1.

Siguranța laboratorului
Întrebarea 1: Care simbol descrie un reactiv oxidant ?
•Opțiunea D
•Opțiunea A
•Opțiunea B
•Opțiunea C

Întrebarea 2: Ce următorul simbol înseamnă?

•Coroziv
•Nociv
•Pericol pentru sanatate
•Toxic

Întrebarea 3: Aici este o imagine a simbolului de pericol pe cutie. Ce înseamnă?

•Inflamabil
•Oxidant
•Toxic
•Exploziv

Întrebarea 4: De ce este ea periculos să poarte lentile de contact în laborator?

•Cele reacționează din plastic cu acizi
•Ochelarii protejează mai bine decât lentilele
•Lichidul poate fi prins sub ele
•Ele nu protejează suficient de bine

Întrebarea 5: Ce trebuie să faceți înainte de a părăsi laboratorul, pentru a vă asigura că

nu purtați urme de substanțe chimice afară?
•Spălați-vă mâinile și apoi îndepărtați haina de laborator
•Scoateți haina de laborator și spălați-vă pe mâini
•Spune-i supraveghetorului tău
•Opriți principala putere

2. Pipetare: Stăpânește tehnica

Întrebarea 1: Testul Bradford funcționează numai la concentrații scăzute de proteine , de la

0,05 la 0,5mg / per ml proteină. Cum putem reduce concentrația de proteine din eșantionul
nostru?
•Se diluează eșantionul
•Se concentrează eșantionului
•Evapore proba
•Purificați proba
Întrebarea 2: Care este intervalul de volum al P1000?
•0,5-2 pL
•20-200 pL
•200-1000 pL
•2 - 20 pL

Întrebarea 3: Cât de mult de proteine de ai nevoie să adăugați la 800 pl tampon în primul

tub de microcentrifugă pentru a face o diluție de 5 ori ?
•200 pL
•100 ml
•500 pL
•100 pL

Întrebarea 4: Cât de mult de fluid din cele 5 ori probă diluată trebuie să fie transferată către cele al
doilea tub de microcentrifugă care conține 900 pL tampon pentru a se dilua în continuare de 50
de ori?
•100 pL
•50 pL
•200 pL

•10 pL

Întrebarea 5: Colorantul pe care l-am adăugat colorează proteinele în albastru. Cum se

schimbă culoarea sa creșterea concentrației de proteine ?
•Culoarea albastră se diminuează
•Culoarea rămâne aceeași
•Culoarea albastră se intensifică
•Culoarea maro se intensifică

Întrebarea 6: Care este intervalul optim de valori de absorbanță măsurate cu un spectrofotometru?

•0,1-1
• 0-0,8
•0,05 - 0,5
•0,08 - 0,65

Question 7: Pentru a determina concentrația de proteină dintr-o probă biologică, folosind

metoda Bradford, această probă s-a diluat de 500 de ori și sa obținut o absorbanță de 0.15.
Curba standard are o pantă de 0,06 mL ' mg 4 . Care este concentrația de proteină a probei
biologice nediluate?
•1,25 mg / ml
•1,25 g / ml
•2,5 mg / ml
•4,5 mg / ml
 3.Pregătirea soluției : De la sare la soluție
Întrebarea 1: De ce ecuație avem nevoie pentru a afla câti moli de NH 4 CI ar fi într-o solutie
de 500 ml cu concentratie 0,300 M?
•C = V / n
•C = nxV
•n = C / V
•n = CxV

Întrebarea 2: Bine. Cum se putem apoi obține de la mol (n) la masa (m)? Vă dau un
indiciu:Vei merge la nevoie de masa moleculară (M).
•m = n / M
•M = mxn
•m = nxM
•m = M / n

Întrebarea 3: Care a fost primul pas al utilizării balanței, înainte de a adăuga ceva la un
vas de cântărit?
•Tara balanța fără un vas de cântărit și balansul deschis
•Tarați balanța cu vasul de cântărire și balansul deschis
•Tarați balanța fără un vas de cântărit și balanța închisă
•Tarați balanța cu vasul de cântărire și balansul închis

4. Spectrofotometre: Construirea și explorarea Instrumentului

Întrebarea 1: Care este funcția unui spectrofotometru?
•Măsurați lungimea de undă care trece prin cuvetă
•Măsurați greutatea cuvetei
•Măsurați masa moleculară a enzimei
•Măsurați cantitatea de lumină care trece prin cuvetă

Întrebarea 2: Care este funcția gratarului de difractie?

•Pentru a furniza o sursă de lumină
•Pentru a transforma lumina incidentă în lumină transmisă
•Pentru a măsura transmitanța
•Pentru a separa lumina în lungimile sale de undă componente

Întrebarea 3: Ce parametru măsoară direct detectorul ?

•Lumina incidentă totală care strălucește pe cuvetă (l0)
•Absorbanta
•Lungime de undă
•Lumina transmisă prin cuvă (l t)

Pagina 5
5. Spectrofotometrie: Învață legea Beer-Lambert cu experimente
de absorbție
Întrebarea 1: Investigăm rata inițială de reacție a unui catalizator. Care parte a curba de
absorbție ar trebui să utilizați pentru a determina viteza de reacție inițială ?
•B
•C
•A
•D
Întrebarea 2: Gandeste - te inapoi la cand am discutat despre determinarea absorbanței în
timpul construirii spectrofotometrului. Care ecuație am putea folosi pentru
adetermina concentratia produsului din valoarea absorbantei ?
• Legea Beer-Lambert : A = e -c -l
• Regula de diluare: M, - vj = M 2 - V 2
•Modificarea entalpiei: AH = AE + PAV
•Prima lege a termodinamicii: AE = q ♦ w
Întrebarea 3: Când catalizatorul a fost la 0,1 mg / ml și concentrația substratului 16 pM,
rata inițială a absorbantei schimbarea a fost de 0,005 unități de absorbanță pe secundă.
Produsul măsurat are un coeficient de stingere molară de 6220 iar calea lungimea este lățimea
unei cuvete; 1 cm. Folosind informațiile de mai sus, puteți identifica care valori
sunt importante și rearanjați ecuația Beer-Lambert pentru a converti valoarea
ratei absorbantei până la valoarea ratei concentrației?
•0,8 M ' -S' 1
•1,2 pM ' -S1
•0.8pM *
•1,2MV

Pagina 6
6. Cinetica enzimatică

Întrebarea 1: Vrem să determine concentrația de NADH într - o soluție , care, de asemenea ,

conține NAD *. Ce lungime de undă este optimă pentru a măsura NADH?
•260 nm
• 340 nm
•290 nm
•400 nm

Întrebarea 2: Trebuie să se preparam un master mix cu reactivii pentru fiecare reacție. De ce

nu vom adăuga enzima în amestec de master mix?
•Enzima ia mai volum și se va dilua reacția
•Enzimă conține un inhibitor atât de obiceiul de lucru
•Reacția va începe imediat și masuratoarea noastra va fi inexacta
•Mixul master nu poate conține proteine, deoarece acestea interferează cu măsurătorile
Întrebarea 3: De ce nu avem nevoie de tampon în master mix?
•Pentru a mări volumul mixului master
•Pentru a stabiliza temperatura amestecului principal
•Pentru a elimina culoarea din mixul principal
•Pentru a stabili pH-ul reacției

Întrebarea 4: Amestecul master mix conține acum: 0,16 ml de 10 pM etanol, 0,2 ml de 10 pM

NAD * și 0,54 ml tampon. Vom adăuga 0,1 ml de 1 mg / ml ADH astfel încât volumul total
va fi 1 mL. Care este concentrația substratului în acest mix master?

•0,016 mM
•0,16 mM
•0,0016 mM
•1,6 mM

Întrebarea 5: Privind complotul, care este Km ?

• B
• C
• A
• D

Întrebarea 6: In inhibitia competitiva, V MBX (app) este ... și Km ( app ) este ....
•Scăzut; crescut
•Neschimbat; neschimbat
•Creșterea; scăzut
•Neschimbat; crescut

Întrebarea 7: Inhibarea necompetitiv, The VmaxUppjis ... și km ( « P p) este ....

•Creșterea; scăzut
•Scăzut; neschimbat
•Scăzut; scăzut
•Creșterea; neschimbat

Întrebarea 8: Inhibarea necompetitive, VmaxV max este ... si Km este ....

•Scăzut; scăzut
•Neschimbat; scăzut
•Scăzut; crescut
•Creșterea; neschimbat

7. Electroforeza pe gel: Vizualizați și separați nucleicul acizi

Întrebarea 1: Care este funcția unei scări în electroforeza pe gel ?

•Control pozitiv
•Evitați ca benzile să se scurgă din gel
•Măsurați dimensiunea benzilor din eșantion
•Control negativ
Întrebarea 2: Unde pe gel vor fi cele mai mari molecule de ADN și de ce?
•Aproape de partea de jos, deoarece au o sarcină mai negativă
•În partea de jos , deoarece migrează prin matricea de gel mai repede
•Lângă partea de sus , deoarece ele nu pot sa migreze prin matricea gelului asa repede
•Aproape de vârf, deoarece acestea sunt mai puțin încărcate negative

Întrebarea 3: Cum sunt vizualizate moleculele de ADN sau ARN pe gel?

•Cele Benzile arunca o umbră atunci când lumina trece prin gel
•Un colorant etichetat care se leagă la ADN - ul se adaugă
•Sarcina negativă a ADN - ului este utilizată pentru a detecta benzile
•ADN - ul este extras din gel și apoi măsurat

8. HPLC

Întrebarea 1: Care moleculă iese ultima din coloană? Derulați în jos pentru a vedea opțiunile
•Toți împreună
•Povidonă
•Stearat de magneziu
•Clorhidrat de metformină

Pagina 9
Întrebarea 2: Măsurarea timpului pe eșantion componente constă în
staționară de fază în raport cu momentul în care se află în mobil faza se numește?
•Rezoluţie
•Selectivitate
•Numărul plăcii
•Factorul de retenție

Întrebarea 3: Care dintre următoarele este considerat un vârf bun ?

•A
•C
•D
•B

Întrebarea 4: Într-un sistem HPLC , margelele din interiorul coloanei se mai numesc și faza ...
•Staționar
•Coloană
•Solid
•Mobila

Întrebarea 5: Ce face trecerea fazei mobile prin coloană?

•Gravitatie
•Forța capilară
•Electricitate
•Pompa
Întrebarea 6: Cum ar trebui să pregătiți o curbă de calibrare ?
•Prin injectarea unei cantități cunoscute de analit și determinarea aria vârfului
•Prin precis măsurarea debitului ratei
•Prin utilizarea unui detector Rl și zaharoză ca analit
•Prin setarea răspunsului detectorului la zero

Întrebarea 7: În HPLC cu fază inversă ...

•O fază staționară hidrofobă este combinată cu o fază mobilă polară
•O fază staționară hidrofilă este combinată cu o fază mobilă polară
•O fază staționară hidrofobă este combinată cu o fază mobilă nepolară
•O fază staționară hidrofilă este combinată cu o fază mobilă nepolară

Întrebarea 8: În funcție de interacțiune, diferiți compuși vor călători prin coloana

la viteze diferite și eluați la momente diferite. Acest timp specific se numește?
•Timp de bază
•Timp de vârf
•Timp de retenție
•Timp de eluare

Întrebarea 9: Coloana se mai numește faza staționară și este locul unde ia ...loc.
•Injectarea probei
•pregătirea unei mostre
•Proba de excreție
•Separarea probei

9. ELISA

Întrebarea 1. Ce pas trebuie să facem după acoperirea plăcii?

•Adăugarea substratului TMB
•Blocarea plăcii
•Adăugarea unei enzime peroxidază de hrean
•Adăugarea anticorpului primar.

Întrebarea 2: Care etapă trebuie să o facem după adăugarea anticorpului secundar?

•Adăugarea substratului TMB
•Blocarea plăcii
•Detectarea spectrofotometrului.
•Adăugarea unei enzime peroxidază de hrean

Întrebarea 3: Care biomoleculă poate detecta în mod specific prezența unei anumite proteine,
cum ar fi FIX recombinant , într- o probă plină de alte proteine?
•Integri ns
•Antigeni
•Imunoglobuline
•Androgeni
Întrebarea 4: Faceți clic pe Vizualizare imagine. Ce tip de ELISA este prezentat în diagramă?
•Direct
•Sandwich
•Indirect
•Competitiv

Întrebarea 5: Cum se numesc anticorpii cu specificitate ridicată care detectează un singur

epitop ?
•Terapeutic
•Monoclonal
•Specific
•Policlonal

Întrebarea 6: Tamponul de blocare de bază conține 5% ser albumină serică (BSA) dizolvată
în PBS. Care este scopul adăugarea unui blocare tampon?
•Pentru a minimiza raportul semnal-zgomot
•Pentru a crea un mediu optim pentru interacțiunea hidrofilă
•Pentru a preveni legarea proteinelor specifice de placă
•Pentru a reduce semnalul de fond EUSA

Întrebarea 7: Tween 20 este utilizat în tamponul nostru de spălare . Ce tip de compus

este Tween 20?
•Reactant
•Enzimă
•Substrat
•Surfactant

Întrebarea 8: Care este scopul standardului?

•Pentru a evita un fals pozitiv
•Pentru a asigura un semnal de detectare ridicat
•Pentru a valida falsul negativ
•Pentru a crea curba standard

Întrebarea 9: ELISA cantitativă include o serie de diluare a concentrațiilor cunoscute

folosit pentru a crea o curbă standard. Această curbă standard permite concentrațiile de
antigeni într - un eșantion să fie cuantificate. Primul godeu conține 200 pl de standard , cu
concentrație de 90 ng / ml per mililitru. Dacă vrem să folosim o diluție cu factor de diluție de
2, cât de mult eșantion ar trebui să fie transferat de la primul godeu către cel de-al doikea
godeu care conține 100 pL diluant?
•ISO pL
•200 pL
•50 pL
•100 pL
Întrebarea 10: Vom efectua o serie de diluții cu un factor de diluție de 2. Concentrația
a standardului în prima sondă este de 90 ng / ml. Volumul alicotului este de 100 pL. Volumul
diluantul din godeul 2-8 este de 100 pL fiecare. Care este concentrația de standardului în
goseul 8? Luați în considerare faptul că diluam concentrația la jumătate în fiecare etapă.
•1,7 ng / pL
•0,7 ng / pL
•11,3 ng / pL
•5 ng / pL

Întrebarea 11: Un control pozitiv este un eșantion cunoscut pentru a

da rezultate pozitive pentru testul dat. Care este scopul controlului pozitiv ?
•Validați rezultatele fals pozitive
•Dă întotdeauna rezultate pozitive
•Verifica dacă rezultatele negative sunt valide
•Oferiți rezultate pozitive chiar și atunci când procedura nu este optimizată

Întrebarea 12: Cum se numește un grup de eșantioane la care nu se așteaptă un

răspuns ? Acest grupul conține toți tampoanele și reactivii, cu excepția substanței de interes.
•Eșantion pozitiv
•Standard
•Probă de testare
•Control negative

Întrebarea 13: Care este scopul agitării placa ELISA?

•Reducerea timpul de spălare
•Optimizarea semnal-zgomot raportului
•Prelungirea timpului de incubație
•Creșterea ratei de legare

Întrebarea 14: TMB (tetrametil benzen) este un substrat pentru peroxidaza de hrean (HRP).
Care este containerul adecvat pentru depozitarea TMB?
Recipient protejat împotriva luminii

•Sticla pahar
•Tub Eppendorf
•Flacon din metal

Întrebarea 15: O soluție de oprire se adaugă pentru a

oferi un fix final punct pentru analiză. Ce este solutia de oprire pentru substratul TMB din
ELISA în prezența peroxidazei de hrean (HRP)?
•Clorura de sodiu
•Hidroxid de sodiu
•Acid sulfuric
•Acid clorhidric
Întrebarea 16: Ecuația curbei standard este y = 0,9988x -1,437. În ELISA noi
aM măsurat absorbanța folosind un spectrofotometru. Cum putem calcula suma
de FIX în fiecare probă?
•Suma FIX = (0 9988 ♦ Absorbanță) /1.437
•Cantitatea de Fix = {Absorbanta + 1,437) / 0.9988
•Suma FIX = 0,9988 * Absorbanță -1,437
•Suma FIX • 0,9988 = Absorbanță ♦ 1,437

Întrebarea 17: De la: doamna Stauffer. Bună ziua, am nevoie de ajutorul tău pentru depanare.
La ELISA, rezultatul meu e ciudat. Toate godeurile prezintă culori albastre strălucitoare
similare , chiar și controlul negativ . Ce fel de problemă am ?
•Nu aveți nicio dezvoltare a culorii
•Ai un fundal ridicat
•Nu aveți citire optică
•Ai o absorbanță redusă

Întrebarea 18: De la: Senor Guzman. Salut! Am generat curba standard pentru experimental
meu ELISA. Ce crezi?
•Curba perfectă, standard Senor!
•Nu aveți suficiente mostre
•Curba dvs. standard este slabă
•Te folosind regresiei greșită

Întrebarea 19: În ELISA direct , ce componente sunt atașate direct la placă?

