Pregunta 1: Se hicieron dos cultivos, uno partiendo de una
colonia no fluorescente, y otra fluorescente; ¿qué se trata de demostrar haciendo esto?
Se demuestra así la función de la arabinosa, que activa la síntesis
de la proteína GFP.
Pregunta 2: ¿Qué papel cumplen en el proceso de clonación el
iluminador UV, la estufa de incubación y la agitación mecánica antes y durante la incubación?
1. El iluminador se usa para seguir el rastro continuamente de las
colonias fluorescentes (que lo son en longitudes de onda de UV). 2. La estufa de incubación, como tal, permite obtener mejores condiciones de incubación de las colonias bacterianas. 3. La agitación mecánica, se emplea para homogeneizar la muestra.
Pregunta 3: ¿Para que se hacen crecer las bacterias en caldo
nutritivo previamente a hacer la purificación?
Para tener un crecimiento mayor de las bacterias.
Fase de concentración celular y lisis
Pregunta 1: Indica el papel en esta fase del protocolo de la
ultracentrífuga, la lisozima y el congelador.
La ultracentrífuga sirve para precipitar todas las bacterias en
suspensión, para poder decantar posteriormente. La lisozima sirve para la digestión enzimática de la pared bacteriana, mientras que el congelador se emplea para la rotura completa de la bacteria.
Pregunta 2: ¿Por qué eliminamos el sobrenadante después de la
primera centrifugación?
Para tener una mayor concentración protéica.
Pregunta 3: ¿Cómo puede la congelación romper las membranas
celulares?
Mediante la formación de cristales tras la digestión con la lisozima.
Pregunta 4: ¿Cuál es el propósito de lisar las bacterias?
Conseguir la extracción de la proteína que contiene la bacteria.
Pregunta 5: ¿Qué color tiene el concentrado celular? ¿Qué color
debería tener el sobranadante? Interpreta los resultados.
El color del concentrado ha de ser fluorescente, pues es quien
contiene el gen GPF, mientra sque el sobrenadante no presenta color (no se ha producido la lisis de las células).
Pregunta 6: ¿Por qué eliminamos el concentrado celular en esta
fase del procedimiento?
Fase de cromatografía
Pregunta 1: Describe brevemente el proceso de cromatografía
por interacción hidrofóbica. Relaciona la expliación con el caso concreto de purificación de esta práctica.
Este tipo de cromatografía separa las proteínas en base a su
hidrofobicidad superficial, y se caracteriza por la adsorción de las biomoléculas a la superficie débilmente hidrofóbica de la resina en una solución fuertemente salina y su posterior elución mediante un gradiente salino negativo.
Pregunta 2: Cubre la siguiente tabla indicando las observaciones
realizadas después de correr los tres tampones de cromatografía.
Tubo de recogida Predicción Observación bajo luz
UV (columna e tubo) #1 Sin color Sin color / color verde #2 Sin color Sin color / color verde #3 Con color verde Color verde / sin color
Pregunta 3: Teniendo en cuenta los resultados, indica el papel
de:
• El tampón de equilibrado: estabilizar los cationes y aniones en
la columna de intercambio catódico. • El tampón de unión: • El tampón de lavado: arrastra los restos que quedan en la columna. • El tampón de elución (TE): ayuda en la elución de las proteínas.
Pregunta 4: ¿Qué tampones tienen concentración salina mayor y
cual menor? ¿Qué se puede decir sobre el papel de la salinidad?
Los primeros tienen mayor concentración. La salinidad de la
superficie hidrofóbica permite una mayor elución al disminuir la concentración de la sal en el tampón