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GRUPO 1
2002
GRUPO 1
Luiz Edson
LAVRAS
MINAS GERAIS - BRASIL
2002
SUMÁRIO
1 introdução..............................................................................................................................1
OBJETIVO..............................................................................................................................2
2 referencial teórico..................................................................................................................4
2. Carboidratos:.......................................................................................................................7
3. Proteínas:...........................................................................................................................11
material e métodos................................................................................................................16
Procedimento para obtenção da curva padrão de aminoácidos (aa) a partir de uma solução de
glicina (0,1µ mol/mL):..........................................................................................................16
3 resultados e discussão..........................................................................................................22
1- Curva Padrão Para Açúcares Redutores Pelo Método Do Ácido Dinitrosalicílico ..........23
Gráfico1: repetição 1 .................................................................24
Gráfico 2 : repetição 2...........................................................................................................24
Gráfico 3 : repetição 3...........................................................................................................25
Gráfico 4 : repetição 4...........................................................................................................25
2- Curva Padrão Para Aminoácidos (α-NH2) Pelo Método da Ninhidrina............................26
Gráfico 1 : repetição 1 .............................................................27
Gráfico 3 : repetição 3 ..........................................................................................................28
Gráfico 4 : repetição 4...........................................................................................................28
3- Curva Padrão Para Proteína Pelo Método de Bradford ...................................................29
Gráfico 1 : repetição 1 ...........................................................30
Gráfico 2 : repetição 2...........................................................................................................30
..............................................................................................................................................30
Gráfico 3 : repetição 3 ..........................................................................................................31
Gráfico 4 : repetição 4...........................................................................................................31
4- Curva Padrão Para Açúcares Totais Pelo Método da Antrona .........................................32
Gráfico 1 : repetição 1 ..........33
Gráfico 2 : repetição 2...........................................................................................................33
Gráfico 3 : repetição 3...........................................................................................................34
Gráfico 4 : repetição 4...........................................................................................................34
ReferênciaS bibliográficaS....................................................................................................36
1 INTRODUÇÃO
1
OBJETIVO
2
- Elaborar as curvas padrão a partir das medições realizadas
e verificar o grau de ajuste das mesmas.
3
2 REFERENCIAL TEÓRICO
1. Aminoácidos:
4
A união de aminoácidos forma os polipeptídeos com peso
molecular abaixo de 10.000 daltons e as proteínas. Esta união ocorre por
desidratação, formando a ligação peptídica entre o grupo amino de um
aminoácido e o grupo carboxil de outro.
A ionização de polipeptídeos depende de seus grupos α-amino e α-
carboxil livre em cada extremidade e do número de seus grupos R
ionizáveis.
Métodos de quantificação de aminoácidos
A análise quantitativa de aminoácidos é importante para a
determinação da estrutura das proteínas e dos complexos peptídicos
similares, que são elementares para a determinação química de amostras
de moléculas orgânicas (Spackamn, Stein e Moore, 1958).
A quantificação de aminoácidos é determinada pelo método da
Ninidrina (Hidrato de tricetohidrindeno):
A ninhidrina (Figura 1) ocasiona a reação de desaminação
oxidativa dos aminoácidos, produzindo amônia (NH3) e a redução da
ninhidrina a hidrindantina. Esta reage com a amônia liberada, formando
um complexo azul, com absorção máxima em luz de comprimento de
onda de 570 nm. A intensidade da cor azul produzida em condições
padronizadas serve de base para um teste quantitativo para aminoácidos,
podendo detectar até 1µ g de aminoácido. Outras aminas além dos
aminoácidos, também reagem com a ninhidrina, formando uma cor azul,
mas sem ocorrer liberação de CO2, a qual é indicativa de um aminoácido.
A amônia (NH3) e peptídeos também reagem, porém, mais lentamente
que os α -aminoácidos. A prolina e a 4-hidroxiprolina produzem um
complexo de cor amarela quando reagem com a ninhidrina.
5
Figura 1. Molécula de Ninidrina
6
2. Carboidratos:
7
glicose, pois nessas condições os monossacarídeos são instáveis, sofrendo
oxidação, degradação e polimerização.
Os monossacarídeos são estáveis quando tratados em soluções de
ácidos minerais diluídos, mesmo sob aquecimento; entretanto, as aldoses
sofrem desidratação quando são aquecidas em presença de ácidos
minerais fortes, formando furfural no caso das pentoses ou
hidroximetilfurfural no caso das hexoses.
Esta reação constitui a base de alguns testes qualitativos de
açúcares, pois os furfurais reagem com determinados compostos
aromáticos, formando produtos coloridos característicos (Conn e Stump,
1993).
8
molecular de 194,23. A reação é realizada em meio fortemente ácido,
onde há hidrólise dos dissacarídeos e formação de furfurais, os quais
reagem com a antrona formando um produto de coloração azul-
esverdeada, que é quantificada colorimetricamente.
No presente trabalho dosou-se os açúcares solúveis totais pelo
método proposto por Yemm e Willis (1954).