•Detectarea anticorpilor
•Antigeni
•Agenți de blocare
•Captează anticorpi

Întrebarea 20: Ce componentă a sandwich-ului ELISA este necesară în perechi?

•Antigeni

•Enzime
•Anticorpi
•Agenți de blocare

Întrebarea 21: Într - un competitiv ELISA, cum ar fi trebui sa reactioneze semnalul

măsurat de catre detector la o crestere a antigenului in proba?
•Crește
•Scădea
•Nu este afectat
•Meci
10. Testul Biuret pentru proteine

Întrebarea 1: Un control pozitiv este un eșantion cunoscut ca da rezultate positive

pentru testul dat . Care este scopul unui control pozitiv?
•Dați întotdeauna rezultate negative
•Oferiți rezultate pozitive chiar și atunci când procedura nu este optimizată
•Verificați dacă rezultatele negative sunt valide
•Validează fals-pozitive rezultate

Întrebarea 2: Aminoacizii sunt legați printr- un tip specific de legătură covalentă . Reactia
Care produce aceasta legătura produce de asemenea și o singură moleculă de apă. Ce tip
de legătură leagă amino acizii împreună într- un lanț?
•Legături peptidice
•Legături metalice
•Legături de hidrogen
•Legături ionice

Întrebarea 3: O secvență de aminoacizi sau o polipeptidă crește de la capătul N-terminal la

Capatul C-terminal. Secvența liniară a aminoacizilor dintr-o proteină este considerată ...
Structura secundara a proteinei.
•Secundar
•Terţiar
•Primar
•Trimestrial

Pagina 15
11. Pregătirea probei de cancer pentru masă
Spectrometrie
Întrebarea 1: Ce tehnică poate fi utilizată pentru a caracteriza proteinele?
•Colonoscopie
•Biopsie
•Spectrometrie de masa
•Extracția proteinelor

Întrebarea 2: Ce proces este prezentat în de mai sus imaginea?

#>^*2^
•Liza
•Denaturare
•Precipitare
•Digestie

Întrebarea 3: Să verificăm dacă vă amintiți cum a început extracția proteinelor ... Care
proces este prezentat în imaginea de mai sus?
•Precipitare
•Liza
•Denaturare
•Digestie

Întrebarea 4: Care este ordinea etapelor necesare pentru a extrage proteinele din celule și
pentru a le pregati pentru analiza MS?
•Liza celulară - digestie - denaturare
•Liza celulară - denaturare - digestie
•Denaturare - digestie - liză celulară
•Denaturare - liză celulară - digestie

12. Hematologie: Introducere în sânge

Întrebarea 1: În timp ce proba este analizată, să revizuim funcțiile echipamentului nostrum.

Cum poate un analizor automat de hamatologie sa determine numărul total de celule?
•Este determinat manual de către tehnicianul de laborator
•Pe baza rezistenței electrice
•Cu un aparat PCR încorporat
•Cu un microscop încorporat

Întrebarea 2: Care este avantajul unui frotiu de sânge comparativ cu un numararea totala de
celule sangvine ?
•Frotiurile de sânge se obțin mai repede decât hemograma completă
•Acesta ajută la identificarea infecțiilor virale
•Acesta servește ca un control de calitate suplimentar
•Pentru a obține o imagine clară a morfologiei celulelor sanguine
Protectia muncii

Created by free version of DocuFreezer

Instrumente de bază in laborator

Unitati de măsură

Matematica in laborator
—
 Simularea laboratorului virtual - Lab Safety

Scop:
- Sa folositi correct echipamentul de laborator
- sa descrieti ce este voie si ce NU este voie sa faceti in laborator
- Sa folositi corect dotarile pentru indepartarea unei eventuale contaminari
- Sa reactionati correct in situatii de urgenta
Protectia muncii
I l.‘ ' ' =2 ° 4-- III- uu—_. - c n

' Sa stiti unde se afla W

1-“ .v echipamentul de Important. Lab Safety Rules r

aa siguranta

.9
44 .\ i“
Urmati instructiunile

Imbracati-va corespunzator
NU experimentati iresponsabil!

' $ I
Lasati experimentele
acasa
0.4 Sa stiti cum sa procedati
in cazul unui accident
o
NU mancati sau
m‘.“ I NU gustati sau mirositi " beti in laborator ~ ‘
substantele chimice
“v A. a ,
NU experimentati pe
propria persoana Arunca in mod
corespunzator deseurile
generate.

vYv
1. Purtarea echipamentului de protective corespunzator.
2. Schimbarea manusilor contaminate si aruncarea lor in gunoiul biologic nu menajer, pentru a evita o
raspandire a unei eventuale contaminari.
3. Spalarea pe maini cand se lucreaza cu materiale care dauneaza sanatatii si inainte de a parasi
laboratorul
4. Nu mancati si nu stocati mancare in laborator: pe masa, in frigider, in congelator!
5. Nu beti.
6. Nu fumati.
7. Nu purtati lentile de contact.
8. Nu aplicati produse cosmetice.
9. Urmati regulile de protectie ale laboratorului privind indepartarea obiectelor ascutite: sticla sparta, ace,
lame de bisturiu, pipete de sticla.
10.Nu produceti aerosoli si nu stropiti si nu varsati probele biologice, reactivii de lucru.
11.Decontaminati suprafetele de lucru intotdeauna inainte si dupa experimente.
12.Spalati frecvent echipamentul de laborator, chiar daca nu a fost contaminat.
13.Decontaminati toate materialele cu potential infectios inainte de aruncare.
14.Anuntati orice incident ce poate rezulta in expunerea colegilor la un material infectios.
 NENUMĂRATE SUBSTANȚE SUNT TOXICE SI SE ETICHETEAZĂ CORESPUNZĂTOR

“‘3“t3?
*3 —
Dc:-if...
4!" :3'2!
E: '55 1"!

{31|}.-

@3454
n 3?
rig? i44 “2:? I#7:?

" In”! ..

’3" ". 1'"..- ET -; ;,.- ..

varran i ‘5'*3: - “'34;,-i" {'21’3'“
“5::#554. 9#4344 G5:3
inr? '5‘
 .4 o 4
\ 4 . t .. 344.4%; _ .4;--
\ \ 4“ ".‘4 r‘4 w' #4”. e t 44 4',
I .\ . "r,

~
‘ ,
A
;t_~/
1'" f " a
‘ ,4” -' ‘5‘ 4
. .‘Zr‘ ~ ' s
Q _
1‘4 Q ,‘
m ' 4 ...
‘2
’ X

,44
44 .. 4 4444 44
' V154,
4: ,- ‘ ' :4 » v
3?" 44» '4_.‘-
31"t,33?! "'- 3‘
- \
3am: ', , _>
V
m)-
" ' ‘1
m
4 .
444,. g- :.
- r» .« 441
/.. o 4 .

?????
, 4 , .

Int ,4 O
.» ..-' "' I x"
7' "" ,2? ’ '
.~ ,>
'3'-
.rw ,4
,
v. - 4.
a 4
44 4 4' :4 "‘4#4 o \
.f ,4. 5' : a; 4..
‘44) ,4-4 'p4\x;
’ t, w - 4'» > 4” «
1'1" 4' £0;
' 49' ‘- "5:
',, r.
. .“.:'4 4' 4- 4_ 4
fat: 4. A 4 L
' chm 4%}- . .
\4-444Jy}455 :. ~ ‘ .
.14. W'F'V“ ' .
\.'a\-4 \t‘ “F" s l.
*5"?' .t
- Xv if"; 4 :
4. ' ' d.
.pW ii“ v.‘"(-J',t, A" : I‘-
7...,
urxg'e—h ‘ “1'9 ‘\ . a: fig ;..
. .33: , \r‘a - I: V .-.. .
4.4 fix: .4 wi- ;. 3; .
\
..4:4 \4‘ - -44 '4.4,445 4. .4 .: 4 V-44 -
"V. x 4 4 4 4 \
4

2v. \ 3.3? , : ' ._ , wt «-

4,4,3. 4:441. ~ . -€144
4. 3'1}.- M‘ 4.- 44 ‘4. ‘~, \ S4 4 p“ Q ~

" " .“1!*.~".‘.‘. .4 ‘3 d

4 . 4 «*‘2- «v4 ‘
"Viki“
‘_4_4.‘
4 . 44 .t " fit4n-v.‘
G'f-J-._ .
”M l
 Instrumente de bază in laborator
—
(::::u
Echipamente de laborator Reactivi

Termometru Preparea solutiilor

Balanta
Calcularea concentratiilor
Centrifuga
Pregatirea reactivilor pentru analiza
Sticlarie de laborator
Pipete
 - , .9?

TERMOMETRUL

- Aplicatie: toate reactiile analitice - temperature optima → temperatura trebuie controlata cu precizie in determinarile enzimatice
- 2 tipuri majore: de sticla cu lichid, electronic (termistor)
- Toate trebuiesc bine calibrate pentru acuratete

Principiul de functionare: ca urmare a variatiilor de temperatura are loc variatia de volum si presiune a lichidului care va urca intr-un tub
capilar. Inaltimea coloanei de lichid din tubul capilar este proportionala cu tempeatura care induce dilatarea lichidului.

Interval variabil: temperatura necesara trebuie sa se afle la jumatatea scalei de temperatura.

Lichidele din interiorul termometrelor trebuie sa aiba anumite proprietati:

•Fluidul trebuie sa ramana lichid in domeniul de temperatura al utilizarii termometrului
•Dilatarea sa fie uniforma cu temperatura (sa nu prezinte anormalitati = coeficientul de dilatare sa nu varieze neuniform cu temperatura)
•Substante folosite si temperaturile la care pot fi aplicate:
-Mercur: de la -30°C la 350°C
-Pentan de la -200°C la 30°C NU APA!!!!!!!!!!
-Etanol de la -110°C la 60°C
-Galinstan de la -10°C la 1000°C
l.— L _,.| l
:o “a“
‘[."| 25' Max} 2,4 mm

Sisteme automate → acuratete mai mare si rapiditate in citire → termistorul Tinned Dapper Leads J Epr‘f 0:13th |
 Valoare de referință

Număr de Acuratețe
determinări

Valoarea controlată
Precizie

Acuratețea este proximitate măsurătorilor față de o valore reală.

Precizia este gradul de reproductibilitate a unei măsurători în condiții standard.
Toleranța este acea variație permisă unei dimensiuni sau proprietăți, care nu va afecta
semnificativ funcționarea unui sistem.
 ran. 7_
' -4 77 V“- - .‘ ‘ "/’i\
-
'-1,r,~-i<‘;,un.. ,4

Balantele . T I 4 1‘“? z 4 . , 7 *

K K a"a ' 4‘4 f“:

3' 4
Clasificare 1: mecanice sau electrice l
?
t
.
1 l
7 4 4
' ark-““- 44
, T4
4 4 4 / \ 4
t ‘ =Ti§7tc

Clasificare 2: - I
~ . 4s,, t t
\"\ ‘T I ‘ 75'

I , ' _, \ i w‘
r ‘ \\\\

- analitice  1 mg (se citeste a 3-a zecimala)

‘ 4...] 4' 49am" 4 4 O

T 4: ’4 v
‘t .———-r _, -_ 4 ®“¢vv

,, , 122::
' -

- de precizie  2 g (5 zecimale) .
\‘w"
Q

- microbalante  0.1 g
‘7» //:/__ 9X8

Este foarte important ca balantele sa se pastreze curate,

sa fie pozitionate intr-o zona ferita de curenti de aer sau
_

vibratii de tip mecanic, zgomot electric, deci nu la 4TH?” yank: HI”...- --.44444\

fereastra. Inainte de a cantari ceva, sa se verifice TI"‘\.4 xx:

TX 4/"-

orizontalitatea balantei. Inca rrec’r [In rre ct

 Centrifuga 133‘
9r".-
m: : .

5 ‘V I l r I
4 .‘ 0 7‘ - I -

“W V $§3§%. '7 I r \r I - '

,. 7 - ' ' _ ’ 45‘ a \
| - 4444 “4:4,, 57,, / “Hg 44.
. ‘9 44 [i \\
Ajustarea I g I,“ I" ‘
vitezei de rotatie 1 ' a .47677. I21 s.
4433 4444 4 444 _ 7___:~_’» '

Ajustarea timpului
/ + Rotor Axis

./ Rotating Radius
.-.7=—-_7:n
Rotating Radius
Anglo Rotors Horizontal Rotors
 FI'I:L"|." |.|L|H-|'I
El]- 53. noon moon:
1!!
‘5' 11m:- 1mm:-
‘5 4r-
nloua our-u.
~= 35 moon room:-
mm:- stoop-co
I2 3: film Ez-EIZIJJIIJ

1l:|_lI|I:I 15mm!“

- .- 5|JJEI FILM
a 4 Ugh-II} - -. 1 mm mom I
'- ‘ :I'
I a Inn-Inflow .=
-E 3" E mmpawm .- .l'lililfl-zl] 1.11:. mm:- 5
'I' 1'3 E :u g mum-19h I I
if “iii-opium I “1:" g
1 15 up nil: ”hi. _ mm:- .
I -' I E
.E g HI I on - 5o} soon-1 1
4! 1! E Il-jI-I 4. E || Fli- E 1.513 1!” 4
E 5 g —--- ‘ - IIIIBI-III1g 15 31} mm Jr
12 E I I I

-' hum-dimly '

I ma WM 1-”: “m?“ II.
mwm .-
‘ 1n uni-:1 a:
El} EIIII
'1 ToEIHfiEFEF
fl HI=JHIH1I1IIH a} 1444:“ Elm EEII
a men-unpu-

il H: m
r=fll m ”I“
a [Ir—u“ .

=1- son
I :. an fl“ ”“3
run-u
Utilizare:
•Separarea serului sau plasmei de celulele sanguine
•Separarea unui supernatant de sediment
•Separarea a 2 fractii nemiscibile
•Indepartarea aerului

Precautii de folosire:
•Curatarea zilnica.
•Balansarea corespunzatoarea a probelor (volum si greutate) pentru a reduce vibratiile.
•Capacul sa fie bine fixat pe toata durata centrifugarii.
•Tuburile centrifugate sunt inchise.
Sticlarie si plastice de laborator
- Sticla: pipete, pahare de diferite forme, cilindri, baloane,
- Tipuri de sticlă:
- borosilicat (Pyrex or Kimax), - rezistenta termică
- aluminosilicat (Corex),
- cu rezistenta la acizi si baze puternice (Vycor)
- sticla de Silex (var de soda, usor de reciclat) folosita pentru colectarea deseurilor.

- materialele plastice : durabilitate si rezistenta termica si chimica

- Tipuri de plastic: polietilen, polipropilen, Tygon, Teflon
- Unele teste de realizeaza de preferinta in recipient de plastic si nu de sticla deoarece
anumiti ioni metalici se pot absorbi la sticla.
- !!!! Nu orice plastic poate fi folosit in laboratorul clinic: acesta trebuie sa indeplineasca
anumite norme (standard) de toleranta a acuratetii
 !!! Vasele trebuie sa fie curate.
Vasele care vin in contact cu probe contaminante nu se refolosesc.
Aruncarea echipamentului de laborator contaminat biologic se face conform standardelor.

