Diagnosticul molecular in infectia HIV

Doua teste de diagnostic molecular sunt frecvent folosite in cazul infectiei HIV:
 determinarea incarcaturii virale (viremie, ARN-HIV-1, VL)
 genotiparea HIV in vederea detectarii mutatiilor de rezistenta la tratamentul
antiretroviral (ARV).
Viremia HIV este primul marker detectabil in sangele pacientilor infectati HIV. In cursul
evolutiei acestei infectii, ARN-HIV este detectat in jurul zilei 10 post-infectie. Este un test
folositor mai ales in urmatoarele situatii:
 Suspiciune de infectie HIV recenta (pacienti aflati in fereastra serologica)
 Pentru confirmare test ELISA pozitiv si/sau WB indeterminat
 Diagnostic nou- nascuti din mame seropositive
 Monitorizarea terapiei ARV
Determinarea viremiei HIV se face prin reactia real-time RT-PCR.
Etapele PCR conventional (end-point PCR) sunt:
o Denaturarea ADN – ruperea puntilor de hidrogen din dublu helix. Vor rezulta
monocatene ADN - 95 grade
o Atasarea primerilor (forward si revers) – 48-60 grade. ADN polimeraza are nevoie de
un punct de initiere a sintezei ADN oferit de capatul 3’OH al primerilor. Primerii sunt
molecule scurte monocatenare ADN care prezinta complemetaritate pentru regiunea tinta
(in cazul de fata, regiuni din genomul HIV).
o Elongarea (sinteza ADN)– realizata de ADN polimeraza care catalizeaza incorporarea
de nucleotide la capatul primerului, incorporare bazata de complementaritate cu secventa
tinta (temperatura standard este de 72 grade)
Toate etapele de mai sus se succed in cicluri de 30-40 de ori si se realizeaza folosind thermal
cycler-ul, un instrument care permite incubarea controlata a probelor la temperaturile indicate,
trecerea de la o temperature la alta facandu-se rapid.
Detectia ampliconului in cazul PCR conventional (end-point PCR) se face la finalul programului
termic, folosind electroforeza in gel de agaroza si coloratie cu bromura de etidiu sau Sybr Green.
In cazul real-time PCR (rt-PCR), detectia ampliconului se face in timp real, dupa fiecare ciclu de
amplificare masurandu-se nivelul de fluorescenta. In rt-PCR se poate folosi Sybr Green, un agent
intercalar fluorescent (se intercaleaza intre bazele azotate ale molecule ADN dublu catenare) sau
sonde TaqMan marcate fluorescent. Acestea din urma sunt molecule scurte de ADN
monocatenar complementare cu regiunea tinta, in forma nativa nu emit fluorescenta
(fluorocromul este complexat cu molecula quencher). Enzima ADN polimeraza incorporeza
nucleotide la capatul primerului si datorita activitatii exonucleazice 5’-3’ pe care o poseda, cand
intalneste sonda ADN hibridizata, cliveaza fluorocromul aflat la capatul acesteia. Fluorocromul
liber emite fluorescenta atunci cand este excitat de sursa laser. Nivelul de fluorescenta este
direct proportional cu cantitatea de ADN sintetizata. Inregistrarea semnalului fluorescent dupa
fiecare ciclu rt-PCR poarta denumirea de curba de amplificare. Cand curba de amplicare intra in
etapa de crestere exponentiala si intersecteaza linia prag (threshold) este inregistrata valoare ct
(ciclu prag/threshold).
Platforma rt-PCR permite incubarea controlata a probelor la temperaturile impuse de programul
PCR si masurarea semnlului fluorescent. Este dotata cu o sursa laser pt excitarea fluorocromilor
si camere performante de captarea semnalui luminos emis de acestia.

Pentru cuantificarea acizilor nucleici virali din probele biologice se folosesc standarde (solutii
ARN/ADN de concentratie cunoscuta) rulate in paralel cu probele de testat in reactia rt-PCR. Se
traseaza o curba standard folosind cantitatea si valorile ct obtinute pentru fiecare standard in
parte. Folosind aceasta curba standard si introducand in ecuatia dreptei valoarea ct a probei
testate, se obtine cantitatea de acid nucleic viral din proba.
In cazul viremiei HIV, concentratia de ARN-HIV-1 se exprima in copii ARN/ml.
Cu cat concentratia ARN-HIV din sangele pacietului este mai mare, cu atat valoarea ct este mai
mica si vice-versa.