Figura 3. Reação da antrona com ácido sulfúrico e depois com o açúcar solúvel.
9
A quantificação de monossacarídeos pode dar uma indicação indireta da
capacidade fotossintética da planta.
Esses açúcares tem caráter redutor devido à presença de um grupo
aldeído ou cetona livre na molécula. Eles são capazes de reduzir diversos
íons metálicos e a partir dessa propriedade foram desenvolvidos vários
métodos de identificação e quantificação desses açucares. A seguir
apresenta-se alguns desses métodos:
• Reação de Benedict: O reagente contém íons de cobre na forma
oxidada (Cu 2+), os quais são mantidos em solução formando um
complexo alcalino de citrato. Em presença de açucares redutores o
cobre é reduzido formando um precipitado de coloração amarela
ou vermelha (Cu2O). O açúcar por sua vez é oxidado, quebrado e
polimerizado na solução alcalina (Conn e Stumph, 1993);
• Outras reações de redução: redução da ferricianida, reação com
ácido para-hidroxibenzóico hidrazida (PHABAH) e 3,4
dinitrobenzóico, reação com trifenil tetrazolium, método do ácido
cítrico, do fenolsulfúrico, do ferro reduzido e azul de metileno;
• Método de Somogy e Nelson: é baseado na reação de um
composto contendo cobre em meio alcalino, sendo a reação
quantificada por colorimetria;
10
dinitrosalicílico para 3-amino-5nitrosálico, o qual é um produto de
cor laranja, enquanto o grupo aldeído dos açucares redutores é
oxidado para carbonila.
3. Proteínas:
11
componentes da amostra, no tempo da reação, na precisão desejada e
na sensibilidade da análise. A seguir alguns métodos são citados:
12
muito erro se a quantidade de N for muito pequena e
também depende de fator de conversão médio para cada
espécie. Este método é pouco útil para estudos em
metabolismo vegetal, pois as mudanças de composição
protéica ocorre principalmente em termos qualitativos.
13
• Método de Bradford (1976): é utilizado na determinação
do conteúdo de proteínas totais que se ligam ao corante de
um modo proporcional à concentração. O corante utilizado
é o Comassie Brilliant Blue G- 250, o qual existe em duas
formas coloridas diferentes, a vermelha e a azul. A forma
vermelha é convertida na forma azul após a ligação do
corante com a proteína. Esta coloração ocorre rapidamente
(2min.) e é estável por até uma hora. O método tem
sensibilidade para detectar até 5µg/mL de proteína;
14
Neste trabalho utilizou-se o método de Bradford para
determinação da curva padrão de proteína.
15
MATERIAL E MÉTODOS
16
Tabela 1. Procedimento para obtenção da curva padrão de aminoácidos
GLY
(0,1µ mol/mL) Água Reagentes A+B+C Etanol 60%
Tubos (mL) (mL) µ mol de aa (mL)** (mL)***
01 0,0 1,0 0,00 1,7 1,3
02 0,2 0,8 0,02 1,7 1,3
03 0,4 0,6 0,04 1,7 1,3
04 0,6 0,4 0,06 1,7 1,3
05 0,8 0,2 0,06 1,7 1,3
06 1,0 0,0 0,10 1,7 1,3
** 0,5 mL de A + 0,2mL de B + 1,0mL de C
17
Determinação De Proteínas Pelo Método De Bradford (Comassie Blue G-250):
Preparo do reagente:
Dissolver 100 mg de Comassie blue G-250 em 50 mL de etanol
95%. A esta solução adicionar 100 mL de ácido fosfórico 85%. A
solução resultante é diluída para 1 litro com água. As concentrações
finais são: 0,01% de Comassie, 8,5% de ácido fosfórico e 4,7% de etanol
(Deixar 12 horas agitando em overnight).
Atenção:
ácido fosfórico tem que ser adicionado ao Comassie dissolvido em etanol, nunca
o contrário.
reagente de Comassie deve ser filtrado antes de ser usado.
18
A quantificação de proteínas em extratos vegetais pode ser feita usando-se volumes
iguais do extrato e de TCA (10%) resultando em uma concentração final de TCA
igual a 5%.
Este extrato deve ser centrifugado e o precipitado ressuspendido com NaOH
0,1N. Posteriormente, retirar uma alíquota de 0,1mL da proteína ressuspendida,
adicionar 5mL do reagente de Comassie, agitar e fazer a leitura a 595nm.
19
Após adicionar o reagente de DNS, agitar a mistura e levar os tubos para
banho-maria à 100ºC por 5 minutos. Deixar esfriar a temperatura ambiente e
completar o volume para 10mL com água destilada ou não (conforme o caso). Fazer a
leitura a 540nm.
Para quantificar os AR de um extrato de tecidos convenientemente preparado,
pode-se usar até 1,5 mL de alíquota e adicionar o reagente de DNS e posteriormente
seguir as mesmas recomendações para a obtenção da curva padrão.