Merisous Bottom of
{irradiation line the n'IeI'iisous

Vesela de laborator A B

In general se cunosc: FIGURE 1-3. Pipetting technique. {A} Meniscus is brought above
the desired graduation line. {B} quuid is allowed to drain until the
bottom of the meniscus touches the desired calibration mark.
- sticle – pentru a depozita solutiile
- baloane cotate pentru a aduce solutiile la volum bine controlat
- paharele Erlenmeyer si Berzelius sunt folosite pentru prepararea solutiilor: inerte
chimic, stabile termic si mecanic.
- Cilindri gradati – folositi pentru a masura volumele de lichid. Atentie: cilindrii gradati
nu au acuratetea baloanelor cotate!
Micropipetele

sea7-74
Poziția
relaxată
Primul
stop
(calibrat)
Al doilea
stop
(ejecție
fluid)
444.444
14 s “g;-
Ejecție
vârf
pipetă
Calibrarea pipetelor

l~ ,

_ \ l / ~ .77
9' *4 E44 Disposableliu '-

1‘ 4 - Calibratiai ~
Mistilled water '\
Calibrarea și curățarea pipetelor https://www.youtube.com/watch?v=MBq55FtOzN4
Iv v .
| "'Id

TcstVolumc m l
Ten Volume (ml 75' VOW“c ml
M
W
‘ Grams
":0 Weig' ht 111 H2 OWci ghtin Grams
":0 Weight in Grams
i f —_—
‘ “
r m —_—
2 fi m—
—
3 “ W —
E l —_—
‘ “ _
5 m- _
6 __
_ _
’ _ _—
' _ __—
‘°° _
__

Mean M44444 I {I —
wul.
.MDlT" lem: “4444404
= _F
-«.i- 5” n4 _ 'I
mil/ill; 2:414:22 “44,44 £44444
’ "DIV/or
Mid "Hulk.“
8 544 5
glNkvmmn Dc04vmi on
“44d444
S'Mdnr “ m = — I 1 ill]
WWW landzlWA , 4
‘I-cv 4
”DIVMI "u v
M. (7V
‘Dlei
"DIV/0i
 SIMULĂRI
Prepararea soluțiilor
[:::l::::]
• Folosirea corectă a balanței
analitice
• Cântărirea
• Folosirea sticlăriei de laborator
• Concentratii molare
Pipetarea
• Să selectați pipeta corespunzătoare
volumului de pipetat
• Să stăpâniți tehnica de pipetare cu
pipeta cu două trepte
• Să realizați o diluție în serie
• Să folosiți această pipetare pentru a
cuantifica proteinele
 REACTIVII Solutie = solut + solvent = substanta dizolvata + subst. dizolvanta
Concentratie!
10% NaCl: 10 g NaCl +100 mL apa! Incorect:
g solut/ 100 g solutie 10g NaCl + apa = 100 mL
Procentuală mL solut /100 mL solutie
g solut / 100 mL solutie Ce concentratie procentuala avem daca dizolvam 10g NaCl in 1L final?
1L ..................10g
100 mL (0.1L) ......x Solutie: x=10g*0,1L/1L =1g deci 1%

Molară (CM mol/L) = numar moli (N)/L solutie

Cum preparam 350 mL solutie de NaCl 2M (2 moli in 1L)
N=md/MM Md=10 g
MMNaCl= Acl+ANa=35,5+23=58,5 g/mol CM=N/V = md/(MM*V)
N=10/58,5=0,171 moli
V=0,1L Md= CM*MM*V
CM=0,171moli/0,1L=1,71mol/L Md = 2moli/L*58,5 g/mol*0,35L=40,95 g NaCl
UNITĂȚILE
UNITATILE DE
DE MĂSURĂ
MASURA

Indiferent de sistemul de codificare, orice rezultat al laboratorului clinic care estimeaza cantitatea are doua componente:
•un numar – descrie valoare numerica, cantitatea
•o unitate de masura – masura fizica, calitatea: unitate de masa, de volum, de lungime, de timp.

In anul 1960 – sistemul internațional de unitati SI

•7 unitati de baza: unitati derivate = fie o derivata matematica, fie obtinute

•lungime – metrul – m prin functii matematice ce folosesc una sau mai multe din
unitatile de baza:
•masa – kilogramul – kg •viteza – m/s
•cantitatea de substanta – mol •frecventa (s-1)
•activitatea catalitica (kat)
•timp (s),
•curent electric (A), •unitati non-SI = unitati frecvent folosite, care nu pot fi
clasificate ca unitati de baza sau derivate:
•temperatura (°K), •de timp: minutul (60 s), ora (3600 s)
•intensitatea luminoasa (cd) •de masa: gram (10-3 kg)
•de volum: litrul (1 L = 1 dm3 = 10-3 m3
•de lungime: 1 Angström = 1A = 10-10 m
W
b
BASE ounmmr NAME SYMBOL
moron PREFIX SYMBOL fl
1o 1“ atto a W
1o ‘5 fem'to 1‘ W
H} 12 pico F W
H1 9 mm H m
H1 5 micru iL W
1t} 3 milli "1 m
1“ 2 “e"ti E @
1i} 1 deci d Frequency Hertz Hz
14::1 deka da W
“F hectu h M
103 kilo k W
“’4 "”993 l“ M
"39 sisal G Minute tame] {605} min
111::12 tera T W
H)“ peta P W
1o“ exa E W
Profiles are used to ilticateamhunit or multipleofa basicSl urit. W
Rezultatele testelor se comunica de obicei sub forma de:
- concentratie a substantei masurate (concentratie molara)
- ca masa raportata la volum: (ex.: mg/dL, g/dL, g/L, mEq/L, and IU)
- exista unitati uzuale si traditionale pot crea confuzii in interpretarea rezultatelor.

!!!!! Domeniile de referință ale testelor de chimie clinică nu sunt universale!

De aceea, se recomanda exprimarea cantitatii de analit sub forma de mol de substanta dizolvata la volum de solutie
(mol/L). In functie de modalitatea de exprimare a cantitatii analitului (mol sau g) se pot aplica factori de conversie
care transforma exprimarea conventionala in unitati SI.

Factorii de conversie:
•albumina serica g/100mL X 10 = g/L
•colesterolul: mg/dL X 0.026 = mmol/L
•cortizolul g/dL X 0.0276 =  mol/L
•hormonul tiroidian T4 g/dL X 12.9 = nmol/L
•acidul folic ng/dL X 2.27 = nmol/L
•vitamina B12 ng/dL X 0.0738 = pmol/L
Princigle of Bradford Assay

O
Unstable S‘f‘bl? + PrOtEIn
Cationic Anionic 595 nm
C88 C88 4
Coomassre
0T Na+
-I- .

0-3-0 CH3 brilliant blue

H

Ella o “‘
UOACHs

Coomassie Brilliant Blue

O.8 Q)“ V CH3
0‘ 0'

Microplate Bradford Protein Assay

~ ‘ 7 [LB
.T I . 7T1‘ ;: i. ‘ -:'7V"“T":T : T‘T ‘ E
2'?- 444‘.,,r- . 4'4 .4 .‘4_- 3 “x I: ‘—
. a 1,4 4‘TT4'
f} ("'" ,' 7..- ., 4 DE
4"; 4 4 4‘ 4 .4 f 44 4,44 4' 4 E: 4 4'. "4 T I

.’ _T 4 42‘ ,4". 4V Th9 .\ , '. , 1 >4 l; N . Ill-T...

’4. 12$4,41/\j-79§5_,Ii'ljljafl 7}“; 35‘5‘d° 3 41.4 <—

‘3 2i i 4‘»; '44 444 ‘f 3-. 't ‘5 .. T 3
;= ~"r . -*‘ . ,5 m
"f -‘5 “i W‘Jfimfivt 7»: 6:33217-‘L. m . g._ a ”-2
.s‘ w‘WC—uf 3‘», x. .
“4“- .~".“ 1}} = 52-” 33$ ,,~‘- to
. "*‘LI‘ 44,4: 44 9'
: " 4 ~ ' -‘"<T,V-'~<;§=*,:$ =~‘.-.
4444 44344444.. 44 44444:..4443: .44;444'K 4/4: 444444 E fl

. ~ ' sm‘w .352 ya [am o 1115 11.: use o.e

:7
‘ "i74,"".;4~s.§4 "r,s'v'7-.a§~v.:.-*’.tr‘z;:’7,?at.“ 3': . -
' 4...:3".4335‘44‘.;*j',}:- ‘_:4'." Gonoenlrauon {mgrml}
(4'; 44.;1‘44 444 L... 4 .4- «’3 "43’ .4 2. t'c- 1' '
 .. o 4
\ 4 . t .. ‘14.}; 4 .;--
\ \ ». '..‘. r‘4 w' #4 e t ‘4 4',
I .\ . "r,

~
‘ ,
A
;t_~/
1'" .- ‘ a
‘ ,4” -' ‘5‘ 7
. .‘Zr‘ ~ ' s
Q _
1‘4 Q ,‘
m ' . ...
‘2
’ ‘

_44
44 .. 4 ‘44 44
' ‘4' 15",,
.3 ,- ‘ ' .4 » v
3;. .g‘ ”3‘-
$33?! "'- 3‘
t, - \
3am: ', , _>
V
m)-
" ' ‘1
m
4 .
.44.. J- J.
- r» .« _ J.
/.. o a .

?????
, A , .

ht ,. O
.» ..-' "' I x"
, "" .23, ’ I
.~ ,>
'3'-
.*'s..4 A
,
v. - ..
a J
4' 4 4' A4 ,.‘4#4 o \
.f ,4. 5' : a; 4..
‘44:) ,.4 'p.\x;
’ t. w - 9 » 4J~ «
1'1" 4' £0;
' 49' ‘- "5:
',, r.
. .".:'4 4' J- '_ 4
fat: .. A a a,
' ';:>.~:t.;2 Jif- . .
\4-4'4Jy}455 :. ~ ‘ .
.14. “'34.”; ' .
\.'a\-. \t‘ “F" s l.
'13,"?~ .t
- Xv if"; 4 ‘
'. V ' d.
.p“:,..‘. ii“ v.‘"r'->.',t, A" . I‘-
7...,
arm's—h ' “1'9 ‘\ . a: fig ;..
.. “my , \r‘a - I: V .-.. .
4.‘ at , w" ;. 3; .
\
.._1. \A. - -.4 '.-Ni 4. .4 .: 4 V-44 -
"V. x 4 4 4 4 \
4

:v. t 4.3? , : ' ._ , wt «-

4,...“ J:__. ~ . -9344
.' ‘11.}. M4 :4.- 444 ‘1’; ‘~, \ S4 4 p“ Q ~

" " .“1!*.~".‘.‘. .. ‘3 d

\ . 4 «*‘2- «v4 ‘
"Viki“
‘_4_4.‘
4 . 44 .t " fit4n-v.‘
“”4444.. .
”M l
 Următoarele simulări:
Spectrofotometrul și legea Cinetica enzimatică
Lambert Beer
❑ Ce este spectrofotometrul ❑ Aplicație a spectrofotometurlui pentru măsurarea

Created by free version of DocuFreezer

❑ Cum functioneaza pentru a masura absorbanta cineticii enzimatice

❑ Din ce este compus spectrofotometrul ❑ Modelul Michaelis –Menten pentru cinetica

❑ Cum sunt asamblate partile spectrofotometrului enzimatică

❑ Sugerează un protocol de măsurare a unei substante ❑ Analiza datelor experimentale pentru a calculat Km și
cu ajutorul spectrofotometurlui Vmax

❑ Aplica legea Lambert-Beer pentru a estima ❑ Factori ce pot modifica cinetica enzimatică
concentratia de substanta ❑ Tipuri de inhibitori – înțelegerea inhibiției enzimatice
la nivel de cinetică
Electroforeza proteinelor serice și urinare

Created by free version of DocuFreezer

LP Chimie clinică
12 martie 2021
16 martie 2021
ELECTROFOREZA PROTEINELOR SERICE
Permite separarea proteinelor serice in 5 fractiuni (albumina, alfa1, alfa2, beta, gama globuline) la pH 9.2 sau in 6
fractiuni (albumina, alfa1, alfa2, beta 1, beta2, gama globuline) la pH 8.5. Utilizarea amidoblack drept colorant confera
rezolutie, specificitate si sensibilitate metodei, putand fi detectate, chiar si benzi monoclonale slab reprezentate.

I flifllflflflDJE-fir.
fl W.dc
= HEM-hilt W.
gnaw

' fllpnpmtain
- AA, 1 9. . : : Imhndilfl

' I ' . nhumin :11 .12 fl 1!

-I- ém -

La pH >8.5, proteinele serice sunt incarcate negative.

La pH > 8.5, proteinele serice sunt încărcate negativ.

Migrarea proteinelor depinde de :

- sarcina electrica

- dimensiune si formă

- tensiunea aplicată (70 – 100V) – CURENT COTINUU

‘3 Curent alternativ
2' Curent continuu

51A 3!—
°M l "'"'
W“ Album?" GyLobuLIns

«1 .12 ., 1r \ €14on {.5 V

_ .13 W .1; g1 '

I ' . ‘1’): 1 I f
1.1 g, 0
Electroforeza proteinelor se folosește pentru a diagnostica diferite boli,
deoarece:
- Aspectul general al distribuției proteinelor este constant în condiții fiziologice
(intensitatea benzilor, raportul dintre intensități)
- Modificările proteinelor plasmatice ca urmare a diferitelor maladii va modifica
aspectul electroforezei – raportul între proteine.

Proteina totală 6.8 – 8.7 g/dL Adulți separare 6 benzi

Albumina 3.5 – 5 g/dL 52 – 68% 52 – 68%
1 – globulinele 0.1 – 0.4 g?dL 2 – 5% 1 - 3%
2 – globulinele 0.4 – 1.3 g/dL 6.6 – 13.5 % 9.5 – 14.4%
 - globulinele 0.6 – 1.3 f/dL 8.5 – 14%
 1 – globulinele 6 - 9.8%
 2 – globulinele 2.6 – 5.8%
 - globulinele 0.6 – 1.5 g/dL 11 – 21% 10.7 – 20.3%
Albumina serică:
- Este o proteină sintetizată de către ficat sub forma de prealbumină și maturată la albumină la nivelul AG
- Este o proteina globulară, de 65kDa, neglicozilată, încărcată negativ la pH 7,5,
- Se găsește în plasma sanguină – cea mai abundentă proteină
- Este esențială pentru menținerea presiunii oncotice = presiunea osmotică (presiunea care dislocuiește
moleculele de apă) necesară distribuirii fluidelor între vasele de sânge și țesuturi
- Transportor nespecific al unor hormoni steroidieni, acizi grași, hormoni tiroidieni, medicamente acide

Variații patologice:
- Hipoalbuminemia
• insuficienta aportului albuminelor in alimentatie (malnutritie cronica severa)
• diminuarea sintezei: insuficienta hepatica (ciroze, hepatite) si inflamatii
• pierderea accentuata pe cale urinara (sindrom nefrotic), digestiva sau cutanata (arsuri)
• hipercatabolism: sindroame inflamatorii severe, endocrinopatii diverse (tireotoxicoza, sindrom Cushing)

- Hiperalbuminemia
- fara semnificatie patologica importanta apare frecvent la pacientii cu hemoconcentratie locala sau
sistemica (deshidratare) sau in urma perfuziilor cu albumina
1 – globulinele:
1-lipoproteina (HDL) -
1-glicoproteine (glicoproteina acidă) – proteină hepatică, mediator al fazei acute,
proteină trasnportoarea a compușilor lipofili bazici,
1-antitripsina – inhibitor al proteazelor – rol protector față de enzimele eliberate în
inflamații
- scădere
• în urma unei insuficiențe hepatocelulare, malnutriției sau pierderii de proteine
• în cazul deficitului de alfa-1 antitripsina: congenital sau asociat cu anumite boli
pulmonare (emfizem) sau hepatice (hepatita neonatală)
- Crestere
• în toate reacțiile inflamatorii acute
• hepatita cronică
• terapie cu estrogeni
• sarcina
2 – globulinele:
• 2 macroglobulina, - poteină hepatică, eliberată în plasmă, cu funcție antiproteazică:
inhibă fibrinoliza (pplasmina și kalikreina), poteină purtătoare a numeroți factori de
creștere, și citokine.
• Haptoglobina – proteină hepatică, cu rol de legare a hemoglobinei - indice al anemiei
hemolitice, mutații ale genei sunt legate de nefropatia diabetică,
• pre--lipoproteina,
• proteina C,
• 2- lipoproteina,
• 2-antiplasminul,
• angiotensinogen,
• globulinele de legare a tiroxinei, cortizolului, vitaminei D

Cresterea: Scăderea:
- infectii acute, - pancreatite acute severe,
- reumatism articular acut, arterita, - leziuni hepatocelulare
- sindrom nefrotic (în special 2 macroglobulina) - sindroame de coagulare intravasculara
- diabet zaharat, diseminata,
- neoplazii; - anemie hemolitică intravasculară (corelat cu
Hb, Hct)
- anemii megaloblastice
 - globulinele: - proteine cu origine predominant hepatică
- Lipoproteine
- Transferine (1)
- proteinele complementului C3, C4 (2)

Creșteri: Scăderi:
• anemia feripriva • insuficienta hepatica,
• dislipidemii • malnutritie,
• boala Cushing • Inflamații (transferina )
• hepatite toxice
• ciroze, inclusiv alcoolice
• Inflamații (C3, C4)
 Gamopatie monoclonală: Gamopatie____‘_______
policlonală:
 - globulinele:
. -_______J_. ___- __r

vârf ascuțit, vârf rotunjit,

- Bandă dominată de imunoglobuline : IgA, IgM, IgG bază îngustă bază largă

Creșteri
• Infecții bacteriene
• parazitoze
• colagenoze
• poliartrita reumatoidă
• Obstrucție biliară Gamma

• hepatita acuta sau cronica

Albumin

• ciroza hepatica
• leucemii
• mielom multiplu
• boli inflamatorii.
Beta
Alphan Alphaz

Scăderi:
• Sindrom nefrotic
• Hipogamaglobulinemie congenitală sau
dobândită Electroforeza proteinelor din
serul unui pacient cu mielom multiplu
 a abylobulins
Inflamatie acuta -

.1 1-01 mad-a2 globulin

Albumin =-1.o. to; 1. B :, y :

Alumna 1. a. $311.8 =. 1?