Testarea genotipică a rezistenţei HIV-1 la tratamentul antiretroviral se realizeaza prin

tehnica secventierii acizilor nucleici (metoda Sanger). Demonstatie video.
Principalele etape sunt:
Prima etapa: extractia manuala de ARN HIV-1 din probele de ser ale pacientilor
Precum majoritatea operatiilor efectuate in laboratorul de diagnostic molecular, lucrul cu probe
biologice infectioase presupune luarea masurilor de preventive necesare: folosirea halatului de
protectie, a manusilor fara talc (recomandate pentru testele de biologie moleculara), lucrul in
hota cu flux laminar, nivel BSL2.
Inainte de inceperea lucrului propriu-zis, se decontamineaza suprafata de lucru din incinta hotei
cu solutie dezinfectanta.
Se introduc probele de sange ale pacientilor infectati cu HIV-1 care au fost in prealabil
centrifugate 10 min la 3000rpm. Pentru testarea genotipica a rezistentei HIV-1 la tratament este
recomandat ca valorile incarcaturii virale sa fie mai mari de 1000c/ml. Din vacutainerele primare
se transfera in criotuburi probele de ser, avand grija sa verificam etichetarea corecta a acestora si
pastrarea corespondentei.
Se repartizeaza 500ul de ser in tuburi noi de centrifuga marcate corespunzator si se centrifugeaza
la rece timp de 1 ora la 21000xg in vederea concentrarii particulelor virale.
Intre timp, vom scoate de la congelator tamponul de liza si cel de elutie din trusa comerciala
Viroseq (Abbott) pentru a ajunge la temp camerei.
Se scot tuburile din centrifuga si cu o pipeta Pasteur sterila se inlatura cu grija supernatantul.
Peste sedimentul constituit din particule virale HIV se adauga 600 ul tampon de liza virala. Se
vortexeaza energic pentru resuspendarea sedimentului si se centrifugeaza scurt pentru inlaturarea
picaturilor de pe capac.
Se lasa la incubat 10 min la temp cam pentru a permite liza eficienta a invelisului viral.
Pentru precipitarea moleculelor de ARN, se adauga 600ul alcool isopropilic, se vortexeaza
energic si se centrifugeaza 15 min la 13000xg.
Supernatanul este inlaturat cu grija folosind o pipeta Pasteur sterile. Se adauga 1ml solutie etanol
70%, se vortexeaza energic si se centrifugeaza 5 min la 13000xg.
Din nou se indeparteaza supernatantul, se centrifugeaza scurt pentru a aduna resturile de etanol
care vor fi apoi indepartate cu varful unei pipete. Daca nu sunt indepartate, resturile de etanol pot
inhiba reactia de RT si PCR. Pentru siguranta, depozitul de ARN viral se lasa la uscat 5 min,
lasand tuburile deschise.
In final, fiecare sediment este resupendat in solutia tampon de elutie inclusa in trusa. Se
vortexeaza pentru buna omogenizare si se centrifugeaza scurt pt inlaturarea picaturilor din capac.
Avem astfel probele de ARN viral extrase.

Etapa 2: reactia de reverstranscriere si polimerizare in lant.

Scopul este amplificarea genei pol din genomul HIV-1, codificatoare a unor tinte terapeutice
antiretrovirale: proteaza, reverstranscripaza
In aria curata a laboratorului (zona de pregatire a reactivilor), vom scoate de la congelator
reactivii necesari acestei etape. Ii vom lasa sa ajunga la temp cam, ii vom vortexa si centrifuga
scurt (acestea fiind de fapt manevre clasice de pregatire a rectivilor si probelor in laborator).
Pentru reactia de RT vom avea nevoie de:
 Tampon de reactie (contine solutia tampon, nucleotide, primeri)
 DTT
 Inhibitor de RNaze
 Enzima MuLV – o reverstranscripaza
Se calculeaza si se prepara un volum suficient (1-2 probe in plus) pentru a compensa eroarea de
pipetare
Se pregatesc tuburi de 0.2 ml cu pereti subtiri, pentru a permite transferul rapid de temperatura
din timpul reactiei de RT si PCR. Se repartizeaza 10ul din proba de ARN viral, se pun apoi pe
thermalcycler.
Capacul instrumentului trebuie sa fie incalzit in prealabil (103 grade) pentru a preveni
condensarea probelor in capacul tuburilor.
Probele se lasa 30 sec la 90 grade in vederea relaxarii structurilor secundare a ARN, apoi racire 5
min la 42 grade, pentru a atinge temperatura optima de functionare a enzimei. Se scot tuburile
din thermal cycler, se adauga 10ul amestec RT pregatit anterior, apoi tuburile se reintroduc in
instrument si se lasa 1 h la 42 grade timp in care are loc reactia de reverstranscriere propriu-zisa.
In final, pt a opri reactia, tuburile sunt incubate 5 min la 99 grade pt inactivarea enzimei.
Similar cu amestecul de RT a fost pregatit si amestecul de PCR care a fost adaugat in tuburi,
peste produsul reactiei de RT (ADNc HIV-1). Tuburile au fost apoi reintroduse in thermacycler
si lansat programul de PCR recomandat de producatorul trusei comerciale Viroseq.
La final, produsii de PCR obtinuti vor fi evaluati (calitativ si cantitativ) prin electroforeza
orizontala in gel de agaroza.
Se introduce gelul in tancul de electroforeza si se completeaza cu tampon de migrare pentru ca
gelul sa fie scufundat in totalitate.
Se aliquoteaza 5 ul tampon de incarcare si se adauga un volum egal de proba, apoi intregul
volum este incarcat in godeul gelului. Dup ace toate probele au fost astfel incarcat, se inchide
capacul tancului si se porneste electroforeza.
Dupa 30-45 min, se opreste migrarea, se scoate gelul si se vizualizeaza la transiluminator UV. Se
fotografiaza gelul si se compara banda fiecarei probe cu benzile de concentratii cunoscute ale
markerului de migrare moleculara care a migrat simultan cu probele de testat. Ampliconul
asteptat are o dimensiune de 1800 pb.
Etapa 3: PCR secventiere
Pentru fiecare proba se folosesc 6 amestecuri de reactie furnizate in trusa Viroseq (notate A, B,
C, F, G, H). Fiecare dintre amestecuri contine tampon de reactie, 1 primer specific, ADN
polimeraza, nucleotide naturale (dNTP) si terminatori si sintezei (ddNTP marcati fluorescent) in
raport de 10:1. Fiecare ddNTP este marcat distinct, cei 4 fluorocromi vor permite in final citirea
secventelor.

