoscute.

1
 Biochimie-Facultatea de Inginerie medicală 2019-2020

A. Izolarea cazeinei
Intr-un pahar Erlenmeyer de 250-mL se introduc 50 ml lapte si se incalzeste pe baie de apa la 400C
sub agitare.
Cand laptele atinge temperatura dorita, se scoate din baie si se adauga sub agitare 1ml acid acetic
glacial sub agitare. Se observa formarea precipitatului.
Se agita ocazional inca 10 minute, apoi se filtreaza printr-o panza de tifon. Se indeparteaza apa din
precipitat presand cu ajutorul unei baghete. Precipitatul format se transfera intr-un pahar uscat, iar filtratul se
amesteca cu 5ml solutie Na2CO3 20% si se utilizeaza mai departe pentru izolarea lactozei.
Peste precipitat se adauga 15 ml etanol. Se agita bine 10 minute, maruntind precipitatul cat mai bine,
apoi se lasa sa se decanteze si se filtreaza tot cu o panza de tifon. Precipitatul se scoate pe o placuta Petri
si se lasa la uscat circa 15 minute, maruntind din cand in cand cu ajutorul unei spatule.
Se cantareste produsul obtinut si se calculeaza procentul de cazeina din lapte cu formula:
𝑚𝑐𝑎𝑧𝑒𝑖𝑛𝑎
% cazeina = ∙ 100
50 𝑚𝑙 𝑙𝑎𝑝𝑡𝑒

B. Izolarea lactozei
Filtratul obtinut in prima faza se transvazeaza intr-un pahar si se incalzeşte la fierbere, direct pe plita, timp de
10 minute, cand are loc precipitarea celorlalte proteine. Solutia se filtreaza fierbinte pe filtru cutat, apoi se
raceste si se utilizeaza pentru identificarea lactozei.

C. Analiza chimica a cazeinei

Se prepara o solutie de cazeina prin introducerea a 0.2g din cazeina separata in 25 ml apa, se adauga o
picatura de solutie NaOH 10% si se agita pana la dizolvare completa.

1. Testul biuretului
Este unul din cele mai importante teste pentru proteine. Cand o proteina reactioneaza cu sulfatul de cupru(II)
testul pozitiv este dat de formarea unui complex de cupru care are culoarea violet.

Testul este pozitiv pentru orice proteina ce contine doua sau mai multe din urmatoarele grupe:

2
 Biochimie-Facultatea de Inginerie medicală 2019-2020

Mod de lucru
Intr-o eprubeta se introduc 2 ml solutie de caseina, se adauga 5 picaturi de solutie NaOH 10% si 2
picaturi de solutie 5% CuSO4. Se agita bine si se noteaza rezultatul.
2. Testul cu ninhidrina
Aminoacizii si proteinele care au o grupa amino libera reactioneaza cu ninhidrina dand un complex albastru-
violet:

Mod de lucru
Intr-o eprubeta se introduc 2 ml suspensie de caseina, se adauga 5 picaturi de solutie de ninhidrina si
se incalzeste la fierbere cu atentie timp de 5 min. Se agita bine si se noteaza rezultatul.

Obs. 1. Solutia de ninhidrina contine etanol. Atentie la incalzire.

2. Ninhidrina reactioneaza si cu proteinele din piele, dand compusi colorati, care se
indeparteaza greu. Feriti contactul pielii cu solutia de ninhidrina.

3. Testul xantoproteic
Este o reactie caracteristica proteinelor care contin aminoacizi cu inel benzenic. Acidul azotic concentrat
reactioneaza cu inelul benzenic conducand la nitroderivati de culoare galbena.

Intr-o eprubeta se introduc 2 ml suspensie de caseina, se adauga 10 picaturi de acid azotic concentrat
si se incalzeste pe baie de apa cu atentie timp de 5 min. Se agita bine si se noteaza rezultatul.

D. Analiza chimica a lactozei

1 Testul cu reactiv Benedict
Glucidele reducătoare sunt detectate cu ajutorul reactivului Benedict care conţine ioni de
Cu2+(albastru) si care in urma unui proces redox datorat grupei aldehidice trec in ioni de Cu+ care precipita
sub forma de Cu2O (rosu). Lactoza, fiind formata dintr-o molecula de glucoza si una de galactoza unite prin
legătură 1,4-β-glicozidică are hidroxilul anomeric liber si poate da test pozitiv cu reactivul Benedict.
Mod de lucru

3
 Biochimie-Facultatea de Inginerie medicală 2019-2020

Intr-o eprubeta se introduc 3 ml solutie de lactoza separata anterior. Se adauga apoi 3 picaturi de
reactiv Benedict, se agita bine si se introduce intr-o baie de apa la fierbere unde se mentine 2 minute. Se
scoate si se noteaza culoarea observata.

Se completeaza tabelul:
Volum lapte (ml)
Masa cazeina separata (g)
Procent cazeina in lapte(%)
Cantitate de cazeina intr-un litru
de lapte (g/l)
Teste chimice de identificare Culoare observata Observatii
Testul biuretului
Testul cu ninhidrina
Test xantoproteic
Reactia cu reactiv Benedict

Intrebari
1. Cazeina are punctul izoelectric la pH 4.6. Ce tip de sarcini (pozitive sau negative) vor fi majoritare in structura cazeinei
in lapte?
2. Daca se adauga o cantitate mai mare de acid acetic se va obtine o cantitate mai mare de cazeina sau nu? Explicati
raspunsul dat.
3. In locul acidului acetic poate fi utilizat si alt acid? Dati exemple de produse comune care pot fi utilizate pentru
precipitarea cazeinei.
4. Un procent destul de mare din populatia globului (aprox. 5%) prezinta intoleranta la lactoza. Care este cauza
intolerantei la lactoza?