Acute Phase Reactams .

*9 Immednate response pattern
Mum
1 line-n ”light-dayb- lupu-

l s

I I J 4 S
" n cm W
° OMACRMQ.WW 55-. .1 a, . 7
1 W Idem

https://www.slideshare.net/RajeshBendre/interpreting-serum-protein-electrophoresis
 ‘ al 02 y-globul ins

Inflamatie cronica
—

- normal or 1 albumin
em! or 02 globulins
- t 1 v globulins
Ciroza hepatica
v-globulins

l
Sindromul nefrotic aZ-globulin b-globulin fractions
ELECTROFOREZA PROTEINELOR URINARE

- se realizează în gel de agaroză cu SDS

- Nu necesită concetrarea urinii
- Evidențierea se face cu violet acid – afinitate mai mare pentru canități mici de proteine (15mg/L)

De la linia de start, in ordinea mobilității lor electroforetice deosebim:

•Proteine de origine glomerulara (GM > 70 kDa)
• alfa-2 macroglobulina W5 m G
• IgM
• haptoglobina
• IgA - Protn'ne ttbulare
• IgG (MM<70 kDa)
• transferina
•Albumina -. — - <— Albumina
•Proteine de origine tubulara (GM < 70 kDa) m:
• dimeri de lanturi usoare Wire
• alfa-1 microproteina (MM>70k 0a)
• lanturi usoare libere
• RBP (retinol binding protein) 1 2 a o 5 e
• lizozim m
• beta-2 microglobulina
MODIFICARI EVIDENTIATE LA ELECTROFOREZA PROTEINELOR URINARE

Proteinuria fiziologica
• < de 120mg / 24h
• Electroforeza releva prezenta albuminei ca proteina majoritara, a transferinei si a
imunoglobulinelor.

Acest tip de proteinurie apare in:

• efort (la sportivii cu activitate fizica intensa, frecvent asociata cu microhematurie si prezenta
cilindrilor)
• ortostatism (indeosebi la pubertate)
• febra
• la varstnici
• post prandial (dupa ingestia oricarui aliment sau, dimpotriva, a anumitor alimente)
• stres sau expunere la frig

Proteinuria patologica
> 125mg / 24h putand fi de doua feluri:
•Intermitenta - moderata, fara suspiciunea unei afectari renale sau instituirea unui tratament sau diete.
•Persistenta : renala (tubulara, glomerulara, mixta), pre-renala, post renala si microalbuminurie
Proteinuria glomerulara > 1 g/l
- albumina ca fractiune majoritara si a proteinelor cu masa moleculara mai mare de 65-70 kDa
(transferina, Ig G) – selectiva
- neselectiva cu prezenta tuturor proteinelor serice, mai putin cele cu greutate moleculara mare cum
ar fi lipoproteinele, IgM, alfa-2 macroglobulina
Apare in: •nefroza lipoidica
•glomeruloscleroza •intoxicatii cu metale grele
•sindrom nefrotic •neoplazii

Created by free version of DocuFreezer

•amiloidoza •medicamente

Proteinuria tubulara < 1 g/l

- se caracterizeaza prin continut scazut de albumina (< 25% din totalul proteinuriei)
- apar proteine cu masa moleculara mai mica de 65-70 kDa (alfa-1 microglobulina, beta-2 microglobulina,
lanturi usoare libere
Apare in: •amiloidoza
•intoxicatii cu unele metale grele: cadmiu, zinc, plumb, •boala Wilson
mercur, aur •sarcoidoza
•pielonefrita acuta sau cronica •cistinoza metabolica congenitala
•rejectia transplantului renal •acidoza tubulara
•sindrom Fanconi
Proteinuria mixta > 1 g/24h – insuficienta renala
:— Microalbuminuria 30-300 mg/24h – diabet zaharat
Metode cromatografice: HPLC
Metode imunologice: ELISA

Created by free version of DocuFreezer

LP4 Chimie clinică
26 martie 2021
30 martie 2021
 HPLC = high performance liquid chromatography
= high pressure liquid chromatography

Este o cromatografie pe coloană modificată

Cromatografie pe coloană HPLC

‘I ' High pressure pump

Mobile hase ‘-" Particulele fazei stațioanre
H <— p Pressure - 40MP
(- Sample sunt foarte mici

Stationary phase Stationary phase Suprafață mare
(Silica, Alumina, cellulose) (Silica, Alumina, cellulose) 
Rezoluție mare = eficiență
l
de separare
l .
I

Lichidul curge gravitațional Lichidul curge sub presiune foarte mare

Componente:
- Coloana: din oțel inoxidabil pentru a rezista la o presiune de 40 MPa
- Fluxul prin coloană 1 – 3 mL /min
- Faza staționară – din material adsorbant (reține proba la suprafață, nu o modifică)
- Faza mobilă – polară sau nepolară, în funcție de probă
- Pompă de presiune mare
- Injector
- Detector
- UV
- IR
- Indice de refracție (carbohidrați)
- MS
- Electrochimic
H PLC . High pressure pump 7.

mam... u
”l22:222.,
E3
Column I I /\ :

7 I'I

:‘ _ l '
’ Detector ’ - W
Separarea unei probe necunoscute – analiză calitativă

Glucoză Sucroză

| 5min ; l 8min ;
Timp Timp

Timp
Glucoză
/
Probă necunoscută Sucroză

’ 1
,1 3. 3 1-3 3.11 8,..9. 19
Determinarea cantității unui compus într-o proba necunoscută
– analiză cantitativă

Glucoză Glucoză
10mM ZOmM

5min 5min
Timp Timp

Glucoză
30mM l A A A

l 5min ; 12345678910
Timp Timp
Tipuri de HPLC

HPLC
HPLCde
defază
fazănormală
normală

——— " E 1

Sample I‘-
lnjector
'
FAZA MOBILĂ I

FAZA nepolară
STAȚIONARĂ
polară
O Molecule polare
a C Molecule nepolare
. ' ' '5 Detector
Tipuri de HPLC

HPLC
HPLCde
defază
fazănormală
reversată
i
——<-R ” “1'33?
Sample I I
Injector ¢
FAZA MOBILĂ
FAZA polară
Column
STAȚIONARĂ
nepolară
0 Molecule polare
a C Molecule nepolare
. _v_\_. Detector
HPLC de excludere sterică (pe baza mărimii)

___U m:
2323': 'l' o o
!_ Stationary * *
Moleculele mici intră în C .
o
pori
Porous beads
Moleculele mari rămân
C
în faza mobilă
Cum funcționează excluderea sterică? Time sequence

Sample a
mixture Size Large Medium Small
injected separation solutes solutes solutes
eluted eluted eluted

a... ’0 a3. a?”

packing .fi. ' a.
u.c . .0 c,o
“a c s “a
.3 13.: a a p.13 c.c
“C O O
O O O

Elullon
ourve . I

Retention time or Elution volume

—>
HPLC de schimb ionic

_ High pressure pump

Sample I‘-
injector

Moleculele + + 1-
Column de interes +. +
+

L” Detector
Labster –HPLC:
Combină tehnica de HPLC cu o aplicație experimentală directă.

• Să vă familiarizați cu diferitele componente ale HPLC

• Să înțelegeți principiile de separare: interacțiunile dintre analit și faza staționară
• Să înțelegeți rolul factorilor care influențează comportarea analiților

Toate acestea pornind de la o întrebare: este metformina stabilă termic?

Pentru aceasta, în acest laborator veți învăța să alegeți faza mobilă și coloana corespunzătoare, astfel încât
să separați componentele unui medicament și să îi măsurați concentrația.

Vă veți familiariza cu modalitatea de analiză a unui medicament, aplicabilă în terapia de monitorizare a

medicamentelor, dar și în analize de laborator clinic, unde, HPLC permite cuantificarea numai daca se
cunoaște compusul urmărit. Dacă nu, HPLC se folosește pentru separare și purificare, urmată de identificare
și cuantificare prin spectrometrie de masă.
 ,9 Cu rezultatele obținute pentru calibrarea HPLC
me“ pentru metformină, construiți o curbă de
like etalonare și calculați ecuația de regresie liniară.
Deși în laboratoarele clinice se folosea mai mult GC, utilizarea HPLC cu particule de siliciu poros
foarte mici (sub micronice) devine preferată pentru că are eficiență de separare mai mare și
timp mai rapid de analiză. La acesta se adaugă: automatizarea pipetării probelor, celule de
detecție de dimensiuni mici, colectarea și analiza datelor, aspecte tehnice ce permit procesarea
unui număr mare de probe și generarea unui număr mare de rapoarte de analiză.
În probele de sânge și urină, este nevoie de o extracție eficientă a compusului, cuplată cu o
analiză rapidă, fără a distruge calitatea probei (comparație cu GC, unde tratamentul termic
poate distruge probele biologice)

!!! Probele biologice sunt procesate înainte de analiză pentru a îndepărta factorii
contaminanți (cel mai frecvent existenți în sânge). Ex: extracție în solvent, ultrafiltrarea.
Catecolaminele = neurotransmițători (noradrenalina NA, dopamina DA) și hormoni ai glandei
medulosuprarenale (adrenalina A). NA, A și DA se pot folosi pentru diagnosticarea maladiei
Parkinson, hipertensiunii, distrofiei musculare, feocromocitomului (cancer al glandei
medulosuprarenale). CA se pot detecta atât în sânge cât și în urină, folosind metode de detecție
electrochimice sau fluroescente (mai sensibilie).

Vitaminele
Vitaminele joacă un rol important în funcționarea normală a organismului. Ele îndeplinesc acest rol
la concentrații foarte mici, de aceea determinarea lor necesită metode foarte sensibile. HPLC-ul
poate fi folosit pentru determinarea vitaminelor în sânge și lichidul cefalorahidian, după ce se
îndepărtează compușii de interferență.
La ora actuală combinația LC/MS/MS este folosită pentru estimarea vitaminelor, hormonilor și a
altor biomarcări.
Monitorizarea diabetului
Diabetul rezultă din incapacitatea celulelor pancreatice de a produce insulina sau apariția rezistenței la insulină în celulele
țintă. În acest caz, HPLC are un rol important în monitorizarea controlului glicemiei și estimarea Hb glicozilate. Picături de
sânge colectate la diferite intervale de timp, pot fi pipetate pe hârtie, uscate și păstrate până la 2 săptămâni pentru
măsurarea nivelului de HbA1c prin HPLC (sensibilitate mare de detecție).

Metformina, testată în acest program de simulare, este un medicament de prima instanță pentru tratamentul diabetului
de tip 2, în particular la persoane supraponderale și obeze cu funcție hepatică normală.
Mecanismul de acțiune ale metforminei nu este pe deplin cunoscut, s-au propus mecanisme multiple, printre care:
- inhibarea catenei transportoare de electroni mitocondriale – forțează degradarea glucozei ca sursă de energie
- activarea protein kinazei activate de AMP – inhibă producția de glucoză (gluconeogeneza) hepatică
- crește sensibilitatea la insulină prin facilitarea legării insulinei la receptori – ceea ce facilitează folosirea glucozei:
induce fosforilarea transportorului de glucoză GLUT4 și sporește preluarea intracelulară a glucozei
- descrește absorbția glucozei din tractul gastroinstestinal
 2. Metode imunologice: ELISA

ELISA = Enzyme-linked immunosorbent assay este o metodă analitică des utilizată

pentru a detecta cantitativ și calitativ prezența unui ligand (proteină, antigen sau
anticorp) în probe biologice, cu ajutorul unui anticorp (AC) specific față de ligand.
ELISA este folosită ca metodă de diagnostic în laboratoarele clinice, în biotehnologie
și pentru controlul de calitate în diferite ramuri industriale.
În funcție de modul de lucru ELISA este de mai multe tipuri:

. [Substrate

.rSuhstrate %

. [Substrate ’
it}
\Secgngary
anti 0 yr
,~ Inhibitgr
Antigen
0 .rSuhstrate

P . %
.’ \ .’ -
JL
’ \
conjugate
\ ’Capture antiialnti}.r ’ \
JLg}
’ \anltliltlizrgy
A9. conjugate . .

Direct ELISA Indirect ELISA Sandwich ELISA Competitive ELISA

ELISA directă – în care AC primar este conjugat cu enzima de detecție

1_Q_Q_L
. . W.1... : Antigenul (AG, virus) se adsoarbe pe suprafața godeului plăcii de titrare.

. l
AG se va incuba cu un AC specific, la care este conjugată (legată covalent)
I 1 I o enzimă: peroxidaza, fosfataza alcalină sau -galactozidaza.

l
Se inițiază reacția enzimatică prin adăugarea substratului enzimei. În
funcție de substratul ales, reacția va fi colorimetrică, chemiluminescență,
fluorescentă. Intensitatea culorii dezvoltate va fi proporțională cu
parametrul măsurat în proba biologică, deoarece interacțiile sunt 1:1.
I! I! I!
 .I-Substrate

ELISA indirectă
AC primar nu este conjugat, prin urmare la el se va lega la élleisszzt“
conjugate

un AC secundar care va conține enzima de detecție. AC

secundari recunosc de cele mai multe ori fragmente Fac IJL\
. I-Substrate
sau Fc ale imunoglobulinelor specie-specifice și au .
Indirect ELISA %
aplicabilitate lărgită.
éll§
ELISA sandwich
principiul este similar, dar pe suprafața godeului se fixează o cantitate
cunoscută de AC specific, nemarcat, care va interacționa cu AG prezent în
O’Jk
\1 r’Capture antibody

proba de testat. Peste AG se adaugă un al doilea AC primar specific (AG

între 2 anticorpi ca un sandwich). Acest AC primar poate fi conjugat cu o Sandwich ELISA
enzimă (ca în ELISA directă) sau la el se va lega un AC secundar conjugat cu
o enzima (ca în ELISA indirectă)
21:33: . I- Substrate

ELISA competitivă: ., x it?