Figura 1. Structura chimică a celor 4 ddNTP-uri folosite în reacţia de secvenţiere.

Se aduc la temperatura camerei amestecurile preformate de PCR secventiere, se omogenizeaza
prin vortexare, urmata de centrifugare scurta. Se va folosi o placa cu 96 godeuri. Pentru fiecare
proba se aliquoteaza 12 ul din fiecare amestec. Se adauga apoi 8 ul produs PCR. Se introduce
placa in thermalcycler si se porneste programul de secventiere: 25 cicluri, fiecare alcatuit din 30
sec la 96 grade, 5 sec la 50 grade si 4 min la 60 grade.
Inainte de a fi incarcate pe secventiator, moleculele de ADN nou sintetizate trebuiesc purificate,
in principal in vederea indepartarii ddNTP marcati fluorescent. Pentru purificare se va folosi
precipitarea cu solutie acetat de Na si etanol absolut. Se amesteca bine prin pipetare pentru a
asigura precipitarea moleculelor de ADN, apoi se centrifugeaza jumatate de ora la 4600 rpm. Se
inlatura supernantant prin absorbtie pe hartie prosop, apoi se spala cu solutie de etanol 70%. Prin
centrifugare 10 min la 4600 rpm, moleculele ADN raman pe fundul godeurilor
Se recurge la aceeasi manevra de inlaturare a supernatantului, urmele de etanol sunt indepartate
prin evaporare.
Sedimentul ADN este resuspendat in 20 ul de formamide cu scopul de a mentine moleculele
ADN in forma monocatenara, esentiala pentru asigurarea unei secventieri reusite. In acelasi scop
se recurge si la denaturare termica 3 min 95 grade, urmata de trecere imediata pe gheata.

Etapa 4: detecţia automată a secvenţelor ADN şi analiza computerizată a secvenţelor.

Interpretarea rezultatelor
Placa cu moleculele de ADN purificate si denaturate corespunzator este pregatita pentru a fi
incarcata in secventiator (platforma ABI 3500). Acesta este un secventiator care permite
electroforeza capilara a probelor, este dotat cu 8 capilare in care probele ADN migraza de la
catod la anod, permitand separarea moleculelor ce difera intre ele cu o nucleotida. Are o camera
de detective dotata cu un laser pentru excitarea fluorocromilor si o camera foto performanta
pentru inregistrarea semnalului luminos emis. Datele brute sunt vizualizate sub forma
electroferogramelor, o reprezentare grafica a succesiunii bazelor azotate (A, G, T, C) in secventa
de interes. Folosind programe informatice specific se asambleaza toate secventele rezultate
corespunzatoare unei probe, rezultand in final o secventa consensus corespunzatoare genei pol a
tulpinii HIV-1 infectante. Aceasta secventa va fi ulterior analizata cu algoritmi de intrarpretare a
mutatiilor de rezistenta disponibili public. De exemplu Stanford HIV Drug Resistance Database
(https://hivdb.stanford.edu/) sau Geno2pheno (https://www.geno2pheno.org/). Acestia compara
secventa de analizat cu secventa de referinta corespunzatoare virusului salbatic (fara mutatii de
rezistenta). Se identifica mutatiile de rezistenta prezente in gena proteazei (PR), clasificate ca
majore si accesorii. Pt gena reverstranscriptazei (RT), mutatiile sunt impartite in mutatii de
rezistenta la inhibitorii nucleozidici de reverstranscriptaza (NRTI) si in mutatii de rezistenta la
inhibitorii non-nucleozidici de reverstranscriptaza (NNRTI).
Algoritmul specific utilizat interpreteaza mutatiile de rezistenta identificate in proba testata. Se
determina gradul de rezistenta/sensibilitate pentru diferitele clase de medicamente ARV testate.
In final, se poate genera un raport de rezistenta ca va fi ulterior transmis medicului infectionist in
vederea evaluarii tratamentului.