20
Determinação De Açúcares Solúveis Totais Pelo Método Da Antrona:
Preparo do reagente:
Pesar 40mg de Antrona, colocar em um bequer e adicionar 1,0mL de água
destilada e depois 20mL de ácido sulfúrico concentrado (H2SO4). Este reagente deve
ser preparado na hora do uso.
Antes de colocar a antrona, manter os tubos de ensaio em gelo.
21
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
22
Nos trabalhos realizados, cada participante do grupo era
responsável por duas repetições de cada ponto das curvas, totalizando
oito repetições por ponto. Márcio foi repetição I, Daniela repetição II,
Ednabel repetição III e Anne repetição IV.
As curvas padrões foram determinadas no Windows Exel com o
uso do gráfico de dispersão, sobre o qual aplicou-se regressão linear, cujo
modelo é y = ax + b. Como critério de qualidade de ajuste foi utilizado o
R2.
23
Gráfico1: repetição 1
y = 0,0074x - 0,0012
R2 = 0,903
0,5
0,4
0,3
abs
0,2
0,1
0
0 20 40 60
ug/m l de ast
Gráfico 2 : repetição 2
y = 0,0056x + 0,0324
0,4 R2 = 0,8533
0,3
abs
0,2
0,1
0
0 20 40 60
ug/m l de ast
24
Gráfico 3 : repetição 3
0,2
0,1
0
0 20 40 60
ug/ml de ast
Gráfico 4 : repetição 4
0,4 y = 0,0055x - 0,0041
R2 = 0,8125
0,3
abs
0,2
0,1
0
0 10 20 30 40 50 60
u g/m l d e as t
25
Gráfico 5 : Média dos gráficos 1, 2, 3, 4
y = 0,0932x + 0,0024
0,6
R2 = 0,9982
0,4
abs
0,2
0
0 2 4 6
u m oles de ar
26
Gráfico 1 : repetição 1
y = 5,0886x + 0,0182
0,8 R2 = 0,9207
0,6
abs
0,4
0,2
0
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1
u m ol de aa
Gráfico 2: repetição 2
0,2
0
0 0,05 0,1
u m ol de aa
27
Gráfico 3 : repetição 3
0,4
0,2
0
0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1
u m ol de aa
Gráfico 4 : repetição 4
y = 4,3843x + 0,032
0,5 R2 = 0,9417
0,4
0,3
abs
0,2
0,1
0
0 0,05 0,1
u m ol de aa
28
Gráfico 5 : Média dos gráficos 1, 2, 3, 4
y = 4 ,6 9 1 4 x + 0 ,0 0 7 1
0 ,6
R2 = 0 ,9 8
0 ,4
abs
0 ,2
0
0 0 ,0 2 0 ,0 4 0 ,0 6 0 ,0 8 0 ,1
u m ol de a a
29
Gráfico 1 : repetição 1
0,5 y = 0,0041x - 0,0135
0,4 R2 = 0,9941
0,3
abs
0,2
0,1
0
0 50 100
ug/0,1ml proteina
Gráfico 2 : repetição 2
0,4
y = 0,0031x - 0,016
0,3 2
R = 0,9899
abs
0,2
0,1
0
0 20 40 60 80 100
ug/0,1ml proteina
30
Gráfico 3 : repetição 3
0,2
0,1
0
0 50 100
ug/0,1ml proteina
Gráfico 4 : repetição 4
0,4
y =0,0031x - 0,0119
0,3 R2 =0,9921
abs
0,2
0,1
0
0 50 100
ug/ 0,1ml proteina
31
Gráfico 5 : Média dos gráficos 1, 2, 3, 4
0,4
y = 0,0034x - 0,0174
0,3 R 2 = 0,9919
abs
0,2
0,1
0
0 20 40 60 80 100
ug/0,1ml proteina
Tabela 1. Valor de absorbância de açúcares solúveis totais (A620 nm) de cada um dos
participantes do grupo em cada ponto da curva e sua média.
32
Gráfico 1 : repetição 1
y = 0,0053x + 0,0052
0,4
R2 = 0,7383
0,3
0,2
abs
0,1
0
0 20 40 60
ug/m l de as t
Gráfico 2 : repetição 2
y = 0,0074x - 0,0012
0,6 R2 = 0,903
0,4
abs
0,2
0
0 20 40 60
u g/m l de as t
33
Gráfico 3 : repetição 3
y = 0,0056x + 0,0324
0,4 R2 = 0,8533
0,3
abs
0,2
0,1
0
0 20 40 60
ug/m l de as t
Gráfico 4 : repetição 4
0,1
0
0 10 20 30 40 50 60
u g/m l d e as t
34
Gráfico 5 : Média dos gráficos 1, 2, 3, 4
0,5 y = 0,0066x + 0,0191
R2 = 0,8727
0,4
0,3
abs
0,2
0,1
0
0 20 40 60
ug/ml de ast
35
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
36
SOUTHGATE, D.A.T. Determination of food carbohydrates. 2.ed. London:
Elsevier Applied Science, 1991. 232p.
37
38