. I \
Se bazează pe competiția pentru același AC a unui AG marcat cu un
AG nemarcat (din proba biologică). Competitive ELISA
Etapele principale în ELISA

1. Depunerea antigenului sau anticorpului

2. Blocarea
3. Incubarea cu AC primar
4. Incubarea cu AC secundar
5. Devoltarea reacției colorimetrice
Nr. Enzima Substratul Lungimea de undă și Limita de detecție
Crt culoarea
1 Fosfataza alcalină p-nitrofenil fosfat 405 nm 10 ng/godeu
(AP) (PNPP) galben
2 Peroxidaza (HRP) Dihidroclorura de o- 490nm 7 pg/godeu
fenilendiamina (OPD) portocaliu
3 Peroxidaza (HRP) 3, 3’, 5, 5’-tetrametil 450nm (652nm) 2 -8 pg/godeu, în
benzidina (TMP) galben (albastru înainte funcție de formă
de soluția STOP)
4 Galactozidaza O-nitrofenol--D- 410nm 10 ng/godeu
(Gal) galactopiranozid (ONPG) galben
Pe fiecare plăcuță se realizează:
- o curbă standard pornind de la diluții în serie care are rolul de a preveni erorile de
pipetare ale operatorului, erorile datorate schimbării lotului reactivilor sau chiar datorate
diluțiilor reactivilor, erori datorate condițiilor experimentale de temperatură, timp de
incubare. Move: 60 til 60 ul. 60 at 60 ul. 60 ul. 60 ul.

into:
WWW
(180 "U 120 ul. 120 ul. 120 ul. lZOuL 120 LIL 120 UL 120 ill.

III-IDES
Neat 1:9 127 1.81 1 :243 1.729 Blank/Negative

- Controlul pozitiv – al standardului – același compus cu și standardul - testează

integritatea curbei de etalonare (nediluat)
- al proiectului – compusul de determinat – testează metoda (aceleași
diluții ca probele)
- Controlul negativ
- Blanc
- Probele de testat, diluate astfel încât să se situeze în zona de liniaritate a curbei standard
Labster –ELISA:
Aplicarea tehnicii ELISA pentru cuantificarea producției ”in vitro” de factor IX, în
vederea utilizării lui pentru tratamentul hemofiliei

• Să cunoașteți structura anticorpilor

• Să vă familiarizați cu diferitele tehnici ELISA.
• Să vă familiarizați cu etapele ELISA sandwich.
• Să înțelegeți principiile de preparare a controalelor pe placă și analiza rezultatelor.
• Să înțelegeți ce probleme pot să apară cum se pot rezolva
 1. Redactați un protocol de lucru (nu mai mare de 1
,9 pagină, în care să includeți etapele tehnicii ELISA, cu
durata și temperatura de incubare a fiecărei etape în
me“ parte, conform laboratorului virtual.
like 2. Ce pereche enzimă – substrat s-a folosit în simulare?

Created by free version of DocuFreezer

Cu ce reactiv s-a oprit reacția enzimatică?
3. Cum preparați o diluție în serie în pas de 5?
Metode de analiză a proteinei totale
A
.-

Labster:
- Metoda biuretului

Created by free version of DocuFreezer

- Pregatirea biopsiei de cancer de
colon pentru MS

LP5 Chimie clinică

9/13 aprilie 2021
Proteina totală din sânge (proteinemia) reprezintă o
estimare a tuturor proteinelor.
Hipoproteinemie Hiperproteinemie
• Pierderea excesivă a proteinelor • Deshidratare
• Excreție renală • Transpirație excesivă
• Sângerări interne sau externe • Vomă
• Arsuri avansate • Diaree
• Malnutriție sau malabsorbție • Acidoza diabetică
• Hipoaldosteronism
• Sinteza redusă în boli hepatice sau în
imunodeficiențe • Producție de  - globuline – mielom
multiplu
• Catabolism proteic accelerat

Dacă se detectează cantități anormale – teste suplimentare

Generalități:
- se dozează în sânge (de preferat în ser și mai rar în plasmă), urină, LCR
- metodele pot fi calitative, semicantitative, cantitative
- în funcție de metoda folosită apar interferențe date de:
➢ Lipemie – turbiditate, influențează măsurătorile spectrofotometrice în VIS
➢ Hemoliză – liza hematiilor duce la eliberarea proteinelor intracelulare – creșteri
- cantitatea de proteină:
➢ din poziție stând: 6.5 – 8.3 g/dL
➢ din poziție culcat: 6 – 7.8 g/dL (redistribuirea apei dinspre țesuturi spre sânge)
dww

➢ variații fiziologice:
• nou născut:  - crește și se stabilizează până la 3 ani
___.—

• în sarcină 
_fi

• persoane în vârstă 
Metode de laborator folosite pentru determinarea proteinei totale

1. Măsurarea azotului total

2. UV

3. Metoda Kjeldahl

4. Refractometrie

5. Biuret

6. Colorimetrică
 1. Determinarea azotului total
- Azotul (N) se găsește în:
- compuși proteici care au grupări aminice NH2 sau inele ciclice ale Pro, His, Trp
- compuși neproteici: creatinina și ureea
- Scopul determinării: evaluarea echilibrului azotului - monitorizarea stării nutriționale (în
special pentru pacienții care beneficiază de hrănire parenterală
- Principiul metodei:
Tot azotul legat chimic se transformă în NO

CHEMILUMINISCENȚĂ
Detectare
Amplificare
Conversie în semnal electric
Conversie în cantitate
 Spectrul UV al proteinelor 2. UV
.N
01

- Este o metodă directă bazată pe proprietatea

Absorbance (AU)
N

nucleului aromatic (Tyr, Phe, Trp) de a absorbi

_x
01

lumina de 280 nm și a legăturii peptidice de a

—l

absorbi lumina de 210 nm

_o
01

200 250 300 350 400

Wavelength (nm)

- în mod ideal, toată absorbanța serului la aceste lungimi de undă – este a proteinelor
plasmatice
- Interferențe: Tyr, Trp, acidul uric, bilirubina libere din sânge
- Principiul metodei: 3. Metoda Kjeldahl
—
metodă clasică de determinarea a conținutului proteic pe baza cuantificării conținutului de
N proteic
- nu se folosește în laboratorul clinic ca test de rutină – are mai mare utilizare în ind. alim.
- calculul pornește de la presupunerea că în masa proteică 16 % este azot – 2 erori asociate:
C
a- conținutul de N este între 15.1 – 16.8% - atenție la proba standard de calibrare
__é. Had/is.—
- nu se pierde proteină în etapa de precipitare
- Etapele modului de lucru:
- Precipitarea proteinelor serice cu un solvent organic: acid tricloracetic (TCA) – fără

:a E
componente neproteice care rămân în supernatant
- ”digestia proteinelor” = fragmentarea prin tratare cu H2SO4 la 340 – 360C în prezența CuSO4
(catalizator) și a K2SO4 (crește punctul de fierbere), cu formarea de CO2, CO, H2O, SO2 și bisulfit
de amoniu (NH4HSO4)
“’
- NH4HSO4 în mediu alcalin (NaOH) degajă amoniac (NH3)Q
- Amoniacul va interacționa cu acidul boric, căruia îi va schimba pH-ul
L3
- Readucerea pH-ului la valoarea inițială cu volum controlat de HCl 0.1 M - TITRIMETRIE
 Kjeidahl's trap

i," \ " 1' Water

Organic 00m
+Conc.
pan 1 _‘
I I. T27
1 on
O _ its
4- Cusqrzs 4" gt? ‘
.‘“4
.. k8“! h s i ‘ . Water
' flaska Contents 0 klnlet‘
,3, .\ Kjeidahl's flas ' 1 \a
after digestion _ ‘ ' ' .
+NaOH o n volu
ndardl
d
 I I I I
. 1 11

1“ 1 . l Lil-1:?! l u “I”

r- ~ { _1
t—fi‘é‘ ' 9
“ i ‘ _.
- .
.u ' ‘1 ,' I :1 K 7. — h 1.

o 1 ‘ % H l' ." r;-

II‘I . I. 'i I f L-d— _-—.—- ' ‘—
4

| I _l __ 1
' ‘ --""=;-1 -T5i.’r-"?;;‘:-' ’5‘; L, 311., 11 111 1 ‘ 1

_': “ “L Mgr . — it . ‘ “ I

' '* WI: lit in ii =2 ~—

1
‘4 Let-hrs ' .
..._- a...— O - 1 _L
f1 1711-1
' f” V .111
‘

.. /
‘ _ ill ii
o a

1
' ——

' :1 5'
‘ I. i. ._ . /
‘ntl . U‘

a ‘tii-Zz.
’ l _— ——-~ 3,1, ‘- _ 11 _ _ _ , ‘
" ‘ . W4; ' ' I _
‘ "/1

https://www.gerhardt.de/en/analysis-methods/kjeldahl-analysis-for-nitrogen-and-protein/
 4. Refractometria
- Principiul metodei: măsoară refracția luminii cauzată de prezența solutului
- Indicele de refracție = raportul vitezei luminii în două medii diferite: aer/ soluție apoasă
- În soluție apoasă, viteza este încetinită, proporțional cu conținutul acesteia în substanțe
dizolvate (în ser, majoritatea sunt proteine)
- Metodă rapidă, ușoară ce folosește un volum mic de ser .-v‘

- Interferențe:
compuși neproteici, electroliți, uree, glucoză A
ser icteric, lipemic, hemolizat
temperatură
___/I,— Poziția Poziția
aproximată reală
-
- \ O
.
 u \

’ ’ E— 4 103::
, =_
1 340 A E; 2 1 020
=

' 10H
1 335 , 7 E 0 3
1. 333 — w: 1 0:0 ,
ND SERUMP URINE SPG f A ‘ j

JSCP =‘

———-
 5. Metoda biuret
2-
GYM-'2 HzNYO

Principiu:

2 Na+
"Y”?
HZN .OCOUi-i'
9W" NH;
În mediu alcalin, ionii de Cu2+
—-.—’~— _—

HZN NH2 complexează cu grupările participante

Aef' 'so.@*

0 1N N o la legătura peptidică, inducând o

0 H2 HzN’ko virare de culoare din albastru în mov
care absoarbe  = 540 nm.

Mod de lucru:
Preparatul proteic se amestecă cu reactivul Biuret, se incubează 10 min la 37C, se răcește
la temperatura camerei și se măsoară absorbanța la 540 nm. Absorbanța măsurată se va
citi de pe o curbă de etalonare.
Reactivul biuret conține: CuSO4, tartrat de Na și K (previne precipitarea Cu în mediu
alcalin), KI (antioxidant) dizolvate în 0.2M NaOH (pH alcalin).
Interpretarea rezultatelor:
- Intensitatea culorii va depinde de concentrația de proteină
- Culoarea mov poate avea diferite nuanțe de mov, de la roz până la roșu mov, nuanță care
depinde de numărul de legături peptidice ale probei:
- Este necesară existența a cel puțin 2 legături peptidice, prin urmare la această reacție
nu participă AA și dipeptide, deci numai peptide cu cel puțin 3 AA (tripeptide)
- !!!!! În prezența unor concentrații mari de proteine mici, culoarea dezvoltată va fi de
nuanță deschisă (deoarece proteinele au număr mic de legături peptidice), care
spectrofotometric se interpretează ca absorbanță scăzută → cantitate mică → eroare
- Interferențe: lipemia
[M A: %~@&_
‘kks 7) th/i_
 5. Alte metode colorimetrice
Sunt metode care se bazează pe colorarea proteinelor în prezența reactivilor organici:
Albastru de bromfenol Ponceau S Amido black Albastru de Coomassie
1
«W W 1 .
1 3,2 ———’I’
a 1 2 3 4 5 6 7 8
_.1 ; _ 95-.

. ”-0 ‘ ".4 " "' ’— "'

--- _ - - - - ‘ 7 V —
_ ' — — -
_ 4— :T: 2 -.

1 I _ - __ .‘ -

, .T. .._‘. .. ..a

f
Atot = 1290 mm2
ur ‘\\ \IK .Vx
_ me
F E“-
Em,
if
m
. E-
a...
"mi
 1 \ Ck
___._-_[

(to M09B0UUWLV :
.
/0 f I E '
(Ra
w
Ci Lr \AL
@635I6... Fl“ - |
: “ Egz’w/
n g I 1 E W k
77 0/9 an ' l l ,
DMD“ O1Mm1"
q %l,- ll"!
W\b

Wka =
M mm
fi g
0 /1 Wm. .. .
rm--

'sws'I/Ia;W
Ill s.“ a
0: M UK
wng)‘
5” I
II. II
1” .II
II
/

AQQ/j)r
WW
Ila-E'E
UR kwg J
‘ E}.
wwe cu 2flifli’t
15 .
fig? Mi' 1%
[Egg
“ ‘2‘
 I I h."- IE‘IEH w
4 ‘11- I
K OR/ja

fin. II...- V; . II.

Ell]
I
.I. I %

A1 logc/L:
"-‘W—
I I E
$7””‘WuJI l*- I...III?”
“W
I W I. E

K I I l l l l l l l 6“
P 2 l
\—.'I“.----- .9
l fl l l l l I I I
5“
I |
—'.E|fl
—2|n' I I I - l . . - I mI
2:}
flJflfl E I fl I I E I
-
. ' lflfi fi a fi a/I — ‘ n /_
~ - «3% HWiESWE®Ffi H
v

fifi'm
WWW walll L”
III... E?—
K ”E , . $5
flllllllil J“
.
M
I. I
W—
WW
IEIIIIIII “I“—
:IIEIIII 5"”—
,I- _‘l I I ”1““
. Ifiabl: I 3'“
. indtlmllll “L“
Il‘fiill "“—
Q/ 3?
 “-_--_- _II

HI...- I“
“I... I l :

/\

£5 I
-.|'

' 2-.
 7101/? VTOAF TQINHTQV +\y\f.
Studiu de caz: NW_N+ Or M, +7 Wimp «T 0.3T 0.30 r
QFLV.

În sângele unei paciente s-au depistat urmatoarele cantități de proteine serice:

albumină, 3.2 g/dL;

1-globuline, 0.31 g/dL;
2-globuline, 1.59 g/dL
-globuline, 0.72 g/dL;
-globuline, 0.96 g/dL.

Calculați procentele corespunzatoare si estimați daca electroforegrama este normală

Intervale de referință % g/dL

albumină 53–65% 3.5 - 5
1-globuline 2.5–5% 0.1 – 0.3
2-globuline 7–13% 0.6 - 1
-globuline 8–14% 0.7 – 1.1
-globuline 12–22% 0.8 – 1.6
Studiu de caz:
În sângele unei paciente s-au depistat urmatoarele cantități de proteine serice:
“gumk coma
albumină, 3.2 g/dL; _a

1-globuline, 0.31 g/dL; {—Y" 2

0 n3‘
- Mr Z.

2-globuline, 1.59 g/dL

-globuline, 0.72 g/dL;
-globuline, 0.96 g/dL. K a“, ,
2W2 G%Xflwz
3’2:

Calculați procentele corespunzatoare si estimați daca electroforegrama este normală

albumină 53–65% \ I
0‘ N? ‘
1-globulins 2.5–5%
2-globulins A> 7–13% _ />®LQ -—-’U,@ (”A/Mi
-globulins - 9 8–14% f _ DA 'ng
Ola—‘1‘
-globulins 12–22%
’4’”;
 Intervale de referință % g/dL
albumină 53–65% 3.5 - 5
1-globuline 2.5–5% 0.1 – 0.3
2-globuline 7–13% 0.6 - 1
-globuline 8–14% 0.7 – 1.1
-globuline 12–22% 0.8 – 1.6

caz 1 caz 2 caz 3 caz 4 caz 5

albumină, 4.2 g/dL; 4.2 g/dL 4.2 g/dL 4.2 g/dL 3g/dL
1-globuline, 0.2 g/dL; 0 g/dL 0.2 g/dL 0.2 g/dL 0.2 g/dL
2-globuline, 0.8 g/dL 0.8 g/dL 0.8 g/dL 1.5 g/dL 0.8 g/dL
-globuline, 0.9 g/dL; 0.9 g/dL 0.9 g/dL 1.3 g/dL 0.9 g/dL
-globuline, 1.2 g/dL. 1.2g/dL
- 3 g/dL
- 1.2 g/dL
I 1.2 g/dL

% caz 1 caz 2 caz 3 caz 4 caz 5

albumină, 57.5% 59% 46.2% 50% 49.2%
1-globuline, 2.7% 0% 2.2% 2.4% 3.3%
2-globuline,
-globuline,
-globuline,
-_ '
11%
12.3%
16.4%
11.3%
12.7%
16.9%
_ :3 6
8.8%
9.9%
33%
17.9%
15.5 %
14.%
13.1%
14.8%
19.7%
 0 Vp ‘ ,. Dr
DY $2003
/©
”53% Q’-©%
021% z
wvflffbfiKIQUAW/gfif)

Q3 AW} 92% gig» @WJ/ :TWWL

JXXKBI (0003' @993 %x

Created by free version of DocuFreezer

mg??? nee/a

7/) Exprimarea procentuală a proteinelor serice nu oferă informații

despre cantitate, ci numai despre relatia dintre proteine.
 A
.-

Automatizarea determinărilor clinice.

Labster:

Created by free version of DocuFreezer

- Hematologie

LP6 Chimie clinică

23/27 aprilie 2021
 Principii de automatizare în chimia
clinică

✓ Laboratorul modern de chimie clinică posedă un grad ridicat de automatizare în care

pot fi executate automat etapele procesului analitic care înainte erau realizate manual.

E
✓ Permite operatorului să se concentreze asupra sarcinilor care nu pot fi automatizate cu
ușurință
✓ Crește eficiența și capacitatea de rezolvare a altor probleme.
✓ Procesul de analiză poate fi împărțit în trei etape majore
 etape majore corespunzătoare
etapa preanalitică procesare probe
etapa analitică analiză chimică
etapa postanalitică gestionare date

✓S-au înregistrat îmbunătățiri substanțiale în

toate cele trei domenii în ultimile decenii.

Faza analitică este cea mai automatizată, iar eforturile de

cercetare și dezvoltare se concentrează pe creșterea
automatizării
 ISTORIA ANALIZOARELOR AUTOMATE

Primul analizor automat a fost introdus de către Technicon (1957), Primul "AutoAnalyzer" (AA) a fost un
analizor secvențial, cu debit continuu, cu un canal capabil să furnizeze un singur rezultat al testului la
aproximativ 40 probe pe oră.

[.7777

1
’ {*7

W Prototype
1 W
V
‘t'. A r AutoAnalyzer
?_h“’“— W, M
, “-"r4 .24
- .
13>
I A. ,,
h
versiune 1953
‘
‘ W 3*‘x '3at~ »
'7
‘-" >“i'x‘
‘7!" :’ .- 1‘
"' '9 W\
1 w A
I
1 .

, 1 ':
. , .'

a» .‘qr>:::;r’-‘;‘Vu€:
' II. V. r ,’
L;

Primul AutoAnalyzer
T V

‘ . . Iq‘ 1.."
" IV - - I".
..A
éfi‘é’fi ‘

lansat in 1957
‘~
‘ IA

{ .
‘

. . .
i
Următoarea generație de instrumente Technicon care s-au dezvoltat a fost seria Simultaneous Multiple
Analyzer (SMA).
SMA-6 și SMA-12 au fost analizoare cu mai multe canale (pentru diferite teste), care funcționau sincron
pentru a produce 6 sau 12 rezultate simultan la o rată de 360 ​sau 720 teste pe oră.

.. - I L ‘
1£
\H
Până la mijlocul anilor
'60 acești analizatori x I. "
de flux continuu nu au .I , fi. . ‘
avut o concurență
semnificativă pe piață. inn" ’4‘“. ." "r? 't . ‘ -

..‘.-_ '-A‘o .. > .. - [_ f~~ ~1" !

'-.- .o' '. "’ ' ,-jr..‘.-'

JI"UJ_‘ . d ‘.
‘ do - .
‘, \‘4
7 '7 '—
'-
În 1970 a fost introdus primul analizor centrifugal comercial după un prototip din 1967
a lui Norman Anderson, alternativă la tehnologia cu flux continuu, care a ridicat
probleme semnificative de transport și deșeuri costisitoare de reactivi.

Special cuvotte for CENTRIFUGAL ANALYZER

Analizele se realizau în paralel și

utilizau tehnologie informatică. Wampum Auhomatod mtplpsw

Ca urmare a miniaturizării
computerelor și a progreselor în
industria polimerilor a fost introdusă a az/gz/Z

\
// I

doua generație de instrumente (1975) . (1;, 1,115.: ,

. ,/ .//
’1“ /////
.’

care folosea cuvete de material

plastic.
‘m\ ‘1‘”: HM H, grrL‘,‘

WMWMmMBZO-SOmmmaim mm
Următoarea dezvoltare majoră care a revoluționat
instrumentația de analizoare clinico-chimice s-a
produs odată cu introducerea analizorului clinic _ S “If s
a“ ‘ I' " ..
automat ACA, produs de DuPont (acum Siemens).
A fost primul analizor discret în flux discontinuu,
precum și primul instrument care avea capacități The Duant
de acces aleatoriu, prin care specimenele pot fi
analizate dintr-o secvență aleatoare, dictată de Automatic
analist, după cum este necesar.
Cfinkml Analyzer
A fost prevazut cu un sistem de pipetare care a
permis trasnferul de lichid, astfel ca atât proba cât
și reactivii pot fi aspirață dintr-un anumit recipient in the Medan-Sized Community Hospital
și dispensați în tubul de reacție.
O etapă majore în evoluția tehnologică a fost: introducerea tehnologiei de analiză pe
film subțire din 1976 și producția analizorului Kodak Ektachem (Vitros, Ortho-Clinical
Diagnostics) în 1978.

KODAK EKTACH EM 700 Analyzer

Acest instrument a fost primul
care a folosit microvolume de l::; I '-" Year 1573
probă și reactivi pe folii de tip : -;.. . Company: Eastman

diapozitiv pentru chimie uscată și Category:

Kudak
Ilahemistrgll,r
a integrat extensiv tehnologia
informatică în proiectarea și
utilizarea acestuia. DESCRIPTIUN
Dry-film based ehemis1nr anah'zer.

SUURCE
Ed Maren {Press Release MED Meefing]

BlBLIUGRAPH‘r‘
Fitzs'rnmens TC, Parker FEE, Shaslry l'u'lE, Smith MR, Tersteeg GE- Teehnalagyr far the
KDDAK EICFACHEM res Malyzer. Clin Chem 1983291211.
Din 1980, au fost elaborate mai multe tipuri de analizatoare, în sistem discret care
încorporează:
- electrozi selectivi cu ioni (ISE),
- fibrele optice,
- sisteme de analiză policromatică,
- hardware și software pentru manipularea datelor
- meniuri de testare mai mari.
- 1 ‘I u. r a 1 |
1

Analizoare mai populare și mai performante

a: _ ‘ ”I!
care utilizează aceste tehnologii precum și -
l
i,d_ \r‘vz” ' I
I,

alte tehnologii încă din 1980 sunt | I

analizoarele Astra (acum Synchron)

L.\- ’

(Beckman Coulter), care utilizează extensiv

electrozi selectivi de ioni
Beckman Inscrumems' self-calibrating. multichannel
ASTRA" B AUTOMATED STAT ROUTINE ANALYZER provides fast,
accurate testing of electrolytes and routine chemisuries.

BECKHAN INSTRUMENTS. INC."

Clinical Instruments Division
Paramax care a introdus eșantionarea analizoarele Hitachi (Boehringer Mannheim,
primară a tuburilor; acum Roche Diagnostics), cu discuri de
reacție reutilizabile și matrice de șir de
diode pentru scanare spectrală.

/ 7 "2;;

‘ ' I 'fil

.
ll :.= Illn - .
Sistemele automatizate utilizate în prezent în
laboratoarele de chimie clinică sunt analizoarele
Aeroset și ARCHITECT (Abbott Laboratories)

m
-. A.” 5 .

J" .' 1...." ' A

neW“.-.
LIFE . " ‘ . z A . . . . '
_-.... n nMF mm' | | I l l
, ,L L L L L 1|§§IFI§I¢I¥I

‘1»; l g ,
 , _ - __D: ' -'_‘...
:: '“ 1 '_-: \Kx " ,

/ a. 5:— ,3‘1‘1‘: , "5'

. ' ‘,»?-..v:-,r:,~:s:.-:.-:'.-:’:::.~:j.-.',;r_-'1\1um} , .,
, —# ‘7 ~

analizoarele Synchron (Beckman Coulter),

. SIEMENS
.
\.

1 -— - ——~ ,-< ,,' ‘2“‘-_

1‘ a l - $..

\ V "I I 5 . '-'
- _ , o
. .. L
\
.\ "-1-
k...a);
H .‘.;‘\ .'\~
h I. '

L _l ’. .
> . '“' f":
,, . ‘ 1 ‘ .- ' ' ' " ' “{7, J 1

r3117?“ Twoxav

= 1 ’j ’:
analizoarele Advia (Siemens) —
=—

==
1 L
=2 5 .:::"-: :11:
_ .
‘

—_.:
,

:T’ :7 ’ 1' 1 V ”T— _1. ‘1 T f :.: ‘2 ‘15?“

.f:_:i 4:11 , L1; 1 LL; " _;;::;;;2; 11
f; '— 3.7?TE%*EE;_1 .11??:fi%ji}ff%£¥£ 2.5:: :21: i; , ,
7 f: I 3:: *§;1}'?‘i5 :1 T 3'; 1
.;_,L 7:, ,, {2, r «.14» a;
Diferențele dintre instrumentele producătorilor, principiile de funcționare
și tehnologiile sunt mai puțin distincte acum decât în ​anii de început ai
automatizării în laborator.

:
Analizoarele moderne sunt mai rapide și mai ușor de utilizat ca urmare a
reînnoirii continue și a perfecționării electronice.

—
Metodele sunt mai precise, mai sensibile și mai specifice cu o intervenție
minimă a operatorului
Producătorii au răspuns, de asemenea, dorinței medicilor de a efectua teste de laborator la
capul pacientului: s-au introdus analizatoare de laborator mici, portabile, ușor de operat în
laboratoarele de medicină (POL), precum și în unitățile de îngrijire chirurgicală și urgențe care
solicită rezultate de laborator imediate.
O altă zonă de specialitate cu un arsenal cu analize rapide în dezvoltare sunt tehnicile
imunochimice: tehnicile imunologice pentru analiza efectelor medicamentelor, a identificării
unor proteine specifice, a markerilor tumorali și a hormonilor au evoluat la un nivel crescut
de automatizare.
Instrumentele care utilizează tehnici precum imunotestarea poluării prin fluorescență (FPIA),
nephelometria și imunotestarea competitivă și necompetitivă cu detectarea
chemiluminiscentă au devenit populare în laboratoare.
Cea mai recentă dezvoltarea în analiza clinică de chimie a fost combinarea metodelor
chimice cu imunoteste într-un singur analizor modular.
Analizorul dimensional RxL cu n .- __—
Ill-ll

un modul de imunotestare _-

heterogene a fost introdus în

1997.
Acest design permite o ‘ l

consolidare suplimentară a H ‘
stației de lucru cu îmbunătățiri 51. » ) . L»:- L- . - .
Dink-Mimi}: L:’(,“‘“r;.’.

ulterioare ale eficienței

SIEMENS

operaționale și reduceri
ulterioare ale timpului de
analiză.

‘—
—
_——.
__"—

Dimension RxL Max - Siemens Healthineers Global Siemens Healthineers

Analizoarele modulare care combină 'fi '4‘“;
capacitățile de chimie și de imunotestare
sunt acum disponibile de la mai mulți
furnizori. A
‘1‘ 3’? 8"? fl .1 .

W
. I I .
Analizoare modulare pentru chimie/analize B
imunologice.
(A) Siemens Dimension Vista 3000T.
(B) Roche MODULAR ANALYTICS.
C _L______a
(C) Abbott ARCHITECT ci 8200.
(D) Beckman Coulter Synchron LXi 725.
-;f!fii7r“'t ‘ CL
11"‘_ - 1" t

D 31'. 5:341
➢ Alte direcții în dezvolarea aparaturii de analiză conduc spre o mai mare
automatizare alături de creșterea numărului de teste și un timp de reacție mai
scăzut.
➢ Competiția intensă între producătorii de instrumente a determinat automatizarea
mai sofisticată a analizoarelor, cu tehnologii creative și caracteristici unice.
➢ Mai mult, creșterea costurilor a stimulat reforma sistemului de sănătate și, mai
precis, a gestionat mediile de îngrijire și de capital în cadrul cărora laboratoarele
sunt forțate să opereze.
ABORDĂRI DE BAZĂ ÎN AUTOMATIZAREA ANALIZOARELOR

Există multe avantaje pentru procedurile de automatizare:

➢ Unul dintre obiective este creșterea numărului de teste efectuate de un laborator
într-o anumită perioadă de timp
➢ Un al doilea scop este de a minimiza variația rezultatelor de la un laborator la altul
➢ Un al treilea avantaj este obținut deoarece automatizarea elimină erorile potențiale
ale analizelor manuale, cum ar fi etapele de pipetare volumetrice, calculul
rezultatelor și transcrierea rezultatelor.
➢ Un al patrulea avantaj se adresează faptului că instrumentele pot folosi cantități
foarte mici de probe și de reactivi.
Există trei abordări de bază în instrumentele de analiză:
➢ sistemul în flux continuu,
➢ sistemul de analiză centrifugală
➢ sistemul de analiză discretă.
Toate cele trei sisteme pot folosi
analiza un număr mare de probe
într-o singură etapă), dar numai
sistemul de analiză discretă
oferă acces aleatoriu.

În sistemul cu flux continuu, lichidele (reactivi, diluanți și probe) sunt pompate printr-un
sistem de tuburi continue. Probele sunt introduse într-o manieră secvențială, urmând una
pe cealaltă prin aceeași rețea. O serie de bule de aer la intervale regulate servesc drept
medii de separare și curățare.
• permite să se execute mai multe probe care necesită aceeași procedură.
• analizorii mai dezvoltați folosesc canale paralele unice → mai multe teste pentru fiecare
probă.
Dezavantajele majore: risipa de reactivi care curg continuu.
Analiza centrifugală utilizează forța generată de
centrifugare pentru a transfera și apoi conduce lichide în (a)
Sample input Sample OUtPUt
cuve separate pentru măsurare în perimetrul unui rotor storage

de filare.
Centrifuge unit
• sunt cele mai capabile să ruleze mai multe eșantioane,
câte un test la un moment dat într-o serie de probe. Centrifuge unit Analyser 5

• analiza probelor se face simultan ceea ce este un Analyser l Analyser 4

avantaj major, deoarece reacțiile din toate celulele sunt

Analyser 2 Analyser 3
citite practic simultan, fără a mai fi nevoie să se ruleze
un rotor complet de probe.
Analiza discretă este separarea fiecărui eșantion și a reactivilor însoțitori într-un recipient
separat.
Analizoarele discrete au capacitatea de a executa:
• mai multe teste dintr-o probă la un moment dat
• din mai multe eșantioane câte un test la un moment dat.
Acestea sunt analizoarele cele mai populare și versatile și au înlocuit aproape complet
analizatoarele în flux continuu și centrifugală.
Cu toate acestea, deoarece fiecare eșantion se află într-un recipient de reacție separat,
uniformitatea calității trebuie menținută în fiecare cuvetă astfel încât o anumită calitate a
eșantionului să nu fie afectată de spațiul special pe care îl ocupă.
Această dezvoltare tehnologică a fost însoțită de demonstrarea unor noi posibilități de:
1. reducere a erorilor,
2. limitare a costurilor.
3. creștere a fluxului continuu de analize
4. dezvoltarea a noi produse de automatizare comercială pentru laboratoarele clinice
Laboratoare analitice în care s-a introdus automatizarea
1. chimie clinică,
2. imunologie și imunochimie,
3. analiza urinei,
4. hematologie,
5. coagulare,
6. transfuzie,
7. microbiologie,
8. diagnostic molecular
 Chimie clinică
Sistemele automatizate din domeniul chimiei
clinice pot fi diferențiate pe baza:
(1) volumului de testare care se efectuează pe
instrumente și
(2) capacitatea de conectivitate în grupuri de _l \
instrumente sau în sisteme de
automatizare mai mari de laborator.

l " ‘—
ua.- a.
Exemplu de analizor de proteine
Instrumentele automate de mare capacitate, pentru laboratoarele cu volum mare de
probe, îmbunătățesc în mod obișnuit eficiența prin manipularea mai multor analize/oră
cu o capacitate mai mare atât pentru probe cât și pentru reactivi

- '
(at: “‘-
,‘w
‘ 1 * ’
him-
J‘fii;"ff‘-‘:-ir
‘, _——— —. {IE—=96
-_P-

E‘b _- “. ~

_ I

Exemplu de sistem automatizat de chimie clinică de mare capacitate.

Sistem de chimie clinică Beckman Coulter AU5840, care include unități tampon de încărcare și rack, doi
electrozi ioni-selectivi și patru module analitice.
Labster:

Hematologie

- Recapitulare a tipurilor de celule sanguine – rolul îndeplinit

Created by free version of DocuFreezer

- Analiza celulelor sanguine cu ajutorul analizorului automat
- Prepararea unui frotiu de sange
- Colorația Giemsa
- Microscopie
- Corelarea parametrilor obținuți pentru diagnosticarea unor boli ale sângelui
 Spectrofotometrul
Spectrofotometrul este ”eroul nerecunoscut” al multor descoperiri din biologie. În această
simulare veți explora partea mecanică a acestui instrument.

Se explorează părțile componente fără grija greșelilor!

Simularea vă ajută să construiți un spectrofotometru. Puteți încerca orice configurație
posibilă și să observați efectul asupra traseului luminii, fără a strica nimic. Se învață prin
eroare! Dar, noțiunile vor deveni din ce în ce mai complexe, în așa fel încât să prezinte de la
principiile de bază până la optimizarea protocolului.

Obiectivele învățării
La sfârșitul simulării trebuie să fiți capabili să:
● Prezentați cum se folosește spectrofotometrul pentru a măsura absorbanța

Created by free version of DocuFreezer

● Explicați funcția fiecărei componente în parte
● Alegeți lungimea optima pentru măsurarea unui compus de interes, cunoscând spectrul
de absorbție.

TEORIA
Spectrofotometrul
Spectrofotometrul este instrumentul care măsoară cantitatea de umină care trece printr-o
soluție, furnizând astfel informații despre intensitatea energiei radiate. Acest instrument
determină raportul dintre intensitatea luminii emise de o sursă internă și cea care trece
printr-o soluție. Acest raport se poate folosi pentru a determina concentrația unei
molecule dizolvată într-o soluție (probă).

Spectrofotometrul are următoarele componente (Fig. 1):

● o sursă de lumina
● osursă de descompunere a luminii
● un selector de lumina cu lungimea de undă specifică
● locul de plasare al probei (cuvetei)
● detector – celulă fotoelectrică ce va converti energia fotonică în curent electric,
măsurabil.
Figura 1: Părțile componente ale
spectrofotomerului sunt: sursa de lumina
Selectarea lungimii Detector
emite lumina care va fi concentrată pe o
Colimator
(Ientilé) de undé (aperturé) (fotocelulé)
prismă care o va descompune. Mai
_' N departe, trece printr-o apertură care va
—> l —> |—- lăsa să treacă o singură lungime de undă.
’0 h ‘
Această lumina parțială trece prin proba
q z
N Afisaj
Sursa de lornocromator Cuva CU digital plasată într-o cuvă și detectorul va
(prisma) solugia de
Iuminé
măsura intensitatea luminoasă de
testat 1
cealaltă parte a cuvei.
Înainte de a măsura o probă, spectrofotometrul este programat să măsoare energia luminii
de o anumită lungime de undă, lumina care ajunge la detector (transmisă). Lungimea de
undă poate fi ajustată cu finețe și se stabilește în funcție de spectrul de absorbție al
compusului determinat.

Spectrul de absorbție
E mm
9 '
9 . '.
3': : o
‘v ‘v “v ‘Nr ~‘v
Fig.2 Spectrul de absorbție al unui
compus vs spectrul de transmisie.
Pentru a construi spectrul de absorbție,
se va măsura absorbanța (respectiv
spectra transmitanța) luminii ce trece prin
soluția de caracterizat. Astfel, soluția va
fi stimulate cu lumina de lungimi de
undă diferite, care vor acoperi spectrul
luminii VIS (sau și UV unde este necesar).
Pentru fiecare  se va măsura o
absorbanță și se construiește un graphic
(linia punctată). Lungimea de undă la
care absorbția este maximă se alege
wavelength pentru determinările ulterioare.

Din suprapunerea spectrului de absorbție și al spectrului de transmisie se obervă că

lalungimea de undă specifică, absorbanța este maximă iar transmitanța este minima.

În urma măsurătorii, spectrofotometrul va oferi ca rezultat o valoare de absorbanță (A).

Absorbanța este calculată ca:
A = log(I0/It)
unde I0 este intensitatea lungimii incidente (lumina care cade pe proba de măsurat), și
It este intensitatea luminii care trece prin soluție (transmisă) și ajunge la un
detector fotovoltaic.

Relația dintre absorbanța și concentrația de soluție este liniară și este descrisă de legea
Lambert -Beer :
A =εc l
unde c este concentrația de soluție
l este lungimea undei luminoase (adâncimea cuvetei) = distanța traversată de lumina
prin soluție; se exprimă în cm
ε este coeficientul de extincție molară, specific fiecărui compus; este un parametru dependent de
lungimea de undă
A este o mărime adimensională, se exprimă în unitați arbitrare.

Spectrofotometrul poate să ofere ca rezultat final atât absorbanța cât și transmitanța.

Deoarece absorbanța are o variație liniară cu concentrația, se preferă folosirea acestui
parametru.

2
 Spre exemplu: măsurarea concentrației de NADH. NADH are un maxim de absorbție la
, 340 nm, de aceea, spectrofotometrul este ajustat la această lungime de undă.
Coeficientul de extincție al NADH este ε = 6220 M-1cm-1. Adâncimea cuvetei este de 1
H°“‘°" cm. Absorbanța măsurată este A=0.26. Folosind legea Lambert Beer, să se calculeze
@1' concentrația NADH?

Legea Lambert-Beer are anumite limitări tehnice

- se aplică numai soluțiilor diluate! Când concentrația compusului crește, crește și
frecvența interacțiunilor fizico-chimice dintre molecule. De aceea, la o anumită
concentrație, moleculele vor afecta distribuția sarcinilor și polaritatea moleculelor
învecinate. Consecința acestei interacțiuni este că relația dintre absorbanță și concentrație
nu mai este liniară.
p

Toate măsurătorile să aibă valoarile absorbantelor mai mici decât 1:

A<1.
gins :
Absorbanța este invers proporțională cu transmitanța = lumina care trece printr-o probă
deoarece nu este absorbită. Ca urmare a relației logaritmice dintre A și intensitatea
luminoasă, când absorbanța este 1, 10% din lumina este transmisă. Dacă absorbanța este 2,
1% din lumina incidentă este transmisă.

A=1 → log (I0/It) = 1 → (I0/It) = 10 → It = I0/10 dacă I0 = 100% atunci It este 10%

Coeficientul de extincție molară

Coeficientul de extincție molară a unei substanțe ne informează cât de bine blochează o
substanță trecerea luminii.

Coeficienții de extincție molară sunt dependenți de lungimea de undă, astfel că aceeași

substanță poate avea diferiți coeficienți de extincție la diferite lungimi de undă.

De obicei, o substanță va manifesta absorbție maximă într-o anumită regiune a spectrului

(Fig.2). Aceste valori maxime arată care este lungimea de undă optima la care se pot
măsura substanțele din soluții. Lungimea de undă la care s-a facut determinarea trebuie
să coincidă cu lungimea de undă la care s-a măsurat coeficientul de extincție.
O \-

Aplicație:

1. Determinarea concentrației totale de proteină dintr-un extract proteic total

Pentru determinarea cantitativă conținutului de proteină totală dintr-un preparat
biologic, se determină se poate folosi una din următoarele metode colorimetrice:
Bradford, Lowry, BCA

3
Principiul metodelor:
1. Metoda Bradford: se bazează pe interacția colorantului Coomassie Brilliant Blue G-250
care formează legături de tip hidrofob (van der Waals) cu aminoacizii bazici Arg, Lys,
His din structura proteinelor. Ca urmare a interacției dintre proteină și colorant,
proprietățile spectrale ale colorantului se modifică de la brun, astfel că lungimea de
undă la care absorbția este maximă se modifică de la 465 nm (forma nelegată la
proteine, forma instabilă) la albastru 595 nm (forma legată la proteine, forma stabiă).
Prin urmare, monitorizarea complexului Coomassie-proteină se va monitoriza la 595
nm.
Sputum

465 nm
0.900
0.800
0.700
0.600
00

0.500
0.400
0.300
0.200
0.100
0.000
1300 1150 500 550 600 650 700 750 800
Wavelength ln nm

2. Metodele ce folosesc reactivii Lowry =”Folin Ciocâlteu” (FC) și BCA se bazează pe capacitatea
amino acizilor cu nucleu aromatic (Phe, Tyr, Trp) de a complexa ionii de cupru în mediu
bazic, urmată de reacția cu acidul fosfomolibdenic și fosfowolframic (Lowry) sau cu acidul
bicinconinic (BCA) ce va duce la apariția unui complex de culoare albastră cu absorbție la 750
nm (metoda Lowry) sau un complex mov cu absorbție la 562 nm (BCA).

Mod de de lucru:
Bradford: extractul proteic total (EPT) se incubează cu reactivul Bradford timp de 10
minute la temperatura camerei (RT) după care absorbția se citește la 595 nm. Reacția se
poate desfășura în diferite tuburi de laborator, pentru care volumele se scalează astfel:
- în eprubetă: 30 L EPT + 1.5 mL reactiv Bradford
- în tub Ependorff: 1 L EPT + 1 mL reactiv Bradford
- în placă cu 96 godeuri: 5 L EPT + 250 L reactiv Bradford
- specific laboratorului în urma optimizării metodei
Lowry: 0.5 mL probă + 0.7 mL soluția Lowry (Cu2+, pH bazic) se amestecă și se incubează 20
min RT în întuneric. Reactivul FC (fosfomolibdat și fosfowolframat, sensibil la lumină) se
prepară proaspăt, cu 5 min înainte, și se adaugă în volum de 0.1 mL Se amestecă și se
incubează 30 min RT în întuneric. După perioada de incubare se agită încă o dată și se citește
absrobția la 750 nm.

Indiferent de metodă:
1. inițial se prepară o curbă standard, folosind o soluție de albumină serică bovină (BSA)
purificată, de concentrație cunoscută (2mg/mL) dizolvată în apă.

4
 2. fiecare determinare va avea un blanc = probă în care nu se adaugă nici o proteină și
care arată culoarea (absorbția) dezvoltată de mediul de reacție în absența proteinelor

3. aceeași probă se testează de 3 ori (replicat tehnic) pentru a se verifica erorile de

pipetare.

4. Înainte de efectuarea oricărei măsurători, spectrofotometrul se aduce la 0 cu apă

(referința cu transmitanță de 100% și absorbanța 0).

Exemplu de experiment și teme (T)

Dorim să determinăm concentrația de proteină totală din probe izolate de la 8 pacienți
normali (A) și 8 pacienți cu astm (grup B).
În ziua în care preparatele se prelucrează, se realizează și o curbă de etalonare folosind
BSA (2mg/mL) ca standard de proteină și reactivul Bradford, din același lot cu cel pentru
omogenatele de testat
Etapa 1: Prepararea curbei de etalonare.
Ce este curba de etalonare?
Curba de etalonare arată variația absorbanței (A) cu concentrația de standard (aici proteina
BSA). Pentru a se construi, se pornește de la concentrații cunoscute de proteină, pe un
interval de concentrație, astfel determinat încât A să varieze liniar cu cantitatea de
proteină.
Exercițiu: Presupunând că vom efectua reacția în placă cu 96 de godeuri, cu raportul 5 L
soluție proteică + 0.25 mL reactiv Bradford completați în tabelul de mai jos volumele de
soluție stoc de BSA (2mg/mL) ce trebuie pipetate astfel incât în cei 5 L soluție proteică să
regăsiți cantitatea de proteină menționată în tabel (coloana galbenă). Diferența până la 5 va
fi apă.
- OX _ ___-- A595 OY
Nr.crt. Conc de a=Volum Volum A1 A2 A3 A1 -B A2 -B A3-B A-B
P finală BSA H2O medie
(mg/mL) (2mg/mL) (5-a)
I 1
(x)
0 0 5 0.243 0.240 0.270
_-
- 2 1 ___-___- 0.314 0.332 0.313
- 3 2 ___-___- 0.371 0.371 0.387
- 4 4 ___-___- 0.474 0.481 0.500
5 6 _- 0.614 0.608 0.638
6 8 0.725 0.745 0.749
- 7 10 _- ___- 0.827 0.855 0.875 _-
Ex: 2 mg BSA /mL este echivalentă cu 2 g/L. Pentru a pipeta un volum ce conține 2g de
proteină vom pipeta 1 L de soluție stoc de 2mg/mL. Restul până la 5L va fi apă (4 L).
p

H°“‘°’i T1: Calculați similar pentru celelalte cantități și completați tabelul de mai sus.

5
 Etapa 2: Probele se pregătesc în triplicat. Se adaugă reactivul Bradford și după timpul de
incubare se vor citi A595 corespunzătoare.
A1, A2 și A3 reprezintă densitățile optice citite la 595 nm. După cum vedeți, eprubetele 1
care nu conțin nici o proteină au A diferite de zero. Acesta este blancul (B) care se scade
din A a probelor, deoarece este un parametru care nu depinde de cantitatea de proteină.
,0
Home T2: Efectuați calculul de scădere a B mediu din toate A si notați-le în tabel.
W)“
Etapa 3:

,o —
Home T3: Calculați (A-B) medie și reprezentați grafic aceste valori medii în funcție de cantitatea de
proteină (m) din 5 L.
W)“
Veți obține o dreaptă care trece prin origine, care se poate aproxima cu o ecuație de
regresie liniară:
A=b*x
Aproximați liniar această variație și calculați panta b.

Etapa 4: Pregătirea probelor de concentrație necunoscută

Înainte de incubare cu reactivul Bradford, probele biologice se vor dilua de 10 ori. Având în
vedere că testarea se va face cu 5 L de probă diluată, calculați ce volume trebuie să
pregătiți pentru triplicat, calculând un exces de cel puțin 10% care să compenseze pentru
eventualele erori de pipetare.

Mai departe, din fiecare probă se pipetează în triplicat (3 godeuri diferite) volumul ce intră
în reacția Bradford. După timpul de incubare se vor citi A corespunzătoare.

Proba A595 1 A595 2 A595 3 A-B A-B Conc Conc

mediu C1 C2
1 Blanc 0.246
-_-_--__--- 0.240 0.270
2 A1 0.576
- 0.567 0.564
3 A2 0.592
-_ - ___-___- 0.593 0.594
4 A3 0.472
-_-_--__--- 0.487 0.492
5 A4 0.601 0.62 0.602
6 A5 0.634 0.64 0.632
7 A6 0.631
-_-_--__--- 0.629 0.632
8
- A7
_- 0.611 ___-___-
0.607 0.592
9 A8 0.647
-_-_--__--- 0.655 0.662
10 B1 0.609 0.608 0.629
11 B2 0.639 0.626 0.629
12 B3 0.644
-_-_--__--- 0.626 0.624
6
 13 B4
“fi. 0.581
-_-_--__ 0.606 0.586 _- -
14 B5 0.64 0.628 0.624
-15 _-_
B6 0.622 0.63 ___-__-
0.648
16 B7 0.637 0.644 0.641
17 B8
Homti 0.751 _-
0.76 0.752 __---
p

T5: Calculați concentrația de proteinlă (mg/mL) a fiecărei probe!

Etape:
- se scade media Ablanc din fiecare A proba
- se calculează o valoare medie a A pentru fiecare probă
- se folosește curba standard pentru a converti A în concentrația de proteină (c1):
x= A / b
- se calculează concentrația ținând cont de diluție si condițiile de reacție (c2).

Created by free version of DocuFreezer

p
T6: Completati în tabel valorile obținute.
H°“‘e' Există diferențe semnificative între cele două grupuri A și B privind concentrația proteică
w” totală?

7
 1. Lab Safety
Question 1: Which symbol depicts an oxidizing reagent?

• Option D
• Option A
• Option B
• Option C

Question 2: What does the following symbol mean?

• Corrosive
• Harmful
• Health hazard
• Toxic

Question 3: Here is an image of the hazard symbol on the box. What does it mean?

• Flammable
• Oxidizer
• Toxic
• Explosive
Question 4: Why is it dangerous to wear contact lenses in the lab?
• The plastic reacts with acids
• Glasses protect better than lenses
• Liquid can be trapped under them
• They don't protect well enough

Question 5: What do you have to do beforeleaving the lab, to make sure you don't carry
traces of chemicals outside?
• Wash your hands and then remove your lab coat
• Take off your lab coat and wash your hands
• Tell your supervisor
• Turn off the main power

2. Pipetting: Master the technique

Question 1: The Bradford assay only works at low protein concentrations, from 0.05 to 0.5
mg / per mL protein. How can we reduce the concentration of protein in our sample?
• Dilute the sample
• Concentrate the sample
• Evaporate the sample
• Purify the sample

Question 2: What is the volume range of the P1000?

• 0.5-2 pL
• 20-200 pL
• 200-1000 pL
• 2 - 20 pL

Question 3: How much protein do you need to add to the 800 pL buffer in the first
microcentrifuge tube to make a 5 times dilution?
• 200 pL
• 100 mL
• 500 pL
• 100 pL

Question 4: How much fluid from the 5 times diluted sample has to be transferred to the
second microcentrifuge tube containing 900 pL buffer to dilute further 50 times?
• 100 pL
• 50 pL
• 200 pL
• 10 pL

Question 5: The dye we added stains proteins blue. How does its color change with
increasing protein concentration?
• Blue color diminishes
• Color stays the same
• Blue color intensifies
• Brown color intensifies

Question 6: What is the optimal range of absorbance values measured with a

spectrophotometer?
• 0.1-1
• 0-0.8
• 0.05 - 0.5
• 0.08 - 0.65

Question 7: Pentru a determina concentrația de proteină dintr-o probă biologică, folosinf

metoda Bradford, această probă s-a diluat de 500 de ori și s-a obținut o absorbanță de 0.15.
Curba standard are o pantă de 0.06 mL’mg4. Care este concentrația de proteină a probei
biologice nediluate?
• 1,25 mg/ml
• 1,25 g/ml
• 2,5 mg/ml
• 4,5 mg/ml

3. Solution Preparation: From salt to solution

Question 1: Which equation do we need to find out how many moles of NH4CI would
there be in 500 mL of a 0.300 M solution of it?
• C = V/n
• C=nxV
• n = C/V
• n = CxV

Question 2: Alright. How do we then get from moles (n) to mass (m)? I'll give you a hint:
You're going to need the molar mass (M).
• m = n/ M
• M=mxn
• m = nxM
• m=M/n
Question 3: What was the first step of using the balance, before adding anything to a
weighing dish?
• Tare the balance without a weighing dish and the balance open
• Tare the balance with the weighing dish on and the balance open
• Tare the balance without a weighing dish and the balance closed
• Tare the balance with the weighing dish on and the balance closed

4. Spectrophotometers: Building and exploring the

instrument
Question 1: What is the function of a spectrophotometer?
• Measure the wavelength that passes through the cuvette
• Measure the weight of the cuvette
• Measure the molecular mass of the enzyme
• Measure the amount of light that passes through the cuvette

Question 2: What is the function of the diffraction grating?

• To provide a light source
• To convert incident light into transmitted light
• To measure the transmittance
• To separate light into its component wavelengths

Question 3: What parameter does the detector measure directly?

• Total incident light shining on the cuvette (l0)
• Absorbance
• Wavelength
• Light transmitted through the cuvette (lt)
 5. Spectrophotometry: Learn the Beer-Lambert law with
absorbance experiments
Question 1: We investigate the initial reaction rate of a catalyst. Which part of the
absorbance curve should you use to determine the initial reaction rate?

0.0025 -e
0c
0.0020

0.0015 1
1/ 1 B
0 0010

0.0005
JA
o 2 4 6 8 10
Mme (nwimes)

• B
• C
• A
• D

Question 2: Think back to when we discussed determining absorbance during the spec
build. Which equation can we use to determine the product concentration from the
absorbance value?
• Beer-Lambert Law: A = e -c -l
• The dilution rule: M,- Vj= M2- V2
• Change in Enthalpy: AH = AE + PAV
• First Law of Thermodynamics: AE = q ♦ w

Question 3: When the catalyst was at 0.1 mg/mL and the substrate concentration 16 pM,
the initial rate of absorbance change was 0.005 absorbance units per second. The
measured product has a molar extinction coefficient of 6220 and the path
length is the width of a cuvette; 1 cm. Using the information above, can you identify
which values are important and rearrange the Beer-Lambert equation to convert the
absorbance rate value to a concentration rate value?
• 0.8 M ’-S'1
• 1.2 pM ’-S1
• 0.8pM’s*
• 1.2MV
 6. Enzyme Kinetics
Question 1: We want to determine the concentration of NADH in a solution that also
contains NAD*. Which wavelength is optimal to measure NADH?

• 340 nm
• 290 nm
• 400 nm
• 260 nm

Question 2: We need to prepare a master mix with the reagents for each reaction. Why
don't we add the enzyme into the master mix?
• The enzyme takes the most volume and will dilute the reaction
• The enzyme contains an Inhibitor so wont work
• The reaction will start immediately and our measurement will be inaccurate
• The master mix cannot contain proteins as they interfere with measurements

Question 3: Why do we need buffer in the master mix?

• To increase master mix volume
• To stabilize master mix temperature
• To remove color from the master mix
• To stablize reaction pH

Question 4: The master mix now contains: 0.16 mL of 10 pM ethanol, 0.2 ml of 10 pM

NAD*, and 0.54 mL buffer. We will add 0.1 ml of 1 mg/mL ADH so that the total volume
will be 1 mL. What is the substrate concentration in this master mix?
• 0.016 mM
• 0.16 mM
• 0.0016 mM
• 1.6 mM
Question 5: Looking at the plot, which one is Km? AAAA

• B
• D

Question 6: In competitive inhibition, the VmBX(app)is ... and the Km(app)is....

• Decreased; increased
• Unchanged; unchanged
• Increased; decreased
• Unchanged; increased

Question 7: In noncompetitive inhibition, the VmaxUppjis... and the Km(«Pp)is ....

• Increased; decreased
• Decreased; unchanged
• Decreased; decreased
• Increased; unchanged

Question 8: In uncompetitive inhibition, the VmaxV max is ... and the Kmis ....
• Decreased; decreased
• Unchanged; decreased
• Decreased; increased
• Increased; unchanged
 7. Gel Electrophoresis: Visualize and separate nucleic
acids
Question 1: What is the function of a ladder in gel electrophoresis?
• Positive control
• Prevent the bands from running off the gel ????
• Gauge the size of the bands in the sample
• Negative control

Question 2: Where on the gel will the largest DNA molecules be, and why?
• Near the bottom because they carry more negative charge
• Near the bottom because the migrate through the matrix of the gel faster
• Near the top because they can not migrate through the matrix of the gel as fast
• Near the top because they are less negatively charged

Question 3: How are DNA or RNA molecules visualized on the gel?

• The bands cast a shadow when light passes through the gel
• A labelled dye that binds to the DNA is added
• The negative charge of the DNA is used to detect the bands
• The DNA is extracted from the gel and then measured

H.PLC
8
Question 1: Which molecule emerge last from the column? Scroll down to see the options

• All of them together

• Povidone
• Magnesium stearate
• Metformin hydrochloride
Question 2: The measurement of the time the sample component resides in the
stationary phase relative to the time it resides in the mobile phase is called?
• Resolution
• Selectivity
• Plate number
• Retention factor

Question 3: Which of the following is considered a good peak?

• A
• C
• D
• B

Question 4: In an HPLC system, the beads inside the column are also called the ... phase?
• Stationary
• Column
• Solid
• Mobile

Question 5: What is making the mobile phase pass through the column?
• Gravity
• Capillary force
• Electricity
• Pump

Question 6: How should you prepare a calibration curve?

• By injecting a known amount of analyte and determining the peak area
• By accurately measuring the flow rate
• By using a Rl-detector and Sucrose as analyte
• By setting the detector response to zero
Question 7: In reversed-phase HPLC...
• A hydrophobic stationary phase is combined with a polar mobile phase
• A hydrophilic stationary phase is combined with a polar mobile phase
• A hydrophobic stationary phase is combined with a non polar mobile phase
• A hydrophilic stationary phase is combined with a non polar mobile phase

Question 8: Depending on the interaction, different compounds will travel through the
column at different speeds and elute at different times. This specific time is called?
• Base time
• Peak time
• Retention time
• Elution time

Question 9: The column is also called the stationary phase and it is where the ... takes
place.
• Sample injection
• Sample preparation
• Sample excretion
• Sample separation

9. ELISA
Question 1. Which step do we have to do after coating the plate?
• Adding TMB substrate
• Blocking the plate
• Adding a horseradish peroxidase enzyme
• Adding the primary antibody.

Question 2: Which step do we have to do after adding the secondary antibody?

• Adding TMB substrate
• Blocking the plate
• Spectrophotometer detection.
• Adding a horseradish peroxidase enzyme

Question 3: Which biomolecule can specifically detect the presence of a certain protein,
such as recombinant FIX, in a sample full of other proteins?
• Integri ns
• Antigens
• Immunoglobulins
• Androgens
Question 4: Click View Image. What type of ELISA is shown in the diagram?

• Direct
• Sandwich
• Indirect
• Competitive

Question 5: What are antibodies with high specificity that only detect one epitope called?
• Therapeutic
• Monoclonal
• Specific
• Polyclonal

Question 6: The basic blocking buffer contains 5% Bovine serum albumin (BSA) dissolved
in PBS. What is the purpose of adding a blocking buffer?
• To minimize signal-to-noise ratio
• To create an optimal environment for hydrophilic interaction
• To prevent specific proteins from binding to the plate
• To reduce EUSA background signal

Question 7: Tween 20 is used in our wash buffer. What type of compound is Tween 20?
• Reactant
• Enzyme
• Substrate
• Surfactant

Question 8: What is the purpose of standard?

• To avoid a false positive
• To ensure a high detection signal
• To validate the false negative
• To create standard curve
Question 9: Quantitative ELISA includes a dilution series of known concentrations that is
used to create a standard curve. This standard curve allows the concentrations of antigens
in a sample to be quantified. The first well contains 200 pL of standard with a
concentration of 90 ng/mL per mililiter. If we want to use a dilution with dilution factor of
2, how much sample should be transferred from the first well to the second well that
contains 100 pL diluent?
• ISO pL
• 200 pL
• 50 pL
• 100 pL

Question 10: We will perform serial dilution with a dilution factor of 2. The concentration
of the standard in the first well is 90 ng/mL. The aliquot volume is 100 pL. The volume of
diluent in well 2- 8 is 100 pL each. What is the concentration of the standard in well 8?
Take into account that we are diluting the concentration to half in each step.
• 1.7 ng/pL
• 0.7 ng/pL
• 11.3 ng/pL
• 5 ng/pL

Question 11: A positive control is a sample known to give positive results for the given
test. What is the purpose of positive control?
• Validate false positive results
• Always give positive results
• Verify that the negative results are valid
• Give positive results even when the procedure is not optimized

Question 12: What is a group of samples where no response is expected called? This
group contains all buffers and reagents except the substance of interest.
• Positive sample
• Standard
• Test sample
• Negative control

Question 13: What is the purpose of agitating the ELISA plate?

• Reducing the washing time
• Optimizing the signal-to-noise ratio
• Prolonging the incubation time
• Increasing the rate of binding

Question 14: TMB (tetramethyl benzene) is a substrate for horseradish peroxidase (HRP).
What is the proper container for storing TMB?
Light protected container
• Glass beaker
• Eppendorf tube
• Metal vial

Question 15: A stop solution is added to provide a fixed end point for the assay. What is
the stop solution for the ELISA substrate TMB in the presence of horseradish peroxidase
(HRP)?
• Sodium chloride
• Sodium hydroxide
• Sulfuric acid
• Hydrochloric acid

Question 16: The equation of the standard curve is y = 0.9988x -1.437. In ELISA we
measured the absorbance using a spectrophotometer. How can we calculate the amount
of FIX in each sample?
• Amount of FIX = (0 9988 ♦ Absorbance)/1.437
• Amount of Fix = {Absorbance + 1.437)/ 0.9988
• Amount of FIX = 0.9988 * Absorbance -1.437
• Amount of FIX • 0.9988 = Absorbance ♦ 1.437

Question 17: From: Ms. Stauffer. Hello, I need your help for troubleshooting. My ELISA
result looks weird. All wells exhibit similar bright blue colors, even the negative control.
What kind of problem do I have?
• You have no color development
• You have high background
• You have no optical reading
• You have low absorbance

Question 18: From: Senor Guzman. Hi! I have generated the standard curve for my ELISA
experiment. What do you think?
• Perfect, standard curve Senor!
• You don't have enough samples
• Your standard curve is poor
• You're using the wrong regression

Question 19: In direct ELISA, which components are directly attached to the plate?
• Detection antibodies
• Antigens
• Blocking agents
• Capture antibodies

Question 20: Which component of sandwich ELISA is required in pairs?

Antigens
• Enzymes
• Antibodies
• Blocking agents

Question 21: In a competitive ELISA, how would the signal measured by the detector react
to an increase of antigen in the sample?
• Increase
• Decrease
• Not affected
• Match

10. Biuret's Test for Proteins

Question 1: A positive control is a sample known to give positive results for the given test.
What is the purpose of a positive control?
• Always give negative results
• Give positive results even when the procedure is not optimized
• Verify that the negative results are valid
• Validate false-positive results

Question 2: Amino acids are linked by a specific type of covalent bond. The reaction
producing this bond also produces one water molecule. What type of bond links amino
acids together in a chain?
• Peptide bonds
• Metallic bonds
• Hydrogen bonds
• Ionic bonds

Question 3: A sequence of amino acids, or a polypeptide, grows from the N-terminus to

the C-terminus. The linear sequence of amino acids within a protein is considered the ...
structure of the protein.
• Secondary
• Tertiary
• Primary
• Quarternary
 11. Cancer Sample Preparation for Mass
Spectrometry
Question 1: Which technique can be used to characterize proteins?
• Colonoscopy
• Biopsy
• Mass spectrometry
• Protein extraction

Question 2: Which process is shown in the above image?

# > ^*2^
• Lysis
• Denaturation
• Precipitation
• Digestion

Question 3: Let's check if you remember how the protein extraction started... Which
process is shown in the above image?

• Precipitation
• Lysis
• Denaturation
• Digestion

Question 4: What is the order of steps required to extract the proteins from cells and
prepare them for MS analysis?
• Cell lysis - digestion - denaturation
• Cell lysis - denaturation - digestion
• Denaturation - digestion - cell lysis
• Denaturation - cell lysis - digestion
 12. Hematology: Introduction to blood
Question 1: While the sample is being analyzed, let's review the functions of our
equipment. How does an automatic hematology analyzer determine the total number of
cells?
• It's determined manually by the lab technician
• Based on electrical resistance
• With an in-built PCR machine
• With an in-built microscope

Question 2: What's the advantage of a blood smear compared to a complete blood count?
• Blood smears are obtained more quickly than complete blood count
• It helps identify viral infections
• It serves as an additional quality control
• To obtain a clear image of the blood cell morphology